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1、(10)申请公布号 CN 102649952 A (43)申请公布日 2012.08.29 CN 102649952 A *CN102649952A* (21)申请号 201210143343.4 (22)申请日 2012.05.10 C12N 9/26(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12P 19/14(2006.01) (71)申请人。
2、 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 山东农业大学植物保护学院 (72)发明人 张修国 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛 酸酶 PCIPG20 及其编码基因与应用。本发明所提 供的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20， 是如下 a） 或 b） 或 c） 的蛋白质 ： a） 由序列表中序列 2 第 20-360 位所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； b） 由序列表 中序列 2 。
3、所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； c） 将 序列表中序列 2 所示的氨基酸序列或序列 2 第 20-360 位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨 基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有多 聚半乳糖醛酸酶活性的由 a） 衍生的蛋白质。多 聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 具有较高的多聚半乳糖 醛酸酶和果胶酶活性， 其多聚半乳糖醛酸酶的比 活力达 420.2U/mg 蛋白， 其果胶酶的比活力达 220.2U/mg 蛋白。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 10 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 。
4、说明书 8 页 序列表 10 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种蛋白， 是如下 a） 或 b） 或 c） 的蛋白质 ： a） 由序列表中序列 2 第 20-360 位所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； b） 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； c） 将序列表中序列 2 所示的氨基酸序列或序列 2 第 20-360 位所示的氨基酸序列经过 一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的由a） 衍生的蛋白质。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白的核酸分子。 3. 根据权利要求 2 所述的核酸分子， 其特征在于 ： 所述核酸分子为如下 1） 或 2。
5、） 或 3） 或 4） 所示的基因 ： 1） 其编码序列是序列表中序列 1 的第 58-1083 位核苷酸的 DNA 分子 ； 2） 其编码序列是序列表中序列 1 的第 1-1083 位核苷酸的 DNA 分子 ； 3） 在严格条件下与 1） 或 2） 限定的 DNA 分子杂交且编码权利要求 1 所述蛋白的 DNA 分 子 ； 4） 与 1） 或 2） 限定的 DNA 分子具有 90以上的同源性且编码权利要求 1 所述蛋白的 DNA 分子。 4. 下述 1） -4） 中的任一种生物材料 ： 1） 含有权利要求 2 或 3 所述核酸分子的表达盒 ； 2） 含有权利要求 2 或 3 所述核酸分子的重。
6、组表达载体 ； 3） 含有权利要求 2 或 3 所述核酸分子的重组微生物 ； 4） 含有权利要求 2 或 3 所述核酸分子的转基因细胞系。 5. 制备权利要求 1 所述蛋白质的方法， 包括将权利要求 1 所述的蛋白质的编码基因在 生物细胞中进行表达得到权利要求 1 所述蛋白质的步骤 ； 所述生物细胞为微生物细胞、 植 物细胞或非人动物细胞。 6. 制备表达权利要求 1 所述蛋白质的重组微生物的方法， 包括将权利要求 1 所述的蛋 白质的编码基因导入宿主微生物细胞， 得到表达权利要求 1 所述蛋白质的重组微生物的步 骤。 7. 权利要求 1 所述的蛋白质在作为多聚半乳糖醛酸酶或果胶酶中的应用。 。
7、8.权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在制备多聚半乳糖醛 酸酶或果胶酶中的应用。 9. 权利要求 1 所述的蛋白质在降解植物细胞壁中的应用。 10. 权利要求 1 所述的蛋白质在降解果胶或多聚半乳糖醛酸中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102649952 A 2 1/8 页 3 来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 及其编码基因 与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因与应用， 特别涉及来自辣椒疫霉 的多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因与应用。 背景技术 0002 植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶， 其中多。
8、 聚半乳糖醛酸酶 (PG ： EC 3.2.1.15) 是多种植物病原卵菌分泌的一种重要致病酶， 该类酶 通过降解寄主植物细胞壁的果胶、 中胶层而破坏寄主防御体系， 近而增强病菌对寄主的亲 合力， 因此该类酶是一种重要的致病因子。研究表明多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁结合 蛋白酶， 可催化果胶分子中 - （1,4） - 聚半乳糖醛酸裂解， 降解细胞壁的果胶， 导致细胞壁 软化， 利于病原菌的各种侵染结构、 及其分泌的各种致病酶或致病毒素顺利侵染寄主组织 细胞而导致寄主的病程发展。PG 分为内切型 （endo-） 和外切型 (exo-) 两种， 均由多基因编 码， 植物病原卵菌 PG 基因簇成员间。
9、所编码的多聚半乳糖醛酸酶的性能存在差异， 该类酶降 解寄主细胞壁的性能常由单个或几个关键 Pg 基因协同作用。因此， 探索植物病原卵菌与寄 主互作过程中分泌的 PG 对寄主植物的致病作用， 立足于致病靶标 Pg 基因及其编码的蛋白 质功能特性研究， 具重要的理论和实验意义。 0003 在世界范围内， 植物病原卵菌易导致多种植物的病害， 给农业生产造成了严重的 损失。资料表明 PG 是多种植物病原卵菌的重要致病因子， 辣椒疫霉病是一种重要的卵菌病 害， 能导致多种植物发生严重病害， 深入开展辣椒疫霉菌 （Phytophthora capsici) 多聚半 乳糖醛酸酶基因分离及靶标基因编码的蛋白制。
10、作和功能分析具重要的实践意义， 可以实现 对于植物病原卵菌所导致的多种植物病害的防治与研究。 0004 而且， 多聚半乳糖醛酸酶可用于食品加工， 如在果汁和酒的生产中， 多聚半乳糖醛 酸酶可用于增加果汁的产量， 便于加压和过滤， 而且可以提高果汁和酒的透明度。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供一种多聚半乳糖醛酸酶。 0006 本发明所提供的多聚半乳糖醛酸酶， 名称为 PCIPG20， 来源于辣椒疫霉菌 （Phytophthora capsici) 的一个强致病菌株 SD33， 是如下 a） 或 b） 或 c） 的蛋白质 ： 0007 a） 由序列表中序列 2 第 20-360 位所示。
11、的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0008 b） 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0009 c） 将序列表中序列 2 所示的氨基酸序列或序列 2 第 20-360 位所示的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的 由 a） 衍生的蛋白质。 0010 其中， 序列表中序列2由360个氨基酸残基组成， 第1-19位氨基酸组成信号肽。 a） 所述的蛋白质是多聚半乳糖醛酸酶的成熟蛋白， b） 所述的蛋白质是多聚半乳糖醛酸酶的前 说 明 书 CN 102649952 A 3 2/8 页 4 体蛋白。 0011 为了使上述 （a） 中的蛋。
12、白便于纯化， 可在由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0012 表 1 标签的序列 0013 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为 5 个） RRRRR Poly-His 2-10（通常为 6 个） HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 0014 上述 （c） 中的 PCIPG20 可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。上述 （c） 中的 PCIPG20 的编码基因可通过将序列表中序列 1 自 5端第 1 至 1083。
13、 位碱基所示的 DNA 序列 中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或 在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0015 编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子也属于本发明的保护范围。 0016 其中， 所述核酸分子可以是 DNA， 如 cDNA、 基因组 DNA 或重组 DNA ； 所述核酸分子也 可以是 RNA， 如 mRNA 或 hnRNA 等。 0017 所述核酸分子具体可为如下 1） 或 2） 或 3） 或 4） 所示的基因 ： 0018 1） 其编码序列是序列表中序列 1 的第 58-1083 位核苷酸。
14、的 DNA 分子 ； 0019 2） 其编码序列是序列表中序列 1 的第 1-1083 位核苷酸的 DNA 分子 ； 0020 3） 在严格条件下与 1） 或 2） 限定的 DNA 分子杂交且编码上述多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的 DNA 分子 ； 0021 4） 与 1） 或 2） 限定的 DNA 分子具有 90以上的同源性且编码上述多聚半乳糖醛 酸酶 PCIPG20 的 DNA 分子。 0022 上述严格条件可为用 6SSC， 0.5%SDS 的溶液， 在 65下杂交， 然后用 2SSC， 0.1%SDS 和 1SSC， 0.1%SDS 各洗膜一次。 0023 其中， 序列表中的序列。
15、 1 由 1083 个核苷酸组成， 编码序列表中序列 2 所示的蛋白 质。 0024 下述 1） -4） 中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围 ： 0025 1） 含有编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的表达盒 ； 0026 2） 含有编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的重组表达载体 ； 0027 3） 含有编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的重组微生物 ； 0028 4） 含有编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的转基因细胞系。 0029 上述生物材料中， 1） 所述的含有编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的 说 明 书。
16、 CN 102649952 A 4 3/8 页 5 表达盒， 是指能够在宿主细胞中表达多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的 DNA， 该 DNA 不但可包 括启动多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 基因转录的启动子， 还可包括终止多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20转录的终止子。 进一步， 所述含有多聚半乳糖醛酸酶PCIPG20表达盒还可包括增强 子序列。2） 所述的含有编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的重组表达载体具体可 为在载体 pPIC9K 的多克隆位点插入多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 编码基因得到的重组表达 载体。3） 所述的重组微生物具体可为酵母， 细菌， 藻和真菌。其。
17、中， 酵母可来巴斯德毕赤酵 母， 如巴斯德毕赤酵母 GS115。4） 所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。 0030 本发明的又一个目的是提供一种制备多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的方法。 0031 本发明所提供的制备多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的方法， 包括将多聚半乳糖醛酸 酶 PCIPG20 编码基因在生物细胞中进行表达得到多聚半乳糖醛酸酶的步骤 ； 所述生物细胞 可为微生物细胞、 植物细胞或非人动物细胞。 0032 本发明的再一个目的是提供一种制备表达多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的重组微 生物的方法。 0033 本发明所提供的制备表达多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 。
18、的重组微生物的方法， 包括 将多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的编码基因导入宿主微生物细胞， 得到表达多聚半乳糖醛酸 酶 PCIPG20 的重组微生物的步骤。 0034 其中， 所述的重组微生物具体可为酵母， 细菌， 藻和真菌。 其中， 酵母可来巴斯德毕 赤酵母， 如巴斯德毕赤酵母 GS115。 0035 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20、 编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子或含有 编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子的生物材料在降解果胶中的应用， 也属于本发 明的保护范围。 0036 扩增编码多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 的核酸分子全长或其任一片段的引物对也 。
19、属于本发明的保护范围。如扩增序列 1 的第 58-1083 位核苷酸的引物对。 0037 实验证明， 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 可降解辣椒细胞壁。多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 在降解植物细胞壁， 如降解辣椒细胞壁中的应用也属于本发明的保护范围。 0038 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 具有较高的多聚半乳糖醛酸酶和果胶酶活性， 其多聚 半乳糖醛酸酶的比活力达420.2U/mg蛋白， 其果胶酶的比活力达220.2U/mg蛋白， 可用 于食品加工， 如在果汁和酒的生产中。 附图说明 0039 图 1 为 pPIC9K-pcipg20/GS115 表达产物及其纯化蛋白 SDS-PAGE。
20、 电泳。 0040 图 A 中 M 为 标 准 蛋 白 分 子 量， 1 为 空 载 体 pPIC9K/GS115 表 达 产 物， 2-8 为 pPIC9K-Pcipg20/GS115 于 1-7 天表达产物。图 B 中 M 为标准蛋白分子量， 1 为 Pcipg20 表 达纯化蛋白。 0041 图 2 为多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 接种辣椒叶片 168 小时的电镜照片。 0042 图中 A 为 PCIPG20 对辣椒叶片细胞壁的降解效果， 剑头所示 ； B 为钝化的 PCIPG20 对辣椒叶片细胞壁无破坏作用， 剑头所示 （阳性对照） ， C 为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何 破坏作用。
21、， 剑头所示 （阴性对照） 。 0043 图 3 为多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 接种辣椒叶片 168 小时的电镜照片。 说 明 书 CN 102649952 A 5 4/8 页 6 0044 图中 A 为 PCIPG2 对辣椒叶片细胞壁的降解效果， 剑头所示 ； B 为钝化的 PCIPG2 对 辣椒叶片细胞壁无破坏作用， 剑头所示 （阳性对照） ； C 为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破 坏作用， 剑头所示 （阴性对照） 。 0045 图 4 为多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG5 接种辣椒叶片 168 小时的电镜照片。 0046 图中 A 为 PCIPG5 对辣椒叶片细胞壁的降解效果， 箭头所示。
22、 ； B 为钝化的 PCIPG5 对 辣椒叶片细胞壁无破坏作用， 箭头所示 （阳性对照） ； C 为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破 坏作用， 箭头所示 （阴性对照） 。 具体实施方式 0047 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0048 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0049 实施例 1、 多聚半乳糖醛酸酶的制备 0050 1多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 表达 0051 1.1 制备多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20、 PCIPG2 和。
23、 PCIPG5 的编码基因 0052 本 申 请 的 发 明 人 从 辣 椒 疫 霉 (P.capsici） SD33（J.Phytopathol 157:585-591,2009)（山东农业大学） 中发现了多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 基因、 PCIPG2 基 因和 PCIPG5 基因。其中， 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 基因的核苷酸序列如序列表中序列 1 所示， 其编码序列是序列 1 的第 1-1083 位， 编码序列 2 的蛋白质。序列 1 的第 1-57 位编码 由19个氨基酸残基组成的信号肽。 PCIPG2基因核苷酸序列如序列表中序列3所示， 其编码 序列是序列 3 的第 。
24、106-1191 位。序列 3 的第 106-162 位编码由 19 个氨基酸残基组成的信 号肽。PCIPG5 基因核苷酸序列如序列表中序列 4 所示， 其编码序列是序列 4 的第 43-1128 位。序列 4 的第 43-102 位编码由 20 个氨基酸残基组成的信号肽。 0053 根 据 序 列 表 中 序 列 1 所 示 的 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 PCIPG20 基 因 设 计 扩 增 序列表中序列 2 第 20-360 位的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 成熟蛋白的一对引物 Pcipg20mF、 Pcipg20mR， 并在上下游引物两端分别引入 EcoR 和 Not 酶切位。
25、点。 Pcipg20mF 和 Pcipg20mR 扩增的序列是序列 1 的第 58-1083 位， Pcipg20mF 的序列为 ： CCGGAATTCCACCACCACCACCACCAC TCACCTATGCTACGTGAA， Pcipg20mR的序列为 ： ATTTGCGGCCGC TTAACAGGTAATCCCTGCCG。 0054 根据序列表中序列 3 所示的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 基因设计扩增序列表 中序列 3 第 20-361 位氨基酸残基所示的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 成熟蛋白的一对 引物 Pcipg2mF、 Pcipg2mR， 并在上下游引物两端分别引入 EcoR。
26、 和 Not 酶切位点。 Pcipg2mF 和 Pcipg2mR 扩增的序列是序列 3 的第 163-1191 位核苷酸， Pcipg2mF 的序列为 ： 5 -ACTCGAATTCCACCACCACCACCACCA CTCGCCTATGCTGCGCG-3 ， Pcipg2mR 的序列为 ： 5 -ACTT GCGGCCGCTTAGCACTTGACTGT-3 。 0055 根据序列表中序列 4 所示的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG5 基因设计扩增序列表中 序列 4 第 21-361 位氨基酸残基所示的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG5 成熟蛋白的一对引物 Pcipg5mF、 Pcipg5mR， 并在。
27、上下游引物两端分别引入 EcoR 和 Not 酶切位点。Pcipg5mF 和 Pcipg5mR 扩增的序列是序列 4 的第 103-1128 位核苷酸， Pcipg5mF 的序列为 ： 说 明 书 CN 102649952 A 6 5/8 页 7 0056 5 -TATAGAATTCCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGACACCCATGATCCGTCAGG C-3 ） ， Pcipg5mR 的序列为 ： 0057 5 -TATAGCGGCCGCTTAGCACTTGACAGTGCTGG-3 。 0058 以辣椒疫霉 (P.capsici） SD33（J.Phytop。
28、athol 157:585-591,2009) 的总 RNA 反 转录得到的 cDNA 为模板， 用上述引物分别进行 PCR 扩增， 将扩增产物回收后分别与 pGEM-T Easy Vector（Promega） 连接， 并转化大肠杆菌 DH5， 通过蓝白斑筛选、 质粒 DNA 的酶切 鉴定筛选出阳性克隆， 提取阳性克隆的质粒进行测序， 将含有序列 1 的第 58-1083 位的重 组质粒命名为 pGEM-pcipg20m， 将含有序列 3 的第 163-1191 位核苷酸的重组质粒命名为 pGEM-pcipg2m ； 将含有序列 4 的第 103-1128 位核苷酸的重组质粒命名为 pGEM。
29、-pcipg5m。 0059 2. 在巴斯德毕赤酵母中表达多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 0060 2.1 制备表达载体及工程菌 0061 将 pGEM-pcipg20m、 pGEM-pcipg2m 和 pGEM-pcipg5m 分别用 EcoR 和 Not 双酶 切， 分别回收插入片断， 并与同样双酶切的酵母表达质粒 pPIC9K （Invitrogen） 进行连接， 转 化大肠杆菌 JM109， 转化的 JM109 经 Amp 抗性筛选， 菌落经 37摇培过夜后抽提质粒， 重组 质粒用酶切及鉴定， 提取阳性克隆的质粒进行测序， 将在 pPIC9K 载体的。
30、 EcoR 和 Not 位 点之间定向插入序列 1 的第 58-1083 位的重组质粒命名为 pPIC9K-pcipg20m， 将在 pPIC9K 载体的 EcoR 和 Not 位点之间定向插入序列 3 的第 163-1191 位核苷酸的重组质粒命 名为 pPIC9K-pcipg2m ； 将在 pPIC9K 载体的 EcoR 和 Not 位点之间定向插入序列 4 的第 103-1128 位核苷酸的重组质粒命名为 pPIC9K-pcipg5m。 0062 将 pPIC9K、 pPIC9K-pcipg20m、 pPIC9K-pcipg2m 和 pPIC9K-pcipg5m 用 Sal 限制 性内切。
31、酶 （位于 HIS4 区域内） 进行线性化酶切， 以获得 GS115 His Mut+ 表型转化子。将回 收纯化目的片段采用电击法转化巴斯德毕赤酵母 GS115（Invitrogen） 感受态细胞， 筛选 His+Mut+（即组氨酸快速利用型） 的酵母重组子。 以酵母转化子基因组DNA为模板， 使用AOX1 特征引物 （5 AOX1Primer:5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3和 3 AOX1primer:5 -GCAAATG GCATTCTGACATCC-3 ） 和上述基因特异性引物进行PCR扩增， 将用Pcipg20mF和Pcipg20mR扩 增得到约1000bp和用A。
32、OX1特征引物扩增得到约1500bp的pPIC9K-pcipg20m转化巴斯德毕 赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-pcipg20m/GS115 （PCIPG20基因已整合到Pichia pastaris GS115的基因组中） 。 将用Pcipg2mF和Pcipg2mR扩增得到约1000bp和用AOX1特 征引物扩增得到约 1500bp 的 pPIC9K-pcipg2m 转化巴斯德毕赤酵母 GS115 得到的转化子命 名为 pPIC9K-pcipg2m/GS115 （PCIPG2 基因已整合到 Pichia pastaris GS115 的基因组中） 。 将用 Pcipg5mF。
33、 和 Pcipg5mR 扩增得到约 1000bp 和用 AOX1 特征引物扩增得到约 1500bp 的 pPIC9K-pcipg5m转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-pcipg5m/GS 115 （PCIPG5 基因已整合到 Pichia pastaris GS 115 的基因组中） 。将用 AOX1 特征引物扩增得 到约 500bp 的转化 pPIC9K 的重组巴斯德毕赤酵母命名为 pPIC9K/GS115（空载体对照） 。 0063 2.2 酵母工程菌的培养和多聚半乳糖醛酸酶的诱导分泌表达 0064 1） 分别挑取 pPIC9K-pcipg20m/GS 115、 。
34、pPIC9K-pcipg2m/GS115、 pPIC9K-pcipg5m/ GS 115 和 pPIC9K/GS 115 菌落， 接种于含 25mL BMGY 培养基的 250mL 摇瓶中， 28-30振荡 培养 （250 300rpm） 至对数生长期 （OD600达 2-6， 约 16-18 小时） 。 0065 2） 室温下以 3000g 离心 5min 回收酵母细胞。弃去上清， 将细胞重悬于适当体积的 说 明 书 CN 102649952 A 7 6/8 页 8 BMMY 培养基中， 至 OD600值为 1.0（约 100-200mL） 。 0066 3） 将培养液置于 1L 摇瓶中， 。
35、覆盖两层无菌纱布， 置摇床中， 28-30继续培养并开 始诱导表达。 0067 4） 诱导表达起始后， 每隔 24 小时补加 100% 甲醇至终浓度为 0.5% 以维持诱导。 0068 5） 间隔 24 小时取样一次， 至 168 小时， 每次取诱导培养液 1mL 于 1.5mL 离心管中， 室温下以最大转速离心 2-3min， 取上清液进行 SDS-PAGE 电泳 （以不加甲醇诱导剂的质粒诱 导的蛋白为对照） 。 0069 电泳结果表明 pPIC9K-pcipg20m/GS115 经甲醇诱导后， 在 44kDa 处有一条特异蛋 白带， 而空载体对照则无此带， 说明 PCIPG20 基因已经在。
36、毕赤酵母中进行了有效的表达 （图 1） ； pPIC9K-pcipg2m/GS115 经甲醇诱导后， 在 37kDa 处有一条特异蛋白带， 而空载体对照 则无此带， 说明 PCIPG2 基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达 ； 表明 pPIC9K-pcipg5m/ GS115 经甲醇诱导后， 在 40kDa 处有一条特异蛋白带， 而空载体对照则无此带， 说明 PCIPG5 基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达。 0070 2.3 多聚半乳糖醛酸酶纯化及其活性测定 0071 其中， 多聚半乳糖醛酸酶的纯化方法如下 ： 2.5 多聚半乳糖醛酸酶融合蛋白纯化 0072 2.3.1 蛋白样品的制备 0。
37、073 按照步骤 2.2 中 1） -4） 的方法进行诱导表达， 诱导 168 小时后取诱导培养液按照 如下方法进行蛋白样品的制备。 0074 (1) 收集诱导培养液， 6000rpm 离心 30min， 弃沉淀， 取上清液。 0075 (2)将上清液按照60%的饱和度加入(NH4)2SO4沉淀多聚半乳糖醛酸酶， 8000rpm离 心 30min， 收集沉淀。 0076 (3) 沉淀用 8ml Native Binding Buffer（Invitrogen R901-15） 重新悬浮后， 透 析过夜弃除盐离子， 透析产物即待纯化的蛋白样品。 0077 2.3.2 多聚半乳糖醛酸酶的纯化 00。
38、78 2.3.2.1Ni-NTA 凝胶纯化柱准备 0079 (1)吸取1.5ml凝胶树脂加入至10ml凝胶纯化Ni-NTA柱中， 轻微离心使树脂沉淀 至柱子底部， 流尽清液。 0080 (2) 加入 6ml 双蒸水， 重新悬浮树脂。 0081 (3) 轻微离心使树脂沉淀至柱子底部， 流尽清液。 0082 (4) 加入 6ml Native Binding Buffer（Invitrogen R901-15） ， 重新悬浮树脂。 0083 (5) 连续重复步骤 3 三次。 0084 (6) 连续重复步骤 4-5 三次。 0085 2.3.2.2 多聚半乳糖醛酸酶纯化 0086 (1) 取可溶性蛋。
39、白 8ml 注入 Ni-NTA 柱中。 0087 (2) 轻柔搅拌使树脂在蛋白液中悬浮， 吸附 30-60min， 去掉上清。 0088 (3) 用 8ml Native Wash Buffer （Invitrogen R901-15） 冲洗， 使树脂沉淀至柱子 底部， 去掉上清。 0089 (4) 重复步骤 3 三次。 0090 (5) 用 8-12ml Native Elution Buffer（Invitrogen R901-15） 洗脱蛋白。 说 明 书 CN 102649952 A 8 7/8 页 9 0091 (6) 重复步骤 5 一次， 收集洗脱样品， 取 1ml 洗脱液进行 S。
40、DS-PAGE 分析。 0092 (7) 将洗脱液用双蒸水透析， 去盐离子， 获得纯的多聚半乳糖醛酸酶的酶液。 0093 2.3.3 多聚半乳糖醛酸酶活测定 0094 其中， 多聚半乳糖醛酸活性测定方法如下 ： 0095 用 3,5- 二硝基水杨酸 （DNS） 法测定多聚半乳糖醛酸酶活性 ： 3,5- 二硝基水杨酸 1g 溶于 20mL 氢氧化钠溶液 （1mol/L） 中， 加入蒸馏水 50mL、 酒石酸钾钠 30g， 溶解后用蒸馏 水稀释至 100mL， 密封防止二氧化碳进入。取 0.1% 多聚半乳糖醛酸 （SigmaP3850） 溶液 （用 50mmol/L NaAc， pH5.0 缓冲液。
41、配制） 1.8mL， 加酶液 100L、 l50mmol/L NaAc（pH5.0） 缓冲液 100L， 30水浴 1h。酶作用后的溶液 0.2mL 与 DNS 试剂 0.2mL 混合， 沸水浴加热 10min。 混合物用水稀释至 3mL， 在 540nm 下用 UV-1601 型紫外分光光度计比色， 以不加酶液的多聚 半乳糖醛酸作对照， 记录 OD 值。一个酶活力单位 (U) 定义为 ： 1 分钟内水解 1mol 多聚半 乳糖醛酸所需的多聚半乳糖醛酸酶的量。 0096 实验设三次重复。结果表明由 pPIC9K-pcipg20/GS115 表达纯化产物多聚半乳 糖醛酸酶 PCIPG20 的多聚。
42、半乳糖醛酸酶活力为 420.2U/mg 蛋白， pPIC9K-pcipg2/GS115 表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 的多聚半乳糖醛酸酶活力为 230.2U/mg 蛋白， pPIC9K-pcipg5/GS115 表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG5 的多聚半乳糖醛酸酶活力 为 280.2U/mg 蛋白。pPIC9K/GS115 表达产物无多聚半乳糖醛酸酶活性。 0097 2.3.4 果胶酶活测定 0098 用 3,5- 二硝基水杨酸 （DNS） 法测定多聚半乳糖醛酸酶活性 ： 3,5- 二硝基水杨酸 1g 溶于 20mL 氢氧化钠溶液 （1mol/L） 中， 加入蒸馏水 5。
43、0mL、 酒石酸钾钠 30g， 溶解后用蒸 馏水稀释至 100mL， 密封防止二氧化碳进入。取 0.5% 果胶 （SolarbioP9135-25）溶液 （用 50mmol/L NaAc， pH5.0 缓冲液配制） 1.8mL， 加酶液 100L、 l50mmol/L NaAc（pH5.0） 缓冲液 100L， 30水浴 1h。酶作用后的溶液 0.2mL 与 DNS 试剂 0.2mL 混合， 沸水浴加热 10min。 混合物用水稀释至 3mL， 在 540nm 下用 UV-1601 型紫外分光光度计比色， 以不加酶液的果胶 作对照， 记录OD值。 一个酶活力单位(U)定义为 ： 每分钟每毫克酶。
44、蛋白催化底物释放1mol D- 半乳糖醛酸为一个酶活单位。 0099 实验设三次重复。结果表明由 pPIC9K-pcipg20/GS115 表达纯化产物多聚半乳糖 醛酸酶 PCIPG20 的果胶酶活力为 220.2U/mg 蛋白， pPIC9K-pcipg2/GS115 表达纯化产物 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 的果胶酶活力为 120.2U/mg 蛋白， pPIC9K-pcipg5/GS115 表达 纯化产物多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG5 的果胶酶酶活力为 140.2U/mg 蛋白。pPIC9K/GS115 表达产物无果胶酶活性。 0100 实施例 2、 多聚半乳糖醛酸酶对辣椒叶片细胞壁的。
45、降解 0101 将实施例 1 中纯化的多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 采用针刺 法接种辣椒叶片。具体方法如下 ： 取 4-6 叶期中椒 6 号辣椒苗， 采用针刺法接种辣椒叶 片， PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 的接种浓度均为 700ug/mL。同时以无菌水接种和钝化的 PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 作为对照。蛋白接种辣椒叶片 1-7 天期间， 间隔 24 小时取样一 次， 进行透射电镜观察细胞壁降解情况。其中， 钝化的 PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 按照如 下方法获得 ： 将实施例 1 中纯化多聚半。
46、乳糖醛酸酶 PCIPG20、 PCIPG2 和 PCIPG5 经热水煮沸 5min 后用于活性检测。 说 明 书 CN 102649952 A 9 8/8 页 10 0102 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG20 在接种 168 小时时将辣椒叶片细胞壁降解至破裂的 程度， 而钝化的 PCIPG20 和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用 （图 2） ， 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 在接种后至 168 小时只对辣椒叶片细胞壁轻微降解， 钝化的 PCIPG2 和无菌水对辣 椒叶片细胞壁无破坏作用 （图 3） ； 多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG5 在接种 168 小时时将辣椒叶片 细胞壁降解至轻微破裂的程。
47、度， 钝化的 PCIPG5 和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用 （图 4） 。 说 明 书 CN 102649952 A 10 1/10 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102649952 A 11 2/10 页 12 0003 序 列 表 CN 102649952 A 12 3/10 页 13 0004 序 列 表 CN 102649952 A 13 4/10 页 14 0005 序 列 表 CN 102649952 A 14 5/10 页 15 0006 序 列 表 CN 102649952 A 15 6/10 页 16 0007 序 列 表 CN 102649952 A 16 7/10 页 17 0008 序 列 表 CN 102649952 A 17 8/10 页 18 0009 序 列 表 CN 102649952 A 18 9/10 页 19 0010 序 列 表 CN 102649952 A 19 10/10 页 20 序 列 表 CN 102649952 A 20 1/2 页 21 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102649952 A 21 2/2 页 22 图 4 说 明 书 附 图 CN 102649952 A 22 。