治疗基底细胞样基因型癌症 相关申请的交叉引用
本申请要求 2009 年 11 月 5 日提交的美国临时申请 No.61/258,274 的权益， 其全 部内容以引用的方式并入本文。
背景
三阴性乳腺癌 (TNBC) 代表相当比例 ( 约 20-25％ ) 的乳腺癌患者。TNBC 以缺乏 HER2、 雌激素受体 (ER) 和孕酮受体 (PR) 为特征。 TNBC 具有不良预后， 并且迄今没有发现治 疗的靶向途径。
概述
提供了治疗患有癌症的受治疗者的方法。 所述方法包括选择患有乳腺癌的受治疗 者， 其中乳腺癌是基底细胞样基因型癌症并且其中乳腺癌是 HER2 非扩增的， 和对受治疗者 施用死亡受体激动剂。
任选地， 所述方法包括选择患有乳腺癌的受治疗者， 其中乳腺癌具有选自由管腔 细胞、 HER2 扩增的或基底细胞样基因型组成的组的一种或多种特征 ； 对受治疗者施用 IAP 抑制剂 ； 和对受治疗者施用死亡受体激动剂。
也提供筛选乳腺癌细胞对 DR5 激动剂的反应性的方法。所述方法包括检测癌细胞 中的基底细胞样表型 ； 检测癌细胞是 HER2 非扩增的 ； 和检测与对照相比癌细胞中降低水平 的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。
也提供筛选三阴性乳腺癌细胞对 DR5 激动剂的反应性的方法。任选地， 所述方法 包括检测细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的水平并将其与对照进行比较。与对照相比， 细 胞中较低水平的复合物表明反应性。
任选地， 所述方法包括检测乳腺癌细胞中缺乏 N 端半胱天冬酶相关募集结构域 (CARD) 的 DDX3。缺乏 N 端 CARD 的 DDX3 表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂有反应性。
任选地， 所述方法包括检测乳腺癌细胞中包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列的 IAP 蛋白。80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂没有反应性。
还提供与 DDX3 的 N 端 CARD 选择性结合的抗体。也提供与缺乏 N 端 CARD 的 DDX3 选择性结合的抗体。也提供与包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 的 IAP 蛋白选择性 结合的抗体。
附图描述
图 1 示出显示用 TRA-8 处理后三阴性乳腺癌细胞系经历细胞凋亡的图。在体外用 TRA-8 处理三阴性乳腺癌细胞系 24 小时。 使用基于荧光素酶的测定来测定细胞成活力以测 量 ATP 水平。相对于未处理的对照细胞， 将值表示为平均值和标准差 (n ＝ 6 次重复 )。
图 2A 和 2B 示出用 TRA-8 和化学治疗药物的组合的处理引起对基底细胞 A 和基底 细胞 B 乳腺癌细胞系的附加或协同作用。图 2A 示出显示用 TRA-8 抗体和化学治疗剂 ( 顺 铂、 卡铂和阿霉素 ) 的组合处理的三阴性基底细胞 B SUM159 乳腺癌细胞中增加的细胞凋亡 的图。图 2B 示出显示用 TRA-8 抗体和化学治疗剂 ( 顺铂、 卡铂和阿霉素 ) 的组合处理的 三阴性上皮基底细胞 A HCC1937 乳腺癌细胞中增加的细胞凋亡的图。用化学治疗剂预处
理 SUM159 和 HCC1937 乳腺癌细胞 24 小时并且然后用 TRA-8 抗体再处理 24 小时。用单独 TRA-8 抗体、 单独化学治疗化合物或用 TRA-8 加化学治疗化合物的组合处理细胞。 通过测量 ATP 水平来测定细胞成活力。将值表示为平均值和标准差 (n ＝ 4 次重复 )。
图 3 示出 DR5/DDX3/IAP 细胞凋亡抑制性复合物的模型。
图 4 示出 DDX3 的 siRNA 介导的敲低逆转对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性。图 4A 示 出蛋白质印迹的图像， 其显示用针对 DDX3 mRNA 的 siRNA 处理的细胞中降低的 DDX3 蛋白表 达。图 4B 示出显示用 TRA-8 抗体处理的 DDX3 表达降低的细胞中增加的细胞凋亡的图。
图 5 示出 DR5 缔合的 DDX3 通过 DDX3 CARD 募集 cIAP1 并且抑制细胞凋亡。图 5A 示出蛋白质印迹的图像， 其显示全长 DDX3 通过向 DR5 募集 cIAP1 来抑制细胞凋亡。如通过 FADD 募集所示， 用 TRA-8 处理后， 表达 CARD 截短的 DDX3(DN) 的细胞已恢复死亡结构域诱 导信号复合物 (DISC) 功能。图 5B 示出显示表达缺乏 CARD 的 DDX3 的 DR5 抗性肿瘤细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡变得更加敏感。
图 6 示出可在 TRA-8 敏感和抗性细胞中定量的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。图 6A 示 出显示 TRA-8 敏感 MDA231P 和 UL-3CP 细胞系中 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 低于 TRA-8 抗性 MDA231R 和 UL-3CR 细胞系的图。图 6B 示出显示与一组 TRA-8 敏感细胞系相比， TRA-8 抗性 细胞系表达较高水平的 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 蛋白的柱形图。 图 7 示出三阴性和非三阴性乳腺癌细胞系中 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的差异。图 7A 示出显示三阴性乳腺癌细胞系 (SUM149、 SUM159、 SUM102、 2LMP、 HCC38、 BT20) 中 DR5 缔合 的 DDX3 和 cIAP1 较低的图。图 7B 示出蛋白质印迹的图像， 其显示在一些三阴性乳腺癌细 胞系中， 由于 N 端 CARD 的丧失， 与 DR5 共免疫沉淀的 DDX3 的分子量低于非三阴性乳腺癌细 胞系。
图 8 示出识别杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 的新型抗体 (3H4) 的特征。 图 8A 示出 3H4 与 cIAP1、 cIAP2、 XIAP 和生存素 (survivin) 的结合特征。图 8B 示出被 3H4 识别的共用 表位的序列。 上部序列是 cIAP1(SEQ ID NO ： 31) 的第二 BIR 结构域 ； 中间序列是 cIAP2(SEQ ID NO ： 32) 的第二 BIR 结构域 ； 底部序列是 XIAP(SEQ ID NO ： 33) 的第二 BIR 结构域。 图 8C 示出用 3H4 对来自一组人胰腺癌细胞系的全细胞裂解物进行的蛋白质印迹分析。泳道 1 ： MIAcapa ； 2： BXPC3 ； 3： Panc 1 ； 4： Panc 2.03 ； 5 S2013 ； 6： S2VP10。
图 9 示出 DDX3/IAP 复合物中 IAP 的下调。图 9A 示出用 AT-406 和 TRA-8 组合处 理下调 DR5 细胞凋亡抗性胰腺细胞中 IAP 蛋白的表达。用对照介质 ( 泳道 1) 或 1000ng/ ml TRA-8( 泳道 2)， 或 10uM AT406( 泳道 3) 或两者 ( 泳道 4) 处理两种人胰腺癌细胞系， S2013( 左图 ) 和 S2VP10( 右图 )， 过夜。通过使用 3H4 抗体的蛋白质印迹分析全细胞裂解 物中的 IAP 蛋白。图 9B 示出 DDX3 复合物中的 IAP 蛋白。使来自以上处理细胞的细胞裂解 物与抗 DDX3 抗体 ( 克隆 3E4) 免疫沉淀。对沉淀的蛋白质进行免疫印迹并且用 3H4 抗体检 测 IAP 蛋白。
图 10 示出 AT-406 对乳腺癌细胞系中 IAP 的体外作用。介用对照质 ( 泳道 1) 或 1000ng/ml TRA-8( 泳道 2) 或 10uM AT406( 泳道 3) 或两者 ( 泳道 4) 处理人乳腺癌细胞系 (MB436 和 2LMP( 图 10A)、 SUM159 和 SUM149( 图 10B)、 BT474 和 MB468( 图 10C)， 过夜。使来 自处理细胞的细胞裂解物与抗 DDX3 抗体 ( 克隆 3E4) 免疫沉淀。对沉淀的蛋白质进行免疫 印迹并且用 3H4 抗体检测 IAP 蛋白。
图 11 示出通过 TRA-8 和 AT406 处理的组合治疗产生的细胞毒性。用 AT-406 处理 细胞 1 小时， 然后用 TRA-8 和 AT-406 处理 24 小时。在加入 TRA-8 后 24 小时通过测量 ATP 水平来测定细胞成活力。
图 12 示出与阿霉素组合， AT-406 增强 TRA-8 体外细胞毒性。TRA-8、 AT-406 和阿 霉素以单独药剂使用或组合使用。在 AT-406 之前 24 小时加入阿霉素， 且在 AT-406 之后 1 小时加入 TRA-8。在加入 TRA-8 后 24 小时通过测量 ATP 水平来测定细胞成活力。
图 13 示出针对无胸腺裸小鼠中原位基底细胞 B 异种移植物的单独 TRA-8 或与白 蛋白结合型紫杉醇 (Abraxane) 或阿霉素 (Adriamycin) 组合的体内功效。将 SUM159( 图 13A) 或 2LMP( 图 13B) 细胞植入乳腺脂肪垫中， 并且在肿瘤被充分建立时， 14 天后开始治 疗。箭头指示施用抗体的间隔 (n ＝ 9-10 只小鼠 / 组 )。
图 14 示出针对无胸腺裸小鼠中 2LMP 原位基底细胞 B 异种移植物的 TRA-8 或白蛋 白结合型紫杉醇与 AT-406 组合的体内功效。将 2LMP 细胞植入乳腺脂肪垫中， 并且在肿瘤 被充分建立时， 10 天后开始治疗。条形指示施用抗体的间隔 (n ＝ 10 只小鼠 / 组 )。
详细描述
本文提供治疗患有癌症的受治疗者的方法。 所述方法包括选择患有乳腺癌的受治 疗者， 其中乳腺癌是基底细胞样基因型癌症并且其中乳腺癌是 HER2 扩增的 ； 和对受治疗者 施用死亡受体激动剂。任选地， 死亡受体激动剂是 DR5 激动剂。任选地， DR5 激动剂是抗体。 任选地， 死亡受体激动剂以三周、 两周或一周的间隔施用。
所述方法可以例如包括选择患有乳腺癌的受治疗者， 其中乳腺癌具有选自由管腔 细胞、 HER2 扩增的或基底细胞样基因型组成的组的一种或多种特征 ； 对受治疗者施用 IAP 抑制剂 ； 和对受治疗者施用死亡受体激动剂。任选地， IAP 抑制剂是 AT-406。
任选地， 所述方法还包括对受治疗者施用化学治疗剂。 任选地， 化学治疗剂是每三 周静脉内施用。 任选地， 化学治疗剂选自由阿霉素、 紫杉醇、 白蛋白结合型紫杉醇、 顺铂和卡 铂组成的组。
乳腺癌可以例如是雌激素受体阴性 (ER 阴性 )、 孕酮受体阴性 (PR 阴性 ) 或 ER 阴 性和 PR 阴性二者。任选地， 与对照相比， 乳腺癌显示降低水平的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。 任选地， 乳腺癌包含缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3。例如， 缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 具 有截短的或缺失的 N 端 CARD。可选地， 缺乏功能性 CARD 的 DDX3 具有在 N 端 CARD 的突变。
任选地， 在不存在死亡受体激动剂的情况下， 乳腺癌对化学治疗剂有抗性。 乳腺癌 可例如对阿霉素有抗性。任选地， 乳腺癌对紫杉醇有抗性。任选地， 乳腺癌对顺铂或卡铂有 抗性。
诱导肿瘤细胞的死亡受体介导的细胞凋亡是对癌症治疗有希望的方法。因为在 大多数 ( 如果不是全部 ) 治疗中， 所以一些靶细胞是有抗性的。例如， TRA-8 是唯一的竞争 性单克隆抗 DR5 抗体， 其诱导人癌细胞的细胞凋亡而没有肝细胞细胞毒性 (Ichikawa 等， Nat.Med.7 ： 954-960(2001))， 在动物模型中表现强抗癌功效 (Buchsbaum 等， Clin.Cancer Res.9 ： 3731-3741(2003)) 且在非人灵长类的毒性研究中具有已证明的安全性。因此， TRA-8 在本文用作实例， 但可在本文教导的方法中使用通过死亡受体 ( 例如， DR4 或 DR5) 激活而诱导细胞凋亡的其它药剂。虽然 TRA-8 与其人源化和人形式作为抗癌疗法正处于 临床开发， 但是尽管合理水平的 DR5 表达， 一些肿瘤细胞系对 TRA-8 介导的细胞凋亡有抗性。这些观察表明该抗性不与受体表达相关但与 DR5 起始的信号转导机制相关。确定的 是， DR5 介导的细胞凋亡可通过普通化学治疗剂而得到显著增强 (Ohtsuka 和 Zhou， J.Biol. Chem.277 ： 29294-29303(2002) ； Ohtsuka 等， Oncogene22 ： 2034-2044(2003))。虽然某些细 胞系对 TRA-8 介导的细胞凋亡有抗性， 但其它细胞系对 TRA-8 介导的细胞凋亡敏感。本文 已鉴定已知具有基底细胞样表型的一类乳腺癌对 TRA-8 介导的细胞凋亡敏感。如本文所证 明， 基底细胞样乳腺癌细胞系含有在 TRA-8 抗性癌细胞系中形成的 DR5/DDX3/cIAP 复合物 的改变。
基于基因表达、 细胞形态学和对治疗的反应， 可将乳腺癌分成至少五个不同的分 子亚型。可将乳腺癌首先分成两大组， 雌激素受体 (ER) 阳性和 ER 阴性。这两组还可细分 为另外不同的生物和临床显著的亚组。ER 阳性肿瘤表达雌激素受体、 ER 反应性基因和管腔 上皮细胞的其它蛋白质。因此， ER 阳性肿瘤是 “管腔肿瘤 (luminal tumor)” ， 取决于特征 性基因表达模式， 其可进一步分类为 A 型管腔肿瘤和 B 型管腔肿瘤。
可将 ER 阴性肿瘤进一步分类为三组 ： HER-2 阳性、 基底细胞样肿瘤和正常乳腺样 肿瘤。HER-2 阳性肿瘤表达高水平的位于染色体 17 的位置 17q21 上的 HER2 扩增子中的基 因， 包括 HER-2 和生长因子受体结合蛋白 7(GRB7)。它们也具有高水平的核因子 (NF)-κB 激活并表达高水平的转录因子 GATA4 但缺乏 ER 和 GATA3 的表达。正常乳腺样肿瘤类似正 常乳腺组织样本， 伴有许多基因 ( 以脂肪细胞和其它非上皮细胞类型为特征 ) 的相对高表 达和管腔上皮细胞基因的低水平表达。 基底细胞样肿瘤表达以基底细胞为特征的基因。 基底细胞样基因产物已牵扯在细 胞增殖、 细胞凋亡的抑制、 细胞迁移和 / 或侵入中， 这些是癌症的特点。基底细胞样肿瘤缺 乏 ER、 ER 反应性基因和其它以管腔上皮细胞为特征的其它基因的表达或表达低水平的 ER、 ER 反应性基因和其它以管腔上皮细胞为特征的其它基因。对于基底细胞样肿瘤的完整综 述， 参见 Rakha 等， J.Clin.Oncol.26 ： 2568-81(2008)。
所谓 “三阴性乳腺癌” 是指雌激素受体 (ER) 阴性、 孕酮受体 (PR) 阴性和 HER2 阴 性乳腺癌。三阴性乳腺癌不表达 ER、 PR 或 HER2。
所谓 “HER2 非扩增的” 是指位于染色体 17 的位置 17q12-q21 上的 HER2 扩增子的 扩增的缺乏。如在 Mano 等， Cancer Treat.Rev.33 ： 64-77(2007) 中所述， 可使用荧光原位 杂交 (FISH) 测定来确定 HER2 扩增子的扩增。HER2 扩增子的扩增见于 HER2 阳性癌症中， 而 HER2 扩增的缺乏则见于基底细胞样表型乳腺癌中。
所谓 “死亡受体” 是指一旦被配体结合就诱导细胞凋亡的受体。 死亡受体包括例如 具有死亡结构域的肿瘤坏死因子 (TNF) 受体超家族成员 ( 例如， TNFRI、 Fas、 DR3、 4、 5、 6)。
通过例如 DR5 的信号转导是控制 DR5 介导的细胞凋亡的关键机制。TNFR 超家 族的死亡受体的共同特征是它们都在其细胞质尾中具有保守的 “死亡结构域” (Zhou 等， Immunol.Res.26 ： 323-336(2002))。非常确定的是 DR5 介导的细胞凋亡开始于死亡结构 域。DR5 通过 TRAIL 或竞争性抗 DR5 抗体在细胞表面的交联导致 DR5 的寡聚， 之后立即将 FADD 募集到 DR5 的死亡结构域 (Bodmer 等， Nat.Cell Biol.2 ： 241-243(2000) ； Chaudhary 等， Immunity 7 ： 821-830(1997) ； Kuang 等， J.Biol.Chem.275 ： 25065-25068(2000) ； Schneider 等， Immunity7 ： 831-836(1997) ； Sprick 等， Immunity 12 ： 599-609(2000))。使 用 FADD 的死亡结构域进一步募集引发剂半胱天冬酶酶原 8 和 / 或半胱天冬酶酶原 10 以通
过亲同种抗原 DD 相互作用形成死亡结构域诱导信号复合体 (DISC)(Krammer， Nature407 ： 789-795(2000))。 激活的半胱天冬酶 8 和 10 可直接激活半胱天冬酶 3 或可裂解含 BH3 的蛋 白 Bid 以通过细胞色素 C 的释放和半胱天冬酶酶 9 激活来激活线粒体依赖性细胞凋亡途径 (Desagher 和 Martinou， Trends Cell Biol.10 ： 369-377(2000) ； Scaffidi 等， EMBO J.17 ： 1675-1687(1998))。形成死亡结构域复合体之后， 激活许多信号转导途径， 诸如半胱天冬 酶、 NF-κB 和 JNK/p38。这些信号转导途径的激活引起通过蛋白质的 Bcl-2 和 IAP 家族来 调节死亡受体介导的细胞凋亡。
所谓 “激动剂” 是指能够与细胞上的受体 ( 例如， 死亡受体 ) 结合并起始通常由内 源性配体的结合所产生的相同反应或活性 ( 例如， 细胞凋亡 ) 的物质。 本方法的激动剂可以 是死亡受体配体。因此， 激动剂可以是 TNF、 Fas 配体或 RAIL。激动剂还可以是包含死亡受 体结合结构域的这些配体的片段， 以便所述片段能够结合并激活死亡受体。激动剂还可以 是包含死亡受体结合结构域的融合蛋白， 以便所述融合蛋白能够结合并激活死亡受体。激 动剂也可以是具有与 TNF、 Fas 或 TRAIL 有至少 85％同源性的氨基酸序列的多肽， 以便所述 同源物能够结合并激活死亡受体。
激动剂还可以是与死亡受体结合的细胞凋亡诱导抗体。 “抗体” 可以是单克隆抗 体、 多克隆抗体、 嵌合抗体、 单链抗体、 人源化抗体、 全人抗体或其任何 Fab 或 F(ab′ )2 片 段。所谓 “细胞凋亡诱导抗体” 是指在使用本文提供的方法激活之前或之后导致编程性细 胞死亡的抗体。因此， 本方法的激动剂可以是对 Fas、 TNFR1 或 TRAIL 死亡受体特异的抗体， 以便抗体激活所述死亡受体。激动剂可以是对 DR4 或 DR5 特异的抗体。激动剂可以是与 小鼠 - 小鼠杂交瘤具有相同的表位特异性或由小鼠 - 小鼠杂交瘤分泌的 DR5 抗体， 所述小 鼠 - 小鼠杂交瘤具有 ATCC 登录号 PTA-1428( 例如， TRA-8 抗体 )、 ATCC 登录号 PTA-1741( 例 如， TRA-1 抗体 )、 ATCC 登录号 PTA-1742( 例如， TRA-10 抗体 )。激动剂可以是与杂交瘤具 有相同的表位特异性或由杂交瘤分泌的抗体， 所述杂交瘤具有 ATCC 登录号 PTA-3798( 例 如， 2E12 抗体 )。
由本方法的抗体靶向的 TRAIL 受体可以是 DR4 或 DR5。这类受体描述在已公布的 专利申请 WO99/03992、 WO98/35986、 WO98/41629、 WO98/32856、 WO00/66156、 WO98/46642、 WO98/5173、 WO99/02653、 WO99/09165、 WO99/11791、 WO99/12963 和 已 公 布 的 美 国 专 利 No.6,313,269， 对于其中所教导的受体， 这些专利申请和专利的全部内容都以引用的方式 并入本文。 可使用本领域已知的方法产生对这些受体特异的单克隆抗体。 参见例如， Kohler 和 Milstein， Nature， 256 ： 495-497(1975) 和 Eur.J.Immunol.6 ： 511-519(1976)， 对于这些 方法， 二者的全部内容在此以引用的方式并入。也参见已公布的专利申请 WO01/83560 中教 导的方法， 所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
所谓 “CARD” 是指半胱天冬酶相关的募集结构域。含有 CARD 的蛋白质以与死亡受 体结合的能力为特征， 其中结合任选地在死亡结构域之外并通过所述死亡受体的死亡结构 域来调节细胞凋亡的激活。DDX3 是以含有 CARD 为特征的蛋白质家族的代表性成员。
含有 CARD 的蛋白质已被确定为细胞死亡的关键调节剂。CARD 由在某些半胱天冬 酶的前结构域的 N 端发现的保守 α 螺旋束组成。CARD 也可发现于多种其它蛋白质中。如 同死亡结构域蛋白， CARD 充当同型蛋白质相互作用基序， 所述同型蛋白质相互作用基序允 许经由 CARD/CARD 相互作用的蛋白质的通讯。具有 CARD 的蛋白质可以是促进细胞凋亡的或抗细胞凋亡的。促进细胞凋亡的 CARD 结构域蛋白质包括某些半胱天冬酶， 诸如半胱天冬 酶 2、 4 和 9， 以及 Apaf1， 其在起始细胞凋亡中发挥重要作用。代表性的抗细胞凋亡 CARD 蛋 白质包括 cIAP1 和 cIAP2， 其与半胱天冬酶的 CARD 相互作用， 并经由其杆状病毒 IAP 重复序 列 (BIR) 结构域抑制半胱天冬酶激活。该家族蛋白质的功能的许多方面指向其作为新型药 物靶标在治疗癌症中的潜在效用。若干含有 CARD 的蛋白质是保守性细胞死亡机构的关键 组分， 当调节异常时， 所述保守性细胞死亡机构促进肿瘤发生并显著有助于肿瘤对化学疗 法的抗性。在一些癌症中失活的促进细胞凋亡的蛋白质 Apaf1 是对线粒体诱导的细胞凋亡 不可缺少的 CARD 蛋白。其它抗细胞凋亡的 CARD 蛋白， 诸如 IAP 家族的蛋白质， 已经显示保 护肿瘤免受细胞死亡刺激并以癌症的某些形式过表达。当与常规化学疗法结合使用时， 激 活或抑制 CARD 蛋白的治疗剂因此可以用作化学敏化剂或用作细胞凋亡的调节剂。
含有 CARD 的蛋白质的 CARD 参与募集细胞凋亡抑制剂 (IAP)， 所述细胞凋亡抑制剂 在病毒感染过程中抑制宿主细胞的细胞凋亡 (Crook 等， J.Virol.67 ： 2168-2174(1993))。 IAP 家族通过与成熟半胱天冬酶的酶活性相互作用和抑制成熟半胱天冬酶的酶活性来对 抗细胞死亡。已鉴定了八种不同的哺乳动物 IAP， 包括 XIAP、 c-IAP1、 c-IAP2 和 ML-IAP/ Livin( 参 见 例 如 Ashhab 等， FEBS Lett.495 ： 56-60(2001) ； Kasof 和 Gomes， J.Biol. Chem.276 ： 3238-3246(2001) ； Vucic 等， Curr.Biol.10 ： 1359-1366(2000))。所有 IAP 含有 一至三个杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 结构域并且具有同源序列。通过所述 BIR 结构域， IAP 分子结合并直接抑制半胱天冬酶 (Deveraux 和 Reed， Genes Dev.13 ： 239-252(1999) ； Deveraux 等， Nature 388 ： 300-304(1997))。 线 粒 体 蛋 白 Smac/DIABLO 可 结 合 并 对 抗 IAP(Suzuki 等， J.Biol.Chem.276 ： 27058-27063(2001)) 以 抑 制 IAP 功 能 (Wieland 等， Oncol.Res.12 ： 491-500(2000))。
在基底细胞样表型乳腺癌细胞中， DR5/DDX3/cIAP 复合物的水平可改变或降低。 如 下面所示， 例如可通过含有缺乏 N 端 CARD 的 DDX3 或在 N 端 CARD 具有突变的 DDX3 来改变 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。在用死亡受体激动剂治疗后， 含有缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 的复合物通常解离， 这允许 DR 介导的细胞凋亡。较低表达水平的 DDX3 或 cIAP 表达也可有 助于乳腺癌细胞中较低水平的 DR5/DDX3/cIAP 复合物。具有较低水平的复合物的细胞也对 用死亡受体激动剂处理敏感， 这允许 DR 介导的细胞凋亡。
提供了治疗患有癌症的受治疗者的方法， 包括对受治疗者施用死亡受体激动剂。 死亡受体激动剂可以例如与 IAP 抑制剂一起施用。 任选地， IAP 抑制剂是 AT406。 死亡受体激 动剂也可连同其它化学治疗剂施用。化学治疗剂的实例包括阿霉素 (adriamycin)、 博来霉 素 (bleomycin)、 卡铂、 苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、 顺铂、 秋水仙碱、 环磷酰胺、 道诺霉素 (daunorubicin)、 放线菌素 D(dactinomycin)、 己烯雌酚 (diethylstilbestrol)、 多柔比星 (doxorubicin)、 依托泊苷 (etoposide)、 5- 氟尿嘧啶、 氟尿苷、 美法仑 (melphalan)、 甲氨蝶 呤、 丝裂霉素、 6- 巯基嘌呤、 紫杉醇、 替尼泊苷 (teniposide)、 6- 硫鸟嘌呤、 长春新碱和长春 花碱。 化学治疗剂的其它实例可见于 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy， 第 18 版， Berkow 等编， Rahway， NH(2005) 和 Sladek 等， Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs， Powis 等编， Taylor and Francis， New York， NY(1987)。
本文提供治疗受治疗者的癌症的方法。 这类方法包括施用有效量的死亡受体激动 剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂或其组合。任选地， 死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂和其组合包含在药物组合物中。
本文提供含有所提供的死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂和其组合以及本 文所描述的药学上可接受的载体的组合物。本文提供的组合物适用于体外或体内施用。所 谓药学上可接受的载体是指不是在生物上或在其它方面不合需要的物质， 即， 将所述物质 施用于受治疗者而不引起不合需要的生物作用或不以有害的方式与含有其的药物组合物 的其它组分相互作用。 选择载体以最大程度降低活性成分的降解并最大程度地减少受治疗 者中不利的副作用。
合 适 的 载 体 和 其 制 剂 描 述 在 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， 第 21 版， David B.Troy 编， Lippicott Williams & Wilkins(2005)。通常， 将适 当量的药学上可接受的盐用在制剂中以使制剂是等渗的。 药学上可接受的载体的实例包括 但不限于无菌水、 盐水、 缓冲溶液如林格氏溶液 (Ringer′ s solution)， 和葡萄糖溶液。溶 液的 pH 一般约 5 至约 8 或从约 7 至 7.5。其它载体包括缓释制剂， 诸如含有免疫原性多肽 的固态疏水聚合物的半渗透矩阵。 矩阵是成形的物品的形式， 例如， 膜、 脂质体或微颗粒。 取 决于例如施用途径和被施用的组合物的浓度， 某些载体可以是更优选的。载体是适于对人 或其它受治疗者施用死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂和其组合的那些载体。
取决于是否需要局部或全身治疗， 和取决于待治疗的区域， 组合物以多种方式施 用。 组合物经由若干施用途径的任何一种施用， 所述若干施用途径包括局部、 口服、 胃肠外、 静脉内、 关节内、 腹膜内、 肌肉内、 皮下、 腔内、 透皮、 肝内、 颅内、 雾化 / 吸入， 或通过经由支 气管镜检安置。任选地， 组合物通过口腔吸入、 鼻吸入或鼻内粘膜施用而施用。通过吸入剂 施用组合物可经由用喷雾或滴液机构递送而通过鼻或口。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌含水或无水溶液、 悬浮液和乳状液。无水溶剂的 实例为丙二醇、 聚乙二醇、 植物油诸如橄榄油， 和可注射有机酯类诸如油酸乙酯。含水载体 包括水、 醇溶液 / 含水溶液、 乳状液或悬浮液， 包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯 化钠溶液、 林格氏葡萄糖、 葡萄糖和氯化钠、 乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物 包括流体和营养素补充剂、 电解质补充剂 ( 诸如基于林格氏葡萄糖的那些 ) 等。防腐剂和 其它添加剂任选地存在， 诸如例如抗菌剂、 抗氧化剂、 螯合剂和惰性气体等。
用于局部施用的制剂包括软膏剂、 洗剂、 乳膏剂、 凝胶剂、 滴剂、 栓剂、 喷雾剂、 液体 和粉剂。常规药物载体、 含水溶液、 粉末或油性基质、 增稠剂等是任选必需的或合意的。
用于口服施用的组合物包括粉剂或颗粒、 水或无水介质中的悬浮液或溶液、 胶囊、 小袋 (sachet) 或片剂。增稠剂、 香料、 稀释剂、 乳化剂、 分散助剂或粘合剂是任选合意的。
还提供筛选乳腺癌细胞对 DR5 激动剂的反应性的方法。所述方法包括检测癌细胞 中的基底细胞样表型 ； 检测癌细胞是 HER2 非扩增的 ； 和检测与对照相比癌细胞中降低水平 的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。所述方法还可包括例如测定癌细胞是雌激素受体阴性 (ER 阴 性 )、 孕酮受体阴性 (PR 阴性 ) 或 ER 阴性和 PR 阴性。任选地， DR5 激动剂是抗体。任选地， 乳腺癌细胞来自乳房活检。
也提供筛选乳腺癌细胞 ( 例如， 三阴性 ) 对 DR5 激动剂的反应性的方法。所述方 法可例如包括检测细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的水平并将其与对照进行比较。与对 照相比， 细胞中较低水平的复合物表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂有反应性。所述方法可例 如包括检测乳腺癌细胞中缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3。缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂有反应性。所述方法可例如包括检测乳腺癌细胞中包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 的 IAP 蛋白。80kDa BIR 表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂没有 反应性。
可用于测定样本中 DDX3、 缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 和包含 80kDaBIR 的 IAP 蛋白的表达水平的测定技术对本领域技术人员是已知的。这类测定方法包括放射免疫测 定 (RIA)、 免疫组织化学测定、 原位杂交测定、 竞争性结合测定、 蛋白质印迹分析和 ELISA 测 定。测定还包括使用选自由以下组成的组的测定来确定 RHA 的水平 ： 微阵列测定、 基因芯 片、 RNA 印迹、 原位杂交测定、 逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 测定、 一步 PCR 测定和实时 定量 (qRT)-PCR 测定。确定蛋白质或 RNA 表达的分析技术是已知的。参见例如 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， NY(2001)。
确定 DR5/DDX3/cIAP 复合物的水平的技术对本领域技术人员也是已知的。确定所 述复合物的水平的测定可选自由以下组成的组 ： 免疫沉淀测定、 免疫共沉淀测定和非凝胶 基方法， 诸如质谱法或蛋白质相互作用谱型分析， 诸如共定位测定。 所述测定在本领域是已 知的。参见例如， Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， NY(2001) ； Dickson， Methods Mol.Biol.461 ： 735-44(2008) ； 和 Zinchuk 等， Acta Histochem.Cytochem.40 ： 101-11(2007)。 还提供与 DDX3 的 N 端 CARD 选择性结合的抗体、 与缺乏 N 端 CARD 或缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX-3 选择性结合的抗体和与包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列的 IAP 蛋白结 合的抗体。
术语抗体在本文以广义使用并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。该术语还可 指的是人抗体和 / 或人源化抗体。用于产生人单克隆抗体的技术的实例包括由 Cole 等 (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， Alan R.Liss， p.77(1985)) 和由 Boerner 等 (J.Immunol.147(1) ： 86-95(1991)) 描述的那些。也可使用噬菌体展示文库来产生人抗 体 ( 和其片段 )(Hoogenboom 等， J.Mol.Biol.227 ： 381(1991) ； Marks 等， J.Mol.Biol.222 ： 581(1991))。还可从转基因动物获得所公开的人抗体。例如， 已经描述了能够响应于免疫 而产生全部人抗体的转基因、 突变小鼠 ( 参见例如， Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90 ： 2551-5(1993) ； Jakobovits 等， Nature 362 ： 255-8(1993) ； Bruggermann 等， Year in Immunol.7 ： 33(1993))。
如本文所使用， 术语肽、 多肽或蛋白质广义地使用是指由肽键连接的两个或多个 氨基酸。蛋白质、 肽和多肽在本文也互换使用以指的是氨基酸序列。应认识到， 术语多肽在 本文使用不暗示组成该分子的氨基酸的特定大小或数量， 以及本发明的肽可含有多达若干 氨基酸残基或更多。
如通篇所使用， 受治疗者可以是脊椎动物， 更具体为哺乳动物 ( 例如人、 马、 猫、 狗、 牛、 猪、 绵羊、 山羊、 小鼠、 兔、 大鼠和豚鼠 )、 鸟类、 爬行类、 两栖类、 鱼类和任何其它动物。 该术语不指示具体年龄和性别。因此， 意在涵盖成年和新生受治疗者， 不管雄性或雌性。如 本文所使用， 患者或受治疗者可互换使用并且可指的是患有疾病或病症 ( 例如癌症 ) 的受 治疗者。术语患者或受治疗者包括人和兽医受治疗者。
根据本文教导的方法， 对受治疗者施用有效量的死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化
学治疗剂或其任何组合。术语有效量和有效剂量互换使用。术语有效量定义为产生期望生 理反应所必需的任何量。可凭经验确定用于施用死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂 和其组合的有效量和进度表， 并且做出这种决定在本领域的技术范围内。用于施用的剂量 范围是足够大以产生期望的效果的那些， 其中影响 ( 例如， 减少或延迟 ) 疾病或病症的一种 或多种症状。 该剂量不应如此大以造成明显不利的副作用， 诸如有害的交叉反应、 过敏反应 等。 通常， 剂量将随年龄、 病状、 性别、 疾病的种类、 疾病或病症的程度、 施用途径或是否在方 案中包含其它药物而变化， 并且可由本领域技术人员确定。 在任何禁忌症的情况下， 可由个 体医师调整该剂量。 剂量可变化， 并且可以每天一次或多次剂量给药来施用， 持续一天或多 天。任选地， 死亡受体激动剂以三周、 两周或一周的间隔施用。任选地， 每三周施用化学治 疗剂。可在文献中找到对于关于药物产品的给定种类的适当剂量的指导。
如本文所使用的术语治疗 (treatment)、 治疗 (treat) 或治疗 (treating) 指的是 减少疾病或病状的作用或疾病或病状的症状的方法。因此在所公开的方法中， 治疗可指的 是确认的疾病或病状的严重性或疾病或病状的症状的 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 100％减少。例如， 如果与对照相比， 受治疗者的疾病的一种或多种症状 有 10％减少， 则认为用于治疗疾病的方法是治疗。因此， 与天然或对照水平相比， 减少可以 是 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或介于 10％和 100％之间的 任何百分数减少。可理解， 治疗不是必需指治愈或完全消除疾病、 病状或疾病或病状的症 状。 “任选的” 或 “任选地” 是指随后描述的事件、 情况或物质可能出现或存在或可能不 出现或不存在， 并且所述描述包括其中事件、 情况或物质出现或存在的实例和其中其不出 现或不存在的实例。
公开的是可用于、 可联合用于、 可用于制备所公开的方法和组合物的材料、 组合物 和组分， 或者公开的是所公开的方法和组合物的产物。 本文公开了这些和其它物质， 并且可 理解的是， 当公开这些物质的组合、 子集、 相互作用、 组等时， 尽管可能没有明确公开这些化 合物的每种不同个体和集体组合和排列的具体引用时， 但是上述每一种都具体预期并描述 于本文中。 例如， 如果公开并讨论了一种方法， 并且讨论了许多可对许多包括在本方法中的 分子进行的修改， 那么除非特别指出其相反的情况， 否则具体预期了本方法的每个和每种 组合和排列， 以及可能的修改。同样地， 也具体预期和公开了这些的任何子集和组合。该概 念应用于本公开的所有方面， 包括但不限于使用所公开组合物的方法中的步骤。 因此， 如果 存在多个可进行的附加步骤， 那么应理解的是， 这些附加步骤中的每一个可与所公开方法 的任何具体方法步骤或方法步骤的组合一起进行， 并且具体预期了每个这种组合或组合的 子集， 并且应认为被公开。
本文引用的出版物和它们引用的材料在此以引用的方式整体明确并入。
实施例 一般方法
细胞系、 抗体和试剂。
从美国组织培养库 (ATCC)(Manassas， VA) 购买人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231。获 得人卵巢癌细胞系 UL-3C。将细胞保持在用 10％热灭活的 FCS、 50μg/ml 链霉素和 50U/mL
青霉素 (Cellgro， Mediatech， Inc.， Manassas， VA) 补充的 DMEM 或 RPMI1640 中。
先 前 描 述 了 抗 人 DR4( 克 隆 ： 2E12) 和 抗 人 DR5( 克 隆 ： TRA-8) 单 克 隆 抗 体 (Ichikawa 等， 2003 ； Ichikawa 等， 2001)。培养抗人 DR5( 克隆 ： 2B4) 用于流式细胞术和 免疫沉淀测定。从 Alexis Biochemicals(San Diego， CA) 购买重组可溶 TRAIL。从 BD Pharmingen(San Diego， CA) 购买多克隆抗半胱天冬酶 3 和抗半胱天冬酶 8。制备单克隆抗 人半胱天冬酶 2、 3、 8、 9 和 10 抗体和单克隆抗人 Bcl-2、 Bcl-xL、 Bax、 cIAP-1、 cIAP-2、 XIAP 和生存素抗体。从 Cell Signaling Technology， Inc.(Beverly， MA) 购买抗 PARP 抗体。从 Sigm 购买抗 β- 肌动蛋白抗体。从 Transduction Laboratories(Lexington， KY) 购买抗 FADD。从 Southern Biotechnology Associates， Inc.(Birmingham， AL) 购买所有辣根过氧 化物酶 (HRP) 偶联第二试剂 (secondary reagent)。
从 EMD Biosciences， Inc(San Diego， CA) 购买活性半胱天冬酶 -1、 半胱天冬 酶 -2、 半胱天冬酶 -3、 半胱天冬酶 -6、 半胱天冬酶 -7、 半胱天冬酶 -8、 半胱天冬酶 -9 和半胱 天冬酶 -10。 从 Alexis Biochemicals ； San Diego， CA 购买荧光肽衍生物 Ac-Val-Asp-Val-A la-Asp-AMC(Ac-VDVAD-AMC， 260060M001， SEQ ID NO ： 1)、 Ac-Asp-Glu-Val-Asp- 氨基 -4- 甲 基香豆素 (Ac-DEVD-AMC， 260031M001， SEQ ID NO ： 2) 和 Ac- 羰基 -Ile-Glu-Thr-Asp-7- 氨 基 -4- 甲 基 香 豆 素 (Z-IETD-AMC， 260042M001， SEQ ID NO ： 3)。 从 R&D Systems， Inc(Minneapolis， MN) 购买半胱天冬酶 -2、 -3、 -8、 -10 抑制剂 (FMKSP01)。 对 TRA-8、 2E12 和 TRAIL 介导的细胞凋亡的肿瘤细胞敏感性的细胞毒性分析。
用 8 种浓度 ( 从 1000ng/ml 开始加倍连续稀释 ) 的 TRA-8、 2E12 或 TRAIL 将细胞 ( 每孔 1,000 个细胞 ) 以三个重复接种到 96 孔板。 过夜培养后， 根据制造商的说明 (Packard TM Instruments， Meriden， CT) 使用 ATPLITE 测定来确定细胞成活力。将结果呈现为与介质 对照孔相比经处理细胞中活细胞的百分比。
流式细胞术。
将细胞 (106) 用 PBS 洗涤一次， 并且重悬于含有一抗 (1μg/ml 的 TRA-8) 的 1ml 冷 FACS 缓冲液 ( 具有 5％ FBS 和 0.01％ NaN3 的 PBS) 中。使细胞在冰上染色 60 分钟， 然 后用 3ml 冷 FACS 缓冲液洗涤， 并在 4 ℃下于黑暗中与二抗 (PE 偶联的山羊抗小鼠 IgG 的 1 ∶ 100 稀释 ) 孵育 60 分钟。用 3ml FACS 缓冲液再次洗涤后， 通过 FACSCAN 流式细胞仪 (BD Biosciences ； San Jose， CA) 分析每个样本的 10,000 个细胞。
细胞凋亡相关蛋白质的蛋白质印迹分析。
将肿瘤细胞 (3×106) 用冷 PBS 洗涤两次并用含有 10mM Tris-HCl(pH 7.6)、 150mM NaCl、 0.5mM EDTA、 1mM EGTA、 0.1％ SDS、 1mM 原钒酸钠和蛋白酶抑制剂的混合物 (1mM 苯甲 磺酰氟、 1μg/ml 胃酶抑素 A、 2μg/ml 抑肽酶 ) 的 300μl 裂解缓冲液裂解。对细胞裂解 物进行声处理 10 秒并在 12,000g 下离心 20 分钟。使具有等量总蛋白质的细胞裂解物与 SDS-PAGE 样本缓冲液煮沸 5 分钟。 在 8％、 10％或 12％ SDS-PAGE 中分离总细胞裂解物， 并使 其电泳转移到硝酸纤维素膜上。用 5％脱脂奶粉在 TBST 缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)、 500mM NaCl 和 0.1％ Tween 20) 中封闭印迹， 并与一抗在封闭缓冲液中于 4℃下孵育过夜。 将印迹用 TBST 洗涤三次， 并在室温下用 HRP 偶联的二抗探测 1 小时。用 TBST 洗涤四次后， 根据制造商的说明， 使用 ECL 蛋白质印迹检测系统 (Amersham Biosciences ； Pittsburgh， PA) 使探测的蛋白质可见。
DDX3 的 siRNA 介导的敲低。
设计 RNAi ： 使用在线设计工具 BLOCK-iT RNAi Designer(Invitrogen ； Carlsbad， CA) 来鉴定 DDX3 的 RNAi 靶标。从上链 10 个最高得分的 RNAi 靶标中选择 5 个靶 siRNA 序 列 ( 见表 1)。
表1： siRNA 定向 ： 正义链 - 环 - 反义链
然 后 将 它 们 克 隆 到 BLOCK-iT U6 入 门 载 体 (entry vector)。siRNA 由 U6 启 动子驱动并且可在大多数分化或非分化哺乳动物细胞类型中短暂表达。使用 RNAi 的 LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen ； Carlsbad， CA) 转染抗性细胞以用于 RNAi 反应。转染后 36 小时， 通过使用抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹分析来测定降低的 DDX3 表达。在达到降低的 DDX3 表达时， 合成 siRNA 寡核苷酸 ( 靶序列 ： GGAGAAATTATCATGGGAAAC(SEQ ID NO ： 14) ： 正 义链 RNA5′ -Fl-GGAGAAAUUAUCAUGGGAAAC(Fl-SEQ ID NO ： 15)(Fl ＝荧光素 ) ； 反义链 RNA 5′ -GUUUCCCAUGAUAAUUUCUCC-3′ (SEQ ID NO ： 16)， 并且从 Molecula(Columbia， MD) 购买 RNAi 对照寡核苷酸。
表达载体的产生。
将全长 DDX3 克隆到 pcDNA3.1 质粒 (Invitrogen)， 其中 DDX3 的 N 端具有 His 标 签。使用下列引物对， 通过用从 MDA231 细胞提取的总 RNA 进行的逆转录酶聚合酶链式反应 (RT-PCR) 来产生 DDX3 和 DR5cDNA ： 具有 BamHI 的 DDX31 正向引物 ： 5′ -acggatccaaatgagt catgtggcagtgga-3′ (SEQ ID NO ： 17)， 具有 XhoI 的 DDX3662 反向引物 ： 5′ -ctctcgagcaaa gcaggctcagttaccc-3′ (SEQ ID NO ： 18) ； 具有 KpnI 的 DR5-1 正向引物 ： 5′ -aaaggtaccag ccatggaacaacggggacag-3’ (SEQ ID NO ： 19)， 具有 EcoV 的 DR5-441 反向引物 ： 5′ -aaagata tcttaggacatggcagagtctgcatt-3’ (SEQ ID NO ： 20) ； 将分离的 DDX3 的聚合酶链式反应片段 在框内克隆到 pcDNA3.1-His 载体 (Invitrogen)。将 DR5 cDNA 克隆到 pshutter-CMV 载体。 通过 DNA 测序确认正确的序列。
通过缺失 BamHI 和 XhoI 位点之间的 DDX3 序列来产生 DDX3/pcDNA3.1-His 表达
质粒。具有 BamHI 的 DDX3151 正向引物 ： 5′ -acggatccaaatgttttctggaggcaacactggg-3’ ( SEQ ID NO ： 21) ； 使用以下引物通过缺失 DR5 序列来产生 DR5/pshutter-CMV 表达质粒 ： 具 有 EcoRV 的 DR5-340 反向引物 ： 5′ -aaagatatcttactgtctcagagtctcagtgggatc-3’ (SEQ ID NO ： 22) ； 具有 EcoRV 和 XhoI 的 DR5-330 反向引物 ： 5’ -aaagatatcctcgagatttgctggaaccagc agcct-3’ (SEQ ID NO ： 23)。
用于 DDX3 在细菌中的表达质粒的构建
将 DDX3 或 cIAP1 片段插入 TOPO100 载体 (Invitrogen) 中。将得到的质粒转化到 大肠杆菌菌株 BL21(DE3)， 使其在 LB 培养基中生长到对数生长期并用 0.4mM 异丙基 -1- 硫 代 -β-D- 半乳糖吡喃糖苷诱导 3 小时。 使细胞沉淀， 重悬于裂解缓冲液 (30mM Tris-HCl(pH 7.5)、 0.1mM NaCl、 1mM DTT、 0.1mMEDTA、 1％ Nonidet P-40 和 20μg/ml PMSF) 中， 并进行声 处理。通过 Ni 柱纯化在 14,000×g 下离心 15 分钟后的上清液。通过 BCA 测定 (Pierce， Rockford， IL) 来确定蛋白质浓度， 并在 80℃下储存等分试样。
293 或 3T3 细胞的瞬时转染。
使用 LIPOFECTAMINETM 2000(Invitrogen) 用表达载体转染 293 或 3T3 细胞。转染 之后 24 小时后， 通过使用各自单克隆抗体的蛋白质印迹分析来测定蛋白质表达。对于免疫 共沉淀分析， 用含有蛋白酶抑制剂混合物的免疫沉淀 - 裂解缓冲液对细胞进行裂解。
免疫共沉淀测定。
将抗 DDX3 或抗 DR5 抗体偶联至琼脂糖凝胶珠 (Sigma ； St.Louis， MO)。按如下测 6 定 DR5DISC 的组合物。在 37 ℃下用 500ng/ml 的 TRA-8 处理 5×10 个细胞 ( 如果没有另 外指定 ) 达指定的时间， 并且然后在免疫沉淀裂解缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)、 150mM NaCl、 0.2％ NONIDET P40 和 10％甘油和完全蛋白酶抑制剂混合物 ) 中裂解或在不经处理 ( 未刺激的情况 ) 下裂解。然后在 4℃下用 30μl 珠子使 DR5 DISC 沉淀过夜。免疫沉淀之 后， 用裂解缓冲液将珠子洗涤 4 次。然后用 10mM Tris 缓冲液将珠子洗涤 5 次， 并重悬于上 样缓冲液中以用于 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。
体外半胱天冬酶活性的测定。
在 96 孔透明底板中进行荧光测定， 并且所有的测量在三个重复的孔中进行。加入 100μl 测定缓冲液 (10mM HEPES pH 7.0、 50mM NaCl、 2mM MgCl2、 5mM EDTA 和 1mM DTT)。 向 各孔加入活性半胱天冬酶 -8 和肽底物 (Ac-IETD-AMC) 至最终浓度为 100ng/μl。 加入免疫 共沉淀洗提组分以开始反应。在含有测定缓冲液、 底物和没有细胞裂解物的裂解缓冲液的 孔中测量本底荧光。在 37℃下将酶联板 (assay plate) 孵育 1 小时。在设置成 355-nm 激 发光和 440-nm 发射光的荧光酶标仪 (Bio-Tek ； Winooski， VT) 上测量荧光。
体外半胱氨酸酶裂解测定。
在体外测定中检查半胱天冬酶裂解 DDX3 的能力。在 37℃下进行裂解反应 30 分 钟， 包括 10μl 来自 DR5co-IP 的洗提组分、 10μl 反应缓冲液 (10mM HEPES[pH 7.0]、 50mM NaCl、 2mM MgCl2、 5mM EGTA、 1mM DTT、 2mM ATP) 和 5μl(0.1U/μl) 重组活性形式的半胱天 冬酶。通过使用抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹测定裂解。
实施例 1 ： DDX3 在 TRAIL-R2 介导的细胞凋亡中的作用
候选蛋白质 ( 造成抗性细胞中 DR5 的死亡结构域封阻的 DDX3) 的蛋白质组学分 析。对靶向死亡受体的治疗剂、 TRAIL 和竞争性抗体的自然发展或诱导的细胞凋亡抗性代表在用这些药剂有效治疗癌症中的主要障碍。为了确定在抗性细胞中是否存在 DR5 死亡 结构域复合物的替换组合物， 通过二维蛋白质组学和质谱分析在 TRA-8 处理之前和之后比 较 TRA-8 敏感亲代细胞和 TRA-8 抗性 MDA231 细胞中的现有 DR5 缔合的蛋白质的蛋白质组 学谱。在检查用 SYPROTM ruby(Molecular Probes ； Eugene， OR) 染色的二维凝胶时， 发现了 约～ 80kDa 的蛋白质斑点。该蛋白质与 DR5 的缔合阻断了 DR5 死亡结构域诱导信号复合 物 (DISC) 的形成， 因此引起 TRA-8 抗性。从 SDS-PAGE 切离～ 80kDa 蛋白质并用胰蛋白酶 消化， 而且通过质谱分析法来分析肽序列。来自 6 个经消化片段的蛋白质氨基酸序列与人 DDX3( 表 2) 的 Genbank 序列 100 ％相同， 这表明在 TRA-8 诱导的细胞凋亡过程中 DDX3 从 DR5 解离。如果该蛋白质保持与 DR5 缔合的蛋白质复合物缔合， 则其可防止 FADD 募集并且 导致 DISC 形成失败。
表2： DDX3 片段。
DDX3 是 DR5 介导的细胞凋亡中的 DR5 缔合的蛋白。 为了确定 DDX3 是否确实与 DR5 缔合， 将全长 DDX3( 氨基酸 1-662)、 DDX3 的 N 端片段 ( 氨基酸 1-316) 和 C 端片段 ( 氨基酸 310-662) 克隆到在 N 端具有 6-His 标签的 PCDNAIII3.1 中。 将这些表达载体转染到 MDA231 亲代细胞中以达到重组全长 DDX3 和 DDX3 的缺失突变体的过表达。如通过免疫共沉淀分析 和之后使用抗 6-His 抗体的蛋白质印迹分析所测定， 仅全长 DDX3( 而不是其 N 端和 C 端缺 失突变体 ) 与 DR5 缔合。这些结果证实全长 DDX3 与 DR5 缔合。DDX3 在 MDA231 细胞中与抗 DR5 免疫沉淀。
为进一步证实 DDX3 与 DR5 的缔合， 使 DDX3 的 N 端缺失形式、 C 端缺失形式和全长 形式在大肠杆菌中表达。纯化蛋白质并用作抗原以产生针对 DDX3 的多克隆抗体和一组单 克隆抗体。 通过免疫共沉淀和使用小鼠抗 DDX3 单克隆抗体的蛋白质印迹分析检测 DR5 缔合 的 DDX3。结果证明 DDX3 在非凋亡亲代细胞和抗性细胞二者中与 DR5 免疫共沉淀。在细胞 凋亡过程中， TRA-8 敏感细胞中 DDX3 时间依赖性地减少， 而 TRA-8 抗性细胞中则不是如此。 另外， 通过蛋白质印迹分析， 观察到 TRA-8 诱导的细胞凋亡过程中 DR5 缔合的 DDX3 的迅速 减少和裂解。这表明 DDX3 的裂解是半胱天冬酶依赖性的。基于这些结果， 详细检查 DDX3 序列的 N 端的潜在裂解位点， 并且在氨基酸 129-135 发现相对保守的半胱天冬酶裂解基序 DKSDEDD(SEQ ID NO ： 30)。明显的是， 裂解发生在 DISC 上并且导致 DDX3 的关键功能元件从 DR5 释放。 该数据与后面的模型一致， 这表明可将起始半胱天冬酶迅速募集到 DR5 并容易地 裂解 DDX3。另外， FADD 和半胱天冬酶 -8 与 DR5 缔合并募集至 DR5 以形成 DISC， 其转而引 起与 DR5 缔合的 DDX3 裂解相关的半胱天冬酶级联激活。这表明在某些情况中， DDX3 对于 凋亡程序是必要的， 说明 DDX3 与 DR5 缔合并且参与 DR5 介导的细胞凋亡抗性。
对 DDX3 与 DR5 的相互作用区进行作图。为了更好地理解 DR5 介导的信号转导 中 DDX3 的调控， 使用已由编码 DDX3 的缺失突变体的质粒瞬时转染的 HEK293A 细胞确定
结合 DR5 所需的大致 DDX3 区。使用 TRA-8、 全长 DDX3、 DDX3Δ201-662 或与 DR5 结合的 DR5DDX3Δ1-400 通过免疫共沉淀来测定重组 DDX3 和 DR5 的相互作用。 然而， DDX3Δ251-662 和 DDX3Δ1-350 都不能与 DR5 结合。这表明 DDX3 在 DR5 上有两个结合基序。一个位于 N 端 ( 氨基酸 200-250) ； 另一个邻近氨基酸 350-400。来自相同细胞的裂解物的蛋白质印迹 分析证实产生相似量的野生型 DDX3 和 DDX3 的缺失片段， 这排除了蛋白质表达的差异作为 这些结果的解释。
DDX3 永久地与 DR5 缔合并与 TRA-8 抗性细胞中 FADD 募集的封阻有关， 表明 DR5 缔 合的 DDX3 阻止 FADD 的募集。通过 DR5， DDX3 和 FADD 之间可存在一定关系。为测试 DDX3 和 FADD 是否共享在 DR5 的死亡结构域的共同结合基序或两个结合基序是否紧挨在一起以 致预接合的 DDX3 干扰 FADD 的募集， 测定了 DR5 中 DDX3 结合结构域的位置。构建编码全长 DR5 的载体和 DR5 的一系列氨基端结构域缺失， 包括死亡结构域的完全缺失。在评估 DDX3 的功能和排除内源性人 DR5 的类似方法中， 选择鼠成纤维细胞细胞系 NIH3T3 作为用于共表 达人 DR5 和 DDX3 的宿主细胞。用编码 His 标记的 DDX3 和全长 DR5 ； DDX3 和 DR5 的一系列 缺失突变体 ； 和单独 DDX3 共转染 3T3 细胞。使用 TRA-8 染色通过流式细胞术检查细胞表面 DR5 表达。所有经转染的细胞表现相似水平的细胞表面 DR5， 表明细胞内结构域的缺失并不 改变细胞表面 DR5。另外， 如使用抗 6-his 抗体通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析所检 测， 所有经转染的细胞表达相似水平的重组 DDX3。通过与 TRA-8 免疫共沉淀和用抗 6-His 抗体的蛋白质印迹分析来检查重组 DDX3 与 DR5 的缺失突变体的缔合。DR5 与 DDX3 的相互 作用独立于 DR5 的死亡结构域。为进一步更准确地限定 DR5 结合基序， 构建 DR5 的另外缺 失突变体 D330 和 DR5 的截短 (T300-330)， 与 DDX3 一起共转染至 3T3 细胞中， 并分析它们 的相互作用。结果证明， DDX3 并不与 DR5 死亡结构域结合但与靠近死亡结构域 ( 氨基酸 340-420) 的膜近侧区 ( 氨基酸 300-330) 结合。这表明， DDX3 在 DR5 信号转导中可能发挥 与之前所鉴定的死亡结构域连接蛋白不同的作用。另外， 此区与 DR4 和 DcR2 高度同源。这 些数据表明 DDX3 是与死亡受体家族的成员缔合的普通衔接蛋白。
DDX3 含有 CARD。接下来通过分析 DDX3 的具体特性来研究该分子在 DR5 介导的细 胞凋亡中的功能性意义。最近已鉴定出 DEAD 盒蛋白家族的至少两种 RNA 解旋酶， 其含有 半胱天冬酶募集结构域 (CARD)。这些 RNA 解旋酶中的 CARD 充当细胞凋亡的调控子。因为 DDX3 在 DR5 介导的细胞凋亡的调控中发挥重要的作用， 所以 DDX3(DEAD 盒蛋白家族的解旋 酶的成员 ) 也可具有 CARD， 并且 DDX3 的细胞凋亡抑制功能可直接取决于 CARD。因此， 检查 DDX3 是 CARD 蛋白的可能性。氨基酸比对分析表明 DDX3 含有介于氨基酸 50-150 之间的保 守作用基序， MDA5 和 RIGI 也一样。CARD 是同型的相互作用基序。含有 CARD 的蛋白质可经 由此结构域相互作用。因为 DDX3 是新型、 高度保守的含有 CARD 的解旋酶， 所以它能够与其 它 CARD 蛋白相互作用。cIAP1， 也是含有 CARD 的蛋白， 已被广泛视为半胱天冬酶的抑制剂 并且将其募集至 TNFRI 和 TNFRII 以调控 TNFRI 介导的细胞凋亡。在免疫共沉淀实验中， 使 用抗 DDX3 或抗 DR5 抗体测试 DDX3 是否能够与 cIAP1 相互作用。已确定， 在 TRA-8 未处理 的亲代细胞和抗性细胞中， cIAP1 可容易地与 DDX3 和 DR5 抗体免疫共沉淀。然而， 在 TRA-8 敏感细胞中， cIAP1 迅速地从 DR5-DDX3 复合物中释放， 并且这与亲代细胞中的 DDX3 裂解有 关。相反， TRA-8 处理之后， 抗性细胞中 DR5-DDX3 复合物中的 cIAP1 水平增加。这些结果 表明 DDX3 可作为 DR5 和 cIAP1 之间的连接物。通过敲低 DDX3 逆转抗性。为研究 DDX3 在 DR5 信号转导中的作用， 检查 TRA-8 诱 导的细胞凋亡中内源性 DDX3 的重要性。因为在 TRA-8 诱导的细胞凋亡的过程中， DDX3 在 抗性细胞中不减少， 所以降低水平的 DDX3 表达对于癌细胞对细胞凋亡敏感可以是需要的。 采用 RNAi 策略以确定 DDX3 在对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性中的作用。使用在线设计工具 BLOCK-ITTM RNAi Designer(Invitrogen) 以鉴定 DDX3 的 RNAi 靶标。从上链 10 个最高得 分 RNAi 靶标中选择 5 个靶向的 siRNA 序列， 并且克隆至 BLOCK-ITTM U6 入门载体。用 5 种 RNAi 构建体转染 TRA-8 抗性 MDA231 细胞， 并且在转染后 48 小时， 通过使用单克隆抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹分析来确定 DDX3 的蛋白质表达水平。与未转染或 GFP 转染的对照相比， 5 种测试的 RNAi 构建体中的 4 种是非常有效 ( 超过 50％降低 ) 的 DDX3 表达抑制剂。选择 这些构建体中最有效的构建体 (#2) 用于分析 TRA-8 介导的细胞凋亡中 DDX3 敲低的作用。 为确定 DDX3 表达的敲低是否逆转 TRA-8 抗性细胞中的 TRA-8 敏感性， 用 RNAi 载体 ( 构建 体 #2) 和 GFP 表达载体 ( 作为转染细胞的指示剂 ) 共转染 TRA-8 抗性 MDA231 细胞。转染 后 48 小时， DDX3 与 DR5 免疫共沉淀。如所预期， 与对照细胞相比， DDX3 的表达显著减少。 TM 分选 GFP 阳性细胞并与各种浓度的 TRA-8 培养过夜。使用 ATPLITE 测定， 用 GFP 和对照载 体转染的 MDA231 细胞在 TRA-8 处理后没有经历细胞凋亡， 表明细胞对 TRA-8 保持抗性。然 而， 用 DDX3 RNAi 和 GFP 共转染的细胞表现 TRA-8 剂量依赖性细胞死亡。使用 TUNEL 染色， 发现相当数量的 DDX3 敲低细胞经历细胞凋亡。这些结果表明 DDX3 表达的下调逆转 TRA-8 抗性。 为进一步确定 DDX3 在 DR5 介导的细胞凋亡中的因果作用， 一组肿瘤细胞中的 DDX3 表 达降低并且分析它们对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的敏感性。在该组肿瘤细胞 ( 包括一些自发 抗性细胞 ) 中， DDX3 RNAi 降低内源性 DDX3 的量并增强 TRA8 诱导的细胞凋亡。相反， 用对 照寡核苷酸转染的细胞显示正常 DDX3 表达和保持对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的抗性。因此， DDX3 是 DR5 信号转导器官的关键组分并且对于对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性是必需的。
没有 DDX3 结合区的 DR5 是促进细胞凋亡的。为测试 DDX3 结合基序是否代表调节 DR5 的死亡结构域功能的新型负调控结构域， 将突变 DR5 的细胞凋亡诱导功能与野生型 DR5 进行比较。 用没有死亡结构域的 DR5 转染的细胞似乎不对 TRA-8 处理反应， 但用具有截短的 DDX3 结合结构域的 DR5 转染的细胞似乎是促进细胞凋亡的并且与野生型 DR5 转染细胞相比 对 TRA-8 诱导的细胞凋亡表现更大敏感性。存在 DDX3 的显著的抑制作用， 其可抑制 DR5 介 导的细胞凋亡。这些发现表明 DDX3 是 DR5 介导的细胞凋亡的抑制介质。
DDX3 是调控 DR5 介导的细胞凋亡的 CARD 蛋白。为剖析 DR5-DDX3-cIAP1 信号转 导， 评估了对其与 cIAP1 的结合所需的区。因为 CARD 在 DDX3 的 N 端并且应该与 cIAP1 相 互 作 用， 所 以 此 区 可 负 责 结 合 cIAP1。 用 编 码 His 标 记 的 全 长 DDX3、 DX3Δ51-662、 DDX3Δ101-662、 DDX3Δ151-662 或 DDX3Δ1-350 转染 HEK293A 细胞。全长和 C 端缺失的 DDX3 能够免疫共沉淀 cIAP1， 而开始 100 个氨基酸缺失的 DDX3 不能够免疫共沉淀 cIAP1。 这些结果证实 DDX3 的 N 端 CARD 负责将 cIAP1 募集至 DR5 复合物。也表明 cIAP1 结合基序 位于裂解位点 ( 氨基酸 129-135(DKSDEDD ； SEQ ID NO ： 30)) 之前的 DDX3 的氨基酸 50-100。 如果在 DR5 介导的细胞凋亡过程中 DDX3 被裂解， 则与 cIAP1 结合的 DDX3 的 N 端片段将从 DR5 复合物脱离， 因此减轻 cIAP1 对死亡信号转导的抑制。所以， DDX3 是将 cIAP1 和死亡受 体与细胞凋亡抗性偶联的候选物。
为进一步证实该概念， 使用缺乏氨基酸 1-150 的显性负突变 DDX3。这种突变DDX3ΔCARD(DDX3Δ151-662) 不能与 cIAP1 相互作用， 但仍然能够与 DR5 结合。因此， 评估 DDX3Δ151-662 是否是通过与结合 DR5 的野生型 DDX3 竞争的内源性 DDX3 的显性负抑制剂。 用 DDX3ΔCARD 转染四种类型的细胞。与内源性、 全长 DDX3 相比， DDX3ΔCARD 转染细胞表 现较高水平的 DDX3ΔCARD 表达， 表明截短 DDX3 能够与内源性 DDX3 竞争与 DR5 结合。如通 过 DR5-co-IP 和用抗 DDX3 和抗 cIAP1 抗体探测的蛋白质印迹所分析， cIAP1 与全长 DDX3 免 TM 疫共沉淀， 但不与 DDX3ΔCARD 免疫共沉淀。此外， 使用 ATPLITE 测定来检查经转染细胞对 TRA-8 介导的细胞凋亡的敏感性。 全长重组 DDX3 的表达并不改变对 TRA-8 介导的细胞凋亡 的敏感性， 因为 TRA-8 处理后， 所有测试细胞保持抗性。然而， 下调 DR5 缔合的 cIAP1 后， 表 达高水平 DDX3ΔCARD 的 TRA-8 抗性肿瘤细胞重新获得其对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的敏感 性。这些数据表明 cIAP1 对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的抑制由 DDX3 的完整 CARD 来介导。缺 乏 N 端 CARD 的 DDX3 可作为部分逆转 TRA-8 抗性的显性负调节物。癌细胞对 TRA-8 诱导的 细胞凋亡的潜在敏感性可由 DDX3 的水平和 DR5 缔合的复合物上的 cIAP1 来调控。
DR5-DDX3-cIAP1 复合物抑制半胱天冬酶 -8 激活。将 DDX3 量化以检查与 DR5DISC 处的半胱天冬酶 -8 募集和加工相关的存在于细胞中的 DDX3 的水平如何。用 TRA-8 处理 MDA231 和 UL-3C 亲代细胞和抗性细胞 4 小时， 并且 DR5 与新抗 DR5 单克隆抗体 ( 克隆 ： 2B4) 免疫沉淀， 所述新抗 DR5 单克隆抗体识别不同于 TRA-8 的 DR5 表位。将 DR5/DDX3/cIAP1 复 合物从珠子中释放， 并且使用抗 DDX3 和抗 cIAP1 抗体对 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 进行免 疫印迹和夹心 ELISA 分析。用 2B4 抗 -DR5 抗体涂布 ELISA 板以捕获免疫沉淀的 DR5， 并且 通过针对 DDX3(3E2) 和 cIAP1 的特异性单克隆抗体来测量 DDX3 和 cIAP1。用 TRA-8 处理 亲代敏感或诱导抗性肿瘤细胞并不改变 DR5 蛋白质水平。然而， 在敏感和抗性细胞二者中， TRA-8 处理显著改变了 DR5 缔合的 DDX3 的水平。首先， 如通过 3E2 抗 DDX3 抗体所检测， 与 未处理敏感细胞相比， 未处理抗性细胞表达较高水平的 DR5 缔合的 DDX3。重要的是， TRA-8 处理后， DR5 缔合的 DDX3 在 TRA-8 抗性细胞中显著增加但在敏感细胞中显示明显减少。 DR5 复合物中的 cIAP1 的水平也以与 DDX3 相同的方式被改变。 这些结果表明， 细胞凋亡过程中， 在 TRA-8 敏感细胞中， DDX3 的 CARD 结构域被裂解并且 DDX3 从 DR5 复合物释放， 而在抗性 细胞而不是敏感细胞中， TRA-8 刺激后， DDX3 和 cIAP1 被募集至 DR5。
为形成功能性 DISC， 癌细胞有必要从 DR5 复合物释放 cIAP1 以减少在 TRA-8 诱导 的细胞凋亡过程中其对半胱天冬酶的抑制。这个过程需要裂解 DDX3， 表明该步骤对起始前 馈细胞凋亡扩增循环 (feed-forward apoptosisamplmcation loop) 是重要的。 因为 DR5 缔 合的 DDX3 对裂解的抗性与抗性细胞中不能形成 DISC 相关， 因此 DR5-DDX3-cIAP1 复合物上 的 DDX3 裂解敏感性在亲代细胞和抗性细胞之间是不同的。分析了在两种细胞中由不同半 胱天冬酶引起的 DR5 缔合的 DDX3 的裂解可能性。DR5-DDX3-cIAP1 复合物与抗 DR5 抗体免 疫共沉淀。将来自珠子的洗提组分与活性半胱天冬酶 -2 和半胱天冬酶 -8 一起孵育。通过 用抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹分析检测 DDX3 的裂解。这些结果结合 ELISA 分析显示， 与敏 感细胞相比， 抗性细胞中由半胱天冬酶 -8 引起的 DDX3 裂解被高度衰减， 尽管半胱天冬酶 -2 在两种细胞中表现相似的蛋白酶潜能。这些结果表明 TRA-8 敏感细胞和 TRA-8 抗性细胞之 间存在 DDX3 复合物的功能差异。其还表明死亡受体连接的初始半胱天冬酶未能裂解 DDX3 是发展 TRA-8 抗性的关键步骤。
因为在经诱导的抗性细胞中， DDX3 的裂解被抑制， 这促使进行研究以确定其中DDX3 抑制 DR5 介导的细胞凋亡的细胞凋亡信号转导的步骤。 预测 DDX3/cIAP1 复合物抑制半 胱天冬酶 -8 激活 ； 因此， 检查了受体激发之后作为基本可检测事件之一的 DR5-DDX3-cIAP1 复合物上半胱天冬酶 -8 的激活。 为评估 DR5-DDX3-cIAP1 复合物对半胱天冬酶 -8 激活的作 用， 使用荧光底物 (Ac-IETD-AMC) 测量半胱天冬酶活性， 所述荧光底物 (Ac-IETD-AMC) 与活 性半胱天冬酶 -8 和来自亲代敏感细胞或诱导抗性细胞的 DDX3 co-IP 洗提组分一起孵育。 与敏感细胞相比， 在来自抗性细胞的 DR5 co-IP 洗提组分的大范围稀释中观察到半胱天冬 酶 -8 活性的剂量依赖性抑制。此外， 纯化的 cIAP1 也完全抑制半胱天冬酶 -8 蛋白酶活性。 似乎合理的是， DDX3 缔合的 cIAP1 是半胱天冬酶 -8 初始激活的抑制剂， 因而防止 DDX3 的 裂解。因此， 这些数据提供了直接的证据， 即 DDX3-cIAP1 可调控半胱天冬酶 -8 活性， 并且 表明 DDX3-cIAP1 是通过 DR5 接合的半胱天冬酶 -8 的特异性调节剂。
DR5-DDX3-cIAP1 对半胱天冬酶 -8 激活的作用通过直接分析 cIAP1 抑制的半胱天 冬酶 -8 结合通过半胱天冬酶测定的 DDX3 的裂解来检查， 并且显示 DDX3-cIAP1 也充当新型 半胱天冬酶抑制剂。DDX3-cIAP1 复合物通过抑制半胱天冬酶 -8 激活而能够捕获死亡受体 促凋亡信号， 因而抑制由初始半胱天冬酶引起的 DR5 缔合的 DDX3 的裂解。 该模型显示 DDX3 经由募集 cIAP1 来保护细胞免受 TRA-8 诱导的细胞凋亡并且有助于癌细胞中死亡信号转导 途径的封阻。
实施例 2 ： 对于三阴性 (TN) 基底细胞乳腺癌细胞系的抗 DR5 介导的细胞毒性。
如表 3 和 4 中所总结， 使用一组 26 个乳腺癌细胞系研究对 TRA-8(DR5) 抗体的细 胞毒性反应与乳腺癌亚型之间的关系， 所述 26 个乳腺癌细胞系包括 15 个分类为基底细胞 ( 基底细胞 A 和基底细胞 B) 的细胞系、 2 个 HER-2 过表达基底细胞和 9 个表达管腔表型的 细胞系。TRA-8 诱导 15 个三阴性乳腺细胞 (TNBC) 细胞系 ( 基底细胞 ) 中的 12 个死亡， 其 中 IC50 值的范围是 0.9 至 4.8ng/ml( 表 3)。图 1 中示出 TRA-8 针对基底细胞 B 亚型的 4 个 细胞系的细胞毒性。TRAIL 产生相当的细胞毒性。9 个管腔乳腺癌细胞系对 TRA-8 都有抗 性 ( 表 4)。用 TRA-8 抗体和化学治疗药物 ( 包括阿霉素、 顺铂和卡铂 ) 的组合处理产生另 外的基底细胞 A 和基底细胞 B 乳腺癌细胞系的协同死亡 ( 图 2)。使用 TRA-8 和化学治疗的 组合， HCC1937( 对 TRA-8 有抗性的 BRCA-1 突变细胞系 ) 表现协同的细胞毒性 ( 图 2)。
表3： TNBC 细胞系的 TRA-8 敏感性。
细胞系 SUM149 2LMP HCC38 SUM159 MDA-MB-436 IC50(ng/ml) 0.9 1.1 0.9 1.9 3.2 肿瘤 炎症性导管癌， 1° 腺癌， 胸腔积液 导管癌， 1° 未分化癌， 1° 腺癌， 胸腔积液管内癌， 1° 腺癌， 1° 腺癌， 胸腔积液 髓样癌， 胸腔积液 管内癌 - 乳突状， 1° 导管癌， 1° 腺癌， 胸腔积液 导管癌， 1° 导管癌， 1° 导管癌， 1°表4： ER+( 管腔 ) 细胞系的 TRA-8 敏感性实施例 3 ： DR5/DDX3/cIAP1 细胞凋亡抑制性复合物的表征。
如上所述， DR5/DDX3/cIAP1 充当负调控复合物， 其对抗 DISC 的形成和功能。因 此， DR5 缔合的 DDX3 和募集的细胞凋亡抑制剂是癌细胞对 DR5 介导的细胞凋亡的敏感性的 预测性生物标记。图 3 说明了一种模型。在该模型中， DDX3 结合与 DR5 的死亡结构域邻近 的区。如同 RNA 解旋酶家族的其它成员， DDX3 在其 N 端含有 CARD， 其负责通过 CARD/CARD 相互作用募集细胞凋亡的抑制剂 (IAP)。此外， 募集的 IAP 经由其杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 来抑制半胱天冬酶的活性， 因而抑制死亡结构域的初始细胞凋亡信号转导。 该模型的 新颖性在于 DR5 的细胞质尾含有至少两个功能上不同的结构域， 其相互作用以决定 DR5 的 细胞凋亡信号转导。当 DDX3/IAP 复合物比死亡结构域复合物占优势时， 癌细胞转向对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性。因此， DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 可充当用于预测肿瘤细胞对抗
DR5(TRA-8) 介导的细胞凋亡的反应的生物标记， 并且也充当用于增强 DR5 介导的细胞凋亡 的药物靶标。
检查了具有确定的对 TRA-8 介导的细胞凋亡的敏感性的一组癌细胞中 DR5 缔合的 蛋白质的蛋白表达谱。这导致将 DDX3 鉴定为新型的 DR5 缔合的衔接蛋白， 其介导 DR5 的死 亡结构域的细胞凋亡抗性。
缺乏 DDX3 结合结构域的 DR5 更加促进细胞凋亡。如上所述， 发现 DDX3 结合结构 域为 DR5 的细胞质尾的氨基酸 300 至 330 的区。具有该区的截短的突变 DR5(D7) 丧失 DDX3 结合而 DR5 的表面表达没有改变。与表达野生型 DR5 的细胞相比， 截短的 DR5 表现增加的 自发性细胞凋亡和 TRA-8 诱导的细胞凋亡。这些结果表明 DR5 的细胞质尾具有经由 DDX3 结合而负调控 DR5 细胞凋亡信号转导的功能区。
DDX3 的敲低逆转 DR5 细胞凋亡抗性。 用 siRNA 敲低 DR5 细胞凋亡抗性细胞中 DDX3 的表达 ( 图 4A)， 所述 DR5 细胞凋亡抗性细胞包括诱导的抗性细胞 (MDA231R 和 UL-3CR) 和 自发抗性细胞 (SKW620、 HT29 和 SKW1116)， 并且分析肿瘤细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的 敏感性。DDX3 表达降低后， 所有抗性细胞中的细胞凋亡抗性被逆转 ( 图 4B)， 表明 DDX3 是 DR5 介导的细胞凋亡的负调节剂。
DDX3 是募集 cIAP1 并抑制 DR5 介导的细胞凋亡的 CARD 蛋白。类似于其它解旋酶 蛋白诸如 MDA5 和 RIG-1， DDX3 在其 N 端具有保守的 CARD。免疫共沉淀显示野生型 DDX3 能 够下拉 (pull-down)cIAP1( 图 5A)。然而， DDX3 的开始 100 个残基的截短 (DN) 导致 cIAP1 免疫共沉淀的丧失。TRA-8 处理后， 如通过 FADD 募集所示， 表达 CARD 截短的 DDX3 的细胞中 的 DISC 功能恢复。表达缺乏 CARD 的 DDX3 的 DR5 抗性肿瘤细胞变得对 TRA-8 诱导的细胞 凋亡更加敏感 ( 图 5B)。这些结果表明 DDX3 充当 DR5 的衔接蛋白。虽然 DDX3 结合 DR5， 但 其 CARD 募集 cIAP1 从而抑制死亡结构域的 DR5 介导的细胞凋亡。
DR5/DDX3/cIAP1 蛋白质复合物是 DR5 介导的细胞凋亡的预测性生物标记。已开 发了使用全细胞裂解物来定量测量 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的测定。DR5 免疫共沉淀后， 通 过夹心 ELISA 测量 DR5、 DDX3 和 cIAP1 的量。当 DR5 在敏感亲代细胞 (MDA231P 和 UL-3CP) 和抗性细胞 (MDA231R 和 UL-3CR) 中同样沉淀时， 缔合的 DDX3 和 cIAP1 在敏感细胞中较低 但在抗性细胞中非常高 ( 图 6A)。 进一步分析一组具有确定的 TRA-8 敏感性的人癌细胞系。 与一组 TRA-8 敏感细胞相比， 一组 TRA-8 抗性细胞表达非常高水平的 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1( 图 6B)。这些结果表明 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 不仅在诱导的抗性细胞中而且在 发展自发性抗性的细胞中用于 TRA-8 抗性的诱导。
三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 蛋白质复合物。最近已证明所有 TNBC 细胞表达细胞表面 DR5 并对 TRA-8 诱导的细胞凋亡敏感， 而非 TNBC 细胞却始终有抗 性。 因此， 检查一组 TNBC 细胞系中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 在 TNBC 细胞中较低 ( 图 7A 和表 5)。有趣的是， 在一些 TNBC 细胞中， 如通过抗 C 端 DDX3 抗体 3E4 所证明， 与 DR5 免疫共沉淀的 DDX3 的分子量较小 ( 图 7B)。这是由于丧失 N 端 CARD 所 造成， 如通过 N 端 CARD 特异性抗 DDX3 抗体 3E2 所测定。与 CARD 的丧失相对应， 这些 TNBC 细胞中缔合的 cIAP1 也减少。DDX3 的 2D-SDS-PAGE 的蛋白质组学分析揭示 TNBC 细胞中的 DDX3 蛋白表达谱改变。这些结果表明 TNBC 细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物可能改变， 这 可能是这些细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的高度敏感性的原因。新型抗体识别 BIR。在筛选抗 IAP 单克隆抗体池的过程中， 鉴定了唯一的单克隆 抗体 (3H4)。3H4 抗体相同地结合 cIAP1、 cIAP2 和 XIAP 但不结合生存素 ( 图 8A)。因为仅 这些蛋白质的共同表位或结构是 BIR 结构域， 所以怀疑该特定抗体是 BIR 结构域特异性抗 体。使用一系列截短的 IAP 蛋白来对 3H4 抗体的表位作图， 并且发现由 3H4 识别的表位是 cIAP1、 cIAP2 和 XIAP 的第二 BIR 结构域 ( 图 8B)， 其在生存素中不存在。蛋白质印迹分析 显示 3H4 抗体检测 68kDacIAP1 或 cIAP2 和 58kDa XIAP。除了这些已知的 IAP 蛋白外， 3H4 还检测未知的 80kDa 蛋白， 如在一组胰腺癌细胞系中所示 ( 图 8C)。
表5： TNBC( 基底细胞 ) 细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的高度敏感性与 DR5/DDX3/ IAP 复合物降低的表达相关。
类型 管腔细胞 细胞系 MCF-7 ZR75-1 MDA-MB-134 HER2， ER+ DY36T2 ZR75-30 HER2， ER基底细胞 HER2+， ERMDA-MB-453 HCC1569 HCC1954 TNBC(BASAL A) MDA-MB-468 HCC1187 BT-20 HCC1937 HCC1143 TNBC(BASAL B) SUM149 HCC38 2LMP SUM159 23 IC50 ＞ 1000 683 ＞ 1000 ＞ 1000 ＞ 1000 ＞ 1000 360 488 17 24 48 ＞ 1000 ＞ 1000 0.9 0.9 1.1 1.9 DR5/DDX3 0.767 0.417 0.914 0.645 0.588 1.551 0.391 0.522 0.247 0.629 0.487 0.562 0.822 0.018 0.367 0.178 0.038 DDX3/IAP 0.962 0.371 1.243 0.967 1.025 1.002 0.552 0.960 0.219 0.356 0.171 1.105 1.347 0.026 0.048 0.218 0.134CN 102666588 A SUM102 BT-549 MDA-MB-231
说明书4.5 18 18 0.133 0.255 0.212 0.155 0.076 0.15821/22 页DDX3/IAP 复合物中 IAP 的下调。AT-406( 由 Ascenta Pharmaceuticals 开发 ) 以 低纳摩尔级亲和力结合多种 IAP 蛋白， 包括 cIAP1、 cIAP2 和 XIAP。已显示 AT-406 协同地增 强 TRAIL 介导的细胞凋亡。为确定 AT-406 是否能够克服胰腺癌细胞的 DR5 细胞凋亡抗性， 对两个人胰腺癌细胞系 (S013 和 S2VP10) 检查了 AT406 对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的作用， 所述两个细胞系对 TRA-8 诱导的细胞凋亡有高度抗性。在用 1000ng/ml 的 TRA-8 处理后， 有非常少量的凋亡细胞。单独 10μM AT406 处理并不诱导显著的细胞死亡。然而， 组合处 理导致多于 70％的细胞死亡。 如通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析所示， 单独 AT-406 并 不改变总 IAP 蛋白表达 ( 图 9A)。然而， 组合处理导致所有 IAP 的减少， 证明细胞凋亡的协 同诱导促进 IAP 蛋白的 AT-406 诱导的降解。为确定 AT-406 对 DR5/DDX3/cIAP1 蛋白质复 合物的作用， 通过 DR5-coIP 检查 cIAP1 的量。单独 AT406 和组合处理后， 在 DR5 复合物中 存在 cIAP1 的显著降低 ( 图 9B)。这不是由于 DR5 缔合的 DDX3 的降低而造成的， 因为 DDX3 与 DR5 同样地免疫共沉淀。这些结果显示 AT-406 选择性地靶向 DR5/DDX3 蛋白质复合物中 的 cIAP1。 AT406 对乳腺癌中 IAP 的体外作用。在一组乳腺癌细胞系 ( 包括三阴性和非三阴 性细胞系 ) 中分析了 AT406 对 DDX3 复合物中 IAP 蛋白表达的作用。如之前所示， 与两个非 三阴性细胞系 BT474 和 MB468( 图 10C)( 其对 TRA-8 介导的细胞凋亡有抗性 ) 相比， 当与 DDX3 免疫共沉淀时， 4 个三阴性乳腺癌细胞系 MB435、 2LMP( 图 10A)、 SUM 159 和 SUM 149( 图 10B)， 表达较低水平的 cIAP1 或 cIAP2 蛋白。单独 TRA-8 处理并不改变 IAP 蛋白的水平。然 而， 单独 AT406( 图 10A-10C， 泳道 3) 或与 TRA-8 组合 ( 图 10A-10C， 泳道 4) 显著降低了与 DDX3 缔合的 IAP 蛋白的水平。
由 TRA-8 和 AT406C 产生的细胞毒性。检查了针对乳腺癌细胞系， AT-406 对 TRA-8 介导的细胞凋亡的作用。存在针对 BT-474、 BT-549 和 2LMP 细胞的 AT-406 和 TRA-8 之间相 互作用的证据 ( 图 11)。也检查了阿霉素对 AT-406 和 TRA-8 介导的细胞凋亡的作用。用 AT-406、 阿霉素和 TRA-8 组合处理 2LMP 细胞后， 存在增强的细胞毒性 ( 图 12)。
TRA-8 和阿霉素或白蛋白结合型紫杉醇针对 TNBC 异种移植物的体内功效。 在无胸 腺裸小鼠中使用 2LMP 和 SUM159 原位基底细胞 B 异种移植物模型检查了单独 TRA-8 和 TRA-8 与白蛋白结合型紫杉醇或阿霉素的组合的体内抗肿瘤功效。一旦肿瘤被充分建立 ( 其中肿 瘤直径为约 6mm) 即开始治疗， 并随时间监测肿瘤大小。 未治疗 SUM159 肿瘤的平均肿瘤大小 在 17.9 天加倍。如图 13A 所示， 与未治疗的对照肿瘤相比， 用单独 TRA-8 治疗携带 SUM159 肿瘤的小鼠产生肿瘤生长的显著抑制， 其中肿瘤加倍时间是 81.3 天， 而用单独阿霉素或白 蛋白结合型紫杉醇治疗将平均肿瘤加倍时间分别延长至 41.9 和 49.3 天。用 TRA-8 和阿霉 素的组合治疗导致平均肿瘤大小的减小 ( 这反映由单独 TRA-8 引起的肿瘤生长抑制 ) 并产 生平均肿瘤加倍时间为 84.7 天和 1/10 完全肿瘤退化， 而在用单独 TRA-8 治疗的小鼠中没 有发生完全肿瘤退化。用 TRA-8 和白蛋白结合型紫杉醇治疗的动物显示与用单独 TRA-8 或
TRA-8 与阿霉素治疗的那些相似的肿瘤生长抑制， 其中平均肿瘤加倍时间为 74.7 天。
如图 13B 所示， 未治疗小鼠中的平均 2LMP 肿瘤大小在 8.6 天加倍， 证明这种侵略 性原位肿瘤模型的迅速生长。用单独白蛋白结合型紫杉醇治疗产生 1/10 完全肿瘤退化并 将肿瘤加倍时间延长至 46.2 天。作为针对 2LMP 异种移植物的单独药剂， 阿霉素比白蛋白 结合型紫杉醇更有效， 并将肿瘤加倍时间增加至 51.1 天。 用单独 TRA-8 治疗显著抑制 2LMP 肿瘤生长， 将肿瘤加倍时间延长至 58.4 天， 并引起 2/10 完全肿瘤退化。用 TRA-8 和阿霉素 组合治疗引起平均肿瘤大小的显著减小并将肿瘤加倍的平均时间增加至 78.2 天。 用 TRA-8 和白蛋白结合型紫杉醇组合治疗是最有效的方案， 其将加倍的平均时间增加至 87.2 天， 并 产生 2/9 完全肿瘤退化。这些结果证明针对基底细胞 B 肿瘤异种移植物， 使用化学治疗药 物结合 TRA-8 的增强的体内功效。
本申请要求 2009 年 11 月 5 日提交的美国临时申请 No.61/258,274 的权益， 其全 部内容以引用的方式并入本文。
背景
三阴性乳腺癌 (TNBC) 代表相当比例 ( 约 20-25％ ) 的乳腺癌患者。TNBC 以缺乏 HER2、 雌激素受体 (ER) 和孕酮受体 (PR) 为特征。 TNBC 具有不良预后， 并且迄今没有发现治 疗的靶向途径。
概述
提供了治疗患有癌症的受治疗者的方法。 所述方法包括选择患有乳腺癌的受治疗 者， 其中乳腺癌是基底细胞样基因型癌症并且其中乳腺癌是 HER2 非扩增的， 和对受治疗者 施用死亡受体激动剂。
任选地， 所述方法包括选择患有乳腺癌的受治疗者， 其中乳腺癌具有选自由管腔 细胞、 HER2 扩增的或基底细胞样基因型组成的组的一种或多种特征 ； 对受治疗者施用 IAP 抑制剂 ； 和对受治疗者施用死亡受体激动剂。
也提供筛选乳腺癌细胞对 DR5 激动剂的反应性的方法。所述方法包括检测癌细胞 中的基底细胞样表型 ； 检测癌细胞是 HER2 非扩增的 ； 和检测与对照相比癌细胞中降低水平 的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。
也提供筛选三阴性乳腺癌细胞对 DR5 激动剂的反应性的方法。任选地， 所述方法 包括检测细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的水平并将其与对照进行比较。与对照相比， 细 胞中较低水平的复合物表明反应性。
任选地， 所述方法包括检测乳腺癌细胞中缺乏 N 端半胱天冬酶相关募集结构域 (CARD) 的 DDX3。缺乏 N 端 CARD 的 DDX3 表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂有反应性。
任选地， 所述方法包括检测乳腺癌细胞中包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列的 IAP 蛋白。80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂没有反应性。
还提供与 DDX3 的 N 端 CARD 选择性结合的抗体。也提供与缺乏 N 端 CARD 的 DDX3 选择性结合的抗体。也提供与包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 的 IAP 蛋白选择性 结合的抗体。
附图描述
图 1 示出显示用 TRA-8 处理后三阴性乳腺癌细胞系经历细胞凋亡的图。在体外用 TRA-8 处理三阴性乳腺癌细胞系 24 小时。 使用基于荧光素酶的测定来测定细胞成活力以测 量 ATP 水平。相对于未处理的对照细胞， 将值表示为平均值和标准差 (n ＝ 6 次重复 )。
图 2A 和 2B 示出用 TRA-8 和化学治疗药物的组合的处理引起对基底细胞 A 和基底 细胞 B 乳腺癌细胞系的附加或协同作用。图 2A 示出显示用 TRA-8 抗体和化学治疗剂 ( 顺 铂、 卡铂和阿霉素 ) 的组合处理的三阴性基底细胞 B SUM159 乳腺癌细胞中增加的细胞凋亡 的图。图 2B 示出显示用 TRA-8 抗体和化学治疗剂 ( 顺铂、 卡铂和阿霉素 ) 的组合处理的 三阴性上皮基底细胞 A HCC1937 乳腺癌细胞中增加的细胞凋亡的图。用化学治疗剂预处
理 SUM159 和 HCC1937 乳腺癌细胞 24 小时并且然后用 TRA-8 抗体再处理 24 小时。用单独 TRA-8 抗体、 单独化学治疗化合物或用 TRA-8 加化学治疗化合物的组合处理细胞。 通过测量 ATP 水平来测定细胞成活力。将值表示为平均值和标准差 (n ＝ 4 次重复 )。
图 3 示出 DR5/DDX3/IAP 细胞凋亡抑制性复合物的模型。
图 4 示出 DDX3 的 siRNA 介导的敲低逆转对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性。图 4A 示 出蛋白质印迹的图像， 其显示用针对 DDX3 mRNA 的 siRNA 处理的细胞中降低的 DDX3 蛋白表 达。图 4B 示出显示用 TRA-8 抗体处理的 DDX3 表达降低的细胞中增加的细胞凋亡的图。
图 5 示出 DR5 缔合的 DDX3 通过 DDX3 CARD 募集 cIAP1 并且抑制细胞凋亡。图 5A 示出蛋白质印迹的图像， 其显示全长 DDX3 通过向 DR5 募集 cIAP1 来抑制细胞凋亡。如通过 FADD 募集所示， 用 TRA-8 处理后， 表达 CARD 截短的 DDX3(DN) 的细胞已恢复死亡结构域诱 导信号复合物 (DISC) 功能。图 5B 示出显示表达缺乏 CARD 的 DDX3 的 DR5 抗性肿瘤细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡变得更加敏感。
图 6 示出可在 TRA-8 敏感和抗性细胞中定量的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。图 6A 示 出显示 TRA-8 敏感 MDA231P 和 UL-3CP 细胞系中 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 低于 TRA-8 抗性 MDA231R 和 UL-3CR 细胞系的图。图 6B 示出显示与一组 TRA-8 敏感细胞系相比， TRA-8 抗性 细胞系表达较高水平的 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 蛋白的柱形图。 图 7 示出三阴性和非三阴性乳腺癌细胞系中 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的差异。图 7A 示出显示三阴性乳腺癌细胞系 (SUM149、 SUM159、 SUM102、 2LMP、 HCC38、 BT20) 中 DR5 缔合 的 DDX3 和 cIAP1 较低的图。图 7B 示出蛋白质印迹的图像， 其显示在一些三阴性乳腺癌细 胞系中， 由于 N 端 CARD 的丧失， 与 DR5 共免疫沉淀的 DDX3 的分子量低于非三阴性乳腺癌细 胞系。
图 8 示出识别杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 的新型抗体 (3H4) 的特征。 图 8A 示出 3H4 与 cIAP1、 cIAP2、 XIAP 和生存素 (survivin) 的结合特征。图 8B 示出被 3H4 识别的共用 表位的序列。 上部序列是 cIAP1(SEQ ID NO ： 31) 的第二 BIR 结构域 ； 中间序列是 cIAP2(SEQ ID NO ： 32) 的第二 BIR 结构域 ； 底部序列是 XIAP(SEQ ID NO ： 33) 的第二 BIR 结构域。 图 8C 示出用 3H4 对来自一组人胰腺癌细胞系的全细胞裂解物进行的蛋白质印迹分析。泳道 1 ： MIAcapa ； 2： BXPC3 ； 3： Panc 1 ； 4： Panc 2.03 ； 5 S2013 ； 6： S2VP10。
图 9 示出 DDX3/IAP 复合物中 IAP 的下调。图 9A 示出用 AT-406 和 TRA-8 组合处 理下调 DR5 细胞凋亡抗性胰腺细胞中 IAP 蛋白的表达。用对照介质 ( 泳道 1) 或 1000ng/ ml TRA-8( 泳道 2)， 或 10uM AT406( 泳道 3) 或两者 ( 泳道 4) 处理两种人胰腺癌细胞系， S2013( 左图 ) 和 S2VP10( 右图 )， 过夜。通过使用 3H4 抗体的蛋白质印迹分析全细胞裂解 物中的 IAP 蛋白。图 9B 示出 DDX3 复合物中的 IAP 蛋白。使来自以上处理细胞的细胞裂解 物与抗 DDX3 抗体 ( 克隆 3E4) 免疫沉淀。对沉淀的蛋白质进行免疫印迹并且用 3H4 抗体检 测 IAP 蛋白。
图 10 示出 AT-406 对乳腺癌细胞系中 IAP 的体外作用。介用对照质 ( 泳道 1) 或 1000ng/ml TRA-8( 泳道 2) 或 10uM AT406( 泳道 3) 或两者 ( 泳道 4) 处理人乳腺癌细胞系 (MB436 和 2LMP( 图 10A)、 SUM159 和 SUM149( 图 10B)、 BT474 和 MB468( 图 10C)， 过夜。使来 自处理细胞的细胞裂解物与抗 DDX3 抗体 ( 克隆 3E4) 免疫沉淀。对沉淀的蛋白质进行免疫 印迹并且用 3H4 抗体检测 IAP 蛋白。
图 11 示出通过 TRA-8 和 AT406 处理的组合治疗产生的细胞毒性。用 AT-406 处理 细胞 1 小时， 然后用 TRA-8 和 AT-406 处理 24 小时。在加入 TRA-8 后 24 小时通过测量 ATP 水平来测定细胞成活力。
图 12 示出与阿霉素组合， AT-406 增强 TRA-8 体外细胞毒性。TRA-8、 AT-406 和阿 霉素以单独药剂使用或组合使用。在 AT-406 之前 24 小时加入阿霉素， 且在 AT-406 之后 1 小时加入 TRA-8。在加入 TRA-8 后 24 小时通过测量 ATP 水平来测定细胞成活力。
图 13 示出针对无胸腺裸小鼠中原位基底细胞 B 异种移植物的单独 TRA-8 或与白 蛋白结合型紫杉醇 (Abraxane) 或阿霉素 (Adriamycin) 组合的体内功效。将 SUM159( 图 13A) 或 2LMP( 图 13B) 细胞植入乳腺脂肪垫中， 并且在肿瘤被充分建立时， 14 天后开始治 疗。箭头指示施用抗体的间隔 (n ＝ 9-10 只小鼠 / 组 )。
图 14 示出针对无胸腺裸小鼠中 2LMP 原位基底细胞 B 异种移植物的 TRA-8 或白蛋 白结合型紫杉醇与 AT-406 组合的体内功效。将 2LMP 细胞植入乳腺脂肪垫中， 并且在肿瘤 被充分建立时， 10 天后开始治疗。条形指示施用抗体的间隔 (n ＝ 10 只小鼠 / 组 )。
详细描述
本文提供治疗患有癌症的受治疗者的方法。 所述方法包括选择患有乳腺癌的受治 疗者， 其中乳腺癌是基底细胞样基因型癌症并且其中乳腺癌是 HER2 扩增的 ； 和对受治疗者 施用死亡受体激动剂。任选地， 死亡受体激动剂是 DR5 激动剂。任选地， DR5 激动剂是抗体。 任选地， 死亡受体激动剂以三周、 两周或一周的间隔施用。
所述方法可以例如包括选择患有乳腺癌的受治疗者， 其中乳腺癌具有选自由管腔 细胞、 HER2 扩增的或基底细胞样基因型组成的组的一种或多种特征 ； 对受治疗者施用 IAP 抑制剂 ； 和对受治疗者施用死亡受体激动剂。任选地， IAP 抑制剂是 AT-406。
任选地， 所述方法还包括对受治疗者施用化学治疗剂。 任选地， 化学治疗剂是每三 周静脉内施用。 任选地， 化学治疗剂选自由阿霉素、 紫杉醇、 白蛋白结合型紫杉醇、 顺铂和卡 铂组成的组。
乳腺癌可以例如是雌激素受体阴性 (ER 阴性 )、 孕酮受体阴性 (PR 阴性 ) 或 ER 阴 性和 PR 阴性二者。任选地， 与对照相比， 乳腺癌显示降低水平的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。 任选地， 乳腺癌包含缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3。例如， 缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 具 有截短的或缺失的 N 端 CARD。可选地， 缺乏功能性 CARD 的 DDX3 具有在 N 端 CARD 的突变。
任选地， 在不存在死亡受体激动剂的情况下， 乳腺癌对化学治疗剂有抗性。 乳腺癌 可例如对阿霉素有抗性。任选地， 乳腺癌对紫杉醇有抗性。任选地， 乳腺癌对顺铂或卡铂有 抗性。
诱导肿瘤细胞的死亡受体介导的细胞凋亡是对癌症治疗有希望的方法。因为在 大多数 ( 如果不是全部 ) 治疗中， 所以一些靶细胞是有抗性的。例如， TRA-8 是唯一的竞争 性单克隆抗 DR5 抗体， 其诱导人癌细胞的细胞凋亡而没有肝细胞细胞毒性 (Ichikawa 等， Nat.Med.7 ： 954-960(2001))， 在动物模型中表现强抗癌功效 (Buchsbaum 等， Clin.Cancer Res.9 ： 3731-3741(2003)) 且在非人灵长类的毒性研究中具有已证明的安全性。因此， TRA-8 在本文用作实例， 但可在本文教导的方法中使用通过死亡受体 ( 例如， DR4 或 DR5) 激活而诱导细胞凋亡的其它药剂。虽然 TRA-8 与其人源化和人形式作为抗癌疗法正处于 临床开发， 但是尽管合理水平的 DR5 表达， 一些肿瘤细胞系对 TRA-8 介导的细胞凋亡有抗性。这些观察表明该抗性不与受体表达相关但与 DR5 起始的信号转导机制相关。确定的 是， DR5 介导的细胞凋亡可通过普通化学治疗剂而得到显著增强 (Ohtsuka 和 Zhou， J.Biol. Chem.277 ： 29294-29303(2002) ； Ohtsuka 等， Oncogene22 ： 2034-2044(2003))。虽然某些细 胞系对 TRA-8 介导的细胞凋亡有抗性， 但其它细胞系对 TRA-8 介导的细胞凋亡敏感。本文 已鉴定已知具有基底细胞样表型的一类乳腺癌对 TRA-8 介导的细胞凋亡敏感。如本文所证 明， 基底细胞样乳腺癌细胞系含有在 TRA-8 抗性癌细胞系中形成的 DR5/DDX3/cIAP 复合物 的改变。
基于基因表达、 细胞形态学和对治疗的反应， 可将乳腺癌分成至少五个不同的分 子亚型。可将乳腺癌首先分成两大组， 雌激素受体 (ER) 阳性和 ER 阴性。这两组还可细分 为另外不同的生物和临床显著的亚组。ER 阳性肿瘤表达雌激素受体、 ER 反应性基因和管腔 上皮细胞的其它蛋白质。因此， ER 阳性肿瘤是 “管腔肿瘤 (luminal tumor)” ， 取决于特征 性基因表达模式， 其可进一步分类为 A 型管腔肿瘤和 B 型管腔肿瘤。
可将 ER 阴性肿瘤进一步分类为三组 ： HER-2 阳性、 基底细胞样肿瘤和正常乳腺样 肿瘤。HER-2 阳性肿瘤表达高水平的位于染色体 17 的位置 17q21 上的 HER2 扩增子中的基 因， 包括 HER-2 和生长因子受体结合蛋白 7(GRB7)。它们也具有高水平的核因子 (NF)-κB 激活并表达高水平的转录因子 GATA4 但缺乏 ER 和 GATA3 的表达。正常乳腺样肿瘤类似正 常乳腺组织样本， 伴有许多基因 ( 以脂肪细胞和其它非上皮细胞类型为特征 ) 的相对高表 达和管腔上皮细胞基因的低水平表达。 基底细胞样肿瘤表达以基底细胞为特征的基因。 基底细胞样基因产物已牵扯在细 胞增殖、 细胞凋亡的抑制、 细胞迁移和 / 或侵入中， 这些是癌症的特点。基底细胞样肿瘤缺 乏 ER、 ER 反应性基因和其它以管腔上皮细胞为特征的其它基因的表达或表达低水平的 ER、 ER 反应性基因和其它以管腔上皮细胞为特征的其它基因。对于基底细胞样肿瘤的完整综 述， 参见 Rakha 等， J.Clin.Oncol.26 ： 2568-81(2008)。
所谓 “三阴性乳腺癌” 是指雌激素受体 (ER) 阴性、 孕酮受体 (PR) 阴性和 HER2 阴 性乳腺癌。三阴性乳腺癌不表达 ER、 PR 或 HER2。
所谓 “HER2 非扩增的” 是指位于染色体 17 的位置 17q12-q21 上的 HER2 扩增子的 扩增的缺乏。如在 Mano 等， Cancer Treat.Rev.33 ： 64-77(2007) 中所述， 可使用荧光原位 杂交 (FISH) 测定来确定 HER2 扩增子的扩增。HER2 扩增子的扩增见于 HER2 阳性癌症中， 而 HER2 扩增的缺乏则见于基底细胞样表型乳腺癌中。
所谓 “死亡受体” 是指一旦被配体结合就诱导细胞凋亡的受体。 死亡受体包括例如 具有死亡结构域的肿瘤坏死因子 (TNF) 受体超家族成员 ( 例如， TNFRI、 Fas、 DR3、 4、 5、 6)。
通过例如 DR5 的信号转导是控制 DR5 介导的细胞凋亡的关键机制。TNFR 超家 族的死亡受体的共同特征是它们都在其细胞质尾中具有保守的 “死亡结构域” (Zhou 等， Immunol.Res.26 ： 323-336(2002))。非常确定的是 DR5 介导的细胞凋亡开始于死亡结构 域。DR5 通过 TRAIL 或竞争性抗 DR5 抗体在细胞表面的交联导致 DR5 的寡聚， 之后立即将 FADD 募集到 DR5 的死亡结构域 (Bodmer 等， Nat.Cell Biol.2 ： 241-243(2000) ； Chaudhary 等， Immunity 7 ： 821-830(1997) ； Kuang 等， J.Biol.Chem.275 ： 25065-25068(2000) ； Schneider 等， Immunity7 ： 831-836(1997) ； Sprick 等， Immunity 12 ： 599-609(2000))。使 用 FADD 的死亡结构域进一步募集引发剂半胱天冬酶酶原 8 和 / 或半胱天冬酶酶原 10 以通
过亲同种抗原 DD 相互作用形成死亡结构域诱导信号复合体 (DISC)(Krammer， Nature407 ： 789-795(2000))。 激活的半胱天冬酶 8 和 10 可直接激活半胱天冬酶 3 或可裂解含 BH3 的蛋 白 Bid 以通过细胞色素 C 的释放和半胱天冬酶酶 9 激活来激活线粒体依赖性细胞凋亡途径 (Desagher 和 Martinou， Trends Cell Biol.10 ： 369-377(2000) ； Scaffidi 等， EMBO J.17 ： 1675-1687(1998))。形成死亡结构域复合体之后， 激活许多信号转导途径， 诸如半胱天冬 酶、 NF-κB 和 JNK/p38。这些信号转导途径的激活引起通过蛋白质的 Bcl-2 和 IAP 家族来 调节死亡受体介导的细胞凋亡。
所谓 “激动剂” 是指能够与细胞上的受体 ( 例如， 死亡受体 ) 结合并起始通常由内 源性配体的结合所产生的相同反应或活性 ( 例如， 细胞凋亡 ) 的物质。 本方法的激动剂可以 是死亡受体配体。因此， 激动剂可以是 TNF、 Fas 配体或 RAIL。激动剂还可以是包含死亡受 体结合结构域的这些配体的片段， 以便所述片段能够结合并激活死亡受体。激动剂还可以 是包含死亡受体结合结构域的融合蛋白， 以便所述融合蛋白能够结合并激活死亡受体。激 动剂也可以是具有与 TNF、 Fas 或 TRAIL 有至少 85％同源性的氨基酸序列的多肽， 以便所述 同源物能够结合并激活死亡受体。
激动剂还可以是与死亡受体结合的细胞凋亡诱导抗体。 “抗体” 可以是单克隆抗 体、 多克隆抗体、 嵌合抗体、 单链抗体、 人源化抗体、 全人抗体或其任何 Fab 或 F(ab′ )2 片 段。所谓 “细胞凋亡诱导抗体” 是指在使用本文提供的方法激活之前或之后导致编程性细 胞死亡的抗体。因此， 本方法的激动剂可以是对 Fas、 TNFR1 或 TRAIL 死亡受体特异的抗体， 以便抗体激活所述死亡受体。激动剂可以是对 DR4 或 DR5 特异的抗体。激动剂可以是与 小鼠 - 小鼠杂交瘤具有相同的表位特异性或由小鼠 - 小鼠杂交瘤分泌的 DR5 抗体， 所述小 鼠 - 小鼠杂交瘤具有 ATCC 登录号 PTA-1428( 例如， TRA-8 抗体 )、 ATCC 登录号 PTA-1741( 例 如， TRA-1 抗体 )、 ATCC 登录号 PTA-1742( 例如， TRA-10 抗体 )。激动剂可以是与杂交瘤具 有相同的表位特异性或由杂交瘤分泌的抗体， 所述杂交瘤具有 ATCC 登录号 PTA-3798( 例 如， 2E12 抗体 )。
由本方法的抗体靶向的 TRAIL 受体可以是 DR4 或 DR5。这类受体描述在已公布的 专利申请 WO99/03992、 WO98/35986、 WO98/41629、 WO98/32856、 WO00/66156、 WO98/46642、 WO98/5173、 WO99/02653、 WO99/09165、 WO99/11791、 WO99/12963 和 已 公 布 的 美 国 专 利 No.6,313,269， 对于其中所教导的受体， 这些专利申请和专利的全部内容都以引用的方式 并入本文。 可使用本领域已知的方法产生对这些受体特异的单克隆抗体。 参见例如， Kohler 和 Milstein， Nature， 256 ： 495-497(1975) 和 Eur.J.Immunol.6 ： 511-519(1976)， 对于这些 方法， 二者的全部内容在此以引用的方式并入。也参见已公布的专利申请 WO01/83560 中教 导的方法， 所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
所谓 “CARD” 是指半胱天冬酶相关的募集结构域。含有 CARD 的蛋白质以与死亡受 体结合的能力为特征， 其中结合任选地在死亡结构域之外并通过所述死亡受体的死亡结构 域来调节细胞凋亡的激活。DDX3 是以含有 CARD 为特征的蛋白质家族的代表性成员。
含有 CARD 的蛋白质已被确定为细胞死亡的关键调节剂。CARD 由在某些半胱天冬 酶的前结构域的 N 端发现的保守 α 螺旋束组成。CARD 也可发现于多种其它蛋白质中。如 同死亡结构域蛋白， CARD 充当同型蛋白质相互作用基序， 所述同型蛋白质相互作用基序允 许经由 CARD/CARD 相互作用的蛋白质的通讯。具有 CARD 的蛋白质可以是促进细胞凋亡的或抗细胞凋亡的。促进细胞凋亡的 CARD 结构域蛋白质包括某些半胱天冬酶， 诸如半胱天冬 酶 2、 4 和 9， 以及 Apaf1， 其在起始细胞凋亡中发挥重要作用。代表性的抗细胞凋亡 CARD 蛋 白质包括 cIAP1 和 cIAP2， 其与半胱天冬酶的 CARD 相互作用， 并经由其杆状病毒 IAP 重复序 列 (BIR) 结构域抑制半胱天冬酶激活。该家族蛋白质的功能的许多方面指向其作为新型药 物靶标在治疗癌症中的潜在效用。若干含有 CARD 的蛋白质是保守性细胞死亡机构的关键 组分， 当调节异常时， 所述保守性细胞死亡机构促进肿瘤发生并显著有助于肿瘤对化学疗 法的抗性。在一些癌症中失活的促进细胞凋亡的蛋白质 Apaf1 是对线粒体诱导的细胞凋亡 不可缺少的 CARD 蛋白。其它抗细胞凋亡的 CARD 蛋白， 诸如 IAP 家族的蛋白质， 已经显示保 护肿瘤免受细胞死亡刺激并以癌症的某些形式过表达。当与常规化学疗法结合使用时， 激 活或抑制 CARD 蛋白的治疗剂因此可以用作化学敏化剂或用作细胞凋亡的调节剂。
含有 CARD 的蛋白质的 CARD 参与募集细胞凋亡抑制剂 (IAP)， 所述细胞凋亡抑制剂 在病毒感染过程中抑制宿主细胞的细胞凋亡 (Crook 等， J.Virol.67 ： 2168-2174(1993))。 IAP 家族通过与成熟半胱天冬酶的酶活性相互作用和抑制成熟半胱天冬酶的酶活性来对 抗细胞死亡。已鉴定了八种不同的哺乳动物 IAP， 包括 XIAP、 c-IAP1、 c-IAP2 和 ML-IAP/ Livin( 参 见 例 如 Ashhab 等， FEBS Lett.495 ： 56-60(2001) ； Kasof 和 Gomes， J.Biol. Chem.276 ： 3238-3246(2001) ； Vucic 等， Curr.Biol.10 ： 1359-1366(2000))。所有 IAP 含有 一至三个杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 结构域并且具有同源序列。通过所述 BIR 结构域， IAP 分子结合并直接抑制半胱天冬酶 (Deveraux 和 Reed， Genes Dev.13 ： 239-252(1999) ； Deveraux 等， Nature 388 ： 300-304(1997))。 线 粒 体 蛋 白 Smac/DIABLO 可 结 合 并 对 抗 IAP(Suzuki 等， J.Biol.Chem.276 ： 27058-27063(2001)) 以 抑 制 IAP 功 能 (Wieland 等， Oncol.Res.12 ： 491-500(2000))。
在基底细胞样表型乳腺癌细胞中， DR5/DDX3/cIAP 复合物的水平可改变或降低。 如 下面所示， 例如可通过含有缺乏 N 端 CARD 的 DDX3 或在 N 端 CARD 具有突变的 DDX3 来改变 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。在用死亡受体激动剂治疗后， 含有缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 的复合物通常解离， 这允许 DR 介导的细胞凋亡。较低表达水平的 DDX3 或 cIAP 表达也可有 助于乳腺癌细胞中较低水平的 DR5/DDX3/cIAP 复合物。具有较低水平的复合物的细胞也对 用死亡受体激动剂处理敏感， 这允许 DR 介导的细胞凋亡。
提供了治疗患有癌症的受治疗者的方法， 包括对受治疗者施用死亡受体激动剂。 死亡受体激动剂可以例如与 IAP 抑制剂一起施用。 任选地， IAP 抑制剂是 AT406。 死亡受体激 动剂也可连同其它化学治疗剂施用。化学治疗剂的实例包括阿霉素 (adriamycin)、 博来霉 素 (bleomycin)、 卡铂、 苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、 顺铂、 秋水仙碱、 环磷酰胺、 道诺霉素 (daunorubicin)、 放线菌素 D(dactinomycin)、 己烯雌酚 (diethylstilbestrol)、 多柔比星 (doxorubicin)、 依托泊苷 (etoposide)、 5- 氟尿嘧啶、 氟尿苷、 美法仑 (melphalan)、 甲氨蝶 呤、 丝裂霉素、 6- 巯基嘌呤、 紫杉醇、 替尼泊苷 (teniposide)、 6- 硫鸟嘌呤、 长春新碱和长春 花碱。 化学治疗剂的其它实例可见于 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy， 第 18 版， Berkow 等编， Rahway， NH(2005) 和 Sladek 等， Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs， Powis 等编， Taylor and Francis， New York， NY(1987)。
本文提供治疗受治疗者的癌症的方法。 这类方法包括施用有效量的死亡受体激动 剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂或其组合。任选地， 死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂和其组合包含在药物组合物中。
本文提供含有所提供的死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂和其组合以及本 文所描述的药学上可接受的载体的组合物。本文提供的组合物适用于体外或体内施用。所 谓药学上可接受的载体是指不是在生物上或在其它方面不合需要的物质， 即， 将所述物质 施用于受治疗者而不引起不合需要的生物作用或不以有害的方式与含有其的药物组合物 的其它组分相互作用。 选择载体以最大程度降低活性成分的降解并最大程度地减少受治疗 者中不利的副作用。
合 适 的 载 体 和 其 制 剂 描 述 在 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， 第 21 版， David B.Troy 编， Lippicott Williams & Wilkins(2005)。通常， 将适 当量的药学上可接受的盐用在制剂中以使制剂是等渗的。 药学上可接受的载体的实例包括 但不限于无菌水、 盐水、 缓冲溶液如林格氏溶液 (Ringer′ s solution)， 和葡萄糖溶液。溶 液的 pH 一般约 5 至约 8 或从约 7 至 7.5。其它载体包括缓释制剂， 诸如含有免疫原性多肽 的固态疏水聚合物的半渗透矩阵。 矩阵是成形的物品的形式， 例如， 膜、 脂质体或微颗粒。 取 决于例如施用途径和被施用的组合物的浓度， 某些载体可以是更优选的。载体是适于对人 或其它受治疗者施用死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂和其组合的那些载体。
取决于是否需要局部或全身治疗， 和取决于待治疗的区域， 组合物以多种方式施 用。 组合物经由若干施用途径的任何一种施用， 所述若干施用途径包括局部、 口服、 胃肠外、 静脉内、 关节内、 腹膜内、 肌肉内、 皮下、 腔内、 透皮、 肝内、 颅内、 雾化 / 吸入， 或通过经由支 气管镜检安置。任选地， 组合物通过口腔吸入、 鼻吸入或鼻内粘膜施用而施用。通过吸入剂 施用组合物可经由用喷雾或滴液机构递送而通过鼻或口。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌含水或无水溶液、 悬浮液和乳状液。无水溶剂的 实例为丙二醇、 聚乙二醇、 植物油诸如橄榄油， 和可注射有机酯类诸如油酸乙酯。含水载体 包括水、 醇溶液 / 含水溶液、 乳状液或悬浮液， 包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯 化钠溶液、 林格氏葡萄糖、 葡萄糖和氯化钠、 乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物 包括流体和营养素补充剂、 电解质补充剂 ( 诸如基于林格氏葡萄糖的那些 ) 等。防腐剂和 其它添加剂任选地存在， 诸如例如抗菌剂、 抗氧化剂、 螯合剂和惰性气体等。
用于局部施用的制剂包括软膏剂、 洗剂、 乳膏剂、 凝胶剂、 滴剂、 栓剂、 喷雾剂、 液体 和粉剂。常规药物载体、 含水溶液、 粉末或油性基质、 增稠剂等是任选必需的或合意的。
用于口服施用的组合物包括粉剂或颗粒、 水或无水介质中的悬浮液或溶液、 胶囊、 小袋 (sachet) 或片剂。增稠剂、 香料、 稀释剂、 乳化剂、 分散助剂或粘合剂是任选合意的。
还提供筛选乳腺癌细胞对 DR5 激动剂的反应性的方法。所述方法包括检测癌细胞 中的基底细胞样表型 ； 检测癌细胞是 HER2 非扩增的 ； 和检测与对照相比癌细胞中降低水平 的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。所述方法还可包括例如测定癌细胞是雌激素受体阴性 (ER 阴 性 )、 孕酮受体阴性 (PR 阴性 ) 或 ER 阴性和 PR 阴性。任选地， DR5 激动剂是抗体。任选地， 乳腺癌细胞来自乳房活检。
也提供筛选乳腺癌细胞 ( 例如， 三阴性 ) 对 DR5 激动剂的反应性的方法。所述方 法可例如包括检测细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的水平并将其与对照进行比较。与对 照相比， 细胞中较低水平的复合物表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂有反应性。所述方法可例 如包括检测乳腺癌细胞中缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3。缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂有反应性。所述方法可例如包括检测乳腺癌细胞中包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 的 IAP 蛋白。80kDa BIR 表明乳腺癌细胞对 DR5 激动剂没有 反应性。
可用于测定样本中 DDX3、 缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX3 和包含 80kDaBIR 的 IAP 蛋白的表达水平的测定技术对本领域技术人员是已知的。这类测定方法包括放射免疫测 定 (RIA)、 免疫组织化学测定、 原位杂交测定、 竞争性结合测定、 蛋白质印迹分析和 ELISA 测 定。测定还包括使用选自由以下组成的组的测定来确定 RHA 的水平 ： 微阵列测定、 基因芯 片、 RNA 印迹、 原位杂交测定、 逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 测定、 一步 PCR 测定和实时 定量 (qRT)-PCR 测定。确定蛋白质或 RNA 表达的分析技术是已知的。参见例如 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， NY(2001)。
确定 DR5/DDX3/cIAP 复合物的水平的技术对本领域技术人员也是已知的。确定所 述复合物的水平的测定可选自由以下组成的组 ： 免疫沉淀测定、 免疫共沉淀测定和非凝胶 基方法， 诸如质谱法或蛋白质相互作用谱型分析， 诸如共定位测定。 所述测定在本领域是已 知的。参见例如， Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， NY(2001) ； Dickson， Methods Mol.Biol.461 ： 735-44(2008) ； 和 Zinchuk 等， Acta Histochem.Cytochem.40 ： 101-11(2007)。 还提供与 DDX3 的 N 端 CARD 选择性结合的抗体、 与缺乏 N 端 CARD 或缺乏功能性 N 端 CARD 的 DDX-3 选择性结合的抗体和与包含 80kDa 杆状病毒 IAP 重复序列的 IAP 蛋白结 合的抗体。
术语抗体在本文以广义使用并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。该术语还可 指的是人抗体和 / 或人源化抗体。用于产生人单克隆抗体的技术的实例包括由 Cole 等 (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， Alan R.Liss， p.77(1985)) 和由 Boerner 等 (J.Immunol.147(1) ： 86-95(1991)) 描述的那些。也可使用噬菌体展示文库来产生人抗 体 ( 和其片段 )(Hoogenboom 等， J.Mol.Biol.227 ： 381(1991) ； Marks 等， J.Mol.Biol.222 ： 581(1991))。还可从转基因动物获得所公开的人抗体。例如， 已经描述了能够响应于免疫 而产生全部人抗体的转基因、 突变小鼠 ( 参见例如， Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90 ： 2551-5(1993) ； Jakobovits 等， Nature 362 ： 255-8(1993) ； Bruggermann 等， Year in Immunol.7 ： 33(1993))。
如本文所使用， 术语肽、 多肽或蛋白质广义地使用是指由肽键连接的两个或多个 氨基酸。蛋白质、 肽和多肽在本文也互换使用以指的是氨基酸序列。应认识到， 术语多肽在 本文使用不暗示组成该分子的氨基酸的特定大小或数量， 以及本发明的肽可含有多达若干 氨基酸残基或更多。
如通篇所使用， 受治疗者可以是脊椎动物， 更具体为哺乳动物 ( 例如人、 马、 猫、 狗、 牛、 猪、 绵羊、 山羊、 小鼠、 兔、 大鼠和豚鼠 )、 鸟类、 爬行类、 两栖类、 鱼类和任何其它动物。 该术语不指示具体年龄和性别。因此， 意在涵盖成年和新生受治疗者， 不管雄性或雌性。如 本文所使用， 患者或受治疗者可互换使用并且可指的是患有疾病或病症 ( 例如癌症 ) 的受 治疗者。术语患者或受治疗者包括人和兽医受治疗者。
根据本文教导的方法， 对受治疗者施用有效量的死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化
学治疗剂或其任何组合。术语有效量和有效剂量互换使用。术语有效量定义为产生期望生 理反应所必需的任何量。可凭经验确定用于施用死亡受体激动剂、 IAP 抑制剂、 化学治疗剂 和其组合的有效量和进度表， 并且做出这种决定在本领域的技术范围内。用于施用的剂量 范围是足够大以产生期望的效果的那些， 其中影响 ( 例如， 减少或延迟 ) 疾病或病症的一种 或多种症状。 该剂量不应如此大以造成明显不利的副作用， 诸如有害的交叉反应、 过敏反应 等。 通常， 剂量将随年龄、 病状、 性别、 疾病的种类、 疾病或病症的程度、 施用途径或是否在方 案中包含其它药物而变化， 并且可由本领域技术人员确定。 在任何禁忌症的情况下， 可由个 体医师调整该剂量。 剂量可变化， 并且可以每天一次或多次剂量给药来施用， 持续一天或多 天。任选地， 死亡受体激动剂以三周、 两周或一周的间隔施用。任选地， 每三周施用化学治 疗剂。可在文献中找到对于关于药物产品的给定种类的适当剂量的指导。
如本文所使用的术语治疗 (treatment)、 治疗 (treat) 或治疗 (treating) 指的是 减少疾病或病状的作用或疾病或病状的症状的方法。因此在所公开的方法中， 治疗可指的 是确认的疾病或病状的严重性或疾病或病状的症状的 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 100％减少。例如， 如果与对照相比， 受治疗者的疾病的一种或多种症状 有 10％减少， 则认为用于治疗疾病的方法是治疗。因此， 与天然或对照水平相比， 减少可以 是 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或介于 10％和 100％之间的 任何百分数减少。可理解， 治疗不是必需指治愈或完全消除疾病、 病状或疾病或病状的症 状。 “任选的” 或 “任选地” 是指随后描述的事件、 情况或物质可能出现或存在或可能不 出现或不存在， 并且所述描述包括其中事件、 情况或物质出现或存在的实例和其中其不出 现或不存在的实例。
公开的是可用于、 可联合用于、 可用于制备所公开的方法和组合物的材料、 组合物 和组分， 或者公开的是所公开的方法和组合物的产物。 本文公开了这些和其它物质， 并且可 理解的是， 当公开这些物质的组合、 子集、 相互作用、 组等时， 尽管可能没有明确公开这些化 合物的每种不同个体和集体组合和排列的具体引用时， 但是上述每一种都具体预期并描述 于本文中。 例如， 如果公开并讨论了一种方法， 并且讨论了许多可对许多包括在本方法中的 分子进行的修改， 那么除非特别指出其相反的情况， 否则具体预期了本方法的每个和每种 组合和排列， 以及可能的修改。同样地， 也具体预期和公开了这些的任何子集和组合。该概 念应用于本公开的所有方面， 包括但不限于使用所公开组合物的方法中的步骤。 因此， 如果 存在多个可进行的附加步骤， 那么应理解的是， 这些附加步骤中的每一个可与所公开方法 的任何具体方法步骤或方法步骤的组合一起进行， 并且具体预期了每个这种组合或组合的 子集， 并且应认为被公开。
本文引用的出版物和它们引用的材料在此以引用的方式整体明确并入。
实施例 一般方法
细胞系、 抗体和试剂。
从美国组织培养库 (ATCC)(Manassas， VA) 购买人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231。获 得人卵巢癌细胞系 UL-3C。将细胞保持在用 10％热灭活的 FCS、 50μg/ml 链霉素和 50U/mL
青霉素 (Cellgro， Mediatech， Inc.， Manassas， VA) 补充的 DMEM 或 RPMI1640 中。
先 前 描 述 了 抗 人 DR4( 克 隆 ： 2E12) 和 抗 人 DR5( 克 隆 ： TRA-8) 单 克 隆 抗 体 (Ichikawa 等， 2003 ； Ichikawa 等， 2001)。培养抗人 DR5( 克隆 ： 2B4) 用于流式细胞术和 免疫沉淀测定。从 Alexis Biochemicals(San Diego， CA) 购买重组可溶 TRAIL。从 BD Pharmingen(San Diego， CA) 购买多克隆抗半胱天冬酶 3 和抗半胱天冬酶 8。制备单克隆抗 人半胱天冬酶 2、 3、 8、 9 和 10 抗体和单克隆抗人 Bcl-2、 Bcl-xL、 Bax、 cIAP-1、 cIAP-2、 XIAP 和生存素抗体。从 Cell Signaling Technology， Inc.(Beverly， MA) 购买抗 PARP 抗体。从 Sigm 购买抗 β- 肌动蛋白抗体。从 Transduction Laboratories(Lexington， KY) 购买抗 FADD。从 Southern Biotechnology Associates， Inc.(Birmingham， AL) 购买所有辣根过氧 化物酶 (HRP) 偶联第二试剂 (secondary reagent)。
从 EMD Biosciences， Inc(San Diego， CA) 购买活性半胱天冬酶 -1、 半胱天冬 酶 -2、 半胱天冬酶 -3、 半胱天冬酶 -6、 半胱天冬酶 -7、 半胱天冬酶 -8、 半胱天冬酶 -9 和半胱 天冬酶 -10。 从 Alexis Biochemicals ； San Diego， CA 购买荧光肽衍生物 Ac-Val-Asp-Val-A la-Asp-AMC(Ac-VDVAD-AMC， 260060M001， SEQ ID NO ： 1)、 Ac-Asp-Glu-Val-Asp- 氨基 -4- 甲 基香豆素 (Ac-DEVD-AMC， 260031M001， SEQ ID NO ： 2) 和 Ac- 羰基 -Ile-Glu-Thr-Asp-7- 氨 基 -4- 甲 基 香 豆 素 (Z-IETD-AMC， 260042M001， SEQ ID NO ： 3)。 从 R&D Systems， Inc(Minneapolis， MN) 购买半胱天冬酶 -2、 -3、 -8、 -10 抑制剂 (FMKSP01)。 对 TRA-8、 2E12 和 TRAIL 介导的细胞凋亡的肿瘤细胞敏感性的细胞毒性分析。
用 8 种浓度 ( 从 1000ng/ml 开始加倍连续稀释 ) 的 TRA-8、 2E12 或 TRAIL 将细胞 ( 每孔 1,000 个细胞 ) 以三个重复接种到 96 孔板。 过夜培养后， 根据制造商的说明 (Packard TM Instruments， Meriden， CT) 使用 ATPLITE 测定来确定细胞成活力。将结果呈现为与介质 对照孔相比经处理细胞中活细胞的百分比。
流式细胞术。
将细胞 (106) 用 PBS 洗涤一次， 并且重悬于含有一抗 (1μg/ml 的 TRA-8) 的 1ml 冷 FACS 缓冲液 ( 具有 5％ FBS 和 0.01％ NaN3 的 PBS) 中。使细胞在冰上染色 60 分钟， 然 后用 3ml 冷 FACS 缓冲液洗涤， 并在 4 ℃下于黑暗中与二抗 (PE 偶联的山羊抗小鼠 IgG 的 1 ∶ 100 稀释 ) 孵育 60 分钟。用 3ml FACS 缓冲液再次洗涤后， 通过 FACSCAN 流式细胞仪 (BD Biosciences ； San Jose， CA) 分析每个样本的 10,000 个细胞。
细胞凋亡相关蛋白质的蛋白质印迹分析。
将肿瘤细胞 (3×106) 用冷 PBS 洗涤两次并用含有 10mM Tris-HCl(pH 7.6)、 150mM NaCl、 0.5mM EDTA、 1mM EGTA、 0.1％ SDS、 1mM 原钒酸钠和蛋白酶抑制剂的混合物 (1mM 苯甲 磺酰氟、 1μg/ml 胃酶抑素 A、 2μg/ml 抑肽酶 ) 的 300μl 裂解缓冲液裂解。对细胞裂解 物进行声处理 10 秒并在 12,000g 下离心 20 分钟。使具有等量总蛋白质的细胞裂解物与 SDS-PAGE 样本缓冲液煮沸 5 分钟。 在 8％、 10％或 12％ SDS-PAGE 中分离总细胞裂解物， 并使 其电泳转移到硝酸纤维素膜上。用 5％脱脂奶粉在 TBST 缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)、 500mM NaCl 和 0.1％ Tween 20) 中封闭印迹， 并与一抗在封闭缓冲液中于 4℃下孵育过夜。 将印迹用 TBST 洗涤三次， 并在室温下用 HRP 偶联的二抗探测 1 小时。用 TBST 洗涤四次后， 根据制造商的说明， 使用 ECL 蛋白质印迹检测系统 (Amersham Biosciences ； Pittsburgh， PA) 使探测的蛋白质可见。
DDX3 的 siRNA 介导的敲低。
设计 RNAi ： 使用在线设计工具 BLOCK-iT RNAi Designer(Invitrogen ； Carlsbad， CA) 来鉴定 DDX3 的 RNAi 靶标。从上链 10 个最高得分的 RNAi 靶标中选择 5 个靶 siRNA 序 列 ( 见表 1)。
表1： siRNA 定向 ： 正义链 - 环 - 反义链
然 后 将 它 们 克 隆 到 BLOCK-iT U6 入 门 载 体 (entry vector)。siRNA 由 U6 启 动子驱动并且可在大多数分化或非分化哺乳动物细胞类型中短暂表达。使用 RNAi 的 LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen ； Carlsbad， CA) 转染抗性细胞以用于 RNAi 反应。转染后 36 小时， 通过使用抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹分析来测定降低的 DDX3 表达。在达到降低的 DDX3 表达时， 合成 siRNA 寡核苷酸 ( 靶序列 ： GGAGAAATTATCATGGGAAAC(SEQ ID NO ： 14) ： 正 义链 RNA5′ -Fl-GGAGAAAUUAUCAUGGGAAAC(Fl-SEQ ID NO ： 15)(Fl ＝荧光素 ) ； 反义链 RNA 5′ -GUUUCCCAUGAUAAUUUCUCC-3′ (SEQ ID NO ： 16)， 并且从 Molecula(Columbia， MD) 购买 RNAi 对照寡核苷酸。
表达载体的产生。
将全长 DDX3 克隆到 pcDNA3.1 质粒 (Invitrogen)， 其中 DDX3 的 N 端具有 His 标 签。使用下列引物对， 通过用从 MDA231 细胞提取的总 RNA 进行的逆转录酶聚合酶链式反应 (RT-PCR) 来产生 DDX3 和 DR5cDNA ： 具有 BamHI 的 DDX31 正向引物 ： 5′ -acggatccaaatgagt catgtggcagtgga-3′ (SEQ ID NO ： 17)， 具有 XhoI 的 DDX3662 反向引物 ： 5′ -ctctcgagcaaa gcaggctcagttaccc-3′ (SEQ ID NO ： 18) ； 具有 KpnI 的 DR5-1 正向引物 ： 5′ -aaaggtaccag ccatggaacaacggggacag-3’ (SEQ ID NO ： 19)， 具有 EcoV 的 DR5-441 反向引物 ： 5′ -aaagata tcttaggacatggcagagtctgcatt-3’ (SEQ ID NO ： 20) ； 将分离的 DDX3 的聚合酶链式反应片段 在框内克隆到 pcDNA3.1-His 载体 (Invitrogen)。将 DR5 cDNA 克隆到 pshutter-CMV 载体。 通过 DNA 测序确认正确的序列。
通过缺失 BamHI 和 XhoI 位点之间的 DDX3 序列来产生 DDX3/pcDNA3.1-His 表达
质粒。具有 BamHI 的 DDX3151 正向引物 ： 5′ -acggatccaaatgttttctggaggcaacactggg-3’ ( SEQ ID NO ： 21) ； 使用以下引物通过缺失 DR5 序列来产生 DR5/pshutter-CMV 表达质粒 ： 具 有 EcoRV 的 DR5-340 反向引物 ： 5′ -aaagatatcttactgtctcagagtctcagtgggatc-3’ (SEQ ID NO ： 22) ； 具有 EcoRV 和 XhoI 的 DR5-330 反向引物 ： 5’ -aaagatatcctcgagatttgctggaaccagc agcct-3’ (SEQ ID NO ： 23)。
用于 DDX3 在细菌中的表达质粒的构建
将 DDX3 或 cIAP1 片段插入 TOPO100 载体 (Invitrogen) 中。将得到的质粒转化到 大肠杆菌菌株 BL21(DE3)， 使其在 LB 培养基中生长到对数生长期并用 0.4mM 异丙基 -1- 硫 代 -β-D- 半乳糖吡喃糖苷诱导 3 小时。 使细胞沉淀， 重悬于裂解缓冲液 (30mM Tris-HCl(pH 7.5)、 0.1mM NaCl、 1mM DTT、 0.1mMEDTA、 1％ Nonidet P-40 和 20μg/ml PMSF) 中， 并进行声 处理。通过 Ni 柱纯化在 14,000×g 下离心 15 分钟后的上清液。通过 BCA 测定 (Pierce， Rockford， IL) 来确定蛋白质浓度， 并在 80℃下储存等分试样。
293 或 3T3 细胞的瞬时转染。
使用 LIPOFECTAMINETM 2000(Invitrogen) 用表达载体转染 293 或 3T3 细胞。转染 之后 24 小时后， 通过使用各自单克隆抗体的蛋白质印迹分析来测定蛋白质表达。对于免疫 共沉淀分析， 用含有蛋白酶抑制剂混合物的免疫沉淀 - 裂解缓冲液对细胞进行裂解。
免疫共沉淀测定。
将抗 DDX3 或抗 DR5 抗体偶联至琼脂糖凝胶珠 (Sigma ； St.Louis， MO)。按如下测 6 定 DR5DISC 的组合物。在 37 ℃下用 500ng/ml 的 TRA-8 处理 5×10 个细胞 ( 如果没有另 外指定 ) 达指定的时间， 并且然后在免疫沉淀裂解缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)、 150mM NaCl、 0.2％ NONIDET P40 和 10％甘油和完全蛋白酶抑制剂混合物 ) 中裂解或在不经处理 ( 未刺激的情况 ) 下裂解。然后在 4℃下用 30μl 珠子使 DR5 DISC 沉淀过夜。免疫沉淀之 后， 用裂解缓冲液将珠子洗涤 4 次。然后用 10mM Tris 缓冲液将珠子洗涤 5 次， 并重悬于上 样缓冲液中以用于 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。
体外半胱天冬酶活性的测定。
在 96 孔透明底板中进行荧光测定， 并且所有的测量在三个重复的孔中进行。加入 100μl 测定缓冲液 (10mM HEPES pH 7.0、 50mM NaCl、 2mM MgCl2、 5mM EDTA 和 1mM DTT)。 向 各孔加入活性半胱天冬酶 -8 和肽底物 (Ac-IETD-AMC) 至最终浓度为 100ng/μl。 加入免疫 共沉淀洗提组分以开始反应。在含有测定缓冲液、 底物和没有细胞裂解物的裂解缓冲液的 孔中测量本底荧光。在 37℃下将酶联板 (assay plate) 孵育 1 小时。在设置成 355-nm 激 发光和 440-nm 发射光的荧光酶标仪 (Bio-Tek ； Winooski， VT) 上测量荧光。
体外半胱氨酸酶裂解测定。
在体外测定中检查半胱天冬酶裂解 DDX3 的能力。在 37℃下进行裂解反应 30 分 钟， 包括 10μl 来自 DR5co-IP 的洗提组分、 10μl 反应缓冲液 (10mM HEPES[pH 7.0]、 50mM NaCl、 2mM MgCl2、 5mM EGTA、 1mM DTT、 2mM ATP) 和 5μl(0.1U/μl) 重组活性形式的半胱天 冬酶。通过使用抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹测定裂解。
实施例 1 ： DDX3 在 TRAIL-R2 介导的细胞凋亡中的作用
候选蛋白质 ( 造成抗性细胞中 DR5 的死亡结构域封阻的 DDX3) 的蛋白质组学分 析。对靶向死亡受体的治疗剂、 TRAIL 和竞争性抗体的自然发展或诱导的细胞凋亡抗性代表在用这些药剂有效治疗癌症中的主要障碍。为了确定在抗性细胞中是否存在 DR5 死亡 结构域复合物的替换组合物， 通过二维蛋白质组学和质谱分析在 TRA-8 处理之前和之后比 较 TRA-8 敏感亲代细胞和 TRA-8 抗性 MDA231 细胞中的现有 DR5 缔合的蛋白质的蛋白质组 学谱。在检查用 SYPROTM ruby(Molecular Probes ； Eugene， OR) 染色的二维凝胶时， 发现了 约～ 80kDa 的蛋白质斑点。该蛋白质与 DR5 的缔合阻断了 DR5 死亡结构域诱导信号复合 物 (DISC) 的形成， 因此引起 TRA-8 抗性。从 SDS-PAGE 切离～ 80kDa 蛋白质并用胰蛋白酶 消化， 而且通过质谱分析法来分析肽序列。来自 6 个经消化片段的蛋白质氨基酸序列与人 DDX3( 表 2) 的 Genbank 序列 100 ％相同， 这表明在 TRA-8 诱导的细胞凋亡过程中 DDX3 从 DR5 解离。如果该蛋白质保持与 DR5 缔合的蛋白质复合物缔合， 则其可防止 FADD 募集并且 导致 DISC 形成失败。
表2： DDX3 片段。
DDX3 是 DR5 介导的细胞凋亡中的 DR5 缔合的蛋白。 为了确定 DDX3 是否确实与 DR5 缔合， 将全长 DDX3( 氨基酸 1-662)、 DDX3 的 N 端片段 ( 氨基酸 1-316) 和 C 端片段 ( 氨基酸 310-662) 克隆到在 N 端具有 6-His 标签的 PCDNAIII3.1 中。 将这些表达载体转染到 MDA231 亲代细胞中以达到重组全长 DDX3 和 DDX3 的缺失突变体的过表达。如通过免疫共沉淀分析 和之后使用抗 6-His 抗体的蛋白质印迹分析所测定， 仅全长 DDX3( 而不是其 N 端和 C 端缺 失突变体 ) 与 DR5 缔合。这些结果证实全长 DDX3 与 DR5 缔合。DDX3 在 MDA231 细胞中与抗 DR5 免疫沉淀。
为进一步证实 DDX3 与 DR5 的缔合， 使 DDX3 的 N 端缺失形式、 C 端缺失形式和全长 形式在大肠杆菌中表达。纯化蛋白质并用作抗原以产生针对 DDX3 的多克隆抗体和一组单 克隆抗体。 通过免疫共沉淀和使用小鼠抗 DDX3 单克隆抗体的蛋白质印迹分析检测 DR5 缔合 的 DDX3。结果证明 DDX3 在非凋亡亲代细胞和抗性细胞二者中与 DR5 免疫共沉淀。在细胞 凋亡过程中， TRA-8 敏感细胞中 DDX3 时间依赖性地减少， 而 TRA-8 抗性细胞中则不是如此。 另外， 通过蛋白质印迹分析， 观察到 TRA-8 诱导的细胞凋亡过程中 DR5 缔合的 DDX3 的迅速 减少和裂解。这表明 DDX3 的裂解是半胱天冬酶依赖性的。基于这些结果， 详细检查 DDX3 序列的 N 端的潜在裂解位点， 并且在氨基酸 129-135 发现相对保守的半胱天冬酶裂解基序 DKSDEDD(SEQ ID NO ： 30)。明显的是， 裂解发生在 DISC 上并且导致 DDX3 的关键功能元件从 DR5 释放。 该数据与后面的模型一致， 这表明可将起始半胱天冬酶迅速募集到 DR5 并容易地 裂解 DDX3。另外， FADD 和半胱天冬酶 -8 与 DR5 缔合并募集至 DR5 以形成 DISC， 其转而引 起与 DR5 缔合的 DDX3 裂解相关的半胱天冬酶级联激活。这表明在某些情况中， DDX3 对于 凋亡程序是必要的， 说明 DDX3 与 DR5 缔合并且参与 DR5 介导的细胞凋亡抗性。
对 DDX3 与 DR5 的相互作用区进行作图。为了更好地理解 DR5 介导的信号转导 中 DDX3 的调控， 使用已由编码 DDX3 的缺失突变体的质粒瞬时转染的 HEK293A 细胞确定
结合 DR5 所需的大致 DDX3 区。使用 TRA-8、 全长 DDX3、 DDX3Δ201-662 或与 DR5 结合的 DR5DDX3Δ1-400 通过免疫共沉淀来测定重组 DDX3 和 DR5 的相互作用。 然而， DDX3Δ251-662 和 DDX3Δ1-350 都不能与 DR5 结合。这表明 DDX3 在 DR5 上有两个结合基序。一个位于 N 端 ( 氨基酸 200-250) ； 另一个邻近氨基酸 350-400。来自相同细胞的裂解物的蛋白质印迹 分析证实产生相似量的野生型 DDX3 和 DDX3 的缺失片段， 这排除了蛋白质表达的差异作为 这些结果的解释。
DDX3 永久地与 DR5 缔合并与 TRA-8 抗性细胞中 FADD 募集的封阻有关， 表明 DR5 缔 合的 DDX3 阻止 FADD 的募集。通过 DR5， DDX3 和 FADD 之间可存在一定关系。为测试 DDX3 和 FADD 是否共享在 DR5 的死亡结构域的共同结合基序或两个结合基序是否紧挨在一起以 致预接合的 DDX3 干扰 FADD 的募集， 测定了 DR5 中 DDX3 结合结构域的位置。构建编码全长 DR5 的载体和 DR5 的一系列氨基端结构域缺失， 包括死亡结构域的完全缺失。在评估 DDX3 的功能和排除内源性人 DR5 的类似方法中， 选择鼠成纤维细胞细胞系 NIH3T3 作为用于共表 达人 DR5 和 DDX3 的宿主细胞。用编码 His 标记的 DDX3 和全长 DR5 ； DDX3 和 DR5 的一系列 缺失突变体 ； 和单独 DDX3 共转染 3T3 细胞。使用 TRA-8 染色通过流式细胞术检查细胞表面 DR5 表达。所有经转染的细胞表现相似水平的细胞表面 DR5， 表明细胞内结构域的缺失并不 改变细胞表面 DR5。另外， 如使用抗 6-his 抗体通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析所检 测， 所有经转染的细胞表达相似水平的重组 DDX3。通过与 TRA-8 免疫共沉淀和用抗 6-His 抗体的蛋白质印迹分析来检查重组 DDX3 与 DR5 的缺失突变体的缔合。DR5 与 DDX3 的相互 作用独立于 DR5 的死亡结构域。为进一步更准确地限定 DR5 结合基序， 构建 DR5 的另外缺 失突变体 D330 和 DR5 的截短 (T300-330)， 与 DDX3 一起共转染至 3T3 细胞中， 并分析它们 的相互作用。结果证明， DDX3 并不与 DR5 死亡结构域结合但与靠近死亡结构域 ( 氨基酸 340-420) 的膜近侧区 ( 氨基酸 300-330) 结合。这表明， DDX3 在 DR5 信号转导中可能发挥 与之前所鉴定的死亡结构域连接蛋白不同的作用。另外， 此区与 DR4 和 DcR2 高度同源。这 些数据表明 DDX3 是与死亡受体家族的成员缔合的普通衔接蛋白。
DDX3 含有 CARD。接下来通过分析 DDX3 的具体特性来研究该分子在 DR5 介导的细 胞凋亡中的功能性意义。最近已鉴定出 DEAD 盒蛋白家族的至少两种 RNA 解旋酶， 其含有 半胱天冬酶募集结构域 (CARD)。这些 RNA 解旋酶中的 CARD 充当细胞凋亡的调控子。因为 DDX3 在 DR5 介导的细胞凋亡的调控中发挥重要的作用， 所以 DDX3(DEAD 盒蛋白家族的解旋 酶的成员 ) 也可具有 CARD， 并且 DDX3 的细胞凋亡抑制功能可直接取决于 CARD。因此， 检查 DDX3 是 CARD 蛋白的可能性。氨基酸比对分析表明 DDX3 含有介于氨基酸 50-150 之间的保 守作用基序， MDA5 和 RIGI 也一样。CARD 是同型的相互作用基序。含有 CARD 的蛋白质可经 由此结构域相互作用。因为 DDX3 是新型、 高度保守的含有 CARD 的解旋酶， 所以它能够与其 它 CARD 蛋白相互作用。cIAP1， 也是含有 CARD 的蛋白， 已被广泛视为半胱天冬酶的抑制剂 并且将其募集至 TNFRI 和 TNFRII 以调控 TNFRI 介导的细胞凋亡。在免疫共沉淀实验中， 使 用抗 DDX3 或抗 DR5 抗体测试 DDX3 是否能够与 cIAP1 相互作用。已确定， 在 TRA-8 未处理 的亲代细胞和抗性细胞中， cIAP1 可容易地与 DDX3 和 DR5 抗体免疫共沉淀。然而， 在 TRA-8 敏感细胞中， cIAP1 迅速地从 DR5-DDX3 复合物中释放， 并且这与亲代细胞中的 DDX3 裂解有 关。相反， TRA-8 处理之后， 抗性细胞中 DR5-DDX3 复合物中的 cIAP1 水平增加。这些结果 表明 DDX3 可作为 DR5 和 cIAP1 之间的连接物。通过敲低 DDX3 逆转抗性。为研究 DDX3 在 DR5 信号转导中的作用， 检查 TRA-8 诱 导的细胞凋亡中内源性 DDX3 的重要性。因为在 TRA-8 诱导的细胞凋亡的过程中， DDX3 在 抗性细胞中不减少， 所以降低水平的 DDX3 表达对于癌细胞对细胞凋亡敏感可以是需要的。 采用 RNAi 策略以确定 DDX3 在对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性中的作用。使用在线设计工具 BLOCK-ITTM RNAi Designer(Invitrogen) 以鉴定 DDX3 的 RNAi 靶标。从上链 10 个最高得 分 RNAi 靶标中选择 5 个靶向的 siRNA 序列， 并且克隆至 BLOCK-ITTM U6 入门载体。用 5 种 RNAi 构建体转染 TRA-8 抗性 MDA231 细胞， 并且在转染后 48 小时， 通过使用单克隆抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹分析来确定 DDX3 的蛋白质表达水平。与未转染或 GFP 转染的对照相比， 5 种测试的 RNAi 构建体中的 4 种是非常有效 ( 超过 50％降低 ) 的 DDX3 表达抑制剂。选择 这些构建体中最有效的构建体 (#2) 用于分析 TRA-8 介导的细胞凋亡中 DDX3 敲低的作用。 为确定 DDX3 表达的敲低是否逆转 TRA-8 抗性细胞中的 TRA-8 敏感性， 用 RNAi 载体 ( 构建 体 #2) 和 GFP 表达载体 ( 作为转染细胞的指示剂 ) 共转染 TRA-8 抗性 MDA231 细胞。转染 后 48 小时， DDX3 与 DR5 免疫共沉淀。如所预期， 与对照细胞相比， DDX3 的表达显著减少。 TM 分选 GFP 阳性细胞并与各种浓度的 TRA-8 培养过夜。使用 ATPLITE 测定， 用 GFP 和对照载 体转染的 MDA231 细胞在 TRA-8 处理后没有经历细胞凋亡， 表明细胞对 TRA-8 保持抗性。然 而， 用 DDX3 RNAi 和 GFP 共转染的细胞表现 TRA-8 剂量依赖性细胞死亡。使用 TUNEL 染色， 发现相当数量的 DDX3 敲低细胞经历细胞凋亡。这些结果表明 DDX3 表达的下调逆转 TRA-8 抗性。 为进一步确定 DDX3 在 DR5 介导的细胞凋亡中的因果作用， 一组肿瘤细胞中的 DDX3 表 达降低并且分析它们对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的敏感性。在该组肿瘤细胞 ( 包括一些自发 抗性细胞 ) 中， DDX3 RNAi 降低内源性 DDX3 的量并增强 TRA8 诱导的细胞凋亡。相反， 用对 照寡核苷酸转染的细胞显示正常 DDX3 表达和保持对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的抗性。因此， DDX3 是 DR5 信号转导器官的关键组分并且对于对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性是必需的。
没有 DDX3 结合区的 DR5 是促进细胞凋亡的。为测试 DDX3 结合基序是否代表调节 DR5 的死亡结构域功能的新型负调控结构域， 将突变 DR5 的细胞凋亡诱导功能与野生型 DR5 进行比较。 用没有死亡结构域的 DR5 转染的细胞似乎不对 TRA-8 处理反应， 但用具有截短的 DDX3 结合结构域的 DR5 转染的细胞似乎是促进细胞凋亡的并且与野生型 DR5 转染细胞相比 对 TRA-8 诱导的细胞凋亡表现更大敏感性。存在 DDX3 的显著的抑制作用， 其可抑制 DR5 介 导的细胞凋亡。这些发现表明 DDX3 是 DR5 介导的细胞凋亡的抑制介质。
DDX3 是调控 DR5 介导的细胞凋亡的 CARD 蛋白。为剖析 DR5-DDX3-cIAP1 信号转 导， 评估了对其与 cIAP1 的结合所需的区。因为 CARD 在 DDX3 的 N 端并且应该与 cIAP1 相 互 作 用， 所 以 此 区 可 负 责 结 合 cIAP1。 用 编 码 His 标 记 的 全 长 DDX3、 DX3Δ51-662、 DDX3Δ101-662、 DDX3Δ151-662 或 DDX3Δ1-350 转染 HEK293A 细胞。全长和 C 端缺失的 DDX3 能够免疫共沉淀 cIAP1， 而开始 100 个氨基酸缺失的 DDX3 不能够免疫共沉淀 cIAP1。 这些结果证实 DDX3 的 N 端 CARD 负责将 cIAP1 募集至 DR5 复合物。也表明 cIAP1 结合基序 位于裂解位点 ( 氨基酸 129-135(DKSDEDD ； SEQ ID NO ： 30)) 之前的 DDX3 的氨基酸 50-100。 如果在 DR5 介导的细胞凋亡过程中 DDX3 被裂解， 则与 cIAP1 结合的 DDX3 的 N 端片段将从 DR5 复合物脱离， 因此减轻 cIAP1 对死亡信号转导的抑制。所以， DDX3 是将 cIAP1 和死亡受 体与细胞凋亡抗性偶联的候选物。
为进一步证实该概念， 使用缺乏氨基酸 1-150 的显性负突变 DDX3。这种突变DDX3ΔCARD(DDX3Δ151-662) 不能与 cIAP1 相互作用， 但仍然能够与 DR5 结合。因此， 评估 DDX3Δ151-662 是否是通过与结合 DR5 的野生型 DDX3 竞争的内源性 DDX3 的显性负抑制剂。 用 DDX3ΔCARD 转染四种类型的细胞。与内源性、 全长 DDX3 相比， DDX3ΔCARD 转染细胞表 现较高水平的 DDX3ΔCARD 表达， 表明截短 DDX3 能够与内源性 DDX3 竞争与 DR5 结合。如通 过 DR5-co-IP 和用抗 DDX3 和抗 cIAP1 抗体探测的蛋白质印迹所分析， cIAP1 与全长 DDX3 免 TM 疫共沉淀， 但不与 DDX3ΔCARD 免疫共沉淀。此外， 使用 ATPLITE 测定来检查经转染细胞对 TRA-8 介导的细胞凋亡的敏感性。 全长重组 DDX3 的表达并不改变对 TRA-8 介导的细胞凋亡 的敏感性， 因为 TRA-8 处理后， 所有测试细胞保持抗性。然而， 下调 DR5 缔合的 cIAP1 后， 表 达高水平 DDX3ΔCARD 的 TRA-8 抗性肿瘤细胞重新获得其对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的敏感 性。这些数据表明 cIAP1 对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的抑制由 DDX3 的完整 CARD 来介导。缺 乏 N 端 CARD 的 DDX3 可作为部分逆转 TRA-8 抗性的显性负调节物。癌细胞对 TRA-8 诱导的 细胞凋亡的潜在敏感性可由 DDX3 的水平和 DR5 缔合的复合物上的 cIAP1 来调控。
DR5-DDX3-cIAP1 复合物抑制半胱天冬酶 -8 激活。将 DDX3 量化以检查与 DR5DISC 处的半胱天冬酶 -8 募集和加工相关的存在于细胞中的 DDX3 的水平如何。用 TRA-8 处理 MDA231 和 UL-3C 亲代细胞和抗性细胞 4 小时， 并且 DR5 与新抗 DR5 单克隆抗体 ( 克隆 ： 2B4) 免疫沉淀， 所述新抗 DR5 单克隆抗体识别不同于 TRA-8 的 DR5 表位。将 DR5/DDX3/cIAP1 复 合物从珠子中释放， 并且使用抗 DDX3 和抗 cIAP1 抗体对 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 进行免 疫印迹和夹心 ELISA 分析。用 2B4 抗 -DR5 抗体涂布 ELISA 板以捕获免疫沉淀的 DR5， 并且 通过针对 DDX3(3E2) 和 cIAP1 的特异性单克隆抗体来测量 DDX3 和 cIAP1。用 TRA-8 处理 亲代敏感或诱导抗性肿瘤细胞并不改变 DR5 蛋白质水平。然而， 在敏感和抗性细胞二者中， TRA-8 处理显著改变了 DR5 缔合的 DDX3 的水平。首先， 如通过 3E2 抗 DDX3 抗体所检测， 与 未处理敏感细胞相比， 未处理抗性细胞表达较高水平的 DR5 缔合的 DDX3。重要的是， TRA-8 处理后， DR5 缔合的 DDX3 在 TRA-8 抗性细胞中显著增加但在敏感细胞中显示明显减少。 DR5 复合物中的 cIAP1 的水平也以与 DDX3 相同的方式被改变。 这些结果表明， 细胞凋亡过程中， 在 TRA-8 敏感细胞中， DDX3 的 CARD 结构域被裂解并且 DDX3 从 DR5 复合物释放， 而在抗性 细胞而不是敏感细胞中， TRA-8 刺激后， DDX3 和 cIAP1 被募集至 DR5。
为形成功能性 DISC， 癌细胞有必要从 DR5 复合物释放 cIAP1 以减少在 TRA-8 诱导 的细胞凋亡过程中其对半胱天冬酶的抑制。这个过程需要裂解 DDX3， 表明该步骤对起始前 馈细胞凋亡扩增循环 (feed-forward apoptosisamplmcation loop) 是重要的。 因为 DR5 缔 合的 DDX3 对裂解的抗性与抗性细胞中不能形成 DISC 相关， 因此 DR5-DDX3-cIAP1 复合物上 的 DDX3 裂解敏感性在亲代细胞和抗性细胞之间是不同的。分析了在两种细胞中由不同半 胱天冬酶引起的 DR5 缔合的 DDX3 的裂解可能性。DR5-DDX3-cIAP1 复合物与抗 DR5 抗体免 疫共沉淀。将来自珠子的洗提组分与活性半胱天冬酶 -2 和半胱天冬酶 -8 一起孵育。通过 用抗 DDX3 抗体的蛋白质印迹分析检测 DDX3 的裂解。这些结果结合 ELISA 分析显示， 与敏 感细胞相比， 抗性细胞中由半胱天冬酶 -8 引起的 DDX3 裂解被高度衰减， 尽管半胱天冬酶 -2 在两种细胞中表现相似的蛋白酶潜能。这些结果表明 TRA-8 敏感细胞和 TRA-8 抗性细胞之 间存在 DDX3 复合物的功能差异。其还表明死亡受体连接的初始半胱天冬酶未能裂解 DDX3 是发展 TRA-8 抗性的关键步骤。
因为在经诱导的抗性细胞中， DDX3 的裂解被抑制， 这促使进行研究以确定其中DDX3 抑制 DR5 介导的细胞凋亡的细胞凋亡信号转导的步骤。 预测 DDX3/cIAP1 复合物抑制半 胱天冬酶 -8 激活 ； 因此， 检查了受体激发之后作为基本可检测事件之一的 DR5-DDX3-cIAP1 复合物上半胱天冬酶 -8 的激活。 为评估 DR5-DDX3-cIAP1 复合物对半胱天冬酶 -8 激活的作 用， 使用荧光底物 (Ac-IETD-AMC) 测量半胱天冬酶活性， 所述荧光底物 (Ac-IETD-AMC) 与活 性半胱天冬酶 -8 和来自亲代敏感细胞或诱导抗性细胞的 DDX3 co-IP 洗提组分一起孵育。 与敏感细胞相比， 在来自抗性细胞的 DR5 co-IP 洗提组分的大范围稀释中观察到半胱天冬 酶 -8 活性的剂量依赖性抑制。此外， 纯化的 cIAP1 也完全抑制半胱天冬酶 -8 蛋白酶活性。 似乎合理的是， DDX3 缔合的 cIAP1 是半胱天冬酶 -8 初始激活的抑制剂， 因而防止 DDX3 的 裂解。因此， 这些数据提供了直接的证据， 即 DDX3-cIAP1 可调控半胱天冬酶 -8 活性， 并且 表明 DDX3-cIAP1 是通过 DR5 接合的半胱天冬酶 -8 的特异性调节剂。
DR5-DDX3-cIAP1 对半胱天冬酶 -8 激活的作用通过直接分析 cIAP1 抑制的半胱天 冬酶 -8 结合通过半胱天冬酶测定的 DDX3 的裂解来检查， 并且显示 DDX3-cIAP1 也充当新型 半胱天冬酶抑制剂。DDX3-cIAP1 复合物通过抑制半胱天冬酶 -8 激活而能够捕获死亡受体 促凋亡信号， 因而抑制由初始半胱天冬酶引起的 DR5 缔合的 DDX3 的裂解。 该模型显示 DDX3 经由募集 cIAP1 来保护细胞免受 TRA-8 诱导的细胞凋亡并且有助于癌细胞中死亡信号转导 途径的封阻。
实施例 2 ： 对于三阴性 (TN) 基底细胞乳腺癌细胞系的抗 DR5 介导的细胞毒性。
如表 3 和 4 中所总结， 使用一组 26 个乳腺癌细胞系研究对 TRA-8(DR5) 抗体的细 胞毒性反应与乳腺癌亚型之间的关系， 所述 26 个乳腺癌细胞系包括 15 个分类为基底细胞 ( 基底细胞 A 和基底细胞 B) 的细胞系、 2 个 HER-2 过表达基底细胞和 9 个表达管腔表型的 细胞系。TRA-8 诱导 15 个三阴性乳腺细胞 (TNBC) 细胞系 ( 基底细胞 ) 中的 12 个死亡， 其 中 IC50 值的范围是 0.9 至 4.8ng/ml( 表 3)。图 1 中示出 TRA-8 针对基底细胞 B 亚型的 4 个 细胞系的细胞毒性。TRAIL 产生相当的细胞毒性。9 个管腔乳腺癌细胞系对 TRA-8 都有抗 性 ( 表 4)。用 TRA-8 抗体和化学治疗药物 ( 包括阿霉素、 顺铂和卡铂 ) 的组合处理产生另 外的基底细胞 A 和基底细胞 B 乳腺癌细胞系的协同死亡 ( 图 2)。使用 TRA-8 和化学治疗的 组合， HCC1937( 对 TRA-8 有抗性的 BRCA-1 突变细胞系 ) 表现协同的细胞毒性 ( 图 2)。
表3： TNBC 细胞系的 TRA-8 敏感性。
细胞系 SUM149 2LMP HCC38 SUM159 MDA-MB-436 IC50(ng/ml) 0.9 1.1 0.9 1.9 3.2 肿瘤 炎症性导管癌， 1° 腺癌， 胸腔积液 导管癌， 1° 未分化癌， 1° 腺癌， 胸腔积液管内癌， 1° 腺癌， 1° 腺癌， 胸腔积液 髓样癌， 胸腔积液 管内癌 - 乳突状， 1° 导管癌， 1° 腺癌， 胸腔积液 导管癌， 1° 导管癌， 1° 导管癌， 1°表4： ER+( 管腔 ) 细胞系的 TRA-8 敏感性实施例 3 ： DR5/DDX3/cIAP1 细胞凋亡抑制性复合物的表征。
如上所述， DR5/DDX3/cIAP1 充当负调控复合物， 其对抗 DISC 的形成和功能。因 此， DR5 缔合的 DDX3 和募集的细胞凋亡抑制剂是癌细胞对 DR5 介导的细胞凋亡的敏感性的 预测性生物标记。图 3 说明了一种模型。在该模型中， DDX3 结合与 DR5 的死亡结构域邻近 的区。如同 RNA 解旋酶家族的其它成员， DDX3 在其 N 端含有 CARD， 其负责通过 CARD/CARD 相互作用募集细胞凋亡的抑制剂 (IAP)。此外， 募集的 IAP 经由其杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 来抑制半胱天冬酶的活性， 因而抑制死亡结构域的初始细胞凋亡信号转导。 该模型的 新颖性在于 DR5 的细胞质尾含有至少两个功能上不同的结构域， 其相互作用以决定 DR5 的 细胞凋亡信号转导。当 DDX3/IAP 复合物比死亡结构域复合物占优势时， 癌细胞转向对 DR5 介导的细胞凋亡的抗性。因此， DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 可充当用于预测肿瘤细胞对抗
DR5(TRA-8) 介导的细胞凋亡的反应的生物标记， 并且也充当用于增强 DR5 介导的细胞凋亡 的药物靶标。
检查了具有确定的对 TRA-8 介导的细胞凋亡的敏感性的一组癌细胞中 DR5 缔合的 蛋白质的蛋白表达谱。这导致将 DDX3 鉴定为新型的 DR5 缔合的衔接蛋白， 其介导 DR5 的死 亡结构域的细胞凋亡抗性。
缺乏 DDX3 结合结构域的 DR5 更加促进细胞凋亡。如上所述， 发现 DDX3 结合结构 域为 DR5 的细胞质尾的氨基酸 300 至 330 的区。具有该区的截短的突变 DR5(D7) 丧失 DDX3 结合而 DR5 的表面表达没有改变。与表达野生型 DR5 的细胞相比， 截短的 DR5 表现增加的 自发性细胞凋亡和 TRA-8 诱导的细胞凋亡。这些结果表明 DR5 的细胞质尾具有经由 DDX3 结合而负调控 DR5 细胞凋亡信号转导的功能区。
DDX3 的敲低逆转 DR5 细胞凋亡抗性。 用 siRNA 敲低 DR5 细胞凋亡抗性细胞中 DDX3 的表达 ( 图 4A)， 所述 DR5 细胞凋亡抗性细胞包括诱导的抗性细胞 (MDA231R 和 UL-3CR) 和 自发抗性细胞 (SKW620、 HT29 和 SKW1116)， 并且分析肿瘤细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的 敏感性。DDX3 表达降低后， 所有抗性细胞中的细胞凋亡抗性被逆转 ( 图 4B)， 表明 DDX3 是 DR5 介导的细胞凋亡的负调节剂。
DDX3 是募集 cIAP1 并抑制 DR5 介导的细胞凋亡的 CARD 蛋白。类似于其它解旋酶 蛋白诸如 MDA5 和 RIG-1， DDX3 在其 N 端具有保守的 CARD。免疫共沉淀显示野生型 DDX3 能 够下拉 (pull-down)cIAP1( 图 5A)。然而， DDX3 的开始 100 个残基的截短 (DN) 导致 cIAP1 免疫共沉淀的丧失。TRA-8 处理后， 如通过 FADD 募集所示， 表达 CARD 截短的 DDX3 的细胞中 的 DISC 功能恢复。表达缺乏 CARD 的 DDX3 的 DR5 抗性肿瘤细胞变得对 TRA-8 诱导的细胞 凋亡更加敏感 ( 图 5B)。这些结果表明 DDX3 充当 DR5 的衔接蛋白。虽然 DDX3 结合 DR5， 但 其 CARD 募集 cIAP1 从而抑制死亡结构域的 DR5 介导的细胞凋亡。
DR5/DDX3/cIAP1 蛋白质复合物是 DR5 介导的细胞凋亡的预测性生物标记。已开 发了使用全细胞裂解物来定量测量 DR5/DDX3/cIAP1 复合物的测定。DR5 免疫共沉淀后， 通 过夹心 ELISA 测量 DR5、 DDX3 和 cIAP1 的量。当 DR5 在敏感亲代细胞 (MDA231P 和 UL-3CP) 和抗性细胞 (MDA231R 和 UL-3CR) 中同样沉淀时， 缔合的 DDX3 和 cIAP1 在敏感细胞中较低 但在抗性细胞中非常高 ( 图 6A)。 进一步分析一组具有确定的 TRA-8 敏感性的人癌细胞系。 与一组 TRA-8 敏感细胞相比， 一组 TRA-8 抗性细胞表达非常高水平的 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1( 图 6B)。这些结果表明 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 不仅在诱导的抗性细胞中而且在 发展自发性抗性的细胞中用于 TRA-8 抗性的诱导。
三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 蛋白质复合物。最近已证明所有 TNBC 细胞表达细胞表面 DR5 并对 TRA-8 诱导的细胞凋亡敏感， 而非 TNBC 细胞却始终有抗 性。 因此， 检查一组 TNBC 细胞系中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物。 DR5 缔合的 DDX3 和 cIAP1 在 TNBC 细胞中较低 ( 图 7A 和表 5)。有趣的是， 在一些 TNBC 细胞中， 如通过抗 C 端 DDX3 抗体 3E4 所证明， 与 DR5 免疫共沉淀的 DDX3 的分子量较小 ( 图 7B)。这是由于丧失 N 端 CARD 所 造成， 如通过 N 端 CARD 特异性抗 DDX3 抗体 3E2 所测定。与 CARD 的丧失相对应， 这些 TNBC 细胞中缔合的 cIAP1 也减少。DDX3 的 2D-SDS-PAGE 的蛋白质组学分析揭示 TNBC 细胞中的 DDX3 蛋白表达谱改变。这些结果表明 TNBC 细胞中的 DR5/DDX3/cIAP1 复合物可能改变， 这 可能是这些细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的高度敏感性的原因。新型抗体识别 BIR。在筛选抗 IAP 单克隆抗体池的过程中， 鉴定了唯一的单克隆 抗体 (3H4)。3H4 抗体相同地结合 cIAP1、 cIAP2 和 XIAP 但不结合生存素 ( 图 8A)。因为仅 这些蛋白质的共同表位或结构是 BIR 结构域， 所以怀疑该特定抗体是 BIR 结构域特异性抗 体。使用一系列截短的 IAP 蛋白来对 3H4 抗体的表位作图， 并且发现由 3H4 识别的表位是 cIAP1、 cIAP2 和 XIAP 的第二 BIR 结构域 ( 图 8B)， 其在生存素中不存在。蛋白质印迹分析 显示 3H4 抗体检测 68kDacIAP1 或 cIAP2 和 58kDa XIAP。除了这些已知的 IAP 蛋白外， 3H4 还检测未知的 80kDa 蛋白， 如在一组胰腺癌细胞系中所示 ( 图 8C)。
表5： TNBC( 基底细胞 ) 细胞对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的高度敏感性与 DR5/DDX3/ IAP 复合物降低的表达相关。
类型 管腔细胞 细胞系 MCF-7 ZR75-1 MDA-MB-134 HER2， ER+ DY36T2 ZR75-30 HER2， ER基底细胞 HER2+， ERMDA-MB-453 HCC1569 HCC1954 TNBC(BASAL A) MDA-MB-468 HCC1187 BT-20 HCC1937 HCC1143 TNBC(BASAL B) SUM149 HCC38 2LMP SUM159 23 IC50 ＞ 1000 683 ＞ 1000 ＞ 1000 ＞ 1000 ＞ 1000 360 488 17 24 48 ＞ 1000 ＞ 1000 0.9 0.9 1.1 1.9 DR5/DDX3 0.767 0.417 0.914 0.645 0.588 1.551 0.391 0.522 0.247 0.629 0.487 0.562 0.822 0.018 0.367 0.178 0.038 DDX3/IAP 0.962 0.371 1.243 0.967 1.025 1.002 0.552 0.960 0.219 0.356 0.171 1.105 1.347 0.026 0.048 0.218 0.134CN 102666588 A SUM102 BT-549 MDA-MB-231
说明书4.5 18 18 0.133 0.255 0.212 0.155 0.076 0.15821/22 页DDX3/IAP 复合物中 IAP 的下调。AT-406( 由 Ascenta Pharmaceuticals 开发 ) 以 低纳摩尔级亲和力结合多种 IAP 蛋白， 包括 cIAP1、 cIAP2 和 XIAP。已显示 AT-406 协同地增 强 TRAIL 介导的细胞凋亡。为确定 AT-406 是否能够克服胰腺癌细胞的 DR5 细胞凋亡抗性， 对两个人胰腺癌细胞系 (S013 和 S2VP10) 检查了 AT406 对 TRA-8 诱导的细胞凋亡的作用， 所述两个细胞系对 TRA-8 诱导的细胞凋亡有高度抗性。在用 1000ng/ml 的 TRA-8 处理后， 有非常少量的凋亡细胞。单独 10μM AT406 处理并不诱导显著的细胞死亡。然而， 组合处 理导致多于 70％的细胞死亡。 如通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析所示， 单独 AT-406 并 不改变总 IAP 蛋白表达 ( 图 9A)。然而， 组合处理导致所有 IAP 的减少， 证明细胞凋亡的协 同诱导促进 IAP 蛋白的 AT-406 诱导的降解。为确定 AT-406 对 DR5/DDX3/cIAP1 蛋白质复 合物的作用， 通过 DR5-coIP 检查 cIAP1 的量。单独 AT406 和组合处理后， 在 DR5 复合物中 存在 cIAP1 的显著降低 ( 图 9B)。这不是由于 DR5 缔合的 DDX3 的降低而造成的， 因为 DDX3 与 DR5 同样地免疫共沉淀。这些结果显示 AT-406 选择性地靶向 DR5/DDX3 蛋白质复合物中 的 cIAP1。 AT406 对乳腺癌中 IAP 的体外作用。在一组乳腺癌细胞系 ( 包括三阴性和非三阴 性细胞系 ) 中分析了 AT406 对 DDX3 复合物中 IAP 蛋白表达的作用。如之前所示， 与两个非 三阴性细胞系 BT474 和 MB468( 图 10C)( 其对 TRA-8 介导的细胞凋亡有抗性 ) 相比， 当与 DDX3 免疫共沉淀时， 4 个三阴性乳腺癌细胞系 MB435、 2LMP( 图 10A)、 SUM 159 和 SUM 149( 图 10B)， 表达较低水平的 cIAP1 或 cIAP2 蛋白。单独 TRA-8 处理并不改变 IAP 蛋白的水平。然 而， 单独 AT406( 图 10A-10C， 泳道 3) 或与 TRA-8 组合 ( 图 10A-10C， 泳道 4) 显著降低了与 DDX3 缔合的 IAP 蛋白的水平。
由 TRA-8 和 AT406C 产生的细胞毒性。检查了针对乳腺癌细胞系， AT-406 对 TRA-8 介导的细胞凋亡的作用。存在针对 BT-474、 BT-549 和 2LMP 细胞的 AT-406 和 TRA-8 之间相 互作用的证据 ( 图 11)。也检查了阿霉素对 AT-406 和 TRA-8 介导的细胞凋亡的作用。用 AT-406、 阿霉素和 TRA-8 组合处理 2LMP 细胞后， 存在增强的细胞毒性 ( 图 12)。
TRA-8 和阿霉素或白蛋白结合型紫杉醇针对 TNBC 异种移植物的体内功效。 在无胸 腺裸小鼠中使用 2LMP 和 SUM159 原位基底细胞 B 异种移植物模型检查了单独 TRA-8 和 TRA-8 与白蛋白结合型紫杉醇或阿霉素的组合的体内抗肿瘤功效。一旦肿瘤被充分建立 ( 其中肿 瘤直径为约 6mm) 即开始治疗， 并随时间监测肿瘤大小。 未治疗 SUM159 肿瘤的平均肿瘤大小 在 17.9 天加倍。如图 13A 所示， 与未治疗的对照肿瘤相比， 用单独 TRA-8 治疗携带 SUM159 肿瘤的小鼠产生肿瘤生长的显著抑制， 其中肿瘤加倍时间是 81.3 天， 而用单独阿霉素或白 蛋白结合型紫杉醇治疗将平均肿瘤加倍时间分别延长至 41.9 和 49.3 天。用 TRA-8 和阿霉 素的组合治疗导致平均肿瘤大小的减小 ( 这反映由单独 TRA-8 引起的肿瘤生长抑制 ) 并产 生平均肿瘤加倍时间为 84.7 天和 1/10 完全肿瘤退化， 而在用单独 TRA-8 治疗的小鼠中没 有发生完全肿瘤退化。用 TRA-8 和白蛋白结合型紫杉醇治疗的动物显示与用单独 TRA-8 或
TRA-8 与阿霉素治疗的那些相似的肿瘤生长抑制， 其中平均肿瘤加倍时间为 74.7 天。
如图 13B 所示， 未治疗小鼠中的平均 2LMP 肿瘤大小在 8.6 天加倍， 证明这种侵略 性原位肿瘤模型的迅速生长。用单独白蛋白结合型紫杉醇治疗产生 1/10 完全肿瘤退化并 将肿瘤加倍时间延长至 46.2 天。作为针对 2LMP 异种移植物的单独药剂， 阿霉素比白蛋白 结合型紫杉醇更有效， 并将肿瘤加倍时间增加至 51.1 天。 用单独 TRA-8 治疗显著抑制 2LMP 肿瘤生长， 将肿瘤加倍时间延长至 58.4 天， 并引起 2/10 完全肿瘤退化。用 TRA-8 和阿霉素 组合治疗引起平均肿瘤大小的显著减小并将肿瘤加倍的平均时间增加至 78.2 天。 用 TRA-8 和白蛋白结合型紫杉醇组合治疗是最有效的方案， 其将加倍的平均时间增加至 87.2 天， 并 产生 2/9 完全肿瘤退化。这些结果证明针对基底细胞 B 肿瘤异种移植物， 使用化学治疗药 物结合 TRA-8 的增强的体内功效。
TRA-8、 白蛋白结合型紫杉醇和 AT-406 的体内功效。与用单独 TRA-8、 白蛋白结合 型紫杉醇或 AT-406 治疗相比， 用 TRA-8 和 AT-406、 TRA-8 和白蛋白结合型紫杉醇或 TRA-8 加白蛋白结合型紫杉醇和 AT-406 治疗携带 2LMP 肿瘤的小鼠延长了肿瘤加倍时间 ( 图 14)。 这些结果显示 AT-406 的添加增强了肿瘤抑制。25CN 102666588 A
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