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1、(10)申请公布号 CN 102660589 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102660589 A *CN102660589A* (21)申请号 201210159877.6 (22)申请日 2012.05.21 C12P 7/14(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C12R 1/72(2006.01) C12R 1/885(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 江苏科技大学 地址 212003 江苏省镇江市梦溪路 2 号 (72)发明人 李强 季更生 吴再强 谷绪顶 万富 费娟娟 (74)专利代理机构 南京苏高专。
2、利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 柏尚春 (54) 发明名称 一种生物乙醇制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种生物乙醇制备方法， 包括 以下步骤 ： 将植物纤维与纤维素酶产生菌种子液 于发酵培养基中恒温振荡培养 0-5 天后， 接入乙 醇生产菌种子液， 继续恒温振荡培养 3-7 天 ； 过滤 发酵液， 滤液减压蒸馏即得生物乙醇。 本发明提供 的一种生物乙醇制备方法产率高、 成本低、 绿色环 保， 适于工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1。
3、/1 页 2 1. 一种生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 将植物纤维与纤维素酶产生菌种子液于发酵 培养基中恒温振荡培养 0-5 天后， 接入乙醇生产菌种子液， 继续恒温振荡培养 3-7 天， 得发 酵液 ； 过滤发酵液， 滤液减压蒸馏即得生物乙醇。 2. 根据权利要求 1 所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 所述纤维素酶产生菌种子 液由纤维素酶产生菌于 PDA 培养基中恒温培养制得， 所述乙醇生产菌种子液由乙醇生产菌 于 YEPD 培养基中恒温培养制得。 3. 根据权利要求 1-2 任一项所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 所述纤维素酶产 生菌为黑曲霉 (Aspergillus 。
4、niger) 或康氏木霉 （Trichoderma koningii)。 4. 根据权利要求 1-2 任一项所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 所述乙醇生产菌 为休哈塔假丝酵母 （Candida shehatae） 或树干毕赤酵母 (Pichia stipites)。 5. 根据权利要求 1 所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 所述植物纤维的用量为每 升发酵培养基中含 2-20g 植物纤维。 6. 根据权利要求 1 所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 所述纤维素酶产生菌种子 液的体积为发酵培养基体积的 2-5。 7. 根据权利要求 1 所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ：。
5、 所述纤维素酶产生菌种子 液与乙醇生产菌的菌种子液体积比为 1 ：（0.5-2） 。 8. 根据权利要求 1 所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 培养温度为 25-30， 振荡 速度为 100-200r/min。 9. 根据权利要求 1 所述的生物乙醇制备方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养基为以下任 一种 ： （1） 培养基 ： 9g Na2HPO4 12H2O， 1.5g KH2PO4， 1.2mg FeNH4-Citrate， 0.34g （NH4） 2SO4， 0.15g 蛋白胨， 0.15g 酵母提取物， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO4。
6、7H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH 为 4-6 ； （2） 培养基 ： 2g KH2PO4， 1.4g（NH4） 2SO4， 0.3gMgSO4， 0.3gCaCl2， 0.5g 蛋白胨， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mLH2O ； pH 为 4-6 ； （3）培养基 ： 1g 蛋白胨， 2.0g NaNO3， 1.5g K2HPO4， 0.3g CaCl2， 0.3g M。
7、gSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.5g CoCl2， 1.5g 酵母提取物， H2O 1000mL ； pH 为 4-6 ； （4） 培养基 ： 3g NaNO3， 1gK2HPO4， 0.5g MgSO47H2O， 0.5g KCl， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH 为 4-6。 权 利 要 求 书 CN 102660589 A 2 1/5 页 3 一种生物乙醇制备方法。
8、 技术领域 0001 本发明涉及一种生物乙醇制备方法， 特别涉及一种微生物混合发酵利用植物纤维 制备生物乙醇的方法。 背景技术 0002 随着世界工业的迅速发展， 石油等化石资源的逐渐枯竭， 利用可再生资源生产生 物能源的研究越来越受到国内外研究者的关注。纤维素是地球上最丰富的可再生资源， 具 有价廉、 可降解和不污染生态环境等优点， 因此用木质纤维素生产燃料乙醇替代石油燃料， 对社会经济的可持续发展具有重要的意义。 0003 但是， 纤维素是以葡萄糖基通过糖苷键连接起来的、 具有线性结构的高分子化合 物， 其结构复杂， 内部存在大量的晶区、 非晶区结构和氢键， 造成了纤维素资源化利用的障 碍。
9、。纤维素酶酶解纤维素被认为最有效的破坏纤维素的复杂结构， 高效利用植物纤维的方 法之一。黑曲霉、 康宁木霉等微生物可以分泌纤维素酶、 木聚糖酶等多种植物纤维降解酶， 高效降解天然植物纤维成为糖， 这些糖可以被微生物利用发酵成为生物乙醇等能源产品， 有助于解决能源危机。然而纤维素酶产生菌虽然能够降解植物纤维， 但是不能用于生产生 物乙醇等产品。 0004 高效代谢木糖和葡萄糖产乙醇的菌种是以植物纤维降解糖为原料生产乙醇的研 究热点之一。 由于常用的酿酒酵母和运动发酵单胞菌等微生物只能利用葡萄糖这样的六碳 糖生产乙醇， 不能利用植物纤维降解产生的木糖， 造成了植物纤维降解产生的木糖浪费， 导 致乙。
10、醇产率不高 ； 并且这些微生物乙醇高产菌不能直接利用植物纤维素生产生物乙醇。 0005 目前有报道利用基因工程改造的酵母菌、 大肠杆菌等工程菌直接利用纤维素制备 乙醇， 但是基因工程菌通常需要抗生素维持其代谢能力， 并且存在生长速度慢、 代谢慢、 乙 醇产率不高、 不能高效利用天然植物纤维等缺点， 因此基因工程菌在直接利用植物纤维制 备乙醇方面显示出不足之处。 发明内容 0006 发明目的 ： 本发明的目的是提供了一种产率高的生物乙醇制备方法。 0007 技术方案 ： 本发明所述的生物乙醇制备方法， 包括以下步骤 ： 将植物纤维与纤维 素酶产生菌种子液于发酵培养基中恒温振荡培养 0-5 天后，。
11、 接入乙醇生产菌种子液， 继续 恒温振荡培养 3-7 天， 得发酵液 ； 过滤发酵液， 滤液减压蒸馏即得生物乙醇。 0008 其中， 所述纤维素酶产生菌种子液由纤维素酶产生菌于 PDA 培养基中恒温培养 制得， 所述乙醇生产菌种子液由乙醇生产菌于 YEPD 培养基中恒温培养制得 ； 培养温度为 25-30， 培养时间为 3-5 天。 0009 为了使纤维素酶产生菌对桑叶中的纤维素充分降解， 本发明优化了发酵条件 ： 0010 所述纤维素酶产生菌为黑曲霉 (Aspergillus niger) 或康氏木霉 （Trichoderma koningii) ； 说 明 书 CN 102660589 A。
12、 3 2/5 页 4 0011 所述乙醇生产菌为休哈塔假丝酵母 （Candida shehatae） 或树干毕赤酵母(Pichia stipites) ； 0012 所述植物纤维的用量为每升发酵培养基中含 2-20g 植物纤维 ； 0013 所述纤维素酶产生菌种子液的体积为发酵培养基体积的 2-5 ； 0014 所述纤维素酶产生菌种子液与乙醇生产菌的菌种子液体积比为 1 ：（0.5-2） ； 0015 培养温度为 25-30， 振荡速度为 100-200r/min ； 0016 所述发酵培养基为以下任一种 ： 0017 （1）培 养 基 ： 9g Na2HPO412H2O， 1.5g KH2P。
13、O4， 1.2mg FeNH4-Citrate， 0.34g （NH4） 2SO4， 0.15g 蛋白胨， 0.15g 酵母提取物， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH 为 4-6 ； 0018 （2） 培养基 ： 2g KH2PO4， 1.4g（NH4） 2SO4， 0.3g MgSO4， 0.3g CaCl2， 0.5g 蛋白胨， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.001。
14、4g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mLH2O ； pH 为 4-6 ； 0019 （3） 培养基 ： 1g蛋白胨， 2.0g NaNO3， 1.5g K2HPO4， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.5g CoCl2， 1.5g 酵母提取物， H2O 1000mL ； pH 为 4-6 ； 0020 （4） 培养基 ： 3g NaNO3， 1g K2HPO4， 0.5g MgSO47H2O， 0.5g KCl， 0.005g FeSO4 7H。
15、2O， 0.0016g MnSO4 H2O， 0.0014g ZnSO4 H2O， 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH为4-6。 0021 有益效果 ： 本发明与现有技术相比， 其显著优点是 ： 本发明的制备方法产率高、 成 本低、 绿色环保， 适于工业化生产。 0022 本发明提供的生物乙醇制备方法产率高。 本发明方法直接利用桑枝、 秸秆、 甘蔗渣 等天然植物纤维为原料， 构建了一种纤维素酶产生菌和乙醇高产菌混合发酵的模式， 不需 要外加糖类或者酶就可以高效生产乙醇。纤维素酶产生菌在培养体系中分泌纤维素酶、 木 聚糖酶及多种其他酶协同降解天然植物纤维中的纤维素和半纤维。
16、素成为可发酵的葡萄糖、 木糖、 阿拉伯糖等糖 ； 同时利用植物纤维作为碳源所产生的部分葡萄糖可以满足纤维素酶 产生菌生存和代谢的需要。 然而， 纤维素酶产生菌不能利用半纤维素降解产生的木糖， 因此 培养液中还剩余大量的糖， 糖积累对于植物纤维降解也产生反馈抑制。而休哈塔假丝酵母 等微生物既可以利用葡萄糖生产乙醇也可以利用木糖高效生产乙醇， 是发酵植物纤维降解 物的优良菌种。在培养体系中加入高产乙醇的微生物如休哈塔假丝酵母进行混合发酵， 休 哈塔假丝酵母等乙醇生产菌直接利用还原糖发酵制备生物乙醇， 同时葡萄糖和木糖等糖的 消耗解除了糖积累对于植物纤维降解的反馈抑制， 提高了植物纤维的利用效率， 。
17、进一步提 高了乙醇的产率。 0023 本发明提供的生物乙醇制备方法成本低。传统的乙醇生产以石油或者蔗糖、 玉米 等为原料 ； 浪费了不可再生的石油资源或者蔗糖、 玉米等粮食资源。 而本发明以可再生的秸 秆等富含纤维素和半纤维素的废弃物为原料， 通过混菌发酵生产乙醇， 实现了秸秆等植物 纤维废弃物的高值转化， 原料来源丰富， 再生循环迅速， 成本低廉， 免去了秸秆等材料酶解 的步骤， 有助于解决能源短缺问题。 0024 本发明提供的生物乙醇制备方法绿色环保。石化工业生产乙醇需要高温高压， 同 时其废水、 废气造成了环境污染。而微生物转化能在水相、 室温和中性 pH 的环境下进行， 无 说 明 书。
18、 CN 102660589 A 4 3/5 页 5 需高压和极端条件， 节省了能源， 避免了石化工业对环境的污染。 具体实施方式 0025 实施例 1 发酵培养基的确定 0026 根据纤维素分解微生物和产油微生物的培养特点， 利用单因素实验、 正交试验等 方法设计混菌发酵培养基配方， 混菌发酵培养基可以同时满足纤维素酶产生菌和乙醇生产 菌两种微生物生长和代谢的需要， 筛选并且设计出发酵培养基如下 ： 0027 （1）培 养 基 ： 9g Na2HPO412H2O， 1.5g KH2PO4， 1.2mg FeNH4-Citrate， 0.34g （NH4） 2SO4， 0.15g 蛋白胨， 0.。
19、15g 酵母提取物， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH 为 4-6 ； 0028 （2） 培养基 ： 2g KH2PO4， 1.4g（NH4） 2SO4， 0.3g MgSO4， 0.3g CaCl2， 0.5g 蛋白胨， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 1000mLH2O ； pH 为 4-6 ； 0029 （。
20、3） 培养基 ： 1g蛋白胨， 2.0g NaNO3， 1.5g K2HPO4， 0.3g CaCl2， 0.3gMgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.5gCoCl2， 1.5g 酵母提取物， H2O 1000mL ； pH 为 4-6 ； 0030 （4） 培养基 ： 3g NaNO3， 1gK2HPO4， 0.5g MgSO47H2O， 0.5g KCl， 0.005g FeSO4 7H2O， 0.0016g MnSO4 H2O， 0.0014g ZnSO4 H2O， 0.002g CoCl2， 100。
21、0mL H2O ； pH为4-6。 0031 实施例 2 发酵条件考察 0032 (1) 菌种的活化 0033 种子液的制备 ： 将黑曲霉 (Aspergillus niger， DSMZ 821) 在 PDA 培养基中 25-30恒温培养 3-5 天制得 0034 乙醇生产菌休哈塔假丝酵母 （Candida shehatae， ATCC34887） 在 YEPD 培养基中 25-30恒温培养 3-5 天制得。 0035 (2) 混菌发酵乙醇方法 0036 分别从菌种混合比例 （黑曲霉 : 休哈塔假丝酵母， 生物量比分别为 1 ： 0.5， 1 ： 1 或 1 ： 2。 ） 、 总接种量、 发。
22、酵温度与发酵初始 pH 值对乙醇得率的影响进行考察， 以确定相关因素 及其影响范围。以单因素实验为基础， 采用正交试验设计对菌种混合比例、 总接种量、 发酵 温度与发酵时间的最佳水平进行研究， 利用响应面分析方法确定最佳发酵条件。 0037 首先采用单因素研究黑曲霉与休哈塔假丝酵母混合发酵甘蔗渣制乙醇的规律， 采 用摇瓶发酵方法液体发酵， 分别考察培养时间、 甘蔗渣 （所采用的甘蔗原料为洗涤除糖之后 的甘蔗渣） 添加量、 初始 PH、 接种量、 磷酸二氢钾、 温度、 转速、 硫酸铵、 装液量对乙醇产量的 影响。 （1） 延迟接入时间 ： 温度 30， 转速 180r/min， 两种菌的接种量分。
23、别为 5ml， 以推迟接 入 0( 所述推迟 0 天即为同时接入 )、 1、 2、 3、 4、 5 天的组合形式接入乙醇生产菌种子液于发 酵液中， 考察乙醇产生菌延迟接入时间对乙醇产量的影响。 （2） 混合培养时间 ： 温度 30， 转速 180r/min， 两种菌的接种量分别为 5ml， 培养时间分别为 1d、 2d、 3d、 4d、 5d、 6d、 7d 的 条件下， 考察不同时间对乙醇产量的影响。 （3） 甘蔗渣添加量 ： 温度 30， 转速 180r/min， 在 50ml 培养基中， 分别接入两种菌， 接种量均为 5ml， 培养时间为 4d， 甘蔗渣添加量分别为 0.1g,0.2g,。
24、0.3g,0.4g,0.5g,0.6g,0.7g,0.8g,0.9g,1.0g 的条件下， 考察不同甘蔗渣添加 说 明 书 CN 102660589 A 5 4/5 页 6 量对乙醇产量的影响。 （4） 培养基 PH ： 温度 30， 转速 180r/min， 两种菌的接种量分别为 5ml， 培养时间为 4d， 初始 PH 分别为 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5.7.0。考察不同初始 PH 对 乙醇产量的影响。 0038 表 1 混菌发酵乙醇条件考察 0039 0040 在单因素的基础上， 然后运用 Plackett-Burman(PB) 法从众多的因素中快速有效 地筛选出对乙。
25、醇产量影响显著的重要因素以做进一步研究。 然后用最陡爬坡路径逼近最大 相应区域， 最后利用响应面法(Response surface methodology,RSM)实验设计进行对显著 因素优化， 最终确定最优实验条件， 并进行验证。 0041 得到发酵最佳工艺条件为 : 菌种体积混合比例为 1:1， 接种量为 5， 发酵温度为 28， 发酵液 pH 值为 5.9, 摇床转速为 100r/min， 装液量 70mL。 0042 实施例 3 生物乙醇的制备 0043 （1） 种子液的制备 ： 将纤维素酶产生菌黑曲霉 (Aspergillus niger， DSMZ 821) 于 PDA 培养基中。
26、恒温培养制得黑曲霉种子液， 将休哈塔假丝酵母 （Candida shehatae， ATCC34887） 于 YEPD 培养基中恒温培养制得休哈塔假丝酵母种子液， 培养温度为 25-30， 培养时间为 3 天。 0044 （2） 将秸秆等植物纤维与黑曲霉种子液于如实施例 1 中所述的培养基 （I） 中恒温 振荡培养 5 天， 黑曲霉种子液的体积为培养基 （I） 体积的 2； 接入休哈塔假丝酵母种子液， 黑曲霉种子液与休哈塔假丝酵母种子液的菌生物量比为 1 ： 0.5， 继续恒温振荡培养 3 天， 培 养温度为 28， 振荡速度为 150r/min ； 说 明 书 CN 102660589 A 。
27、6 5/5 页 7 0045 （2） 过滤发酵液， 滤液减压蒸馏即得生物乙醇， 产率 36.7。 0046 实施例 4 生物乙醇的制备 0047 （1）种子液的制备 ： 将绿色木霉于 PDA 培养基中恒温培养制得康氏木霉 （Trichoderma koningii， CICC 13012） 种子液， 将树干毕赤酵母 （Pichia stipites,CICC 1960） 于 YEPD 培养基中恒温培养制得树干毕赤酵母种子液， 培养温度为 25-30， 培养时间 为 5 天。 0048 （2） 将桑枝等植物纤维与康氏木霉种子液于如实施例 1 中所述的培养基 （II） 中， 康氏木霉种子液的体积为。
28、培养基 （II） 体积的 5 ； 接入树干毕赤酵母种子液， 康氏木霉与 树干毕赤酵母的菌生物量比为 1 ： 2， 恒温振荡培养 5 天， 培养温度为 25-30， 振荡速度为 100-200r/min ； 0049 （2） 过滤发酵液， 滤液减压蒸馏即得生物乙醇， 产率 38.6。 0050 实施例 5 生物乙醇的制备 0051 混合发酵培养在 5L 发酵罐中进行， 发酵培养基 2L， 121灭菌 25min， 冷却至室温 时按 2的接种量先接入黑曲霉种子液， 加入秸秆等植物纤维， 以活化的乙醇产生菌推迟接 入 1d， 2接种量接入休哈塔假丝酵母种子液进行无菌接种。培养温度 28连续发酵培养， 发酵期间， 培养液利用生物传感分析仪直接测定乙醇含量。补料时， 发酵罐停止搅拌， 培养 物静置沉降， 开启蠕动泵从发酵罐中泵出上清液， 将上清液减压蒸馏获得乙醇。发酵 3.6d 获得的秸秆乙醇， 产率为 34.7。 说 明 书 CN 102660589 A 7 。