检测小反刍兽疫病毒的纳米金标记探针及检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102649982 A (43)申请公布日 2012.08.29 CN 102649982 A *CN102649982A* (21)申请号 201210130452.2 (22)申请日 2012.04.27 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 李刚 陶春爱 邱文英 史利军 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 王加岭 (54)。

2、 发明名称 检测小反刍兽疫病毒的纳米金标记探针及检 测试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了一种检测小反刍兽疫病毒 (PPRV) 的纳米金标记探针及检测试剂盒。针对 PPRV N 基因的高度保守区设计两条特异寡核苷 酸探针， 一条探针 5端修饰生物素， 另一条探 针 3端修饰巯基， 其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.3 所示。本发明还提供了利用 纳米金标记寡核苷酸探针检测 PPRV 核酸的方法， 巯基化的探针通过 Au-S 键连接到纳米金颗粒上， 靶核酸两端分别与两条探针结合， 形成杂交复合 物， 通过与固相载体结合、 银染放大信号， 定量检 测靶核酸。本发明的检。

3、测方法核酸最低浓度达 10fmol/L， 该方法灵敏度高， 特异性强， 为临床检 测 PPRV 提供新的方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种用于检测小反刍兽疫病毒的靶核酸， 其具有 SEQ ID NO.1 所示的序列或其特异 性片段。 2. 用于扩增权利要求 1 所述靶核酸的特异性引物。 3. 根据权利要求 2 所述的引物， 其核苷酸序列为 ： PPRV-N115F ： 5 -TCA。

4、TATTTTGACCCGGCCTATTTCC-3， PPRV-N115R ： 5 -GTTTGGCTTCCTCTGCTGTGATAC-3。 4. 与权利要求 1 所述靶核酸配合使用检测小反刍兽疫病毒的探针， 其特征在于， 为两 条特异寡核苷酸探针， 一条探针 5端修饰生物素， 另一条探针 3端修饰巯基。 5. 根据权利要求 4 所述的探针， 其特征在于， 5端修饰生物素的探针其核苷酸序列 为 ： P1-B ： 5 -Biotin-CTCGGACAGGAGATGGTCAGAAGAT-3， 3端修饰巯基的探针其核苷酸序列为 ： P2-G ： 5 -GGTCAGCTCTGTAATCGCGGC(A)1。

5、0SH-3。 6. 一种用于检测小反刍兽疫病毒核酸的纳米金标记的核酸探针， 其特征在于， 核苷酸 序列为 ： P2-G ： 5 -GGTCAGCTCTGTAATCGCGGC(A)10SH-3， 该巯基化探针通过 Au-S 键连接到纳 米金颗粒上。 7. 一种纳米金标记的核酸探针检测小反刍兽疫病毒核酸的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： 1)用权利要求2或3所述的引物对样品进行RT-PCR扩增， 将扩增产物加入杂交缓冲液 中， 95变性 5min， 冰上放置 3-5min ； 2) 加入权利要求 4 或 5 所述的生物素修饰的探针， 42反应 15min ； 3) 加入权利要求 6 所述的。

6、纳米金核酸探针， 42杂交孵育 15min ； 4) 将杂交产物加入包被亲和素的酶标板， 37湿盒孵育 30min， PBST 缓冲液冲洗， 拍 干 ； 5) 酶标板每孔加入银染液， 避光反应 12-15min ； 6) 酶标板置于超纯水中终止反应， 测定 OD630， 绘制标准曲线， 进行结果判定。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 5) 的银染液， 其配置方法为 ： 质量体积比为 1的明胶 ： 0.52mol/L 氢醌 ： pH3.5 柠檬酸缓冲液 ： 0.15mol/LAgNO3溶液 6 3 1 2， 所述比例为体积比， 先将前三者混合， 银染前再加入所述的 。

7、AgNO3溶液。 9. 含有权利要求 2 或 3 所述引物和 / 或权利要求 4 或 5 所述探针的试剂盒。 10. 权利要求 2 或 3 所述引物和 / 或权利要求 4 或 5 所述探针在制备检测小反刍兽疫 病毒试剂盒或检测试剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102649982 A 2 1/7 页 3 检测小反刍兽疫病毒的纳米金标记探针及检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学领域， 特别是涉及用于检测小反刍兽疫病毒的靶核酸， 扩 增靶核酸的引物， 用纳米金标记的核酸探针检测靶核酸的方法及检测试剂盒。 背景技术 0002 小反刍兽疫 (Peste des petits ru。

8、minants， PPR) 是由小反刍兽疫病毒 (Peste des petits ruminants virus， PPRV) 引起的一种严重的烈性、 接触性传染病， 主要感染动 物为小反刍兽， 其中山羊高度易感。PPRV 是副粘病毒科 (Paramyxoviridae) 麻疹病毒属 (Morbillivirus) 成员。该病毒共有 4 个群， 1 种血清型。PPRV 基因组为单股负链无节段 RNA， 从 3至 5端依次是 N-P-M-F-H-L 6 个基因， 分别编码 6 种结构蛋白 (N、 P、 M、 F、 H、 L) 和 2 种非结构蛋白 (C 和 V)。目前， 检测 PPRV 的方法。

9、主要有琼脂糖凝胶扩散实验 (AGlD)、 间接免疫荧光抗体试验(IFAT)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)、 聚合酶链式反应(PCR)及环介 导等温扩增实验 (LAMP) 等， 而还未见关于结合纳米金标记核酸探针检测该病毒的核酸的 报道。 0003 纳米金是一种新兴的生物材料， 其直径为 1 100nm， 具有较大的比表面积、 较强 的化学反应活性及尺寸量子效应， 能与核酸、 蛋白质等生物分子起特殊作用， 且不影响它们 的活性， 因而在分子生物学领域得到广泛使用。在纳米金颗粒上连接寡核苷酸探针检测核 酸的技术最早由美国 Mirkin 等人报道。该研究组把探针标记到纳米金颗粒上， 使纳米金与 。

10、靶核酸形成超分子结构， 从而引起溶液颜色变化， 由此达到可视化定性和定量地检测核酸 的目的。近几年， 纳米金主要用于基因芯片、 斑点杂交、 电化学检测、 靶向药物的研究， 是研 究质量信号放大、 生物条码放大、 生物分子的细胞定位等的理想材料。 0004 目前小反刍兽疫病毒核酸普遍的检测方法主要是 PCR， 并用琼脂糖凝胶电泳鉴定 扩增产物的有无， 从而判断样品是否含该病毒。 而琼脂糖凝胶电泳分辨能力有限， 在扩增产 量较低的情况下， 有可能无法显示。另外， 对于扩增片段在 250bp 以下的短片段， 还容易受 到引物二聚体的干扰， 造成假阳性。另一种检测该病毒核酸的新方法为环介导等温扩增实 。

11、验(LAMP)， 而目前， 在技术尚未十分成熟， 容易产生假阴性。 为了提高PPRV核酸检测结果判 定的精确性及可靠性， 本发明以银染为放大信号系统， 在一定程度上丰富和补充了 PPRV 核 酸检测的方法内容。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供用于检测小反刍兽疫病毒 (PPRV) 的纳米金标记核酸探针 以及利用该探针检测小反刍兽疫病毒核酸的方法。 0006 本发明的另一目的在于提供一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒。 0007 本发明提供了用于检测小反刍兽疫病毒的靶核酸片段， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。 此外， 本领域技术人员应当理解， 该序列的特异性片段也可以作为检测小。

12、反刍兽 疫病毒的靶核酸。 说 明 书 CN 102649982 A 3 2/7 页 4 0008 进一步， 本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物。 0009 在本发明的一个实施方式中， 优选的引物序列为 ： 0010 PPRV-N115F ： 5 -TCATATTTTGACCCGGCCTATTTCC-3 (SEQ ID NO.4) 0011 PPRV-N115R ： 5 -GTTTGGCTTCCTCTGCTGTGATAC-3 (SEQ ID NO.5)。 0012 本发明提供了与 SEQ ID NO.1 所示的靶核酸配合使用检测小反刍兽疫病毒的探 针， 为两条特异寡核苷酸探针， 一条探针。

13、 5端修饰生物素， 另一条探针 3端修饰巯基。 0013 本发明实施例中使用的探针， 是为减少探针与纳米金颗粒偶联的空间位阻， 在巯 基修饰探针的 3端加 polyA。 0014 本发明优选的 5端修饰生物素的探针其核苷酸序列为 ： 0015 P1-B ： 5 -Biotin-CTCGGACAGGAGATGGTCAGAAGAT-3 (SEQ ID NO.2)。 0016 优选的 3端修饰巯基的探针其核苷酸序列为 ： 0017 P2-G ： 5 -GGTCAGCTCTGTAATCGCGGC(A)10SH-3 (SEQ ID NO.3)。 0018 本发明提供一种用于检测小反刍兽疫病毒核酸的纳米金。

14、标记的核酸探针， 其探针 核苷酸序列为 ： 0019 P2-G ： 5 -GGTCAGCTCTGTAATCGCGGC(A)10SH-3 (SEQ ID NO.3)， 该巯基化探针通 过 Au-S 键连接到纳米金颗粒上。 0020 本发明提供利用一种纳米金标记的核酸探针检测小反刍兽疫病毒核酸的方法， 包 括以下步骤 ： 0021 (1) 用本发明提供的引物对待测样品进行 RT-PCR 扩增， 将扩增产物和标准阳性双 链 DNA 片段分别加入杂交缓冲液中， 95变性 5min， 冰上放置 3-5min ； 0022 (2) 加入本发明的 5端修饰生物素的探针， 42反应 15min ； 0023 。

15、(3) 加入本发明提供的纳米金核酸探针， 42杂交孵育 15min ； 0024 (4) 将杂交产物加入包被链霉亲和素的酶标板， 37湿盒孵育 30min， PBST 缓冲液 冲洗， 拍干 ； 0025 (5) 酶标板每孔加入银染液， 避光反应 12-15min ； 0026 (6) 酶标板置于超纯水中终止反应， 测定标准品的 OD630， 绘制标准曲线， 判定结 果。 0027 其中， 步骤 (1) 优选引物为 ： 0028 PPRV-N115F ： 5 -TCATATTTTGACCCGGCCTATTTCC-3 0029 PPRV-N115R ： 5 -GTTTGGCTTCCTCTGCTGT。

16、GATAC-3 0030 其中， 步骤 (5) 优选的银染时间为 15min。 0031 所述步骤 (5) 的银染液， 其配置方法为 ： 质量体积比为 1的明胶 ： 0.52mol/L 氢 醌 ： pH 3.5 柠檬酸缓冲液 ： 0.15mol/L AgNO3溶液 6 3 1 2， 所述比例为体积比， 先 将前三者混合， 银染前再加入 AgNO3溶液。 0032 所述柠檬酸缓冲液配制方法为称取柠檬酸钠2.35g及柠檬钠2.55g， 溶解于约7mL 超纯水中， 完全溶解后定容至 10mL， 其 pH 为 3.5。该溶液需现配现用。 0033 所述步骤 (6)， 标准曲线的具体绘制方法为 ： 1.。

17、 根据已知浓度的标准 N115bp 靶核 酸 (SEQ ID No.1) 用 ddH2O 连续倍比稀释 9 次， 得到浓度为 1mol/L、 100nmol/L、 10nmol/ L、 1nmol/L、 100pmol/L、 10pmol/L、 1pmol/L、 100fmol/L、 10fmol/L 的标准液， 按照本发明的 说 明 书 CN 102649982 A 4 3/7 页 5 反应条件进行实验， 测定 OD630， 并绘制标准曲线。 0034 2.取经RT-PCR后的产物， 根据本发明的反应条件进行操作， 测定其OD630， 结合标 准曲线计算所测 RT-PCR 产物的浓度。 00。

18、35 本发明提供一种检测小反刍兽疫病毒核酸是试剂盒， 含有本发明所提供的引物和 探针。 0036 本发明提供的试剂盒， 含有的引物其序列为 ： 0037 PPRV-N115F ： 5 -TCATATTTTGACCCGGCCTATTTCC-3 0038 PPRV-N115R ： 5 -GTTTGGCTTCCTCTGCTGTGATAC-3。 0039 含有的探针为纳米金标记的核酸探针和 5端生物素修饰的探针， 0040 纳米金标记的探针核苷酸序列为 ： 0041 P2-G ： 5 -GGTCAGCTCTGTAATCGCGGC(A)10SH-3 ； 生物素修 0042 饰的探针序列为 ： 0043 。

19、P1-B ： 5 -Biotin-CTCGGACAGGAGATGGTCAGAAGAT-3。 0044 本发明还提供了上述引物和探针在制备检测小反刍兽疫病毒试剂盒或检测试剂 中的应用。 0045 本发明提供的检测小反刍兽疫病毒的靶核酸和配套使用的两条探针， 一条探针 5端修饰生物素， 另一条探针 3端修饰巯基， 巯基化的探针通过 Au-S 键连接到纳米金颗 粒上， 靶核酸两端分别与两条探针结合， 形成杂交复合物， 利用生物素 - 亲和素结合的高效 性与特异性， 通过与固相载体结合、 银染放大信号， 对PPRV N基因核酸片段进行可视化半定 量检测研究。本发明的检测方法核酸最低浓度达 10fmol。

20、/L， 所需时间约为 1.5h， 该方法灵 敏度高， 特异性强， 稳定性、 重复性较好， 操作简单， 为临床检测 PPRV 提供新的方法。 附图说明 0046 图1为纳米金颗粒标记探针前后的透射电子显微镜图， 其中图1A为探针标记前的 纳米金颗粒， 图 1B 为标记探针后的纳米金颗粒。 0047 图 2 为纳米金溶液标记探针前后波长扫描曲线图， 虚线为未标记探针的纳米金颗 粒吸光值， 实线为标记探针的纳米金颗粒吸光值， 分别在 520nm、 524nm 处达到最高吸光光 度值。 0048 图 3 银染结果， 其中 S 为靶核酸浓度为 1nmol/L 的样品组， C 为对照组。 0049 图 4。

21、 光学显微镜观察银染效果 400， A 为对照组， B 为靶核酸浓度为 1nmol/L 的 样品组。 0050 图 5 不同杂交温度对银染结果的影响。 0051 图 6 不同杂交时间对银染结果的影响。 0052 图 7 特异性分析 1. 正常组 2. 无靶核酸 3. 无纳米金探针 4. 含碱基突变的核酸片 段。 0053 图 8 不同银染时间对银染结果的影响。 0054 图 9 靶核酸浓度对检测结果的影响。靶核酸浓度 1 5 100pmol/L、 10pmol/L、 1pmol/L、 100fmol/L、 10fmol/L。 0055 图 10 靶核酸电泳结果， M:DNA Marker 靶核。

22、酸浓度 1 3 1mol/L、 100nmol/L、 说 明 书 CN 102649982 A 5 4/7 页 6 10nmol/L。 具体实施方式 0056 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0057 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0058 本发明所用的试剂和仪器如下 ： PPRV Nigeria75/1毒株(GeneBank ： X74443.2)由 本实验室保存。Taq DNA 聚合酶、 M-MLV 反转录酶。

23、、 dNTPs 为 Takara 公司产品。RNA 提取试 剂盒为 Axygen 公司产品。氢醌 (Hydroquinone) 为 Amerisco 公司产品。氯金酸 (HAuCl4)、 链霉亲和素、 明胶、 AgNO3、 柠檬酸、 柠檬酸钠及其他试剂均为国产分析纯。Milli-Q 超 纯水 (18.3M.cm-1)。紫外 - 可见光分光光度计 (DU800， Beckman)， 透射电子显微镜 (Transmission Electron Microscope， TEM， TECHAI210， PHILIPS)。 0059 实施例 1 检测 PPRV 靶序列的确定、 引物和探针的设计与合成 。

24、0060 参 考 NCBI 已 公 布 的 PPRV Nigeria75/1(GenBank ： X74443.2) 及 其 他 毒 株 (HQ197753.1、 EU267274.1、 AJ849636.2、 FJ905304.1、 AJ563705.1) 的基因序列， 在 PPRV N 基因保守区发现用于检测小反刍兽疫病毒的靶核酸片段， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所 示。根据该靶序列设计扩增其的特异性引物 ： 0061 PPRV-N115F ： 5-TCATATTTTGACCCGGCCTATTTCC-3(SEQ ID NO.2)， PPRV-N115R ： 5 -GTTTGG。

25、CTTCCTCTGCTGTGATAC-3 0062 (SEQ ID NO.3)。 0063 两条特异的探针序列 ： P1-B ： 5 -Biotin-CTCGGACAGGAGATGGT CAGAAGAT-3 (SEQ ID NO.4)， P2-G ： 5 -GGTCAGCTCTGTAATC GCGGC(A)10SH-3 (SEQ ID NO.5)。 0064 提取PPR病毒总RNA， 反转录PCR获得PPRV N基因高度保守区序列115bp片段， 核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 其中中间部分(5-CTCGGACAGGAGATGGTCAGAAGATCTGCAGGA AAGGTCAGC。

26、TCTGTAATCGCGGC-3)为探针识别区域。 引物和探针由上海生工生物工程公司合 成。将上述 RT-PCR 产物回收纯化， 得到靶核酸， 4保存备用。 0065 实施例 2 纳米金标记核酸探针的制备 0066 1、 纳米金的制备及表征 0067 按照赵立凡等人 ( 赵立凡， 李柏生， 黑笑涵， 等 . 银染增强的纳米金探针技术检测 微量核酸 . 中国生物化学与分子生物学报 .2006(11) ： 919-923.) 的方法， 制备颗粒直径为 13 15nm 的纳米金溶液。4避光保存。用透射电子显微镜观察纳米金颗粒形态及大小 ( 加速电压 120KV)。按照 Georganopoulou 。

27、等人 (Georganopoulou， D.G.， Chang， L.， Nam， J.M.， et al.Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer s disease.Proc Natl Acad Sci USA.2005， 102(7) ： 2273-2276.) 报道的方法计算纳米金溶液的浓度。由公式 0068 A bc 及系数 0069 得 OD520 0.32， 本发明制备的纳米金溶液浓度为 1.2nmol/L。 说 明 书。

28、 CN 102649982 A 6 5/7 页 7 0070 2、 纳米金与巯基化探针的连接 0071 根据赵立凡等人 ( 赵立凡， 李柏生， 黑笑涵， 等 . 银染增强的纳米金探针技术检测 微量核酸 . 中国生物化学与分子生物学报 .2006(11) ： 919-923.) 的报道， 取上述制备得到 的纳米金溶液 1ml， 于 4、 12000r/min 离心 10min。将上清转移至另一 EP 管， 4、 14000r/ min离心20min， 弃上清， 用97l ddH2O重悬沉淀， 加入3l 100mol/L巯基化探针P2-G， 序列为 0072 P2-G ： 5 -GGTCAGCTC。

29、TGTAATCGCGGC(A)10SH-3， 充分混匀室温避光条件下， 80r/ min 轻轻振荡 16h。加入 100l 含 20mmol/LpH7.0 磷酸盐缓冲液 (PB) 和 0.2mol/L NaCl 的混合液， 充分混匀。静置 48h， 吸取上清， 4、 14000r/min 离心 15min， 以收集纳米金颗 粒。弃上清， 用 100l 超纯水重悬红色油状沉淀， 4、 14000r/min 离心 20min， 弃上清， 以去除多余的寡核苷酸探针。最后用 100l 含 0.3mol/L NaCl 和 10mmol/L PB(pH7.0) 的混合液重悬沉淀， 4避光保存。根据现有技术。

30、可知， 每个 13nm 纳米金颗粒上大约标记 220 条巯基修饰的单链 DNA(Yang， M.and C.Wang， Label-free immunosensor based on gold nanoparticle silver enhancement.Anal Biochem.2009， 385(1) ： 128-1319&Wang， Y.F.， Pang， D.W.， Zhang， Z.L.， et al.Visual gene diagnosis of HBV and HCV based on nanoparticleprobe)。 0073 3、 纳米金颗粒表征 0074 透射电。

31、子显微镜 (TEM) 观察纳米金颗粒形貌及大小表明， 颗粒大小约为 13 15nm( 见图 1A)。未连接探针的纳米金颗粒周围界面清晰， 而连接探针的纳米金颗粒周围形 成一层疏水区， 颗粒间稳定性依然存在 ( 见图 1B)。用紫外分光光度计进行 400 600nm 波 长扫描， 纳米金溶液在 520nm 处具有最高吸光光度值。连接巯基化探针后， 纳米金颗粒体积 增大， 出现波长红移现象， 最高最高吸光光度值上升至 524nm( 见图 2)。 0075 实施例 3 纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫病毒方法的建立 0076 1、 杂交反应 0077 取实施例1制得的10l 1nmol/L靶核酸溶液。

32、， 加入20l杂交缓冲液(缓冲液组 分为20mmol/LPB， 0.3mol/L NaCl， 0.01SDS)， 95变性5min， 冰上放置5min。 加入20l 100nmol/L 生物素化探针 P1-B， 序列为 0078 P1-B ： 5 -Biotin-CTCGGACAGGAGATGGTCAGAAGAT-3， 42反应 15min。接着加 入10l实施例2制得的纳米金核酸探针， 42孵育15min。 将杂交产物加到已包被链霉亲 和素的酶标板 ( 链霉亲和素 10g/ml， 每孔包被 100l)。置于湿盒中， 37孵育 30min。 PBST 洗 3 次， 拍干。每孔加 100l 银染。

33、液 (1 (w/v) 明胶 ： 0.52mol/L 氢醌 ： pH 3.5 柠檬 酸缓冲液 ： 0.15mol/LAgNO3溶液 6 3 1 2( 体积比 )， 先将前三者混合， 银染前再加 入 AgNO3溶液 )， 避光反应 15min。柠檬酸缓冲液配制方法是称取柠檬酸钠 2.35g 及柠檬钠 2.55g， 溶解于约 7mL 超纯水中， 完全溶解后定容至 10mL， 其 pH 约为 3.5。将酶标板置超纯 水中终止反应， 测定波长为 630nm 处的吸光光度值。并用倒置光学显微镜观察银颗粒聚集 复合物。 0079 银染后的洗涤对结果观察影响较大。 银染结束后实验组与空白组均形成较深的沉 淀，。

34、 将酶标板置于超纯水中终止反应。 空白组的非特异性沉淀物可以洗去， 而实验组的银颗 粒粘附牢固， 即使清洗动作幅度大， 也不会被洗去。 该部分要求尽量洗去粘附不牢固的沉淀 说 明 书 CN 102649982 A 7 6/7 页 8 物。 0080 2、 银染效果 0081 肉眼可以看到空白组无灰色层 ( 见图 3)， 实验组由于大量银颗粒聚集， 出现灰色 覆盖物。普通倒置光学显微镜下清晰看到银颗粒聚集 ( 见图 4)， 且分散均匀。 0082 3、 检测结果的判定 0083 1. 根据已知标准浓度的 N115bp 靶核酸用 ddH2O 连续倍比稀释 9 次， 得到浓度 为 1mol/L、 1。

35、00nmol/L、 10nmol/L、 1nmol/L、 100pmol/L、 10pmol/L、 1pmol/L、 100fmol/L、 10fmol/L 的标准液， 按照本发明的反应条件进行实验， 测定 OD630， 并绘制标准曲线。 0084 2.取经RT-PCR后的产物， 根据本发明的反应条件进行操作， 测定其OD630， 结合标 准曲线计算所测 RT-PCR 产物的浓度。 0085 实施例 4 纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫病毒方法的条件优化与特性评价 0086 1、 反应条件优化试验 0087 1.1 探针与靶核酸杂交温度及时间设 25、 37、 42 3 个杂交温度， 杂交反应。

36、 15min。 结果见表1， 用方差分析进行统计学分析， OD630在25、 37、 42不同温度下三者 之间的差异有统计学意义 (P 0.05)， OD630 在 25、 37、 60不同温度下三者之间的差 异不显著(P0.05)， OD630在42、 60之间的差异显著(P0.05)， 而由于42时银染 灰度最深， 其OD630值最高(图5)， 并且温度比60更易达到， 因此后续试验以42为杂交 温度。分别以 10min、 15min、 30min、 45min、 60min 为生物素化探针与靶核酸的杂交时间， 结 果见表 2， 杂交反应为 15min 的 OD630 值与杂交反应 10m。

37、in、 60min 的差异显著 (P 0.05)， 与 30min、 45min 的差异不显著 (P 0.05)， 但是由于 15min 下的 OD630 值最高 ( 图 6)， 并 且所需时间较少， 因此选择最佳杂交时间为 15min。 0088 表 1 不同杂交温度的 0D630 及 LSD 法多重比较 0089 0090 不同字母代表差异显著。 0091 表 2 不同杂交时间的 OD630 及 LSD 法多重比较 0092 0093 不同字母代表差异显著。 0094 1.2 银染显色时间 0095 分别设定 6min、 8min、 10min、 12min、 14min、 16min、 。

38、18min7 个银染时间。结果 ： 在 6 12min， 所测的 OD630 上升缓慢， Ag+ 被还原成 Ag， 15min 以后， 生成的 Ag 增多， 并附着 在纳米金上， 这些新生成的银颗粒又促进 Ag 的形成。此时， 空白组的 OD630 也呈上升趋势， 说 明 书 CN 102649982 A 8 7/7 页 9 说明非特异性增加。经多次平行试验确定 12 15min 为最佳银染时间。 0096 2、 特性评价 0097 2.1 特异性分析进行无靶核酸、 含碱基突变的核酸片段、 无 P1B、 无 Au-P2G、 只加靶 核酸、 只加 P1B、 只加 Au-P2G 等实验， 观察银染。

39、灰度变化及 OD630。结果显示， 在缺少靶核酸 序列、 含碱基突变的核酸片段、 纳米金探针及只加入生物素化探针条件下， 各组的 OD630 明 显降低。( 见图 7)。SAS 统计软件进行方差分析， 得出 P 0.05， 说明差异显著。该结果与 赵立凡等人 ( 赵立凡， 李柏生， 黑笑涵， 等 . 银染增强的纳米金探针技术检测微量核酸 . 中 国生物化学与分子生物学报 .2006(11) ： 919-923.) 报道的一致。 0098 2.2重复性及结果稳定性分析相同实验条件的操作重复3次以上， 所测得的OD630 变异系数 CV 在 10左右， 表明该方法重复性较好。银染后的酶标板在室温常。

40、光下放置 90 天， 孔的灰度无明显变化。 用SAS统计软件对银染刚结束和90天后的OD630进行方差分析， 得出 P 0.05， 表明其 OD630 与银染刚结束差异不显著。说明银染后的结果稳定性较好。 0099 表 3 重复性分析 0100 0101 2.3 双链靶核酸灵敏度检测梯度稀释靶核酸， 以不加入靶核酸为阴性对照， 以杂交 液孵育为空白对照。靶核酸浓度在 100pmol/L 至 10fmol/L 之间， OD630 与靶核酸浓度呈良 好的线性关系 ( 图 8)， 回归方程 ： y -0.0284x+0.404， 相关系数 R2 0.994。靶核酸浓度 低于 10fmol/L， 样品。

41、组与对照组的 OD630 难以区别。PCR 产物用 1.5琼脂糖凝胶电泳， 可 以辨别浓度 100nmol/L 以上的靶核酸 ( 图 9)。通过比较可以看出， 该方法的灵敏度比用琼 脂糖凝胶电泳提高 104倍以上。 0102 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102649982 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102649982 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 102649982 A 11 1/3 页 12 图 1A图 1B 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102649982 A 12 2/3 页 13 图 4A图 4B 图 5 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102649982 A 13 3/3 页 14 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102649982 A 14 。