奶山羊PITX1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102649956 A (43)申请公布日 2012.08.29 CN 102649956 A *CN102649956A* (21)申请号 201210114962.0 (22)申请日 2012.04.18 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌区邰城路 3 号 (72)发明人 蓝贤勇 赵海谕 李转见 潘传英 陈宏 雷初朝 (54) 发明名称 奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点及其 检测方法和应用 (57) 摘要 本发明奶山羊 PITX1 基因单核苷。

2、酸多态性位 点及其检测方法和应用， 属于动物分子遗传育种 技术领域。该基因单核苷酸多态性位点包括奶山 羊 PITX1 基因第 201 位为 G 或 A 的单核苷酸多态 性位点， 基因型为 GG、 GA、 AA。通过以包含 PITX1 基因的 DNA 序列为模板， 以引物对 P 为引物， PCR 扩增奶山羊 PITX1 基因 ； 然后利用限制性内切酶 MspI 对 PCR 产物进行酶切 ； 再通过琼脂糖凝胶电 泳检测酶切产物即可鉴定奶山羊 PITX1 基因的单 核苷酸多态性位点。本发明的方法具有能在奶山 羊的标记辅助选择 (MAS) 育种中， 有利于快速建 立遗传资源优良的奶山羊种群， 而且该方。

3、法操作 简单、 快速， 成本低， 而且检测的精确度高的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点， 其特征在于 ： 该基因单核苷酸多态性位点 包括奶山羊 PITX1 基因第 201 位为 G 或 A 的单核苷酸多态性位点， 基因型为 GG、 GA、 AA。 2. 一种检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法， 包括下述步骤 ： (1)、。

4、 以包含 PITX1 基因的 DNA 序列为模板， 以引物对 P 为引物， PCR 扩增奶山羊 PITX1 基因 ； (2)、 然后利用限制性内切酶 MspI 对步骤 (1) 获得的 PCR 产物进行酶切 ； (3)、 再通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤 (2) 获得的酶切产物即可鉴定奶山羊 PITX1 基 因的单核苷酸多态性位点包括第 201 位为 G 或 A 的单核苷酸多态性位点， 基因型为 GG、 GA、 AA ； 所述的引物对 P 为 ： 上游引物 ： F ： 5 -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3 ； 下游引物 ： R ： 5 -TCGTCCATGTCCACGTTCATCG。

5、-3。 3. 如权利要求 2 所述的一种检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法， 其特 征在于， 所述的 PCR 扩增反应程序为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 65.2退火 30s， 72延伸 30s， 35 个循环 ； 72延伸 10min。 4. 根据权利要求 1 所述的一种检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法， 其 特征在于 ： 所述的琼脂糖凝胶电泳为 2.0琼脂糖凝胶电泳。 5.权利要求1所述的奶山羊PITX1基因单核苷酸多态性位点在作为奶山羊泌乳性状的 标记辅助选择育种中提高乳脂量和乳固体物含量的 DNA 遗传标记中的应用。 6. 根。

6、据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于 ： 奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点 的 GA 基因型作为提高奶山羊泌乳性能的 DNA 遗传标记的应用。 权 利 要 求 书 CN 102649956 A 2 1/10 页 3 奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点及其检测方法和应 用 技术领域 0001 本发明属于动物分子遗传育种技术领域， 涉及基因单核苷酸多态性 (SNP) 的检测 及其应用， 具体涉及奶山羊 PITX1( 成对同源异型结构域蛋白转录因子 1) 基因 ( 以序列 Accession No.NW_003104033 为参考 ) 单核苷酸多态性位点及其检测方法和应用。 背。

7、景技术 0002 与奶牛相比， 奶山羊更适用于在恶劣环境条件下饲养， 因为它具有较强抗逆性 ； 与 牛奶相比， 羊奶具有更高的营养价值， 因为它的脂肪球小， 不含过敏原， 酸值低， 比牛奶更易 为人体吸收， 在国际营养界被誉为 “奶中之王” 。然而目前， 我国奶山羊产业相对滞后， 利用 优良奶山羊群体获得羊奶的数量与质量， 与发达国家相比差距巨大， 与目前国内主流的奶 牛业发展 “不可同日而语” 。 为此， 作为我国 “十二五” 规划中奶业发展计划的重要组成部分， 奶山羊业的发展迫在眉睫， 但是目前， 我国该产业发展滞后， 其根本原因在于我国奶山羊品 种种源不足和种群遗传品质较差。 因此， 如。

8、何提高奶山羊种群遗传品质， 从而增加奶山羊的 产奶量并改善乳品质， 是目前我国奶山羊遗传育种专家尚待解决的关键问题。 0003 奶山羊泌乳性能主要包括产奶量、 乳脂率、 乳脂量、 乳蛋白率、 乳蛋白量、 乳固体物 含量等， 属于具有重要经济价值的数量性状位点 (QTL)， 由微效多基因控制， 且遗传力较低。 在奶山羊育种方面， 仅靠传统育种手段对这些泌乳性状进行改良， 无疑是非常缓慢的， 而且 效果也不会很理想， 因此， 应用 DNA 标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传 品质， 从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有效的方法。因为 DNA 标记具有多 态性丰富、 遗传稳定、 。

9、不受组织、 生理发育阶段及环境影响等诸多优点。此外， 随着 DNA 标 记的种类与数目的增多， 基因图谱密度与精度在不断提高， 为遗传改良提供了新的策略， 使 DNA标记辅助选择(MAS)成为一种具有广阔前景的分子育种技术。 由此可见， 利用DNA标记 介导的 MAS 方法和传统育种方法对奶山羊泌乳性状进行改良、 提高， 必将极大地加速选择 进展， 提高选择准确性。 0004 目前， 利用 DNA 标记进行 MAS 育种的主要步骤如下 ： 首先， 在 DNA 水平上快速筛查 与检测影响奶山羊泌乳性状的密切相关的基因 ； 其次， 建立基因多态与泌乳性状的关联分 析， 确定与泌乳性状显著关联的 D。

10、NA 标记或 SNP 位点 ； 最后， 实现遗传标记辅助选择和实现 早期诊断选择。具体而言， 关于 DNA 标记与奶山羊泌乳性状之间关系的研究， 主要有两种基 本方法 ： 候选基因分析和连锁标记分析。 在奶山羊研究中， 候选基因分析比连锁标记分析更 易操作， 且不需要进行特意实验设计、 费用低、 统计功效强， 被广泛采用， 适用于任何可取得 基因型和表型数据的群体。该方法通过统计方法建立相应的数学模型， 从而确定该候选基 因与未知基因的关系或效应。 通常来说， 候选基因是一些与泌乳性状有关的重要基因， 可能 是结构基因、 调节基因或是在生化代谢途径中影响该性状表达的基因。 0005 众所周知，。

11、 生长激素 (GH) 能够促进哺乳动物生长、 泌乳、 细胞增殖。泌乳素 (PRL) 也能够显著地影响哺乳动物的生长、 泌乳以及免疫系统 ； 而且， 已有研究表明， GH 和 PRL 基 说 明 书 CN 102649956 A 3 2/10 页 4 因突变能够显著影响哺乳动物的泌乳期和泌乳性能。因此， GH 基因、 PRL 基因以及它们的 正调控因子基因均可作为影响泌乳性能的关键候选基因。同源异型结构域蛋白转录因子 (PITX) 类转录因子成员在基因活化、 垂体发育中的的关键性作用， 启发此类基因与泌乳性 能的关联性研究。作为 PITX 家族的重要成员， 同源异型结构域蛋白转录因子 1(PIT。

12、X1) 基 因被分别定位在人类第 5 号染色体、 小鼠和原鸡第 13 号染色体、 牛第 7 号染色体， 但山羊 的相应信息尚未公布。序列比对结果表明， PITX1 在人类、 黑猩猩、 狗、 鼠、 鸡、 斑马鱼和牛中 的序列高度保守， 在许多发育通路中发挥重要作用， 包括影响脑垂体的器官发生， 影响 GH、 PRL、 促甲状腺激素(TSH)的表达从而影响动物的泌乳性能。 值得一提的是， PITX1是在发育 中的小鼠、 鸡的胚胎的后肢、 口腔上皮组织、 臂弓等处被发现的， 其决定着肌肉、 骨骼等的形 态。此外， 敲除 PITX1 基因的小鼠表现出在垂体、 后肢和味觉发育上的缺陷和障碍。因此， PI。

13、TX1 基因是垂体 - 下丘脑轴相关激素基因 ( 如 ： PRL 和 GH) 的重要的调节器， 是已知的代 表垂体发育的重要标记基因之一。 0006 所谓单核苷酸多态性 (SNP) 就是指基因组 DNA 序列中由于单个核苷酸 (A/T/C/ G) 的变化而引起的多态性， 其变异形式主要有颠换、 转换、 插入和缺失等。近年来， 已发展 出了许多用于探寻基因 SNP 的方法， 例如 ： DNA 序列测定法、 PCR-SSCP 与 DNA 测序结合法、 PCR-RFLP 法、 AS-PCR 方法、 引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些检测技术中， DNA 序列测定法是最为准确检测 SNP 的方法，。

14、 但是， 其检测费用极其昂贵， 且需要有 DNA 测序仪 等大型仪器， 同时， 在测序过程中需要非常熟练的有经验的技术人员， 所以， DNA 序列测定 法不是一种应用于生产实践的理想的 SNP 检测方法 ； 利用 PCR-SSCP 与 DNA 测序结合法检 测 SNP， 可以适当降低检测费用， 但是， 其实验过程比较长， 操作比较繁琐， 且实验过程中存 在假阴性问题， 所以， 也并非理想的 SNP 检测手段 ； AS-PCR 方法作为一种新型的 SNP 检测 方法， 在未来的应用领域中具有非常广阔的前景， 但是该方法需要设计特别的引物， 且只能 针对特定的基因位点， 同时检测过程中还存在误检的。

15、概率， 因此， 目前不具有普遍应用的特 点 ； 而用引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测 SNP 位点， 需要平板读数仪、 基因芯片、 微球阵列技术和质谱仪等检测平台， 对于一般的分子实验室来说可实施性不强。 综上所述， PCR-RFLP 法是当前检测 SNP 最为理想的遗传标记方法。 0007 最新研究表明， 关于 PIX1 基因 SNP 研究多见于人、 小鼠等生物的体外表达分析， 且常被作为器官机能缺陷和重要的疾病预测相关的候选基因， 而鲜见于家畜和家禽 SNP 分 析。截至目前， 关于奶山羊 PITX1 基因 SNP 研究尚未见相关报道。中国奶山羊 PITX1 基因 SNP 领域的研究匮。

16、乏， 基因位点的功能研究及其遗传变异与泌乳性能 ( 如 ： 产奶量、 乳脂率、 乳脂量、 乳蛋白率、 乳蛋白量、 乳固体物含量等)的关联研究仍是空白。 由于PITX1基因SNP 位点在动物生产实践中对形成胚胎、 调控生长激素和促进垂体分泌激素等具有重要的作 用， 本发明提供的检测方法为 PITX1 基因 SNP 与奶山羊泌乳性状之间关系的建立奠定了基 础， 以便用于中国奶山羊泌乳性状的标记辅助选择 (MAS)， 快速建立遗传资源优良的奶山羊 种群， 从而提高种群遗传品质， 增加奶山羊的产奶量和改善乳品质， 为我国奶山羊业的发展 提供理论与实践资料。 发明内容 0008 本发明解决的问题是， 利。

17、用PCR-RFLP方法快速检测奶山羊PITX1基因SNP， 并将其 说 明 书 CN 102649956 A 4 3/10 页 5 与奶山羊泌乳性状进行关联分析， 验证其作为奶山羊分子育种中辅助选择的 DNA 标记， 从 而加快良种选育速度。 0009 为了实现上述发明的目的， 本发明采取如下的技术方案 ： 0010 奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点， 其中， 该基因单核苷酸多态性位点包括 奶山羊 PITX1 基因第 201 位为 G 或 A 的单核苷酸多态性位点， 基因型为 GG、 GA、 AA。 0011 一种检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法， 包括下述步骤 。

18、： 0012 (1)、 以包含 PITX1 基因的 DNA 序列为模板， 以引物对 P 为引物， PCR 扩增奶山羊 PITX1 基因 ； 0013 (2)、 然后利用限制性内切酶 MspI 对步骤 (1) 获得的 PCR 产物进行酶切 ； 0014 (3)、 再通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤 (2) 获得的酶切产物即可鉴定奶山羊 PITX1 基因的单核苷酸多态性位点包括第 201 位为 G 或 A 的单核苷酸多态性位点， 基因型为 GG、 GA、 AA ； 0015 所述的引物对 P 为 ： 0016 上游引物 ： F ： 5 -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3 ； 0017 下。

19、游引物 ： R ： 5 -TCGTCCATGTCCACGTTCATCG-3。 0018 上述技术方案中所述的一种检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法， 其中， 所述的 PCR 扩增反应程序为 ： 0019 94预变性5min ； 35个循环(94变性30s， 65.2退火30s， 72延伸30s) ； 72 延伸 10min。 0020 上述技术方案中所述的一种检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法， 其中， 所述的琼脂糖凝胶电泳为 2.0琼脂糖凝胶电泳。 0021 上述技术方案中所述的奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点在作为奶山羊泌 乳性状的标记辅助选择。

20、育种中提高乳脂量和乳固体物含量的 DNA 遗传标记中的应用。 0022 上述技术方案中所述的应用， 其中， 奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的 GA 基因型作为提高奶山羊泌乳性能的 DNA 遗传标记的应用。 0023 在本发明中检测奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的方法中， 以奶山羊基因 组 DNA 为模板， 在 Taq DNA 聚合酶、 Buffer( 缓冲环境 )、 Mg2+、 dNTPs 存在的情况下， 利用引 物对 P 进行 PCR 扩增， 然后利用限制性内切酶对扩增得到的 DNA 片段进行酶切， 再通过琼脂 糖凝胶电泳检测即可鉴定奶山羊 PITX1 基因第 201。

21、 位即内含子 1 第 41 位 (NW_003104033 ： g.201G A(IVS1+41G A) 的单核苷酸多态性 ； 本发明的 buffer 中不含有 Mg2+。 0024 本发明中奶山羊PITX1基因第201位为G或A的单核苷酸多态性位点中， A等位基 因表现为230bp， G等位基因表现为 ： 121bp和109bp， 相应地， GG基因型表现 ： 121bp， 109bp ； GA 基因型表现 ： 230bp， 121bp， 109bp ； AA 基因型表现 ： 230bp。 0025 本发明根据牛PITX1基因的序列(GenBank Accession number ： NW。

22、_003104033)设 计引物对 P( 由于 NCBI 未公布山羊基因组序列 )， 以关中奶山羊基因组 DNA 池为模板， 进行 PCR 扩增， 并对 PCR 产物进行测序， 测序后得到奶山羊 PITX1 基因的部分序列。与 NCBI 公布 的序列进行比较后， 发现在第 201 位 ( 内含子 1 的第 41 位 ) 存在 SNP。 0026 针对上述第 201 位的 SNP， 本发明还公开了其筛查和检测方法， 通过设计特定的引 物， PCR 扩增目的片段， 然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定， 能够简单、 快速、 低成本、 精确 说 明 书 CN 102649956 A 5 4/10 页 6。

23、 地检测其单核苷酸多态性。 0027 本发明具有以下有益效果 ： 0028 1、 本发明公开了奶山羊 PITX1 基因单核苷酸多态性位点的筛查和检测方法， 通过 设计特定的 PCR 引物扩增片段， 能够用 RFLP 方法简单、 快速、 成本低、 精确的检测其单核苷 酸的多态性 ； 0029 2、 本发明对关中奶山羊该 SNP 基因型进行了检测和基因频率分析， 对上述 SNP 位 点与奶山羊的泌乳性能 ( 包括羊奶的乳脂含量和乳固体物含量 ) 进行关联分析， 结果表明 该位点可以作为提高奶山羊泌乳性能的分子标记 ； 0030 3、 本发明公开的检测方法为奶山羊PITX1基因的SNP与奶山羊的泌乳。

24、性状关系的 建立奠定了基础， 以便用于奶山羊泌乳性状的标记辅助选择 (MAS) 育种中用于快速建立遗 传资源优良的奶山羊种群。 附图说明 0031 1、 图 1 为奶山羊 PITX1 基因第 201 位 GA 基因型个体的测序图 ； 0032 2、 图2为MspI PCR-RFLP方法检测山羊PITX1基因第1内含子SNP(NW_003104033 ： g.201G A or IVS1+41G A) 序列分析图 ； 0033 3、 图 3 为 MspI PCR-RFLP 方法检测奶山羊 PITX1 基因第 201 位 ( 内含子 1 第 41 位 )SNP 酶切电泳分型图。 具体实施方式 ： 。

25、0034 为使本发明的技术方案便于理解， 以下结合具体实施例对本发明作进一步的说 明。 0035 本发明下述实施例中所用的主要试剂及其来源如下 ： 0036 1、 生化试剂与生物学试剂 ： 0037 Taq DNA 聚合酶 ( 购自 MBI 公司 ) ； 限制性内切酶 MspI( 购自 MBI 公司 ) ； dNTPs( 购自 MBI 公司 ) ； Marker I ： ( 购自北京天根生化科技有限公司 ) ； 蛋白酶 K( 购自华美生物工程公司 )。 0038 2、 普通试剂 ： 0039 普通试剂从华美生物工程公司购买， 为进口分装产品 ： 柠檬酸、 柠檬酸钠、 葡萄糖、 Tris、 ED。

26、TA、 NaCl、 NaOH、 KCl、 Na2HPO4、 KH2PO4、 Tris 饱和酚、 氯仿、 异戊醇、 无水乙醇、 醋酸 钠、 十二烷基磺酸钠 (SDS)、 溴化乙锭 (EB)、 溴酚蓝、 二甲基苯氰 FF、 乙酸、 蔗糖、 硼酸、 琼脂 糖等。 0040 3、 溶液与缓冲液 0041 所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为 15bf/ in(1.034105Pa)， 25min。试剂配制方法均参考 Sambrook 等编著的 分子克隆实验指南 。 0042 (1)、 样品采样所用溶液 ： 0043 抗凝剂 ACD ： 柠檬酸 0.48g ； 柠檬酸钠 1.32g ；。

27、 葡萄糖 1.47g。把它们定容于 100mL 水中， 高压灭菌。每 6mL 新鲜血液中加入 1mL 的 ACD 液。这一抗凝剂优于 EDTA， 在血液贮 存过程中能更好地保存高分子的 DNA， 经其抗凝的血液可以在 0保存数天或 -70长期保 说 明 书 CN 102649956 A 6 5/10 页 7 存。 0044 (2)、 血样基因组 DNA 分离所用溶液 ： 0045 、 PBS 缓冲液 ： NaCl 8g， KCl 0.2g， Na2HPO4 1.44g， KH2PO4 0.24g， 加超纯水至 1000mL， 调 pH 至 7.4， 高压灭菌 ； 0046 、 10SDS ： 。

28、10g SDS溶解于90mL的超纯水中， 68水浴溶解， 用HCl调pH至7.2， 定容至 100mL ； 0047 、 0.5mol/L EDTA ： EDTA 186.1g， 溶于 800mL 的超纯水中， 用 NaOH 调 pH 至 8.0， 定容至 1000mL， 高压灭菌， 4保存 ； 0048 、 1mol/LTrisCl ： 121.14g Tris， 溶于 800mL 超纯水中， HCl 调节 pH 至 8.0， 定 容至 1000mL， 高压灭菌， 4保存 ； 0049 、 5mol/LNaCl ： NaCl 292.2g 溶于 1000mL 超纯水中 ； 0050 、 DN。

29、A 抽提缓冲液 ： 取 0.5mmol/L EDTA 40mL， 1mmol/L TrisCl 10mL ； 0051 、 5mmol/L NaCl 4mL， 10SDS 10mL定容至100mL。 实际浓度为200mmol/LEDTA， pH 8.0 ； 100mmol/L TrisHCl， pH 8.0 ； 200mmol/L NaCl， 2 SDS ； RNase 20g/mL ； 0052 、 NaAc 缓冲液 ： NaAc3H2O 20.4g ； 超纯水 40mL ； 稀 HAc 调 pH 至 7.4 ； 定容至 50mL ； 0053 、 TE 缓 冲 液 ： TrisCl 缓 冲。

30、 液 (pH 8.0)10mmol/L， EDTA 缓 冲 液 (pH 8.0)0.1mmol/L， 高压灭菌， 4保存 ； 0054 、 蛋白酶 K ： 用超纯水配成 20mg/mL， -20保存 ； 0055 (3)、 组织样 DNA 提取所用溶液 ： 0056 除了基因组 DNA 提取时的公用溶液外， 还配置以下试剂 ： 0057 、 2mol/L NaCl ： 11.688g 溶于水， 定容至 100mL， 高压灭菌 ； 0058 、 组织 DNA 提取液 (100mL) ： 1mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL， 0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL， 2。

31、mol/L NaCl 5mL， 定容至 100mL ； 0059 (4)、 琼脂糖电泳分析所用溶液 0060 、 0.5TBE 缓冲液 ： 取 10TBE 50mL 定容至 1000mL ； 0061 、 上样缓冲液 ： 0.25溴酚蓝， 0.25二甲苯青 FF， 40.0 (w/v) 蔗糖水溶液。 0062 实施例一 ： 奶山羊 PITX1 基因部分 DNA 序列的克降与 DNA 测序 0063 一、 奶山羊样品的采集 0064 提取 DNA 所用血样 ( 静脉采血 ) 和耳组织样均采自 658 只健康且无血缘关系的 2-4 岁关中奶山羊， 采自陕西省三原县奶山羊育种场。 0065 二、 血。

32、样基因组 DNA 的提取与分离 0066 (1)、 冷冻血样 ( 主要为血细胞 ) 室温解冻， 转移 500L 至 1.5mL Eppendorf 管， 加入等体积 PBS 液， 充分混匀， 12000r/min 离心 10min(4 )， 弃去上清液， 重复上述步骤至 上清液透明、 沉淀呈淡黄色。 0067 (2)、 在离心管中加入 DNA 抽提缓冲液 500L， 摇动， 使血细胞沉淀脱离离心管管 壁， 37水浴 1h。 0068 (3)、 加蛋白酶K至30L(20mg/mL)并混匀， 55过夜至澄清， 尚未澄清者， 可补加 10L 蛋白酶 K 混匀继续消化直至澄清。 说 明 书 CN 10。

33、2649956 A 7 6/10 页 8 0069 (4)、 将反应液冷却至室温， 加 Tris- 饱和酚 500L， 温和摇动离心管 20min， 使其 充分混匀 ； 4， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另一 1.5mL 离心管中， 重复一次。 0070 (5)、 加氯仿500mL， 充分混匀20min， 4， 12000r/min离心10min， 将上清液转入另 一 1.5mL 离心管中。 0071 (6)、 加氯仿、 异戊醇混合液(241)500mL， 充分混匀20min， 4， 12000r/min离心 10min， 将上清液转入另一 1.5mL 离心管中。 0。

34、072 (7)、 加 0.1 倍体积的 NaAc 缓冲液及 2 倍体积的冰冷的无水乙醇， 混合转动离心管 直至白色的絮状沉淀析出， -20保存 30 60min。 0073 (8)、 4， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 用 70冰冷乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次。 0074 (9)、 4， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 室温下使乙醇挥发干净。 0075 (10)、 干燥后的 DNA 溶于 80 100L 的 TE 液， 4保存直至 DNA 完全溶解， 0.8 琼脂糖凝胶电泳检测其质量， -80保存。 0076 三、 组织样品 DNA 的提取与。

35、分离 0077 (1)、 取奶山羊耳组织样约 10mg 的组织样品， 放于 1.5mL 的离心管中， 用小剪刀尽 量剪碎。 0078 (2)、 加入 600L 组织提取液， 10 SDS 至终浓度为 1， 蛋白酶 K 至终浓度为 100g/mL， 55.0消化过夜， 最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。 0079 (3)、 将溶液冷却至室温， 加入等体积的 Tris 饱和酚， 盖紧管盖， 缓慢地来回颠倒 离心管， 至少持续 10min 以上， 12000r/min 离心 15min。 0080 (4)、 取上清液， 加入等体积的酚氯仿 (1 1)， 盖紧管盖， 缓慢地来回颠倒离心 管， 。

36、至少持续 10min 以上， 12000r/min 离心 15min。 0081 (5)、 取上清液， 加入等体积的氯仿异戊醇 (24 1)， 盖紧管盖， 缓慢地来回颠倒 离心管， 至少持续 10min 以上， 12000r/min 离心 15min。 0082 (6)、 取上清液， 加入 2 倍体积的冰冷无水乙醇和 1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠， 盖紧 管盖， 缓慢地来回颠倒离心管， 直至出现白色絮 DNA。 0083 (7)、 挑出 DNA， 放进一个 1.5mL 的离心管中， 加入 500L 70乙醇， 盖紧管盖， 缓 慢地来回颠倒离心管， 然后 12000r/min 离心 3。

37、 5min， 小心倒掉乙醇， 将管倒置于吸水纸 上。 0084 (8)、 再一次向离心管中加入 500L 70乙醇， 盖紧管盖， 缓慢颠倒， 然后 12000r/min 离心 3 5min， 小心倒掉乙醇， 将管倒置于吸水纸上。 0085 (9)、 待干燥后， 加入 60L 灭菌超纯水， 4保存过夜， 待检测。 0086 四、 DNA 的纯化 0087 (1)、 500L 的 DNA 溶液中加入 10 SDS 使其终浓度为 0.1， 加入蛋白酶 K 至终 浓度达到 100g/mL。 0088 (2)、 5保温 10h 左右。 0089 (3)、 等体积苯酚氯仿异戊醇 (25 24 1) 和氯仿。

38、分别抽提一次。 0090 (4)、 12000r/min 离心 5min 分相， 吸取上层水相至另一离心管中。 0091 (5)、 加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠和 2 倍体积冰冷无水乙醇沉淀 DNA。 说 明 书 CN 102649956 A 8 7/10 页 9 0092 (6)、 倒掉液体， 70乙醇洗涤后凉干， 加入 60L 灭菌超纯水溶解， 4待检测。 0093 五、 分光光度法检测 DNA 0094 用紫外光光度计测定 DNA 样品在 260nm、 280nm 处的 OD 值。计算 DNA 含量和 OD260/ OD280的比值。如 OD260/OD280比值小于 1.。

39、6， 说明样品中含有较多的蛋白质或酚， 则应进行纯 化 ； 若比值大于 1.8， 则应该考虑去除 RNA 纯化。 0095 DNA 浓度 (ng) 50OD260值 稀释倍数 0096 DNA 检测完毕后， 取适量稀释至 50ng/L， 存于 -20备用， 其余的存放于 -80。 0097 六、 DNA 池的构建 0098 DNA 检测完毕后， 从 100 个浓度为 50ng/L 的关中奶山羊 DNA 样品中各取 10L 混合， 构建关中奶山羊群体 DNA 池。 0099 七、 引物的设计 0100 由于目前美国国立医学图书馆(NCBI)网站上并未公布奶山羊PITX1基因的序列， 为此， 以N。

40、CBI上公布的牛PITX1基因(GenBank accession No.NW_003104033)序列为参考， 利用软件 Primer 5.0 设计了扩增奶山羊 PITX1 基因第 1 内含子的 230bp 片段的 PCR 引物 对 P， 其引物对 P 的序列信息如下 ： 0101 上游引物 ： F ： 5 -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3 (nt50-71) ； 0102 下游引物 ： R ： 5 -TCGTCCATGTCCACGTTCATCG-3 (nt 259-279) 0103 八、 PCR 克隆奶山羊 PITX1 基因 0104 以构建好的关中奶山羊群体 DNA 。

41、池为模板， 用上述设计的引物进行 PCR 扩增， PCR 反应体系见表 1。 0105 表 1 PCR 反应体系 0106 灭菌超纯水 (H2O) 15.75L 10PCR 缓冲液 (MBI， Fermentas) 2.5L MgCl2(25mmol/L) 1.5L dNTPs(2.5mmol/L) 2.5L 上游引物 (10pmol/L) 0.5L 下游引物 (10pmol/L) 0.5L Taq DNA 聚合酶 (0.5U/L) 1.25L DNA 模板 (100ng/L) 0.5L 总体积 25L 0107 PCR 反应的程序如下 ： 95预变性 4min， 35 个循环 (94 30s。

42、， 65.2 30s， 72 30s)， 最后 72延伸 10min， 4保存。 说 明 书 CN 102649956 A 9 8/10 页 10 0108 九、 PCR 产物纯化和 DNA 池测序 0109 PCR 扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳检测， 然后进行 PCR 产物的切胶回收及纯 化 ： 在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶， 放入 1.5mL 离心管中， 然后用 PCR 产物回收纯化试剂盒 ( 北京天根生物公司 ) 纯化 PCR 产物， 按照试剂盒说明书操作。 0110 把以关中奶山羊 DNA 池为模板的 PCR 纯化产物送南京金斯瑞有限公司进行双向 测序。对奶山羊 PI。

43、TX1 基因第 1 内含子 230bp 片段的测序峰图进行分析， 其中在同一位点 有两个不同峰表示发生了单核苷酸突变。本发明筛查到了奶山羊 PITX1 基因的 1 个 SNP， 如图 1 所示， 在其第 201 位为 G 或 A 的单核苷酸多态性， 可表示为 G A， 其中图 1 中带框 的字母表示该位点发生 G A 的突变 (NW_00314033 ： g.201G A) ； 绿线代表 A 碱基 的测序峰， 红线代表 T 碱基的测序峰， 蓝线表示 C 碱基的测序峰， 黑线代表 G 碱基的测序 峰 )。然后利用 Blastn 软件和 BioXM(2.6) 软件对 G 等位基因和 A 等位基因的。

44、相应序列进 行序列比对和酶切位点分析， 发现 G A 的突变 (NW_00314033 ： g.201G A) 存在 MspI 多 态性， 其分析结果如图 2 所示， 图 2 为 MspI PCR-RFLP 方法检测山羊 PITX1 基因第 1 内含子 SNP(NW_003104033 ： g.201G A or IVS1+41G A) 序列分析图， 其中带框序列分别表示上 下游引物序列， 粗体且下划线的字母或小点且下划则表示 SNP 位点。 0111 实施例二 ： 奶山羊 PITX1 基因 201 位 G A 多态性的 MspI PCR-RFLP 分析 0112 一、 多态位点分析 0113。

45、 当奶山羊 PITX1 基因第 201 位发生 G A 突变时， 即 G 突变为 A， 原来 CCG序列 相应地变成 CCG从而失去了 MspI 限制性内切酶识别序列， 不能被限制性内切酶 MspI 所 切割。 0114 二、 PCR 反应条件 0115 PCR 扩增体系和反应条件分别如前面所述， 其中模板使用奶山羊个体基因组 DNA， PCR 扩增产物用 1.0琼脂糖凝胶电泳检测， 可以清晰的看到 230bp 的条带。 0116 三、 PCR 产物酶切 (MspI) 及 RFLP 检测 0117 对PCR扩增产物首先分别进行MspI酶切， 然后根据琼脂糖凝胶电泳结果判定该位 点的单核苷酸多态。

46、性。 0118 1、 酶切 ： 0119 (1)、 MspI酶切体系(25L) ： 20L奶山羊个体DNA PCR产物， 2.5L 10buffer 缓冲液(含BSA)， 1.0L(浓度10U/L)的MspI限制性内切酶， 1.5L灭菌超纯水(H2O)。 0120 (2)、 酶切条件 ： 37恒温水浴或空气浴中消化 5h。 0121 2、 琼脂糖凝胶电泳分型 ： 0122 制作 2.0的琼脂糖凝胶， 100V 电压下电泳， 当分子量不同的 DNA 片段分离清晰 时， EB 染色， 用 BIO-RAD Gel Doc 2000 凝胶成像分析系统照相分析， 人工进行判型。 0123 电泳结果如图 。

47、3 所示， 其中泳道 1、 2、 3、 5、 9、 14 为 GG 基因型 ； 泳道 6、 8、 10、 11、 12、 13 为 GA 基因型 ； 泳道 4、 7 为 AA 基因型 ； Marker 为 Marker I， 分别是 600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp 和 100bp ； 由于奶山羊 PITX1 基因 PCR 扩增产物的 SNP 位点所在序列为 CCGG 时， 能被限制性内切酶 MspI 识别， 230bp 的基因片段被切为 121bp、 109bp 两条带 ； 当上述该 位点发生 G A 的突变时， 不能被限制性内切酶 MspI 所识别， 即片。

48、段不能被限制性内切酶 说 明 书 CN 102649956 A 10 9/10 页 11 所切割， 仅有一条230bp大小的条带 ； 由于山羊为二倍体动物， 当发生GA突变时， 可形成 不同的基因型， 分别为 GG、 GA 和 AA， 可以通过其酶切后的电泳图来进行判别， 图 3 中 AA 基 因型表现为 230bp 一条带， GA 基因型表现为 121bp、 109bp、 230bp 三条带， GG 基因型表现为 121bp 和 109bp 两条带。 0124 实施例三 ： 本发明制备的 DNA 标记在关中奶山羊群体多态性中的诊断应用 0125 一、 群体多态性中的诊断 ： 0126 利用上述的 SNP 检测方法对所有关中奶山羊的 DNA 样品分别进行 PCR-RFLP 的基 因型鉴定。 0127 二、 SNP 位点的频率统计分析 ： 0128 基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。 PAANAA/N， 其中 PAA代表某一位点的 AA 基因型频率 ； NAA表。