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1、(10)申请公布号 CN 102660506 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102660506 A *CN102660506A* (21)申请号 201210102857.5 (22)申请日 2012.04.10 C12N 5/0793(2010.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310000 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 张若煜 陈怀红 (74)专利代理机构 杭州裕阳专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33221 代理人 应圣义 (54) 发明名称 成年小鼠神经元的机械分离方法 (57) 摘要 本发明涉及生物医学领域， 公开了一种成 年小鼠神经元。
2、的机械分离方法， 方法如下 ： 在 冰浴组织培养液中采用电子振动切片机制作 350-375m 厚的成年小鼠脑组织切片， 室温条件下 保存 30-60 分钟， 于无菌条件下， 将脑组织切片放 入含有木瓜蛋白酶的组织培养液中， 控制温度为 32.2-35.3， 保存 30 分钟， 将脑切片置于盛有 HEPES 缓冲液的细胞培养皿内， 选择所需分离的 神经区域， 使用细胞分离器分离神经元 ； 筛选健 康神经元 ； 本发明通过将原代培养的化学分离方 法融入到机械细胞分离中， 将脑切片预先用木瓜 蛋白酶处理， 使中年及老年小鼠的健康神经元可 以通过机械分离得到， 本方法简单方便， 分离效果 显著。 (5。
3、1)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种成年小鼠神经元的机械分离方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 步骤 a ： 在冰浴组织培养液中采用电子振动切片机制作 350-375m 厚的成年小鼠脑组织 切片， 室温条件下保存 30-60 分钟， 备用 ； 步骤 b ： 于无菌条件下， 将步骤 a 中的脑组织切片放入含有木瓜蛋白酶的组织培养液 中， 控制温度为 32.2-35.3， 保存 30 分钟， 备用 ； 步骤 c ： 将脑切片置。
4、于盛有 HEPES 缓冲液的细胞培养皿内， 选择所需分离的神经 区域， 使用细胞分离器分离神经元， 频率为 50-60Hz， 摆动幅度 2-4mm， 分离针移动速度 0.8-1.5mm/s ； 步骤 d ： 筛选健康神经元 ； 筛选标准为 ： 1） 细胞轮廓光滑 ； 2） 在显微镜倒置光源下， 透 亮 ； 3） 有突触。 2. 根据权利要求 1 所述的成年小鼠神经元的机械分离方法， 其特征在于 ： 所述的组织 培养液中各成分的最终浓度 ： 125.0mM NaCl、 5.0mM KCl、 1.24mM KH2PO4、 26.0 mM NaHCO3、 2.4 mM CaCl2、 1.3 mM M。
5、gSO4、 10.0 mM 葡萄糖 ； 控制用量为 150-200ml 每只小鼠。 3.根据权利要求1所述的成年小鼠神经元的机械分离方法， 其特征在于 ： 所述的HEPES 缓冲液中各成分的最终浓度 ： 150mM NaCl、 5.0mM KCl、 2.0mM CaCl2、 1.0mM MgCl2、 10.0mM Hepes、 10.0mM D- 葡萄糖 ； 控制用量为每片脑组织切片 2.5-3.3ml。 4. 根据权利要求 1 所述的成年小鼠神经元的机械分离方法， 其特征在于 ： 所述的组织 培养液中的木瓜蛋白酶的含量为 18U/ml。 权 利 要 求 书 CN 102660506 A 2 。
6、1/2 页 3 成年小鼠神经元的机械分离方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医学领域， 尤其涉及了一种成年小鼠神经元的机械分离方法。 背景技术 0002 机械分离神经元的膜片钳实验在神经递质受体机制的研究中具有不可替代的作 用， 机械分离的神经元较原代培养的神经元保存有更好的生理通道机制， 而通常用来进行 机械分离实验的小鼠多为 2 3 周龄 （幼年） ， 老年小鼠大脑结构致密， 基本不可能进行机械 分离， 从而给不同年龄小鼠神经递质受体机制的比较带来困难。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种将原代培养的化学分离方法融入到机械细胞分离中， 将 脑切片预先用木瓜蛋白酶处理， 可对中年。
7、及老年小鼠的健康神经元进行分离的方法。 0004 为了解决上述技术问题， 本发明通过下述技术方案得以解决 ： 成年小鼠神经元的机械分离方法， 包括以下步骤 ： 步骤 a ： 在冰浴组织培养液中采用电子振动切片机制作 350-375m 厚的成年小鼠脑组织 切片， 室温条件下保存 30-60 分钟， 备用 ； 步骤 b ： 于无菌条件下， 将步骤 a 中的脑组织切片放入含有木瓜蛋白酶的组织培养液 中， 控制温度为 32.2-35.3， 保存 30 分钟， 备用 ； 步骤 c ： 将脑切片置于盛有 HEPES 缓冲液 （pH=7.4） 的细胞培养皿内， 选择所需分离的 神经区域， 使用细胞分离器分离。
8、神经元， 频率为 50-60Hz， 摆动幅度 2-4mm， 分离针移动速度 0.8-1.5mm/s ； 步骤 d ： 筛选健康神经元 ； 筛选标准为 ： 1） 细胞轮廓光滑 ； 2） 在显微镜倒置光源下， 透 亮 ； 3） 有突触。 0005 作为优选， 所述的组织培养液中各成分的最终浓度 ： 125.0mM NaCl、 5.0mM KCl、 1.24mM KH2PO4、 26.0 mM NaHCO3、 2.4 mM CaCl2、 1.3 mM MgSO4、 10.0 mM葡萄糖 ； 控制用量为 150-200ml 每只小鼠。 0006 作为优选， 所述的 HEPES 缓冲液中各成分的最终浓度。
9、 ： 150mM NaCl、 5.0mM KCl、 2.0mM CaCl2、 1.0mM MgCl2、 10.0mM Hepes、 10.0mM D- 葡萄糖 ； 控制用量为每片脑组织切片 2.5-3.3ml。 0007 作为优选， 所述的组织培养液中的木瓜蛋白酶的含量为 18U/ml。 0008 本发明由于采用了以上技术方案， 具有显著的技术效果 ： 本发明通过将原代培养的化学分离方法融入到机械细胞分离中， 将脑切片预先用木瓜 蛋白酶处理， 使中年及老年小鼠的健康神经元可以通过机械分离得到， 本方法简单方便， 分 离效果显著， 具有很高的实用性。 附图说明 说 明 书 CN 10266050。
10、6 A 3 2/2 页 4 0009 图 1 是显微镜下未经木瓜蛋白酶预处理的 2 周龄小鼠脑切片神经元图谱。 0010 图 2 是显微镜下未经木瓜蛋白酶预处理的 10 周龄小鼠脑切片神经元图谱。 0011 图 3 是显微镜下经木瓜蛋白酶预处理的 10 周龄小鼠脑切片神经元图谱。 0012 图 4 是经木瓜蛋白酶和未经木瓜蛋白酶处理的荧光定量分析统计结果对比图。 具体实施方式 0013 下面结合附图 1 至附图 4 与实施例对本发明作进一步详细描述 ： 实施例 1 小鼠海马切片的制备与预处理 ： 14 20 天大的 C57BL/6 小鼠， 用戊巴比妥钠 （80mg/ kg） 麻醉后断头。快速在。
11、冰浴 (4 ) 组织培养液 ( 单位 mM ： 125.0 NaCl, 5.0 KCl, 1.24 KH2PO4, 26.0 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 1.3 MgSO4, 10.0 glucose)（控制用量 50 100ml） 中制作 350-375m 厚的组织切片 ( 电子振动切片机 VT1000S， Leica)。机械分离前， 切片 先在室温 （24 32） 组织培养液 （100ml） 中保存 30 分钟， 再在含木瓜蛋白酶 (Papain, 18U/ml, 32.2-35.3)的组织保存液中保存30分钟后 （可通过计算， 直接将木瓜蛋白酶加 入组织保存液中， 调整至目标浓。
12、度及目标温度 （32.2-35.3 )， 再进行机械分离。 0014 神经元的机械分离 ： 将脑切片置于乘有外液的 2mm 细胞培养皿内， 外液为标准 HEPES 缓冲液 （单位 mM ： 150 NaCl, 5.0 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10.0 Hepes, and 10.0 D-glucose. pH7.4Trisbase.）（控制用量为2.5-3.3ml每片脑组织切片） 。 选择所需分 离的神经区域， 使用细胞分离器 （SI-10, KT Lab, Saitama) 分离神经元， 频率为 50-60Hz， 摆动幅度 2-4mm, 分离针移动速度 0.8-。
13、1.5mm/s。 0015 在 1020 倍倒置显微镜下选择健康细胞进行膜片钳或生化实验。健康神经元选 择标准为 ： 1、 细胞轮廓光滑， 2、 在显微镜倒置光源下， 透亮， 3、 有突触。 0016 使用同一小鼠脑切片， 通过比较含木瓜蛋白酶和不含木瓜蛋白酶的组织保存液处 理的成年小鼠海马神经元， 说明木瓜蛋白酶预处理对与成年小鼠神经元分离的作用。 0017 由图 1 至图 3 中可清晰看到， 通过木瓜蛋白酶预处理的脑切片相对与未用木 瓜蛋白酶预处理的脑切片可以分离得到更为健康的神经元。 同时我们对于此作用进行了定 量分析， 抽取 10 只 C57BL/6 小鼠， 每只小鼠制作含海马的脑切片。
14、 6 片， 随即抽取 3 片保存于 含木瓜蛋白酶的组织保存液， 其余 3 片则在不含木瓜蛋白酶的组织保存液中， 细胞分离时 则选用同一指标， 频率为 50Hz， 摆动幅度 3mm, 分离针移动速度 1mm/s。神经元分离结束后， 对培养皿内细胞进行固定和 MAP-2 染色， 并进行荧光定量分析， 结果发现木瓜蛋白酶预处 理的荧光量大约为未用木瓜蛋白酶处理的 4.2 倍 （p0.001） ， 统计结果见图 4， 说明通过木 瓜蛋白酶的预处理， 明显更容易通过机械分离得到的神经元。 0018 总之， 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所作的均等 变化与修饰， 皆应属本发明专利的涵盖范围。 说 明 书 CN 102660506 A 4 1/1 页 5 图 1图 2图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102660506 A 5 。