一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102649967 A (43)申请公布日 2012.08.29 CN 102649967 A *CN102649967A* (21)申请号 201210177083.2 (22)申请日 2012.05.31 C12N 15/75(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 王琦 汝津江 李燕 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种转化野生型枯草芽孢杆菌的。

2、方法 (57) 摘要 本发明公开了转化野生型枯草芽孢杆菌的方 法。本发明提供的方法包括制备感受态细胞和 电击转化两个步骤 ； 所述制备感受态细胞依次包 括如下步骤 ：（1） 将野生型枯草芽孢杆菌接种至 生长培养基， 使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度 为 1.8107-7.7107CFU/mL， 35-37振荡培养 2-3.5h ；（2)将1体积份完成步骤(1)的培养体系 与 0.8-1.2 体积份诱导培养基混匀， 35-37振荡 培养 1.5-3.5h ； 所述电击转化包括如下步骤 ： 将 待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴， 然 后采用 1.2-1.8kV 的电压进行电击， 得到导入所 述。

3、待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。本发明提供 的方法， 转化效果好， 操作简便。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法， 包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤 ； 所述制备感受态细胞依次包括如下步骤 ： （1） 将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基， 使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为 1.8107-7.7107CFU/mL， 35-37振荡培养 2-3.5h ； 所述。

4、生长培养基的溶剂为水， 溶质及 其浓度如下 ： 硫酸铵 1.8-2.2g/L、 磷酸氢二钾 14-16g/L、 柠檬酸三钠 1.5-2.5g/L、 硫酸镁 0.09-0.1g/L、 葡萄糖 4.8-5.2g/L 和酪蛋白水解物 0.18-0.22g/L ； （2) 将 1 体积份完成步骤 (1) 的培养体系与 0.8-1.2 体积份诱导培养基混匀， 35-37 振荡培养 1.5-3.5h ； 所述诱导培养基的溶剂为水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵 1.8-2.2g/L、 磷酸氢二钾 14-16g/L、 柠檬酸三钠 1.5-2.5g/L、 硫酸镁 0.09-0.1g/L 和葡萄糖 4.8-5.。

5、2g/ L ； 所述电击转化包括如下步骤 ： 将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴， 然后采 用 1.2-1.8kV 的电压进行电击， 得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比 为 ： 100ng-5g 所述待转化质粒 ： 0.2109CFU-0.49109CFU 感受态细胞。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述制备感受态细胞还包括如下步骤 （3） ： 将完成所述步骤 （2） 的培养体系冰浴 30min， 然后 4离心收集细胞。 4. 如权利要求 1 至 3 中任一所述。

6、的方法， 其特征在于 ： 所述电击转化中， 所述冰浴的时 间为 30min。 5. 如权利要求 1 至 4 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述电击转化中， 所述电击的电 阻为 200、 电容为 25F。 6. 如权利要求 1 至 5 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述电击转化还包括在所述电 击后进行如下处理的步骤 ： 向电击杯中加入700-1000L 30-37预热的 LB 液体培养基并 混匀， 然后 30-37振荡培养 3h。 7. 如权利要求 1 至 6 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述待转化的质粒为穿梭载体 pBE2、 穿梭载体 pS4GFP 或穿梭载体 pMarA。。

7、 8. 如权利要求 1 至 7 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述野生型枯草芽孢杆菌为未 经过遗传工程改造的枯草芽孢杆菌。 权 利 要 求 书 CN 102649967 A 2 1/9 页 3 一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法 技术领域 0001 本发明涉及细菌转化领域， 具体的涉及一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。 背景技术 0002 枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌， 广泛存在于自然界中， 很多植物内生和土 壤习居枯草芽孢杆菌是潜在的植物病害生物防治因子， 建立相应转化体系是对菌株进行荧 光标记以原位监测其定殖、 分布规律的前提。转化是指细菌摄取外界环境中 DNA 的过程， 细 菌能。

8、够通过自然转化适应复杂的外界环境， 转化的发生可能会造成基因克隆、 突变体产生 和基因图谱等现象。 0003 枯草芽孢杆菌转化机制研究表明， 细胞感应外界信号后经过一系列调控途径诱导 感受态形成因子 ComK 的产生， ComK 再调控一系列后期感受态形成基因 （late competence genes） 表达， 这些基因编码细胞膜上识别并接受外源 DNA 的复合体和胞内保护酶等产物， 目前所有转化的发生都需要细胞处于感受状态， 这样才可能转化成功， 因此制备性能良好 的感受态细胞是实现枯草芽孢杆菌转化的关键步骤。 0004 传统转化方法很难在实验室条件下实现野生型枯草芽孢杆菌的人工转化， 。

9、许多已 经成功转化的菌株是经过遗传改良或是适应了实验室条件的菌株。 对于野生型枯草芽孢杆 菌人工转化来说， 现有的方法主要是自然转化法、 原生质体转化法和传统电击转化法等。 自 然转化法操作简单， 但成功率极低， 该方法中的培养基诱导细胞进入感受状态这一步十分 关键， 加入质粒后发生自然转化的概率很低。原生质体转化法转化率相对较高， 但步骤繁 琐， 加入溶菌酶的量及处理时间、 聚乙二醇 （PEG） 的处理方法及处理时间、 细胞壁的再生及 转化子筛选等步骤非常关键， 很难把握。传统电击转化法使用较多， 操作相对简便， 但转化 效率不高， 电压 （电容与电阻的设置） 和时间常数是关键参数。 发明内。

10、容 0005 本发明的目的是提供一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。 0006 本发明提供的转化野生型枯草芽孢杆菌的方法， 包括制备感受态细胞和电击转化 两个步骤 ； 0007 所述制备感受态细胞依次包括如下步骤 ： 0008 （1） 将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基， 使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓 度 为 1.8107-7.7107cfu/mL（如 1.8107-5107CFU/mL 或 5107-7.7107CFU/mL） ， 35-37（如 35-36或 36-37） 振荡培养 2-3.5h（如 2-3h 或 3-3.5h） ； 所述生长培养基 的溶剂为水 （如双蒸水） ， 溶质及其浓。

11、度如下 ： 硫酸铵 1.8-2.2g/L（如 1.8-2g/L 或 2-2.2g/ L） 、 磷酸氢二钾 14-16g/L（如 14-14.8g/L 或 14.8-16g/L） 、 柠檬酸三钠 1.5-2.5g/L（如 1.5-1.9g/L 或 1.9-2.5g/L） 、 硫酸镁 0.09-0.1g/L （如 0.09-0.098g/L 或 0.098-0.1g/L） 、 葡 萄糖 4.8-5.2g/L （如 4.8-5g/L 或 5-5.2g/L） 和酪蛋白水解物 0.18-0.22g/L （如 0.18-0.2g/ L 或 0.2-0.22g/L） ； 说 明 书 CN 102649967。

12、 A 3 2/9 页 4 0009 （2) 将 1 体积份完成步骤 (1) 的培养体系与 0.8-1.2 体积份 （如 0.8-1 体积份或 1-1.2 体积份） 诱导培养基混匀， 35-37（如 35-36或 36-37） 振荡培养 1.5-3.5h（如 1.5-3h 或 3-3.5h） ； 所述诱导培养基的溶剂为水 （如双蒸水） ， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵 1.8-2.2g/L （如 1.8-2g/L 或 2-2.2g/L） 、 磷酸氢二钾 14-16g/L （如 14-14.8g/L 或 14.8-16g/ L） 、 柠檬酸三钠 1.5-2.5g/L（如 1.5-1.9g/L 或 。

13、1.9-2.5g/L） 、 硫酸镁 0.09-0.1g/L（如 0.09-0.098g/L 或 0.098-0.1g/L） 和葡萄糖 4.8-5.2g/L（如 4.8-5g/L 或 5-5.2g/L） ； 0010 所述电击转化包括如下步骤 ： 将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴， 然 后采用 1.2-1.8kV（如 1.2-1.5kV 或 1.5-1.8kV） 的电压进行电击， 得到导入所述待转化质 粒的重组枯草芽孢杆菌。 0011 所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为 ： 100ng-5g（如 100ng-2g 或 2-5g）所述待转化质粒 ： 0.2109CFU-0.49109C。

14、FU（如 0.2109CFU-0.31109CFU 或 0.31109CFU-0.49109CFU） 感受态细胞。 0012 所述制备感受态细胞还包括如下步骤 （3） ： 将完成所述步骤 （2） 的培养体系冰浴 30min， 然后 4离心收集细胞。 0013 所述离心的条件具体可为 ： 5000r/min 离心 10min。 0014 所述制备感受态细胞还包括如下步骤 ： 完成所述步骤 （3） 后， 依次用 4预冷的双 蒸水和 4预冷的 HEPES 缓冲液清洗所述细胞， 然后用 4预冷 HEPES 甘油缓冲液重悬细 胞， 即为感受态细胞。 0015 HEPES 缓冲液 （1mM， pH7.0）。

15、 的制备方法 ： 将 0.238g HEPES 用双蒸水溶解并定容至 1L。 0016 HEPES 甘油缓冲液 （1mM， pH7.0） 的制备方法 ： 将 0.238g HEPES 固体粉末、 100mL 甘 油和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至 1L。 0017 所述电击转化中， 所述冰浴的时间具体可为 30min。 0018 所述电击转化中， 所述电击的电阻具体可为 200、 电容具体可为 25F。 0019 所述电击转化还包括所述在电击后进行如下处理的步骤 ： 向电击杯中加入 700-1000L（如 700-800L 或 800-1000L） 30-37预热的 LB 液体培养基并混匀， 。

16、然后 30-37振荡培养 3h。 0020 LB 液体培养基 （pH7.2） 的制备方法 ： 将 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10g 氯化钠 和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至 1L。 0021 所述待转化的质粒具体可为穿梭载体 pBE2、 穿梭载体 pS4GFP 或穿梭载体 pMarA。 0022 所述野生型枯草芽孢杆菌可为未经过遗传工程改造的枯草芽孢杆菌。 所述枯草芽 孢杆菌具体可为枯草芽孢杆菌 9407。 0023 以上任一所述的振荡具体可采用如下条件 ： 150-220r/min， 如 150-180r/min 或 180-220r/min。所述振荡的半径具体可为 12mm。。

17、 0024 枯草芽孢杆菌在指数生长后期会有约 10-20% 的细胞进入感受态， 尤其在营养贫 乏的培养基中易形成感受态细胞， 例如以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基。本发明针对 常规枯草芽孢杆菌转化方法用于野生型枯草芽孢杆菌时所存在的操作繁琐、 成功率低、 周 期长、 转化效率低等问题， 提供了一种简便易行的野生型枯草芽孢杆菌快速转化新方法， 该 方法依托枯草芽孢杆菌的自然转化原理， 思路清晰， 操作简便， 转化效果好， 为对菌株进行 说 明 书 CN 102649967 A 4 3/9 页 5 荧光标记以原位监测其定殖、 分布规律奠定了基础， 为进一步的遗传操作打下基础。 本发明 可在野生型枯。

18、草芽孢杆菌转化上应用， 前景广阔。 附图说明 0025 图 1 为穿梭载体 pBE2 的结构示意图。 0026 图 2 为实施例 1 中的 EcoR 单酶切鉴定结果 ； 1 为穿梭载体 pBE2（阳性对照） ， 2 和 3 分别为从两个不同纯培养菌株中提取的质粒， M 为 1kb DNA ladder。 0027 图 3 为穿梭载体 pMarA 的结构示意图。 0028 图 4 为实施例 2 中的 Pst ,Kpn 和 EcoR 单酶切鉴定结果 ； 3、 6、 9 为穿梭载 体 pMarA（阳性对照） ， 1、 4、 7 为某个待验证质粒， 2、 5、 8 为双蒸水 （空白对照） ， M 为 。

19、1kb DNA ladder。 0029 图 5 为实施例 3 中的荧光显微镜观察结果。 0030 图 6 为实施例 3 中的 EcoR 单酶切和 EcoR /Hind 双酶切鉴定结果 ； 1、 4 为 载体 pS4GFP（阳性对照） ， 2 和 5 为一个待测质粒， 2 为单酶切鉴定， 4 为双酶切鉴定， 3 和 6 为另个一待测质粒， 3 为单酶切鉴定， 6 为双酶切鉴定， M 为 1kb DNA ladder。 具体实施方式 0031 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说。

20、明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。本专利中的 “h” 均代表小时。本专利中的 “min” 均代表分钟。 0032 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 9407 ： 由中国农业大学植物病害生物 防治与微生态学实验室分离并保存， 公众可从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： 张圆 圆 , 付学池 , 陈欣怡 , 王琦 . 芽孢杆菌生防制剂对苹果病害的防治 . 植物病理学 报 .2011.41(ZK):135-140。 0033 穿梭载体 pBE2（结构示意图见图 1） ： 公众可从中国农业大学获得 ； 参考文。

21、献 ： 田 涛 , 亓雪晨 , 王琦 , 梅汝鸿 . 芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦体表定殖的初探 . 植 物病理学报 .2004.34(4):346-351。 0034 穿梭载体 pS4GFP （芽孢杆菌与大肠杆菌穿梭载体， 是在 pGFP4412 质粒基础上改造 得到的， pGFP4412 质粒是在穿梭载体 pBE2 基础上改造得到的） ： 公众可从中国农业大学获 得 ； 参考文献 ： 范晓静 , 邱思鑫 , 吴小平 , 洪永聪 , 蔡学清 , 胡方平 . 绿色荧光蛋白基因标 记内生枯草芽孢杆菌 . 应用与环境生物学报 .2007.13(4):530-534。 0035 穿梭载体 pM。

22、arA（芽孢杆菌与大肠杆菌穿梭载体， 结构示意图见图 3） ： 公众可 从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Yoann Le Breton,Nrusingh Prasad Mohapatra,W. G.Haldenwang.In Vivo Random Mutagenesis of Bacillus subtilis by Use of TnYLB-1， a mariner-Based Transposon.Applied and Environmental Microbiology.2006.72(1):3 27-333.。 0036 LB 液体培养基 （pH7.2） 的制备方法 ： 将 。

23、10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10g 氯化钠 和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至 1L ； 121高温灭菌 20min。 说 明 书 CN 102649967 A 5 4/9 页 6 0037 LB 固体培养基 （pH7.2） 的制备方法 ： 将 10g 蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10g 氯化钠、 15g 琼脂粉和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至 1L ； 121高温灭菌 20min。 0038 5无机盐母液 （pH7.0） 的制备方法 ： 将10g硫酸铵、 74g磷酸氢二钾、 9.5g柠檬酸 三钠和 1.0g 七水合硫酸镁用双蒸水溶解并定容至 1L ； 121高温灭菌 20min。。

24、 0039 20% 葡萄糖溶液的制备方法 ： 将 20g 葡萄糖用双蒸水溶解并定容至 100mL ； 用 0.22m 细菌过滤器过滤除菌。 0040 2% 酪蛋白水解物溶液的制备方法 ： 将 2g 酪蛋白水解物 （Casamino acids） 用双蒸 水溶解并定容至 100mL， 用 0.22m 细菌过滤器过滤除菌。 0041 HEPES 缓冲液 （1mM， pH7.0） 的制备方法 ： 将 0.238g HEPES 用双蒸水溶解并定容至 1L ； 用 0.22m 细菌过滤器过滤除菌， 保存于 4。 0042 HEPES 甘油缓冲液 （1mM， pH7.0） 的制备方法 ： 将 0.238g。

25、 HEPES 固体粉末、 100mL 甘 油和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至 1L ； 用 0.22m 细菌过滤器过滤除菌， 保存于 4。 0043 实施例 1、 野生型枯草芽孢杆菌的转化 0044 一、 生长培养基和诱导培养基的制备 0045 生长培养基 （1L） 的制备方法 ： 将 5 无机盐母液、 20% 葡萄糖溶液、 2% 酪蛋白水解 物溶液和双蒸水混合， 得到生长培养基 ； 生长培养基的溶剂为双蒸水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵2g/L、 磷酸氢二钾14.8g/L、 柠檬酸三钠1.9g/L、 硫酸镁0.098g/L、 葡萄糖5g/L、 酪蛋 白水解物 0.2g/L。 0046 诱导。

26、培养基 （1L） 的制备方法 ： 将 5 无机盐母液、 20% 葡萄糖溶液和双蒸水混合， 得到诱导培养基 ； 诱导培养基的溶剂为双蒸水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵 2g/L、 磷酸氢二 钾 14.8g/L、 柠檬酸三钠 1.9g/L、 硫酸镁 0.098g/L、 葡萄糖 5g/L。 0047 二、 感受态细胞的制备 0048 1、 取出 -80冰箱中保存的枯草芽孢杆菌 9407， 在 LB 固体培养基上活化。 0049 2、 用灭菌牙签挑取活化后的单菌落， 接种于 5mL 生长培养基中， 37、 180r/min 振 荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 1。

27、0h。 0050 3、 取 2mL 步骤 2 的菌液接种于 15mL 生长培养基中 （枯草芽孢杆菌 9407 的初始浓 度为 5107CFU/mL） ， 37、 180r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3h。 0051 4、 将 1 体积份完成步骤 3 的培养体系与 1 体积份诱导培养基混匀， 37、 180r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 1.5h。 0052 5、 将完成步骤 4 的培养体系冰浴 30min， 然后加入 4预冷的 50mL 离心管中， 4、 5000r/min 离心 （离心半。

28、径为 7.07cm， 仪器型号为 Himac CR22e, 日本 Hitachi 公司产品） 10min， 弃上清， 收集细胞。 0053 6、 用 30mL 4预冷的双蒸水通过移液枪吸吐清洗步骤 5 得到的细胞， 4、 5000r/ min 离心 （离心半径为 7.07cm， 仪器型号为 Himac CR22e, 日本 Hitachi 公司产品） 10min， 弃 上清， 收集细胞。 0054 7、 用 30mL 4预冷的双蒸水通过移液枪吸吐清洗步骤 6 得到的细胞， 4、 5000r/ min 离心 （离心半径为 7.07cm， 仪器型号为 Himac CR22e, 日本 Hitachi 。

29、公司产品） 10min， 弃 上清， 收集细胞。 说 明 书 CN 102649967 A 6 5/9 页 7 0055 8、 用 4预冷的 30mL HEPES 缓冲液通过移液枪吸吐清洗步骤 7 得到的细胞， 4、 5000r/min 离心 （离心半径为 7.07cm， 仪器型号为 Himac CR22e, 日本 Hitachi 公司产品） 10min， 弃上清， 收集细胞。 0056 9、 用 2mL 4预冷的 HEPES 甘油缓冲液重悬步骤 8 得到的细胞， 分装于 4预冷的 1.5mL 离心管 （200L/ 管） 后立刻投入液氮中速冷。每管含有约 0.31109CFU 感受态细 胞。 。

30、0057 上述步骤 5 至 9 均在冰上进行。 0058 三、 电击转化 0059 1、 取 5g 穿梭载体 pBE2， 加入 1 管步骤二得到的感受态细胞中， 在冰上通过移液 枪轻微吐吸使穿梭载体 pBE2 和感受态细胞充分混匀， 冰浴 30min。 0060 2、 将完成步骤 1 的体系转移至冰上预冷的电击杯中 （2mm） ， 用 BioRad Gene PulserXcell 电穿孔仪进行脉冲电击 （电阻 200， 电容 25F， 电压 1.2kV） 。 0061 3、 完成步骤2后， 立即向电击杯中加入800L 37预热的LB液体培养基， 通过移 液枪轻微吐吸混匀。 0062 4、 完。

31、成步骤 3 后， 将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中， 37、 150r/min 振荡培 养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3h。 0063 5、 将完成步骤 4 的培养体系涂布于含 50g/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上， 37静置培养。 0064 四、 转化效果的验证 0065 1、 随机挑取步骤三的平板上生长的形态与枯草芽孢杆菌 9407 相近的单菌落， 在 含 50g/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上进行纯化培养， 共获得 8 株纯培养的菌株。 0066 2、 将步骤 2 得到的纯培养的菌株在含 50g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 。

32、37、 180r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 过夜。 0067 3、 取完成步骤 2 的培养体系， 一部分提取基因组 DNA 并鉴定 16S rDNA 片 段 （采 用 63F 和 1387R 组 成 的 引 物 进 行 PCR 扩 增， 然 后 将 PCR 扩 增 产 物 进 行 测 序 ； 63F:5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3 ； 1387R:5 -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3 ） ， 另一部分提取 质粒并用限制性内切酶 EcoR 进行单酶切鉴定， 如果 16S rDNA 片段测序与枯草芽孢杆菌 940。

33、7 的 16S rDNA 片段序列 （如序列表的序列 1 所示） 一致且 EcoR 单酶切鉴定结果与穿 梭载体pBE2的EcoR 单酶切鉴定结果一致， 则该菌株为成功将穿梭载体pBE2导入枯草芽 孢杆菌 9407 的重组菌。部分 EcoR 单酶切结果见图 2。 0068 步骤 1 获得的 8 株纯培养菌株均为成功将穿梭载体 pBE2 导入枯草芽孢杆菌 9407 的重组菌， 转化效率为 100%。 0069 实施例 2、 野生型枯草芽孢杆菌的转化 0070 一、 生长培养基和诱导培养基的制备 0071 生长培养基 （1L） 的制备方法 ： 将 5 无机盐母液、 20% 葡萄糖溶液、 2% 酪蛋白。

34、水解 物溶液和双蒸水混合， 得到生长培养基 ； 生长培养基的溶剂为双蒸水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵 1.8g/L、 磷酸氢二钾 14g/L、 柠檬酸三钠 1.5g/L、 硫酸镁 0.09g/L、 葡萄糖 4.8g/L、 酪 蛋白水解物 0.18g/L。 0072 诱导培养基 （1L） 的制备方法 ： 将 5 无机盐母液、 20% 葡萄糖溶液和双蒸水混合， 说 明 书 CN 102649967 A 7 6/9 页 8 得到诱导培养基 ； 诱导培养基的溶剂为双蒸水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵 1.8g/L、 磷酸氢 二钾 14g/L、 柠檬酸三钠 1.5g/L、 硫酸镁 0.09g/L、。

35、 葡萄糖 4.8g/L。 0073 二、 感受态细胞的制备 0074 1、 同实施例 1 的步骤二的 1。 0075 2、 用灭菌牙签挑取活化后的单菌落， 接种于 5mL 生长培养基中， 30、 150r/min 振 荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 8h。 0076 3、 取2mL步骤2的菌液接种于15mL生长培养基中 （枯草芽孢杆菌9407的初始浓度 为 1.8107CFU/mL） ， 35、 150r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 2h。 0077 4、 将 1 体积份完成步骤 3 的培养体系与 1.2。

36、 体积份诱导培养基混匀， 35、 150r/ min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3.5h。 0078 5、 同实施例 1 的步骤二的 5。 0079 6、 同实施例 1 的步骤二的 6。 0080 7、 同实施例 1 的步骤二的 7。 0081 8、 同实施例 1 的步骤二的 8。 0082 9、 同实施例 1 的步骤二的 9。每管含有约 0.2109CFU 感受态细胞。 0083 上述步骤 5 至 9 均在冰上进行。 0084 三、 电击转化 0085 1、 取2g穿梭载体pMarA， 加入1管步骤二得到的感受态细胞中， 在冰上通过移液 枪轻微吐。

37、吸使穿梭载体 pMarA 和感受态细胞充分混匀， 冰浴 30min。 0086 2、 将完成步骤1的体系转移至冰上预冷的电击杯中 （2mm） ， 用BioRad Gene Pulser Xcell 电穿孔仪进行脉冲电击 （电阻 200， 电容 25F， 电压 1.8kV） 。 0087 3、 完成步骤2后， 立即向电击杯中加入700L 30预热的LB液体培养基， 通过移 液枪轻微吐吸混匀。 0088 4、 完成步骤 3 后， 将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中， 30、 150r/min 振荡培 养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3h。 0089 5、 将完成步。

38、骤 4 的培养体系涂布于含 50g/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上， 30静置培养。 0090 四、 转化效果的验证 0091 1、 随机挑取步骤三的平板上生长的形态与枯草芽孢杆菌 9407 相近的单菌落， 在 含 50g/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上进行纯化培养， 共获得 8 株纯培养的菌株。 0092 2、 将步骤 2 得到的纯培养的菌株在含 50g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37、 180r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 过夜。 0093 3、 取完成步骤 2 的培养体系， 一部分提取基因组 DNA 并鉴定 1。

39、6S rDNA 片 段 （采 用 63F 和 1387R 组 成 的 引 物 进 行 PCR 扩 增， 然 后 将 PCR 扩 增 产 物 进 行 测 序 ； 63F:5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3 ； 1387R:5 -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3 ） ， 另一部分提取 质粒并分别用限制性内切酶 Pst 、 Kpn 和 EcoR 进行单酶切鉴定， 如果 16SrDNA 片段 测序与枯草芽孢杆菌 9407 的 16S rDNA 片段序列 （如序列表的序列 1 所示） 一致且 Pst 、 Kpn 和 EcoR 单酶切鉴定结果均与穿梭载体 pMarA 的 Pst 。

40、、 Kppn 和 EcoR 单酶 说 明 书 CN 102649967 A 8 7/9 页 9 切鉴定结果一致， 则该菌株为成功将穿梭载体 pMarA 导入枯草芽孢杆菌 9407 的重组菌。某 个质粒的 Pst 、 Kppn 和 EcoR 单酶切结果见图 4。 0094 步骤1获得的8株纯培养菌株中， 6株为成功将穿梭载体pMarA导入枯草芽孢杆菌 9407 的重组菌， 转化效率为 75%。 0095 实施例 3、 野生型枯草芽孢杆菌的转化 0096 一、 生长培养基和诱导培养基的制备 0097 生长培养基 （1L） 的制备方法 ： 将 5 无机盐母液、 20% 葡萄糖溶液、 2% 酪蛋白水解。

41、 物溶液和双蒸水混合， 得到生长培养基 ； 生长培养基的溶剂为双蒸水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵2.2g/L、 磷酸氢二钾16g/L、 柠檬酸三钠2.5g/L、 硫酸镁0.1g/L、 葡萄糖5.2g/L、 酪蛋 白水解物 0.22g/L。 0098 诱导培养基 （1L） 的制备方法 ： 将 5 无机盐母液、 20% 葡萄糖溶液和双蒸水混合， 得到诱导培养基 ； 诱导培养基的溶剂为双蒸水， 溶质及其浓度如下 ： 硫酸铵 2.2g/L、 磷酸氢 二钾 16g/L、 柠檬酸三钠 2.5g/L、 硫酸镁 0.1g/L、 葡萄糖 5.2g/L。 0099 二、 感受态细胞的制备 0100 1、 同实。

42、施例 1 的步骤二的 1。 0101 2、 用灭菌牙签挑取活化后的单菌落， 接种于 5mL 生长培养基中， 37、 220r/min 振 荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 12h。 0102 3、 取2mL步骤2的菌液接种于15mL生长培养基中 （枯草芽孢杆菌9407的初始浓度 为 7.7107CFU/mL） ， 36、 220r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3.5h。 0103 4、 将 1 体积份完成步骤 3 的培养体系与 0.8 体积份诱导培养基混匀， 36、 220r/ min 振荡培养 （振荡半径。

43、为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3h。 0104 5、 同实施例 1 的步骤二的 5。 0105 6、 同实施例 1 的步骤二的 6。 0106 7、 同实施例 1 的步骤二的 7。 0107 8、 同实施例 1 的步骤二的 8。 0108 9、 同实施例 1 的步骤二的 9。每管含有约 0.49109CFU 感受态细胞。 0109 上述步骤 5 至 9 均在冰上进行。 0110 三、 电击转化 0111 1、 取100ng穿梭载体pS4GFP， 加入1管步骤二得到的感受态细胞中， 在冰上通过移 液枪轻微吐吸使穿梭载体 pS4GFP 和感受态细胞充分混匀， 冰浴 30min。

44、。 0112 2、 将完成步骤1的体系转移至冰上预冷的电击杯中 （2mm） ， 用BioRad Gene Pulser Xcell 电穿孔仪进行脉冲电击 （电阻 200， 电容 25F， 电压 1.5kV） 。 0113 3、 完成步骤 2 后， 立即向电击杯中加入 1000L 37预热的 LB 液体培养基， 通过 移液枪轻微吐吸混匀。 0114 4、 完成步骤 3 后， 将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中， 37、 150r/min 振荡培 养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 3h。 0115 5、 将完成步骤 4 的培养体系涂布于含 50g/mL 卡那霉素的 。

45、LB 固体培养基上， 37静置培养。 说 明 书 CN 102649967 A 9 8/9 页 10 0116 四、 转化效果的验证 0117 1、 随机挑取步骤三的平板上生长的形态与枯草芽孢杆菌 9407 相近的单菌落， 在 含 50g/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上进行纯化培养， 共获得 16 株纯培养的菌株。 0118 2、 将纯培养的菌株进行荧光显微镜检测， 能发出绿色荧光的菌株为阳性菌株， 共 获得 12 株阳性菌株， 部分结果见图 5， 能观察到菌株发出较强的荧光。 0119 3、 取步骤 2 得到的阳性菌株， 在含 50g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37、 1。

46、80r/min 振荡培养 （振荡半径为 12mm， 仪器型号为 QDZ5-HZS-H） 过夜。 0120 4、 取完成步骤 3 的培养体系， 一部分提取基因组 DNA 并鉴定 16S rDNA 片 段 （采 用 63F 和 1387R 组 成 的 引 物 进 行 PCR 扩 增， 然 后 将 PCR 扩 增 产 物 进 行 测 序 ； 63F:5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3 ； 1387R:5 -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3 ） ， 另一部分提取 质粒并分别进行EcoR 单酶切和EcoR /Hind双酶切鉴定， 如果16S rDNA片段测序与 枯草芽孢杆菌 9。

47、407 的 16S rDNA 片段序列 （如序列表的序列 1 所示） 一致且 EcoR 单酶切 和 EcoR /Hind 双酶切鉴定结果均与穿梭载体 pS4GFP 的 EcoR 单酶切和 EcoR / Hind 双酶切鉴定结果一致， 则该菌株为成功将穿梭载体 pS4GFP 导入枯草芽孢杆菌 9407 的重组菌。部分质粒的 EcoR 单酶切和 EcoR /Hind 双酶切结果见图 6。 0121 步骤 1 获得的 16 株纯培养菌株中 12 株为成功将穿梭载体 pS4GFP 导入枯草芽孢 杆菌 9407 的重组菌， 转化效率为 75%( 注 ： 12 株荧光显微镜下能发出绿色荧光的纯培养菌 株全。

48、部鉴定为目标重组菌 )。 0122 对比例 1、 野生型枯草芽孢杆菌的转化 0123 一、 生长培养基和诱导培养基的制备 0124 同实施例 1 的步骤一。 0125 二、 感受态细胞的制备 0126 同实施例 1 的步骤二。 0127 三、 电击转化 0128 分别采用 1.0kV 和 2.0kV 的电压， 其它均同实施例 1 的步骤三。 0129 四、 转化效果的验证 0130 同实施例 1 的步骤四。 0131 采用 1.0kV 的电压时， 步骤 1 获得 5 株纯培养菌株， 其中只有 1 株为成功将穿梭载 体 pBE2 导入枯草芽孢杆菌 9407 的重组菌， 转化效率为 20%。 0132 采用 2.0kV 的电压时， 步骤 1 获得 5 株纯培养菌株， 其中只有 1 株为成功将穿梭载 体 pBE2 导入枯草芽孢杆菌 9407 的重组菌， 转化效率为 20%。 0133 对比例 2、 野生型枯草芽孢杆菌的转化 0134 一、 生长培养基和诱导培养基的制备 0135 同实施例 1 的步骤一。