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胁迫耐受植物
    发明领域 本发明涉及用于产生具有对胁迫尤其是氧化胁迫增强的耐性的植物的方法。 本发 明还涉及用于这种方法的基因表达构建体和具有对胁迫增强的耐性的转基因植物， 例如通 过本文所述方法获得的或可以通过本文所述方法获得的植物。
     导言
     不利地影响生长、 发育或生产的外部条件引发广泛植物响应， 诸如改变的基因表 达、 细胞代谢以及生长速率和作物产量的变化。 有两种类型的胁迫 ： 生物胁迫由其他生物施 加， 诸如病原体， 而非生物胁迫起因于过度或不足的物理或化学环境， 诸如干旱、 盐度、 高或 低的温度或紫外光。
     环境胁迫是植物生产率和作物产量的主要限制因素。 当植物细胞处于环境胁迫下 时， 若干化学上相异的活性氧簇 (ROS) 由分子氧的部分还原产生并且这些可以引起氧化损 伤或充当信号。光合电子传递链组分的自动氧化导致超氧自由基及其衍生物、 过氧化氢和 羟基的形成。这些化合物与多种生物分子 ( 包括 DNA) 反应， 引起细胞停滞和死亡 (Kim 等
     2008， Vranová 等 2002)。
     黄素氧还蛋白 (Fld) 是发现于细菌和一些海藻中但是未在植物中发现的电子传 递黄素蛋白 (Zurbriggen 等， 2007)， 其能够有效地参与若干铁氧还蛋白 (Fd) 依赖的氧化 还原通路， 包括光合作用、 氮同化和硫氧还蛋白介导的氧化还原调节 (Tognetti 等， 2006， 2007b)。在暴露于氧化和非生物胁迫的微生物中， Fld 水平被上调 (Singh 等， 2004)。当表 达于植物叶绿体中时， 黄素蛋白充当一般的抗氧化剂防止不同类型的 ROS 在叶绿体中形成 (Tognetti 等， 2006)。 所得的转基因植物对多种环境挑战、 氧化还原循环氧化剂和异生素发 展出多重耐性 (Tognetti 等， 2006 ； 2007a， PCT/GB2002/004612， 所述所有文件通过引用并 入本文 )。在缺铁 (iron-starved) 蓝细菌中， 当其存在于 Fld 转化植物中时， Fld 由光系统 I(PSI) 还原 (Tognetti 等， 2006)。 在异氧菌中， Fld 可以被丙酮酸 -Fld 还原酶和 NADPH-Fld 还原酶还原 (Blaschkowski 等， 1982)。Fld 也在蓝细菌异形胞中组成型地积累并且已经证 明它可以参与到固氮酶的电子传递 (Sandmann 等， 1990)， 但是终极电子供体的性质是未知 的， 并且可以介导此反应的更有效的、 异形胞特异性的铁氧还蛋白的诱导已经使人们对分 子氮固定期间 Fld 的作用产生了疑问 (Razquin 等， 1995)。
     在植物和蓝细菌两者中， 铁氧还蛋白 -NADP(H) 还原酶 (FNR)(EC1.18.1.2) 是与类 囊体结合的酶， 其以物理的、 组成型的方式参与从铁氧还蛋白或 Fld 到 NADP+ 以形成 NADPH 的电子传递 (Carrillo 和 Ceccarelli， 2003)。 当存在来自 PSI 的强的电子压力时， 此活性与 在光照下介导相反反应的可能性直接冲突。 因此， FNR 介导的 NADPH 对铁氧还蛋白 ( 或 Fld) 的还原不可能以任何显著的速率在体内发生， 并且目前还未报道发现这种活性。 然而， 溶解 的 FNR 与其余的链分开并且迅速地催化它 (Carrillo 和 Ceccarelli， 2003)。 实际上， 可溶的 + FNR 在介导分离的、 FNR 缺失的类囊体的 NADP 光还原中几乎是无活性的 (Forti 和 Bracale， 1984)。在包含用于光捕获的藻胆蛋白体的蓝细菌物种中， FNR 由三个结构域组成 ： 参与藻 胆蛋白体结合的 N 端结构域， 其后是 FAD 结合结构域和 NADP(H) 结合结构域， 所述 FAD 结合结构域和 NADP(H) 结合结构域一起构成该酶的活性部分 (Carrillo 和 Ceccarelli， 2003)。 备选的起始密码子定位于第二个结构域的开始处以产生两个结构域的可溶的 FNR(Thomas 等， 2006)。当细胞转变为异养生活方式并且需要从 NADPH 到 Fd 或 Fld 传递电子的能力时， 优选地使用此内部 Met(Thomas 等， 2006)。在图 1 中提供了描述该理论模型的图解。在所 有蓝细菌和光合真核细胞中都发现有所述酶。 具有相似特异性但是不同生理作用的其他酶 已经在若干非光合植物组织、 在哺乳动物线粒体以及在若干细菌中得到描述。蓝细菌 FNR 已经被很好的表征 (Sancho， 1987， Schluchter 1992)。此外， 编码 FNR 的 petH 基因已经从 若干蓝细菌菌株中克隆 (Fillat 等， 1993)。可以通过如下所述的心肌黄酶活性测定检测活 性 FNR 的存在。
     因此已知将细菌 Fld 结合到烟草叶绿体中可以补偿 Fd 水平的降低， 产生对氧化剂 和广泛不良胁迫条件增强的耐性。本发明目标在于通过保证在还原条件中维持 Fld 来改善 植物的胁迫耐性。
     发明概述
     在一方面中， 本发明涉及用于产生具有加强的胁迫耐性的植物的方法， 所述方法 包括在植物中表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶 多肽的核酸序列。通过这种方法获得的或可以通过这种方法获得的植物也在本发明的范 围内。本发明进一步涉及包含基因序列的核酸构建体， 其中所述基因序列包括编码蓝细菌 FNR 的核酸序列和叶绿体靶向序列。在另一个方面中， 本发明涉及这样的核酸构建体， 所述 核酸构建体包含编码黄素氧还蛋白多肽 (Fld) 的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原 酶 (FNR) 多肽的核酸序列。在另一个方面中， 本发明涉及具有加强的胁迫耐性的转基因植 物， 所述转基因植物表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还 原酶多肽的核酸序列。在另一方面中， 本发明涉及用于在对胁迫的响应中减小植物中 ROS 量的方法， 所述方法包括在植物中表达黄素氧还蛋白多肽和铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多 肽。
     附图
     在非限制性附图中进一步图示本发明。
     图 1. 在表达来自蓝细菌的 Fld 和 FNR 的双转化体中的提议的电子路径。在正常 生长条件下 ( 上图 )， 铁氧还蛋白 (Fd) 和 Fld 两者都可以介导到生产路径的电子传递， 根据 效率 Fd 很可能是优选的。在胁迫下 ( 下图 )， Fd 水平下降并且 Fld 接管了到 NADP 的光合 电子传递， 同时可溶的 FNR 使用部分形成的 NADPH 以保持 Fld 被还原， 防止形成 ROS 和结束 良性循环。
     图 2. 在野生型 (PH) 和转化体烟草的叶片中的 FNR 累积。相当于 17μg 蛋白的来 自 6 周龄独立转化植物 (pnn) 的叶片提取物通过 SDS-PAGE 分级并印迹到硝酸纤维膜上以 用于使用针对鱼腥蓝细菌 (Anabaena) 还原酶的抗血清免疫检测 FNR。
     图 3. 来自转基因烟草植物的 FNR 的亚细胞定位和胶内心肌黄酶活性。A) 在渗透 休克从野生型和 pFNR 植物分离的完整叶绿体后， 类囊体和基质得到分离。相当于 4μg 叶 绿素的样品通过 SDS-PAGE 分离并且通过免疫印迹分析确定 FNR 的存在。B) 相当于 15μg 总的可溶蛋白的来自野生型和 pFNR 植物的基质， 通过非变性电泳分离并且对心肌黄酶活 性染色。图 4. 在 X4 植物后代中的 FNR 和 Fld 表达水平。相当于 8μg 总的可溶蛋白的来 自 6 周龄烟草植物的叶片提取物通过 SDS-PAGE 分级并印迹到硝酸纤维膜上， 以用于使用针 对鱼腥蓝细菌 FNR 和 Fld 的抗血清的免疫检测。
     图 5. 甲基紫精 (MV) 对 FNR/Fld 表达植物叶盘的作用。将来自 6 周龄烟草植物的 叶盘放置在 20μM MV 上并以 600μmol quanta m-2s-1 照射。A) 温育 7h 后拍摄的照片。B) 在用 MV 处理叶盘后通过测量介质相对电导的增加来评估离子渗漏。C) 在 7h MV 处理后确 定叶绿素和类胡萝卜素。
     图 6.MV 对整个烟草植物的作用。将四周龄植物转移到水培系统。在生长室条件 下在暴露于 100μM MV 24h 后拍摄叶片的照片。
     图 7.A) 检测脂质过氧化物。将来自 6 周龄植物的叶盘放置在 10μM MV 或水上 ( 右手的条 ) 并且在 3h 内用 700μmol quanta m-2s-1 照射。每个值是四次样品重复测量值 的平均值 ± 标准差。B) 来自 FNR/Fld 表达植物的叶盘的叶片提取物的 APX 活性。将来自 6 周龄烟草植物的叶盘放置在 20μM MV 上并用 600μmol quanta m-2s-1 照射。在 1.5 和 3h 的温育后采集样品。
     图 8. 包 含 编 码 豌 豆 FNR 转 运 肽 和 黄 素 氧 还 蛋 白 基 因 的 序 列 之 间 的 框 内 (in-frame) 融合片段的双元载体 pCAMBIA 2200 的图示。插在 pCAMBIA 2200 的 Eco RI 位 点的盒事先构建在 pDH51 中。此 Eco RI 片段包含 CaMV 35S 启动子、 黄素氧还蛋白嵌合基 因和 CaMV35S 聚腺苷酸化信号。 图 9. 包含编码豌豆 FNR 转运肽和鱼腥蓝细菌 FNR 基因的两个 C 端结构域的序列 之间的框内融合片段的双元载体 pCAMBIA 2200 的图示。插在 pCAMBIA2200 的 Eco RI 位点 的盒事先构建在 pDH51 中。此 Eco RI 片段包含 CaMV 35S 启动子、 FNR 嵌合基因和 CaMV35S 聚腺苷酸化信号。
     图 10. 源自 MultiSite Gateway 的双元载体 pBinary-BRACT B1， 4-ubi-FNR/B2， 3-actin-Fld 的图示， 所述载体包含编码豌豆 FNR 转运肽和鱼腥蓝细菌 FNR 基因的两个 C 端 结构域的序列之间的、 编码豌豆 FNR 转运肽和来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 Fld(TP-Fld) 基 因的序列之间的框内融合。在共表达载体中， nos 聚腺苷酸化信号与 ubi 和肌动蛋白启动 子分别在 TP-FNR 和 TP-Fld 构建体的两侧。这些构建体首先通过位点特异性 BP 重组反应 克隆到 pDONR221 载体系列的合适的供体载体中。所得的进入 (entry) 克隆又同时参与和 定制的双元 T-DNA MultiSite Gateway 目的载体即 pDEST-BRACT R1， 4-ubi/R2， 3-actin 的 双 LR 位点特异性重组， 产生包含两个目的基因的表达克隆 pBinary-BRACT B1， 4-ubi-FNR/ B2， 3-actin-Fld。 所述构建体到双元载体中的克隆策略基于 MultiSite Gateway 技术的 BP 和 LR 位点特异性重组反应 (Invitrogen， http://www.invitrogen.com)。
     Hyg ： 选择标记 ( 抗潮霉素 (hygromicin)) ； LB ： 左侧边界 ； nos ： 胭脂碱合成酶 ； RB ： 右侧边界 ； TP ： 转运肽 ； ubi ： 泛素。
     图 11. 用于在植物中共表达 Fld 和 FNR 多肽的双元载体的构建。示意图显示用于 在植物中共表达 FNR 和 Fld 的 pBinary-BRACT B1， 4-ubi-FNR/B2， 3-actin-Fld 双元载体的 构建。 两侧具有 attB 位点特异性重组序列的编码 FNR 和 Fld 到叶绿体靶向转运肽 (TP) 的嵌 合融合的序列的 PCR 产物 (attB1-FNR-attB4 和 attB2-Fld-attB3， 分别 ) 在与合适供体载 体 (pDONR21 P1-P4 和 pDONR p2-P3， 分别 ) 进行的 BP 重组反应中是底物。 所得的 pENTR221
     L1-L4-FNR 和 pENTR221 L2-L3-Fld 进入克隆又同时参与和定制的双元 T-DNA MultiSite Gateway 目的载体即 pDEST-BRACT R1， 4-ubi/R2， 3-actin 的双 LR 位点特异性重组， 产生包 含在组成型启动子控制下的两个目的基因的表达克隆。根据制造商建议的实验方案、 使用 说明和命名法进行所述过程 (Invitrogen， http://www.invitrogen.com)。ccdB ： 用于载体 的阴性选择的基因 ； LB ： 左侧边界 ； nos ： 胭脂碱合成酶 ； RB ： 右侧边界 ； TP ： 转运肽 ； ubi ： 泛 素。
     图 12. 大麦胁迫。 甲基紫精 (MV) 对 FNR/Fld 表达杂合大麦植物的叶条 (strip) 的 作用。从生长在土壤中的 6 周龄大麦植物的叶片上切取 10-15mm 长度的叶条。然后在 20℃ 在黑暗中将叶条在 50μM MV 和 0.05％ Tween-20 中温育 30 分钟以允许 MV 扩散到组织中。 然后将所述叶条放置在塑料托盘中使近轴侧向上向着 450μmol quanta m-2s-1 光源。使对 照保持在包含 0.05％ Tween-20 的蒸馏水中。在 7.5h 的光照后评估 A) 叶绿素和 B) 类胡 萝卜素的含量。FNR(1x) ： 杂合有 FNR 的转基因大麦。Fld(1x) ： 杂合有 Fld 的转基因大麦。 FNR/Fld(1x) ： 杂合有 FNR 和 Fld 转基因大麦。WT ： 野生型大麦。
     详述
     现在将进一步描述本发明。在以下段落中， 更详细地限定本发明的不同方面。这 样限定的各方面可以与任何其他方面结合， 除非清楚地显示与之相反。 尤其是， 任何显示为 优选的或有利的特征可以与显示为优选的或有利的任何其他特征结合。 除非另外说明， 本发明的实施将采用本领域技术内的植物学、 微生物学、 组织培 养、 分子生物学、 化学、 生物化学和重组 DNA 技术的常规技术。这样的技术在文献中得到全 面说明。
     如上所提及， 已知将细菌黄素氧还蛋白 (Fld) 结合到烟草叶绿体中可以补偿 Fd 水平的下降， 产生对氧化剂和广泛不良胁迫条件增加的耐性。本发明人已经惊人地发现将 来源于细菌的具有 Fld 还原活性的第二基因引入表达细菌 Fld 的植物中可以改善该植物 的胁迫耐性。不希望受理论限制， 本发明人相信这是由于将 Fld 维持在还原性条件中。如 在实施例中所示， 本发明人已经使用具有来源于蓝细菌并且编码叶绿体靶向的铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶 (FNR) 多肽的核酸序列的构建体并且在表达叶绿体靶向的 Fld 的植物中表 达所述细菌基因。
     因此， 在一方面中， 本发明涉及用于产生具有增强的胁迫耐性的植物的方法， 所述 方法包括在植物中表达编码 Fld 多肽的核酸序列和编码 FNR 多肽的核酸序列。根据本发明 的这些序列在植物中的表达可以通过如本文所述的不同方式实现。
     在第一个实施方案中， 所述方法包括在植物中如本文所述的表达指导 Fld 多肽和 FNR 共表达的核酸构建体。 因此， 根据如本文详述的不同实施方案的单个构建体可以在转化 有根据本发明不同方面的这种构建体的植物中指导两个基因的共表达。 所得的转基因植物 产生 Fld 和 FNR 多肽。在这种方法中， 用共表达构建体转化植物并且产生并选择表达两种 转基因的稳定的杂合植物。
     以下详细描述可以用于此方法的构建体。
     所述核酸构建体包括编码 Fld 多肽的核酸序列和编码 FNR 多肽的核酸序列。优选 地， Fld 和 FNR 序列来源于细菌。
     在一个实施方案中， 编码 Fld 多肽的核酸序列来源于蓝细菌而黄素氧还蛋白
     多肽是蓝细菌黄素氧还蛋白。备选地， 编码 Fld 多肽的核酸序列来源于异养菌。蓝细 菌 可 以 选 自 Crocosphaera、 蓝 菌 属 (Cyanobium)、 蓝 丝 菌 属 (Cyanothece)、 微囊蓝细菌 属 (Microcystis)、 聚 球 蓝 细 菌 属 (Synechococcus)、 集 胞 蓝 细 菌 属 (Synechocystis)、 Thermosynechococcus、 微 毛 蓝 细 菌 属 (Microchaetaceae)、 Nostocaceae、 鞘丝蓝细菌属 (Lyngbya)、 螺旋蓝细菌属 (Spirulina) 或束毛蓝细菌属 (Trichodesmium)。优选的属包括 聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、 Fremyella、 单歧蓝细菌属 (Tolypothrix)、 鱼腥蓝细菌属 (Anabaena)、 项圈蓝细菌属 (Anabaenopsis)、 蓝束丝蓝细菌属 (Aphanizomenon)、 管链蓝细 菌属 (Aulosira)、 Cylindrospermopsis、 筒孢蓝细菌属 (Cylindrospermum)、 Loefgrenia、 节球蓝细菌属 (Nodularia)、 念球蓝细菌属 (Nostoc) 或腔管蓝细菌属 (Wollea)。优选地， 所述属是鱼腥蓝细菌属而蓝细菌是鱼腥蓝细菌属 PCC7119(Fillat 等 1990)。
     在一个实施方案中， Fld 序列具有选自如在下面的表 1 中所示的序列的核酸序列。 在一个实施方案中， FNR 序列具有选自如在下面的表 2 中所示的序列的核酸序列。
     表1
     表 2.
     在另一个实施方案中， 编码蓝细菌 Fld 的核酸序列包括 SEQ ID NO.1。相应的氨 基酸序列显示在 SEQ ID NO.6 中。SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.6 的变体也在本发明的范围 内。变体保留所述蛋白质的生物学活性。
     在进一步的方面中， 本发明涉及用于产生具有加强的胁迫耐受的植物的方法和增 加植物胁迫耐性的方法， 所述方法包括在植物中表达编码 FNR 多肽的核酸序列。在根据本 发明的植物中表达这些序列可以通过如本文说明的不同的方式实现。在另一个实施方案 中， 所述 FNR 多肽是由 SEQ ID NO ： 8 或 9 代表的多肽， 或显示于表 2 的多肽或其蓝细菌同系 物。如在实施例中所示， 本发明人已经使用带有来源于蓝细菌并且编码叶绿体靶向的铁氧 还蛋白 NADP(H) 还原酶 (FNR) 多肽的核酸序列的构建体并且在植物中表达所述细菌基因。
     在一个实施方案中， 编码 FNR 多肽的核酸序列来源于蓝细菌并且所述 FNR 多肽 是蓝细菌 FNR。所述蓝细菌可以是包含藻胆蛋白体的细菌， 例如选自 Crocosphaera、 蓝菌 属 (Cyanobium)、 蓝丝菌属 (Cyanothece)、 微囊蓝细菌属 (Microcystis)、 聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、 集胞蓝细菌属 (Synechocystis)、 Thermosynechococcus、 微毛蓝细菌属 (Microchaetaceae)、 Nostocaceae、 鞘丝蓝细菌属 (Lyngbya)、 螺旋蓝细菌属 (Spirulina) 或 束 毛 蓝 细 菌 属 (Trichodesmium)。 优 选 的 属 包 括 聚 球 蓝 细 菌 属 (Synechococcus)、 Fremyella、 单 歧 蓝 细 菌 属 (Tolypothrix)、 鱼 腥 蓝 细 菌 属 (Anabaena)、 项圈蓝细菌 属 (Anabaenopsis)、 蓝 束 丝 蓝 细 菌 属 (Aphanizomenon)、 管 链 蓝 细 菌 属 (Aulosira)、 Cylindrospermopsis、 筒 孢 蓝 细 菌 属 (Cylindrospermum)、 Loefgrenia、 节球蓝细菌属 (Nodularia)、 念球蓝细菌属 (Nostoc) 或腔管蓝细菌属 (Wollea)。在一个实施方案中， 属 是鱼腥蓝细菌属并且蓝细菌是鱼腥蓝细菌属 PCC7119(Fillat 等 1990)。优选地， 所述序列 包括编码 C 端两个结构域区域的序列， 但是不包括编码藻胆蛋白体结合结构域的区域。例 如， 编码蓝细菌 FNR 的核酸序列包括 SEQ ID NO.3。相应的氨基酸序列显示在 SEQ ID NO.9 中。SEQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.9 的变体也在本发明的范围内。变体保留所述蛋白质的生 物学活性。
     所述构建体可以是异源基因构建体， 其中 Fld 和 FNR 编码核酸来源于不同的生物。 在另一个实施方案中， Fld 和 FNR 编码核酸两者都来源于相同的生物， 例如蓝细菌。在一个
     实施方案中， 两个核酸序列都来源于鱼腥蓝细菌。 例如， 所述构建体可以包含如在 SEQ ID 1 和 3 中所示的序列或其功能变体。在优选的实施方案中， 以上描述的构建体还包含至少两个叶绿体靶向的序列 ( 编 码转运肽 ) 以使每个多肽靶向到叶绿体。根据本发明， 将肽指引到叶绿体的任何序列是合 适的。实例显示在通过引用并入本文的 PCT/GB2002/004612 的表 2 中。例如， 靶向序列可 以来源于豌豆 FNR。
     因此， 在本发明优选的实施方案中， 所述构建体可以包含一个， 优选地如在 SEQ ID 2 和 4 中所示的序列两者或其功能变体。
     以上描述的构建体指导编码 Fld 和 FNR 多肽的核酸序列从单个的构建体共表达。 优选地， 所述构建体包含至少两个叶绿体靶向序列从而编码叶绿体靶向的多肽。作为实施 例， 图 10 显示根据本发明的融合构建体而图 11 图示该构建体如何制成 ( 也见实施例 )。
     以上描述的构建体也在本发明的范围内。 换言之， 本发明涉及这样的核酸构建体， 所述核酸构建体包含编码 Fld 多肽的核酸序列和编码 FNR 多肽的核酸序列两者。构建体和 优选的序列的多种实施方案陈述于上。
     在本文所述的任何构建体中， 编码 Fld 或 FNR 多肽的野生型序列是优选的， 但是 也可以使用突变体 / 变体序列或片段， 只要这样的序列编码与野生型序列具有同样生物学 活性的多肽。野生型序列的序列变化包括不引起编码的氨基酸序列变化的沉默碱基变化 和 / 或影响氨基酸序列但是不影响多肽生物学活性的碱基变化。变化可以是保守氨基酸置 换， 即当两个残基具有相似性质时置换一个氨基酸残基。因此， 由这样的序列编码的变体 / 突变体多肽保留野生型多肽的生物学活性并且给予胁迫耐性。例如， FNR 核苷酸序列在以 下位置的序列变化 ( 如在 SEQ ID NO.3 中所示 ) 不表现出影响所述多肽的活性 ： 535 ： A/G ； Asn(AAC)/Asp(GAC)， 703 ： A/G ； Met(ATG)/Val(GTG)， 763 ： C/G ； Gln(CAA)/Glu(GAA)。 因 此， 包含这些备选的核苷酸 / 氨基酸的 FNR 核酸序列 / 氨基酸序列的变体在本发明的实施方案 的范围内。
     根据本发明所用的核酸可以是双链或单链的， cDNA、 基因组 DNA 或 RNA。本文所述 的任何序列， 诸如 FNR 和 Fld 基因的序列可以是分离自植物、 细菌或人工合成序列的序列。 取决于设计， 核酸可以是全部或部分合成的。 技术人员将理解当根据本发明的核酸包括 RNA 时， 提及所示序列应当被看作是提及 RNA 的等同物， 其中 U 代替 T。
     此外， 本发明涉及 FNR 或 FLD 多肽的同系物以及它在本发明的方法、 构建体和载体 中的用途。 FNR 或 FLD 多肽的同系物与分别由 SEQ ID NO ： 8 至 10 或 SEQ ID NO ： 6 或 7 代表 的和 / 或分别由显示于表 2 和表 1 中的其直向同源物和旁系同源物代表的氨基酸具有， 以 增加的优选性， 以下整体序列同一性 ： 至少 25％、 26％、 27％、 28％、 29％、 30％、 31％、 32％、 33 ％、 34 ％、 35 ％、 36 ％、 37 ％、 38 ％、 39 ％、 40 ％、 41 ％、 42 ％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％。 使用全局比对算法诸如 GAP 程序中的 Needleman Wunsch 算法 (GCG Wisconsin Package， Accelrys)， 优选地使用缺省参数并且优选地使用成 熟蛋白质的序列 ( 即不考虑分泌信号或转运肽 ) 来确定整体序列同一性。
     根据本发明进一步的实施方案， 提供使用以下各项的方法， 和包含以下各项的构 建体、 宿主细胞、 植物和载体 ：a) 分离的核酸分子， 所述核酸分子选自 ： (i) 由 SEQ ID NO ： 1 或 2 或编码列表于表 1 的同系物的那些代表的核酸 ； (ii) 由 SEQ ID NO ： 1 或 2 或编码列表于表 1 的同系物的那些代表的核酸的互补物； (iii) 编码如由 SEQ ID NO ： 6 或 7 中任一个或列表于表 1 的那些代表的多肽的核 酸， 优选地作为遗传密码简并性的结果， 所述分离的核酸可以来源于如由 SEQ ID NO ： 6或 7( 中任一个 ) 或列表于表 1 的那些代表的多肽序列并且进一步优选地给予相对于对照植物 的加强的胁迫耐性 ；
     (iv) 与 SEQ ID NO ： 1 或 2 的核酸序列中任一个或编码列表于表 1 的同系物 ( 优 选地是 SEQ ID NO ： 1 或 2 的同系物 ) 的核酸序列具有， 以增加的优选性， 以下序列同一性 的核酸 ： 至少 30％、 31％、 32％、 33％、 34％、 35％、 36％、 37％、 38％、 39％、 40％、 41％、 42％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％， 并且所述核酸进一 步优选地给予相对于对照植物的加强的胁迫耐性 ；
     (v) 在严格的杂交条件下与 (i) 至 (iv) 的核酸分子杂交并优选地给予相对于对照 植物的加强的胁迫耐性的核酸分子 ；
     (vi) 编码 FLD 多肽的核酸， 所述 FLD 多肽与由 SEQ ID NO ： 6 或 7( 中任一个 ) 代表 的氨基酸序列以及表 1 中的任何其他氨基酸序列具有， 以增加的优选性， 至少 50％、 51％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 并且优选地给予相对于对照植物的增强的胁迫耐性 ；
     以及
     b) 分离的核酸分子， 所述核酸分子选择 ：
     (i) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸 ；
     (ii) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸的互补 物；
     (iii) 编码如由 SEQ ID NO ： 8 或 9 中任一个或列表于表 2 的那些代表的多肽的核 酸， 优选地作为遗传密码简并性的结果， 所述分离的核酸可以来源于如由 SEQ ID NO ： 8或 9( 中任一个 ) 或列表于表 2 的那些代表的多肽序列并且进一步优选地给予相对于对照植物 的加强的胁迫耐性 ；
     (iv) 与 SEQ ID NO ： 3 或 4 的核酸序列中任一个或编码列表于表 2 的同系物 ( 优 选地是 SEQ ID NO ： 3 或 4 的同系物 ) 的核酸序列具有， 以增加的优选性， 以下序列同一性 的核酸 ： 至少 30％、 31％、 32％、 33％、 34％、 35％、 36％、 37％、 38％、 39％、 40％、 41％、 42％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、
     88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％， 并且所述核酸进一 步优选地给予相对于对照植物的加强的胁迫耐性 ；
     (v) 在严格的杂交条件下与 (i) 至 (iv) 的核酸分子杂交并优选地给予相对于对照 植物的加强的胁迫耐性的核酸分子 ；
     (vi) 编码 FLD 多肽的核酸， 所述 FLD 多肽与由 SEQ ID NO ： 8 或 9( 中任一个 ) 代表 的氨基酸序列以及表 2 中的任何其他氨基酸序列具有， 以增加的优选性， 至少 50％、 51％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 并且优选地结合如本文所述的存在于植物中的 FLD 多肽 给予相对于对照植物的增强的胁迫耐性。
     在进一步的实施方案中， 提供使用以下各项的方法， 以及包含选自以下各项的分 离的核酸分子的构建体、 宿主细胞、 植物和载体 ：
     (i) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸 ；
     (ii) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸的互补 物；
     (iii) 编码如由 SEQ ID NO ： 8 或 9 中任一个或列表于表 2 的那些代表的多肽的核 酸， 优选地作为遗传密码简并性的结果， 所述分离的核酸可以来源于如由 SEQ ID NO ： 8或 9( 中任一个 ) 或列表于表 2 的那些代表的多肽序列并且进一步优选地给予相对于对照植物 的加强的胁迫耐性 ；
     (iv) 与 SEQ ID NO ： 3 或 4 的核酸序列中任一个或编码列表于表 2 的同系物 ( 优 选地是 SEQ ID NO ： 3 或 4 的同系物 ) 的核酸序列具有， 以增加的优选性， 以下序列同一性 的核酸 ： 至少 30％、 31％、 32％、 33％、 34％、 35％、 36％、 37％、 38％、 39％、 40％、 41％、 42％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％， 并且所述核酸进一 步优选地给予相对于对照植物的加强的胁迫耐性 ；
     (v) 在严格的杂交条件下与 (i) 至 (iv) 的核酸分子杂交并优选地给予相对于对照 植物的加强的胁迫耐性的核酸分子 ；
     (vi) 编码 FLD 多肽的核酸， 所述 FLD 多肽与由 SEQ ID NO ： 8 或 9( 中任一个 ) 代表 的氨基酸序列以及表 2 中的任何其他氨基酸序列具有， 以增加的优选性， 至少 50％、 51％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 并且优选地结合如本文所述的存在于植物中的 FLD 多肽 给予相对于对照植物的增强的胁迫耐性。
     优选地， 在 SEQ ID NO ： 6 至 9 中任一个的整个多肽序列上对多肽序列进行确定序 列同一性的任何比较， 或者在 SEQ ID NO ： 1 至 4 中任一个的核酸序列的整个编码区上对核酸序列进行确定序列同一性的任何比较。例如， 为确定多肽序列与 SEQ ID NO ： 8 的多肽序 列的序列同一性， 在 SEQ ID NO ： 8 的整个长度上比对序列。
     对照植物是这样的植物， 其不包含本发明的重组 FLD 和 FNR 但是在所有其他方面 尽可能的相同并且被以与本发明的植物相同的方式处理。
     在一个实施方案中， FLD 或 FNR 多肽的功能变体是这样的多肽， 所述多肽分别与如 由 SEQ ID NO ： 6 或 7 的序列代表的 FLD， 或如由 SEQ ID NO ： 8 或 9 的序列代表的 FNR 具有 基本相同的生物学活性。在另一个实施方案中， 功能变体是本文所限定的多肽同系物或由 上文限定的核酸序列同系物编码的那些。
     本文所述的所有核酸构建体可以还包含调节序列。因此， 本文所述的核酸序列可 以在调节序列的操作控制下， 所述调节序列可以控制植物中的基因表达。调节序列可以 是驱动构建体中的基因表达的启动子序列。例如， 可以使用驱动过表达的启动子表达核 酸序列。根据本发明， 过表达是指以比由其内源启动子驱动的内源对应物 ( 植物 FNR 或 Fd) 的表达更高的水平表达转基因。例如， 可以使用强启动子， 诸如花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV35S)、 水稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子或产生加强的表达的任何启动子实施 过表达。备选地， 可以通过使用转录或翻译增强子或激活子来实现加强或增强的表达并且 可以将增强子结合到基因中从而进一步增强表达。 此外， 可以使用可诱导表达系统， 其中表 达被由环境胁迫条件诱导的启动子驱动 ( 例如胡椒病原体诱导的膜蛋白基因 CaPIMPI 或 包含脱水响应元件 (dehydration-responsive element)(DRE) 的启动子， 可由水胁迫、 高 盐浓度和 ABA 诱导的向日葵 HD-Zip 蛋白基因 Hahb4 的启动子 (Dezar 等， 2005)， 或化学可 诱导启动子 ( 诸如类固醇或乙醇可诱导的启动子系统 )。这样的启动子在本领域中例如在 Pastori(2002) 中得到表述。对于技术人员， 其他合适的启动子和可诱导系统也是已知的。
     如技术人员将了解的， 所述构建体也可以包含有助选择转化体的选择性标记， 诸 如给予对抗生素诸如卡那霉素的抗性的标记。
     如上详述， 在本发明方法的一个实施方案中， 使用单个构建体指导 Fld 和 FNr 编码 核酸序列的共表达。
     在另一个实施方案中， 用于产生具有加强的胁迫耐性的植物的方法包括 ：
     a) 在植物中表达核酸构建体， 所述构建体包含编码 Fld 多肽的序列，
     b) 表达核酸构建体， 所述构建体包含编码如本文所述的 FNR 多肽的序列，
     c) 使第一和第二植物杂交， 以及
     d) 产生表达 FNR 和 Fld 两者并且对于 FNR 和 Fld 两者都是纯合的植物。
     根据所述方法的第一步骤， 用包含编码黄素氧还蛋白多肽的序列的核酸构建体转 化第一植物。 这样的构建体已经在 Tognetti 等 (2006) 和 PCT/GB2002/004612 中得到表述， 其二者都通过引用并入本文。 优选的构建体包含源自蓝细菌， 优选地鱼腥蓝细菌， 最优选地 鱼腥蓝细菌 PCC7119 的序列。所述构建体优选地包含将蛋白靶向到叶绿体的转运肽。合适 的构建体也显示在图 8 中。在优选的实施方案中， 所述构建体还包含叶绿体靶向序列， 例如 源自豌豆的序列。所述转运肽将多肽靶向到叶绿体。在优选的实施方案中， 所述构建体包 含如在 SEQ ID NO.1 或 2 中显示的序列。获得表达 Fld 转基因的稳定转化体。
     在第二步中， 用包含编码如本文所述的 FNR 多肽的序列的核酸构建体转化第二植 物。产生表达 FNR 转基因的、 对转基因来说是纯合的稳定的转化体。以下详细描述包含编码 FNR 多肽的核酸序列并且可以用于本文方法的不同实施 方案的核酸构建体。编码 FNR 的核酸序列优选地来源于细菌并且最优选地来源于蓝细菌。
     所 述 蓝 细 菌 可 以 是 包 含 藻 胆 蛋 白 体 的 细 菌， 例 如 选 自 Crocosphaera、 蓝菌属 (Cyanobium)、 蓝 丝 菌 属 (Cyanothece)、 微 囊 蓝 细 菌 属 (Microcystis)、 聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、 集胞蓝细菌属 (Synechocystis)、 Thermosynechococcus、 微毛蓝细菌属 (Microchaetaceae)、 Nostocaceae、 鞘丝蓝细菌属 (Lyngbya)、 螺旋蓝细菌属 (Spirulina) 或 束 毛 蓝 细 菌 属 (Trichodesmium)。 优 选 的 属 包 括 聚 球 蓝 细 菌 属 (Synechococcus)、 Fremyella、 单 歧 蓝 细 菌 属 (Tolypothrix)、 鱼 腥 蓝 细 菌 属 (Anabaena)、 项圈蓝细菌 属 (Anabaenopsis)、 蓝 束 丝 蓝 细 菌 属 (Aphanizomenon)、 管 链 蓝 细 菌 属 (Aulosira)、 Cylindrospermopsis、 筒 孢 蓝 细 菌 属 (Cylindrospermum)、 Loefgrenia、 节球蓝细菌属 (Nodularia)、 念球蓝细菌属 (Nostoc) 或腔管蓝细菌属 (Wollea)。
     如在实施例中所示， 可以使用来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 FNR 基因。缺失掉第三 结构域并且将所得的嵌合基因引入烟草中。因此， 在一个实施方案中， 所述属是鱼腥蓝细 菌。优选地， 所述序列包括编码 C 端两个结构域区域的序列但是不包括编码藻胆蛋白体结 合结构域的区域。FNR 的全长序列显示在 SEQ ID NO.5 中。例如， 所述构建体可以包含 SEQ ID NO.3。所述构建体可以优选地包含编码将所述蛋白靶向到叶绿体的转运肽的序列。转 运肽是叶绿体靶向肽。这优选地源自植物 FNR， 例如豌豆。例如， 所述构建体可以包含 SEQ ID NO.4。作为实施例， 图 9 显示根据本发明的构建体。
     在第三步中， 第一种稳定的转化体与第二种稳定的转化体杂交以产生表达 FNR 和 Fld 两者的稳定的纯合后代植物。如技术人员将了解的， 将 Fld 植物与 FNR 植物杂交将产 生对每个基因是半合子的 “杂种” 。所得的植物需要自交然后选择后代以发现双纯合体 - 即 对于两个转基因都是纯合的植物。技术人员也将了解多倍体需要多于一步 “自交” 。因此， 产生表达 FNR 和 Fld 两者并且对于 FNR 和 Fld 两者都是纯合的植物的步骤包括产生通过步 骤 d) 获得的植物的后代并且选择对于两个转基因都是纯合的植物。如在实施例中所示， 在 使 FNR 植物与 Fld 表达同胞杂交后， 双纯合植物得到选择并显示出相对于单纯合 Fld 植物 的对引起氧化胁迫的氧化还原循环化合物甲基紫精 (MV) 更好的耐性。
     在另一个实施方案中， 用于产生具有加强的胁迫耐性的植物的方法包括 ：
     a) 在植物中表达核酸构建体， 所述构建体包含编码植物中的黄素氧还蛋白多肽或 FNR 多肽的序列，
     b) 用包含分别编码黄素氧还蛋白多肽或 FNR 多肽的序列的核酸构建体转化所述 植物， 以产生表达 FNR 和 Fld 的稳定的纯合植物。
     根据此实施方案， 产生单转化体并且用包含第二基因的核酸构建体再次转化该单 转化体以产生表达 FNR 和 Fld 的稳定的纯合植物。然后选择稳定的纯合植物。
     技术人员将了解， 对不同构建体使用选择性标记基因将帮助促进选择双突变体。
     能够用于此实施方案的构建体也在以上得到描述。
     在另一方面中， 本发明涉及这样的核酸构建体， 所述核酸构建体包含编码蓝细菌 FNR 的核酸序列和叶绿体靶向序列。这样的构建体和不同的实施方案在以上得到描述。
     在另一方面中， 本发明涉及这样的载体， 所述载体包含本文所述的构建体。 所述载 体优选地适于转化植物并且可以使用的载体对技术人员是已知的。 本发明还涉及包含本文所述的构建体或载体的植物宿主细胞。
     本发明还包括这样的宿主细胞， 所述宿主细胞包含编码黄素氧还蛋白多肽的重组 核酸和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的重组核酸序列， 所述两个核酸序列都如上文 所限定。本发明的宿主细胞可以是选自由以下各项组成的组的任何细胞 ： 细菌细胞， 诸如 大肠杆菌或土壤杆菌属 (Agrobacterium) 物种细胞、 酵母细胞、 真菌细胞、 海藻或蓝细菌细 胞， 或植物细胞。 在进一步的实施方案中， 本发明涉及包含在转基因植物细胞中的本发明的 构建体。
     在另一个实施方案中， 本发明的植物细胞是非繁殖细胞， 例如该细胞不能用于总 体上使用标准细胞培养技术从此细胞再生整株植物， 标准细胞培养技术指细胞培养方法但 是排除体外细胞核、 细胞器或染色体转移方法。
     对于本发明， “转基因的” 、 “转基因” 或 “重组” 意味着涉及， 例如， 核酸序列、 表达 盒、 基因构建体或包含核酸序列的载体或转化有根据本发明的核酸序列、 表达盒或载体的 生物， 所有那些构建由这样的重组方法产生， 其中
     (a) 编码在本发明的方法中有用的蛋白的核酸序列， 或
     (b) 与根据本发明的核酸序列可操作相连的遗传控制序列， 例如启动子， 或
     (c)a) 和 b)
     未定位于其天然的遗传环境中或者已经通过重组方法修饰， 修饰可能采用以下形 式， 例如， 置换、 添加、 缺失、 倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然的遗传环境被理解为 是指原始植物中天然的基因组或染色体位置或基因组文库中的存在。在基因组文库的情 况中， 核酸序列的天然遗传环境得到优选地得到至少部分保留。所述环境在核酸序列两侧 的至少一侧上并且具有至少 50bp， 优选地至少 500bp， 尤其优选地至少 1000bp， 最优选地至 少 5000bp 的序列长度。天然存在的表达盒 - 例如核酸序列的天然启动子与相应的编码在 本发明的方法中有用的多肽的核酸序列的天然存在的组合， 如上所述 - 当此表达盒被非天 然、 合成的 (“人工的” ) 方法诸如例如诱变处理修饰时， 成为转基因表达盒。合适的方法在 例如 US 5,565,350 或 WO 00/15815 中得到描述。
     因此对于本发明来说， 转基因植物被理解为是指， 如上， 用于本发明的方法的核酸 不在其在所述植物基因组中的天然位置上， 所述核酸可能同源或异源表达。然而， 如提及 的， 转基因也指， 虽然根据本发明不同实施方案的核酸在其在植物基因组中的天然位置上， 但相对于天然序列所述序列已经被修饰了， 和 / 或天然序列的调节序列已经被修饰了。优 选地将转基因理解为是指在基因组中的非天然位置表达根据本发明的核酸， 即发生核酸的 同源或优选地异源表达。优选的转基因植物在本文中得到提及。
     用于增加植物的胁迫响应或耐性的方法也在本发明的范围内， 所述方法包括在植 物中表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的核 酸序列。该方法使用本文所述的不同构建体和步骤从而产生胁迫耐受植物。相比于野生型 / 对照植物以及相比于只表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列却不表达编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的核酸序列的植物， 胁迫响应得到增加。胁迫响应可以增加至少 2 至 10 倍或更多。
     在另一方面中， 本发明涉及通过本文所述方法获得的或可以通过本文所述方法获 得的转基因植物。在另一方面中， 本发明涉及表达本文所述构建体的转基因植物。本发明还涉及具有增强的胁迫耐性的转基因植物， 所述转基因植物表达编码黄素氧还蛋白多肽的 核酸和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的核酸。
     根据本发明的植物表达编码 FNR 多肽的核酸序列， 例如包括如在 SEQ ID NO.8 或 9 中所示的序列或其功能变体， 并且还表达编码 Fld 多肽的核酸序列， 例如包括在 SEQ ID NO.5、 6 或 7 中所示的序列或其功能变体。
     本发明还延伸至植物的可收获部分诸如但不限于种子、 叶、 果实、 花、 茎、 根、 根茎、 块茎和球根， 所述可收获部分包含编码 FNR 多肽的重组核酸， 优选地也包含编码黄素氧还 蛋白多肽的重组核酸。 此外本发明涉及来源于优选地直接来源于这样的植物的可收获部分 的产品， 诸如干的团块或粉末、 油、 脂肪和脂肪酸、 淀粉或蛋白质。
     在一个实施方案中， 本发明的种子包含本发明的构建体或本发明的载体。在进一 步的实施方案中， 本发明的种子对于本发明的构建体或载体是纯育的。在另一个实施方案 中所述种子包含编码 FNR 多肽的重组核酸并且还包含编码黄素氧还蛋白多肽的重组核酸， 两者都如本文所公开的， 并且所述种子显示增加的胁迫耐性。
     本发明也包括用于产生产品的方法， 所述方法包括 a) 种植本发明的植物和 b) 自 或由本发明的植物或部分包括这些植物的种子产生所述产品。在进一步的实施方案中， 所 述方法包括步骤 a) 种植本发明的植物， b) 从所述植物移去如上所定义的可收获部分以及 c) 自或由本发明的可收获部分产生所述产品。 可以在植物已经生长的地点产生产品， 或者所述植物或其部分可以从该植物已经 生长的地点移走以产生产品。典型地， 在植物长成后， 将所需的可收获部分从所述植物移 走， 如果在重复循环中是可行的， 并且从所述植物的可收获部分制成产品。 每次实施本发明 的方法时， 可以只实施一次种植植物的步骤， 同时允许重复次数的产生产品步骤， 例如通过 重复地移走本发明植物的可收获部分并且如果需要进一步处理这些部分以得到产品。 也有 可能重复种植本发明植物的步骤并储存植物或可收获部分直到之后对累积的植物或植物 部分进行一次所述产品的生产。 可以在时间上有重叠地甚至很大程度上同时地或连续地进 行种植植物和产生所述产品的步骤。通常所述植物在产品被生产前的一段时间长成。
     在一个实施方案中， 通过本发明的方法产生的产品是植物产品， 诸如但不限于， 食 品、 饲料、 食物添加物、 饲料添加物、 纤维、 化妆品或药物。食品被认为是用于营养或补充营 养的组合物。动物饲料和动物饲料添加物， 尤其地， 被认为是食品。在另一个实施方案中， 将本发明的生产方法用于制造农业产品诸如， 但不限于， 植物提取物、 蛋白质、 氨基酸、 碳水 化合物、 脂肪、 油、 聚合物、 维生素等。 植物产品可能在很大程度上由一种或多种农业产品组 成。
     根据本发明不同方面的植物可以是单子叶或双子叶植物。双子叶植物可以选 自这样的科， 其 包括但不限于 ： 菊科 (Asteraceae)、 十字花科 (Brassicaceae)( 例如欧 洲 油 菜 (Brassica napus))、 藜 科 (Chenopodiaceae)、 葫 芦 科 (Cucurbitaceae)、 豆科 (Leguminosae)( 苏木科 (Caesalpiniaceae)、 Aesalpiniaceae、 含羞草科 (Mimosaceae)、 蝶 形花科 (Papilionaceae) 或豆科 (Fabaceae))、 锦葵科 (Malvaceae)、 蔷薇科 (Rosaceae) 或 Solanaceae。例如， 所述植物可以选自莴苣、 向日葵、 拟南芥、 椰菜、 菠菜、 西瓜、 南瓜、 甘蓝、 番茄、 马铃薯、 辣椒、 烟草、 棉花、 油菜 (oilseed rape)、 秋葵、 苹果、 玫瑰、 草莓、 苜蓿、 扁豆、 大豆、 蚕豆 (field(fava)bean)、 豌豆、 小扁豆、 花生、 鹰嘴豆、 杏树、 梨树、 桃树、 葡萄藤或柑
     橘属物种。在一个实施方案中， 所述植物是烟草。在一个实施方案中， 所述植物是大麦。在 一个实施方案中， 所述植物是大豆。在一个实施方案中， 所述植物是棉花。在一个实施方案 中， 所述植物是玉米 ( 玉蜀黍 )。在一个实施方案中， 所述植物是水稻。在一个实施方案中， 所述植物是油菜包括 canola。 在一个实施方案中， 所述植物是小麦。 在一个实施方案中， 所 述植物是甘蔗。在一个实施方案中， 所述植物是糖甜菜。
     同样包括的是生物燃料和生物能作物诸如油菜 (rape)/canola、 亚麻子、 羽扇豆和 柳树、 杨树、 杂交杨树、 柳枝稷、 芒属或裸子植物， 诸如火炬松。同样包括的是这样的作物， 所述作物用于青贮 ( 玉米 )、 牧草或饲料 ( 草、 三叶草、 红豆草 (sanfoin)、 苜蓿 )、 纤维 ( 例 如棉花、 亚麻 )、 建材 ( 例如松树、 橡树 )、 纸浆 ( 例如杨树 )、 用于化学工业的原料 (feeder stocks)( 例如高芥酸油菜、 亚麻子 ) 以及宜人 (amenity) 用途 ( 例如用于高尔夫球场的 草皮 )、 公共及私人花园的装饰物 ( 例如金鱼草、 矮牵牛花、 玫瑰、 天竺葵、 烟草属物种 ) 和 家用植物和切花 ( 非洲紫罗兰、 秋海棠、 菊花、 天竺葵、 锦紫苏属 (Coleus) 吊兰、 千年蕉 (Dracaena)、 橡胶树 )。
     在另一个实施方案中本发明涉及树木， 诸如杨树或桉树。
     单 子 叶 植 物 可 以，例 如，选 自 以 下 科 ： 棕 榈 科 (Arecaceae)、石 蒜 科 (Amaryllidaceae) 或禾本科 (Poaceae)。例如， 所述植物可以是谷类作物， 诸如小麦、 水 稻、 大麦、 玉米、 燕麦、 高粱、 黑麦、 洋葱、 韭菜、 小米、 荞麦、 草皮、 多花黑麦草 (Italian rye grass)、 柳枝稷、 芒、 甘蔗或羊茅属物种。
     优选地， 所述植物是作物植物。作物植物是指用于人或动物消费或使用或其他非 食物 / 饲料用途的商品化规模种植的任何植物。作物植物的非限制实例包括大豆、 甜菜、 糖甜菜、 向日葵、 油菜 ( 包括 canola、 菊苣、 胡萝卜、 木薯、 苜蓿、 车轴草、 油菜子、 亚麻子、 棉 花、 番茄、 马铃薯、 烟草、 杨树、 桉树、 松树、 甘蔗和谷类诸如水稻、 玉米、 小麦、 大麦、 小米、 黑 麦、 黑小麦、 高粱、 双粒小麦、 斯佩耳特小麦 (spelt)、 secale、 单粒小麦、 埃塞俄比亚画眉草 (teff)、 买罗高梁 (milo) 和燕麦。
     优选的植物是烟草、 玉米、 小麦、 水稻、 油菜、 高粱、 大豆、 马铃薯、 番茄、 大麦、 豌豆、 扁豆、 棉花、 蚕豆、 莴苣、 椰菜或其他蔬菜型油菜 (vegetable brassicas) 或杨树。在另一个 实施方案中， 本发明的植物和在本发明的方法中使用的植物选自由以下各项组成的组 ： 玉 米、 水稻、 小麦、 大豆、 棉花、 油菜 ( 包括 canola)、 甘蔗、 糖甜菜和苜蓿。
     用于植物转化的方法， 例如通过土壤杆菌介导的转化或粒子轰击， 以及随后的用 于再生和选择经转化的植物的技术在本领域中是广为人知的。 也在本发明范围内的是经由 生物弹道 (biobalistics) 的叶绿体转化。
     根据本发明的不同方面， 植物胁迫响应得到增强、 加强或改善。 这被理解为是指相 比于在野生型植物中所发现水平的增强。此外， 如在实施例中所示， 相比于只表达编码 Fld 的核序列的转基因植物的胁迫响应， 所述水平也得到增强。技术人员将理解可以测量这种 胁迫响应并且所述增强可以是 2 至 10 倍。有两种类型的胁迫 ： 生物胁迫由其他生物诸如病 原体施加， 而非生物胁迫起因于过度或不足的物理或化学环境， 诸如干旱、 盐度、 高或低的 温度或高光。
     化学活性组分诸如 ROS/RNS 的产生和清除， 对于广泛生物和非生物胁迫和植物中 的生理反应是重要的。 氧化胁迫可以由以下多种环境和生物学因素诱发诸如氧过多、 光、 干旱、 高盐度、 寒冷、 金属离子、 污染物、 异生素、 毒素、 缺氧后的再氧化、 实验操作、 病原体感染 以及植物器官的老化。
     因此， 本发明尤其涉及用于增强或加强植物对氧化胁迫的响应的方法， 例如由极 端温度、 干旱、 紫外光、 辐射、 高盐度、 寒冷、 金属离子、 污染物、 毒素、 或由细菌、 病毒或真菌 导致的病原体感染或其组合引起的氧化胁迫。
     在另一个实施方案中， 本发明的方法和本发明的植物涉及加强的对选自由以下各 项组成的组的胁迫的耐性 ： 干旱、 15℃以下和冰点以上的低温、 冻结温度、 盐胁迫、 营养物限 制、 重金属胁迫、 病原体感染及其组合。
     在另一方面中， 本发明涉及用于在对胁迫的响应中减少植物中 ROS 量的方法， 所 述方法包括在植物中表达黄素氧还蛋白多肽和铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽。根据此方 法， 可以使用如本文所述指导 Fld 和 FNR 两者表达的构建体。备选地， 可以使表达 Fld 的植 物与表达 FNR 的植物杂交从而获得两种基因的共表达。
     在本发明的另外一个方面中， 要求这样的方法的权利， 所述方法用于在胁迫条件 下相比于对照植物增加植物或植物部分例如可收获部分、 花或种子的叶绿素和 / 或类胡萝 卜素水平。
     根据本发明的实施方案， Fld 和 FNR 的相对表达水平可以随直接取决于 Fld 剂量 的效果变化。在优选的实施方案中， Fld 的表达水平与铁氧还蛋白的表达水平至少相同。 实施例 本发明将在以下非限制性实施例中得到描述。
     方法
     载体构建
     构建用于表达 FNR 的 Ti 载体以及在烟草中共表达 Fld 和 FNR
     在蓝细菌中， FNR 是膜内蛋白， 其由三个结构域组成 ： FAD 结合结构域、 NADP(H) 结 合结构域以及与藻胆蛋白体相互作用的整合结构域 (Fillat 等， 1993)， 而前两个结构域可 以通过蛋白水解或诱变与所述内部结构域分离， 产生可溶的两个结构域的蛋白， 所述蛋白 保留全面的 NADPH- 铁氧还蛋白 (Fld) 活性 (Martínez-Júlvez 等， 1996)。这种工程应当保 证蓝细菌 FNR 在转基因植物的叶绿体基质中将保持可溶并且只展示所需的活性。我们因此 处理来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 FNR 基因。使第三个结构域缺失并将所得的嵌合基因引入 烟草。 在使 FNR 植物与表达 Fld 的同胞杂交后， 双纯合植物得到选择并且相比于单纯合 Fld 植物显示对甲基紫精 (MV) 毒性的更大的耐性。
     通过 PCR 扩增克隆到质粒 pTrc99a 中的整个基因 (Fillat 等， 1990)， 使用分别与 位置 1 至 19 和 906 至 925 互补的引物 ( 引物 1)5’ -CCGAGCTCACACCATGACTCAAGCGAA-3’ (S EQ ID NO 11) 和 ( 引物 2)5’ -ACGTCGACCAACTTAGTATGTTTCTAC-3’ (SEQ ID NO 12)， 获得 编码来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 FNR( 不具有藻胆蛋白体结合结构域 ) 的区域的 DNA 片 段。为方便进一步操作， 将 SacI 识别位点 (GAGCTC) 引入到引物 1 的 5′端而将 SalI 位点 (GTCGAC) 引入到引物 2 的 3′端。PCR 条件是 ： 94℃ 60s， 54℃ 60s 以及 72℃ 90s， 30 个循 环， 在包含 10mM Tris-HCl pH 8.4、 5mM KCl、 1.5mM MgCl2、 0.2mM 每种 dNTP 以及 2.5 单位 Taq DNA 聚合酶的介质中使用 1ng 模板 DNA 和 50pmol 每个引物。在完成 30 个循环后， 使反
     应在 72℃温育 10min。用 SacI 和 SalI 消化纯化的具有预测长度 (940bp) 的 PCR 片段。将 所述片段克隆到在 BamHI 和 SalI 限制性位点之间编码整个豌豆 FNR 前体的 pUC9 衍生重组 质粒 (Ceccarelli 等， 1991) 的相容位点， 并且编码豌豆 FNR 的成熟区域的 DNA 片段已经通 过用 SacI 和 SalI 消化从所述质粒移去。这产生源自豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细 菌 FNR 的成熟区域的框内融合。
     在两条链上确定嵌合基因的序列， 并且通过使用 BamHI 和 SalI 消化将其从相应 的质粒切除。然后将所述 1120-bp 片段克隆到 pDH51(Pietrzcak 等， 1986) 的 CaMV 35S 启 动子与聚腺苷酸化区域之间。整个盒进一步被作为 EcoRI 片段分离并且插入到双元载体 pCAMBIA 2200(Hajdukiewiez 等， 1994) 的 EcoRI 位点。最后通过电穿孔使所述构建体进入 根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌株 GV3101 pMP 90(Ausubel 等， 1987)。
     构建用于表达 FNR 和 Fld 的 Ti 载体， 以及在大麦中共表达 Fld 和 FNR
     开发出用于根据 Harwood 等 (2009) 的用 FNR 和 Fld 共转化大麦植物的实验步骤的 两个独立载体。所有涉及的分子生物学重组 DNA 技术对技术人员是已知的并且在文献中得 到全面说明。通过 PCR 扩增之前所述的包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细菌 PCC7119 FNR 的 C 端两个结构域的编码区域 (SEQ ID NO.4) 的框内融合的嵌合基因的序列 以产生适于克隆到 pBRACT 系列的双元载体 (Harwood et al， 2009) 中的产物， 所述 pBRACT 系列的双元载体包含 hpt 基因， 所述 hpt 基因在位于左侧边界 (LB) 的 35S 启动子的控制下 给予潮霉素抗性。所述嵌合克隆的基因在位于右侧边界 (RB) 的玉米泛素启动子的控制下。 使包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 Fld 编码区域 (SEQ ID NO.2， Tognetti 等， 2006 ； PCT/GB2002/004612) 的框内融合的嵌合构建体， 经历与以上所述 相同的实验步骤。
     所得的包含在所需调节序列的控制下的目的基因的双元载体可以直接用于植物 转化步骤， 例如土壤杆菌介导的植物组织转化或粒子轰击技术。
     构建用于在植物中共表达 Fld 和 FNR 的双元载体
     基于 MultiSite Gateway 克隆系统 (Invitrogen， http://www.invitrogen.com) (Karimi 等 2007 ； Dafny-Yelin 和 Tzfira， 2007)， 开发这样的单构建体， 所述单构建体可以 指导 FNR 和 Fld 多肽在转化有这样的构建体的植物中的共表达。图 11 描述了设计和构建 以上提及的双载体的多步骤过程。遵从由制造商提供的使用说明、 实验方案和指导进行所 述过程。所有涉及的分子生物学重组 DNA 技术对技术人员是已知的并且在文献中得到全面 说明。
     通过 PCR 扩增之前所述的包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细菌 PCC7119 FNR 的 C 端两个结构域的编码区域 (SEQ ID NO.4) 的框内融合的嵌合基因的序列 以产生适于用作在与适当的供体载体的 Gateway BP 重组反应中的底物的产物。设计两个 基因特异性的引物， 正向的和反向的， 从而分别将 attB1 和 attB4 序列结合到其 5′端， 所 述 attB1 和 attB4 序列是与 pDONR221 P1-P4 供体载体中的 attP1 和 attP4 位点的特异性 的 BP 重组反应所需要的。attB1-FNR-attB4 PCR 产物与 pDONR221 P1-P4 载体间的位点特 异性 BP 重组反应产生 pENTR221 L1-L4-FNR 进入克隆， 其中 FNR 构建体的两侧是用于 LR 重 组的 attL1 和 attL4 位点特异性序列。使包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细 菌 PCC7119 的 Fld 编码区域 (SEQ ID NO.2， Tognetti 等， 2006 ； PCT/GB2002/004612) 的框内融合的嵌合构建体， 经历与以上所述相似的实验步骤， 除了引物结合 attB2 和 attB3 重组特 异性序列而不是之前构建体的 attB1 和 attB4 位点。所得的 attB2-Fld-attB3 PCR 产物与 pDONR221 P2-P3 供体载体间的 BP 重组反应产生 pENTR221 L2-L3-Fld 进入克隆， 其中 Fld 构建体的两侧是 attL2 和 attL3 LR 重组特异性位点。
     将 pENTR221 L1-L4-FNR 和 pENTR221 L2-L3-Fld 进 入 克 隆 用 作 与 任 何 多 种 特 别设计的 pDEST-BRACT 目的载体 (pBRACT) 的 MultiSite Gateway LR 重组反应的底物。 pDEST-BRACT 载体是 MultiSite Gateway 目的载体， 其被改造从而包含两个 Gateway 盒， 所述两个 Gateway 盒用于在预定方向通过单 LR 位点特异性重组反应独立克隆侧翼有相容 attL 序列的两个不同构建体。它们是双元 T-DNA 载体， 其除了左侧和右侧 T-DNA 边界序 列 (LB 和 RB， 分别 ) 外， 还包含完整的植物选择标记表达盒和植物调节区域 ( 启动子、 终 止子、 增强子 )， 其位于每个 Gateway 盒的两侧从而指导被克隆序列的表达。开发的多种 pDEST-BRACT 目的载体的启动子和终止子和 / 或其包含的 attL 序列的同一性不同。 它们可 以被定做成用于在单子叶或双子叶植物中在组成型或诱导型启动子的控制下最优表达所 述转基因。
     所得的表达克隆是包含在所需调节序列控制下的目的基因的双元载体， 其可以直 接用于植物转化步骤， 例如土壤杆菌介导的植物组织转化或粒子轰击技术。
     在烟草中表达 Fld 和 FNR
     植物转化
     使 用 常 规 技 术 (Gallois 和 Marinho， 1995) 实 施 烟 草 (Nicotiana tabacum cv Petit Havana) 叶盘转化并且进一步分析卡那霉素抗性转化体的后代。使表达如 SDS-PAGE 和免疫印迹评估的高水平蓝细菌 FNR 的初级转化体自花授粉， 并且使用纯合后代进行所有 随后的实验。
     同时表达来自鱼腥蓝细菌的 Fld 和 FNR 的转基因植物的产生
     通过异花授粉进行双表达植物的制备。使用在此项目中产生的、 表达来自鱼腥蓝 细菌的 FNR(pFNR) 的转基因植物， 和在叶绿体中高水平表达鱼腥蓝细菌 Fld 的稳定的纯合 系 (pFld， Tognetti 等， 2006) 作为亲本。使表达 pFNR 和 pFld 的初级双杂合转化体自花授 粉并且通过 SDS-PAGE 和免疫印迹选择双纯合植物。
     胁迫处理
     使对照和转基因植物的种子在补充有 3 ％ (w/v) 蔗糖以及在转化体的情况中 100μg ml-1 卡那霉素的 Murashige-Skoog(MS) 琼脂上发芽。 在 4 周 25℃和 100μmol quanta -2 -1 m s (16h 光照 /8h 黑暗 ) 后， 将幼苗放置在土壤上。从生长在土壤上的两月龄烟草植物嫩 的完全展开的叶子打孔出 13mm 直径的叶盘。给叶盘称重并使其顶侧向上地、 单独地漂浮在 24 孔板中的包含所示量的 MV 的 1ml 无菌蒸馏水上， 并于 25℃在黑暗中温育 12h 以允许 MV -2 -1 扩散到叶子中。然后以 700μmol quanta m s 的白光源照射孔。对照在同样条件下保持 在水中。使用 Horiba 模式 B-173 电导计， 在 MV 胁迫期间叶盘的电解质渗漏被测量为介质 的电导率。
     将在土壤中生长了 3 或 4 周的幼苗转移至包含 Hoagland 溶液 (Hoagland 和 Arnon， 1950) 的水培系统中。在 3 天后， 给 Hoagland 溶液补充以 100μMMV。
     分析步骤色素测定 使用标准方法 (Lichtenthaler， 1987) 测定叶子和质体中的叶绿素和类胡萝卜素含量。 检测脂质过氧化物
     使用 FOX 测定量化在植物组织提取物中脂质过氧化物 (LOOHs) 的存在 (DeLong， 等， 2002)。 使用 300μL 包含 0.01％丁羟甲苯的 80 ∶ 20(v/v) 乙醇∶水萃取叶组织 (4cm2)。 将脂质分配到有机相， 涡旋振荡并以 3,000g 离心。 使 50μl 所述植物提取物与 50μl 10mM tris- 苯膦 (TPP， LOOH 还原剂 ) 结合于甲醇和 500U 牛肝过氧化氢酶 (Sigma) 中。搅拌所 述混合物并温育 30min 以使任何存在的 -OOH 被 TPP(+TPP) 完全还原。相同地处理不添加 TPP 的样品 (-TPP)， 除了用甲醇代替 TPP 等分试样以外。在 30min TPP 温育后， 将 900μl 由 90％甲醇 (v/v)、 25mM H2SO4、 4mM 丁基化羟基甲苯 (BHT)、 25μM 硫酸亚铁铵六水合物和 100μM 二甲酚橙组成的 FOX 试剂添加到每个样品， 并在添加 10min 后在 Ultrospec 1100 分 光光度计 (Amersham， Biosciences) 中记录 560nm 处的吸光度。含有和不含有 TPP 的样品 间的吸光度差异显示 LOOH 的存在 ； 然后使用跨越 0-20μM H2O2 范围的标准曲线将 -OOH 值 表达为微摩尔 H2O2 当量。
     酶活性测定
     为鉴定展示 NADPH 依赖的心肌黄酶活性的酶， 通过非变性 PAGE 在 12％聚丙烯酰 胺凝胶上分离相当于 15μg 可溶蛋白的叶片提取物。在电泳后， 通过在 50mM Tris-HCl、 pH + -1 -1 8.5、 0.3mM NADP 、 3mM Glc-6-P、 1 单位 nl Glc-6-P 脱氢酶和 1mg ml 氮蓝四唑中温育给
     所述凝胶染色直到出现紫色的甲
     条带。在非变性凝胶中使用 Mittler 和 Zilinskas(1993) 的方法确定抗坏血酸过氧化物 酶 (APX) 的酶活性。
     结果
     在转基因烟草叶绿体中表达可溶的鱼腥蓝细菌 FNR
     为了在烟草质体中表达可溶的蓝细菌 FNR， 制备这样的嵌合基因， 其中 C 端两个结 构域的鱼腥蓝细菌 FNR 编码区域 (Fillat 等， 1990) 在氨基端被框内融合到编码豌豆 FNR 的叶绿体转运肽的 DNA 序列 ( 详情见方法部分 )。将所述构建体克隆到在组成型 CaMV 35S 基因启动子控制下的土壤杆菌双元载体中， 并且通过土壤杆菌介导的叶盘转化递送到烟草 细胞中。卡那霉素抗性植物从组织培养重新获得并且通过免疫印迹评估 FNR 累积。通过 SDS-PAGE 分离提取自取样的初级转化体 (pFNR) 或提取自野生型烟草样品的蛋白， 并且用 考马斯亮蓝染色， 或印迹到硝酸纤维素膜上并使用标准技术用针对鱼腥蓝细菌 FNR 的抗血 清检测 ( 图 2)。
     在获得自若干转化体的叶子提取物中可以检测到不同水平的成熟尺寸的活性条 带， 暗示质体输入并处理表达的黄素蛋白。当在转基因植物叶绿体的基质中检测到 FNR 的 同时， 在类囊体膜级分中没有免疫反应性 ( 图 3A)。 叶绿体基质级分的心肌黄酶活性显示在 转基因烟草植物中所述酶是有活性的 ( 图 3B)。
     在叶绿体中表达蓝细菌 FNR 的植物在表型上相对野生型同胞看起来是正常的， 并 且展示对 MV 毒性的野生型水平的耐性 ( 数据未示 )。
     在转基因烟草叶绿体中表达鱼腥蓝细菌 FNR 和 Fld为获得双表达植物， 在表达 FNR 或 FLD 的纯合植物间进行异花授粉。所得的后代 如预期的只包括双杂合样品。使其自花授粉并且通过 Western 印迹法选择双纯合 (2x) 植 物 ( 图 4)。
     对甲基紫精的耐性
     进行实验以评估 FNR/Fld 表达叶盘对 MV 的耐性， 如在方法部分所述。在对照叶 盘中视觉上观察到叶组织漂白， 反映出增加的叶绿素降解 ( 图 5A)。通过测量电解质渗漏 评估归因于 MV 暴露的膜损伤。电导值对在相同条件下发生在水中的离子渗漏进行修正 并且被表达为总离子含量 ( 在 MV 处理的结尾在高压灭菌叶盘后获得的最大值 ) 的百分 比。将叶绿素含量表达为在没有 MV 的相同条件下温育的叶盘的总叶绿素的分数。膜变质 (deterioration) 和色素完整性两者在双纯合 FNR/Fld 植物中相比在单纯合 Fld 表达同胞 中都得到显著地更好的保护 ( 图 5B， C)。
     为评估整株植物对 MV 的耐性， 在如在方法中所述的水培系统中测定它们。相比于 只表达 Fld， FNR 和 Fld 的同时表达提供更多的对 MV 诱发的损伤的保护 ( 图 6)。
     为评估 ROS 增长， 通过 FOX 测定测量脂质过氧化 (Delong 等， 2002)。如在方法中 所述用 10μM MV 处理野生型和转基因烟草植物的叶盘。脂质氢过氧化物 (LOOH) 的水平以 μM H2O2cm-2 表示， 并且在双纯合杂交 X416 中比在纯合亲本 pFld 中显著地更低。两者都比 野生型植物更具有耐性 ( 图 7A)。若干蛋白也是 ROS 优选的目标。叶绿体抗坏血酸过氧化 物酶 (APX) 是其中最敏感的之一。将野生型植物暴露于 20μM MV 在仅仅 90min 温育后导 致此酶活性 70-80％的下降。Fld 的表达提供部分保护 (40-50％的残余活性 )。FNR 在 Fld 表达植物中的同时存在导致 APX 活性几乎定量的保持 ( 图 7B)。
     Fld 和 FNR 在大麦中的表达和共表达
     植物转化。产生同时表达来自鱼腥蓝细菌的 Fld 和 FNR 的转基因大麦植物。
     分别使用包含 Fld 和 FNR 基因的 pBract214 载体转化大麦， 如上所述。 将所述载体 独立地转化到根癌土壤杆菌中并且用两种土壤杆菌株系的混合物转化春大麦变种 Golden Promise。基于具有根癌土壤杆菌的未成熟胚芽的感染进行大麦转化， 随后在包含抗生素 潮霉素的培养基上选择转基因组织。该方法导致多产的独立转基因株系的产生 (Harwoodd 等， 2009) 而潮霉素抗性的转化体的后代得到进一步的分析。 将表达蓝细菌 FNR 和 Fld 的初 级杂合转化体， 如用 SDS-PAGE 和免疫印迹所评估的， 用于进一步实验。在对本文所述的实 验方案的修改中， 只用搭载有一个蓝细菌基因构建体的根癌土壤杆菌株系中的每个来进行 胚芽的感染以获得表达 FNR 或 Fld 构建体的独立的杂合转基因株系。
     大麦中的胁迫处理
     使转基因和对照大麦植物在受控的环境条件下生长， 所述受控的环境条件是指白 天 15℃以及夜晚 12℃的温度， 80％的湿度， 由金属卤化物灯 (HQI) 提供的 16h 光周期并且 在成熟植物株冠水平以 500μmol quanta m-2s-1 的强度补充以钨灯。所用的土壤混合物由 以 2 ∶ 2 ∶ 1 的比率混合的 Levington M3 混合肥料 /Perlite/Grit 组成。从生长在土壤 中的 6 周龄大麦植物的叶子上切取 10-15mm 长的叶条。然后使叶条在包含所示量的 MV 和 0.05％ Tween-20 的蒸馏水中在 20℃在黑暗中温育 30 分钟以使 MV 扩散到组织中。然后将 所述叶条近轴侧向上地放置在塑料托盘中并在 450μmol quanta m-2s-1 光源下温育所示的 时间周期。使对照保持在包含 0.05％ Tween-20 的蒸馏水中。然后如在 5.1 中所述的那样评估叶绿素和类胡萝卜素的含量。
     结果
     使根据本文所述方法获得的表达 Fld 和 FNR 的独立杂合大麦植物经历氧化胁迫条 件以评估它们与其野生型对应物相比的相对耐性。图 12 显示当对于 FNR 和 Fld 基因是杂 合的转基因植物和野生型个体的叶条暴露于氧化还原循环除草剂甲基紫精时获得的典型 结果并且然后如方法中所述的那样估计光合色素叶绿素和类胡萝卜素的含量。 色素降解是 光合器官变质的标志。结果显示， 双杂合 FNR/Fld 转基因植物成功地经受了氧化挑战， 其保 存的总的叶绿素和类胡萝卜素的水平分别比野生型 ( 以及单独的 FNR) 对应物高 2 倍和 4 倍。Fld 表达转基因大麦植物显示中间的耐性水平。考虑到由转基因给予的保护效果的剂 量依赖性的事实， 两种转基因 FNR 和 Fld 的杂合植物展示高的耐性水平的事实是显著的。
     结语
     来自相同蓝细菌物种的 Fld 和 FNR 两者在植物中的同时表达给予相对只表达 Fld 的植物的增强的对 MV 毒性的耐性。为简单起见， pn 植物代表初级 FNR 烟草转化体， Xn 植物 是 pn 植物与来自 Tognetti 等 (2006) 的 pfld5-8 的杂交。Xnn 或 Xnnn 是 X4 双杂合植物自 花授粉的分离子 (segregant)。
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     序列表
     本文所述的核酸序列和相应的肽列表于下。
     Seq 1 ： 不带有靶向序列的用于单融合构建体的 Fld 核酸序列
     ATGTCAAAGAAAATTGGTTTATTCTACGGTACTCAAACTGGTAAAACTGAATCAGT
     AGCAGAAATCATTCGAGACGAGTTTGGTAATGATGTGGTGACATTACACGATGTTT
     CCCAGGCAGAAGTAACTGACTTGAATGATTATCAATATTTGATTATTGGCTGTCCT
     ACTTGGAATATTGGCGAACTGCAAAGCGATTGGGAAGGACTCTATTCAGAACTGG
     ATGATGTAGATTTTAATGGTAAATTGGTTGCCTACTTTGGGACTGGTGACCAAATA
     GGTTACGCAGATAATTTTCAGGATGCGATCGGTATTTTGGAAGAAAAAATTTCTCA
     ACGTGGTGGTAAAACTGTCGGCTATTGGTCAACTGATGGATATGATTTTAATGATT
     CCAAGGCACTAAGAAATGGCAAGTTTGTAGGACTAGCTCTTGATGAAGATAATCAA
     TCTGACTTAACAGACGATCGCATCAAAAGTTGGGTTGCTCAATTAAAGTCTGAATT
     TGGTTTGTAA
     Seq 2 ： 带有靶向序列的用于单融合构建体的 Fld 核酸序列
     ATGGCTGCTGCAGTAACAGCCGCAGTCTCCTTGCCATACTCCAACTCCACTTCCC
     TTCCGATCAGAACATCTATTGTTGCACCAGAGAGACTTGTCTTCAAAAAGGTTTCA
     TTGAACAATGTTTCTATAAGTGGAAGGGTAGGCACCATCAGAGCTCTCATAATGTC
     AAAGAAAATTGGTTTATTCTACGGTACTCAAACTGGTAAAACTGAATCAGTAGCAG
     AAATCATTCGAGACGAGTTTGGTAATGATGTGGTGACATTACACGATGTTTCCCAG
     GCAGAAGTAACTGACTTGAATGATTATCAATATTTGATTATTGGCTGTCCTACTTGG
     AATATTGGCGAACTGCAAAGCGATTGGGAAGGACTCTATTCAGAACTGGATGATG
     TAGATTTTAATGGTAAATTGGTTGCCTACTTTGGGACTGGTGACCAAATAGGTTAC
     GCAGATAATTTTCAGGATGCGATCGGTATTTTGGAAGAAAAAATTTCTCAACGTGGTGGTAAAACTGTCGGCTATTGGTCAACTGATGGATATGATTTTAATGATTCCAAGG
     CACTAAGAAATGGCAAGTTTGT AGGACTAGCTCTTGATGAAGATAATCAATCTGAC
     TTAACAGACGATCGCATCAAAAGTTGGGTTGCTCAATTAAAGTCTGAATTTGGTTT
     GTAA
     Seq 3 不带有靶向序列的用于单融合构建体的 FNR 鱼腥蓝细菌属 PCC7119 核酸序 列 ( 编码两个结构域的序列 )
     ATGACTCAAGCGAAAGCCAAACACGCTGATGTTCCTGTTAATCTTTACCGTCCCAA
     TGCTCCATTTATTGGTAAGGTAATCTCTAATGAACCACTGGTAAAAGAAGGCGGGA
     TAGGTATTGT TCAGCACATTAAATTTGATCTAACTGGTGGTAACTTAAAGTACATCG
     AAGGTCAAAGTATTGGTATCATTCCACCAGGAGTGGACAAGAACGGCAAGCCGGA
     AAAATTGAGACTCTACTCCATTGCCTCGACCCGTCACGGCGATGATGTGGATGAT
     AAAACCATCTCACTGTGCGTCCGTCAATTAGAGTACAAACATGCAGAAAGCGGCG
     AAACAGTTTACGGTGTTTGTTCTACTTACTTGACTCACATTGAACCAGGTTGAGAA
     GTGAAAATCACTGGGCCTGTGGGTAAAGAAATGCTGTTACCCGATGATCCTGAAG
     CTAATGTCATCATGTTGGCAACAGGTACTGGTATTGCGCCTATGCGGACTTACCT
     GTGGCGGATGTTCAAGGATGCAGAAAGAGCTGCTGACCCAGAATATCAATTCAAA
     GGATTCTCTTGGTTAGTCTTTGGTGTTCCTACAACTCCTAACATTCTTTATAAAGAA
     GAAGTGGAAGAAATCCAACAAAAATATCCCGATAACTTCCGCCTAACTTACGCTAT
     CAGCCGGGAGCAAAAGAATCCCCAAGGTGGCAGAGTGTACATCCAAGACCGTGT
     GGCAGAACACGCTGATGAACTGTGGCAATTAATCAAGAATGAAAAAACCCACACC
     TACATCTGTGGTTTGCGCGGTATGGAAGAGGGCATTGATGCTGCTTTAAGTGCTG
     CGGCTGCGAAAGAAGGTGTTACCTGGAGTGATTACCAAAAAGACCTCAAGAAAGC
     TGGTCGCTGGCACGTAGAAACATACTAA
     Seq 4 带有靶向序列的用于单融合构建体 ( 包含编码两个结构域的序列的 FNR 构 建体 ) 的 FNR 核酸序列
     ATGGCTGCTGCAGTAACAGCCGCAGTCTCCTTGCCATACTCCAACTCCACTTCCC
     TTCCGATCAGAACATCTATTGTTGCACCAGAGAGACTTGTCTTCAAAAAGGTTTCA
     TTGAACAATGTTTCTATAAGTGGAAGGGTAGGCACCATCAGAGCTCACACCATGA
     CTCAAGCGAAAGCCAAACACGCTGATGTTCCTGTTAATCTTTACCGTCCCAATGCT
     CCATTTATTGGTAAGGTAATCTCTAATGAACCACTGGTAAAAGAAGGCGGGATAG
     GTATTGTTCAGCACATTAAATTTGATCTAACTGGTGGTAACTTAAAGTACATCGAAG
     GTCAAAGTATTGGTATCATTCCACCAGGAGTGGACAAGAACGGCAAGCCGGAAAA
     ATTGAGACTCTACTCCATTGCCTCGACCCGTCACGGCGATGATGTGGATGATAAA
     ACCATCTCACTGTGCGTCCGTCAATTAGAGTACAAACATCCAGAAAGCGGCGAAA
     CAGTTTACGGTGTTTGTTCTACTTACTTGACTCACATTGAACCAGGTTCAGAAGTG
     AAAATCACTGGGCCTGTGGGTAAAGAAATGCTGTTACCCGATGATCCTGAAGCTA
     ATGTCATCATGTTGGCAACAGGTACTGGTATTGCGCCTATGCGGACTTACCTGTG
     GCGGATGTTCAAGGATGCAGAAAGAGCTGCTGACCCAGAATATCAATTCAAAGGA
     导言
     不利地影响生长、 发育或生产的外部条件引发广泛植物响应， 诸如改变的基因表 达、 细胞代谢以及生长速率和作物产量的变化。 有两种类型的胁迫 ： 生物胁迫由其他生物施 加， 诸如病原体， 而非生物胁迫起因于过度或不足的物理或化学环境， 诸如干旱、 盐度、 高或 低的温度或紫外光。
     环境胁迫是植物生产率和作物产量的主要限制因素。 当植物细胞处于环境胁迫下 时， 若干化学上相异的活性氧簇 (ROS) 由分子氧的部分还原产生并且这些可以引起氧化损 伤或充当信号。光合电子传递链组分的自动氧化导致超氧自由基及其衍生物、 过氧化氢和 羟基的形成。这些化合物与多种生物分子 ( 包括 DNA) 反应， 引起细胞停滞和死亡 (Kim 等
    2008， Vranová 等 2002)。
     黄素氧还蛋白 (Fld) 是发现于细菌和一些海藻中但是未在植物中发现的电子传 递黄素蛋白 (Zurbriggen 等， 2007)， 其能够有效地参与若干铁氧还蛋白 (Fd) 依赖的氧化 还原通路， 包括光合作用、 氮同化和硫氧还蛋白介导的氧化还原调节 (Tognetti 等， 2006， 2007b)。在暴露于氧化和非生物胁迫的微生物中， Fld 水平被上调 (Singh 等， 2004)。当表 达于植物叶绿体中时， 黄素蛋白充当一般的抗氧化剂防止不同类型的 ROS 在叶绿体中形成 (Tognetti 等， 2006)。 所得的转基因植物对多种环境挑战、 氧化还原循环氧化剂和异生素发 展出多重耐性 (Tognetti 等， 2006 ； 2007a， PCT/GB2002/004612， 所述所有文件通过引用并 入本文 )。在缺铁 (iron-starved) 蓝细菌中， 当其存在于 Fld 转化植物中时， Fld 由光系统 I(PSI) 还原 (Tognetti 等， 2006)。 在异氧菌中， Fld 可以被丙酮酸 -Fld 还原酶和 NADPH-Fld 还原酶还原 (Blaschkowski 等， 1982)。Fld 也在蓝细菌异形胞中组成型地积累并且已经证 明它可以参与到固氮酶的电子传递 (Sandmann 等， 1990)， 但是终极电子供体的性质是未知 的， 并且可以介导此反应的更有效的、 异形胞特异性的铁氧还蛋白的诱导已经使人们对分 子氮固定期间 Fld 的作用产生了疑问 (Razquin 等， 1995)。
     在植物和蓝细菌两者中， 铁氧还蛋白 -NADP(H) 还原酶 (FNR)(EC1.18.1.2) 是与类 囊体结合的酶， 其以物理的、 组成型的方式参与从铁氧还蛋白或 Fld 到 NADP+ 以形成 NADPH 的电子传递 (Carrillo 和 Ceccarelli， 2003)。 当存在来自 PSI 的强的电子压力时， 此活性与 在光照下介导相反反应的可能性直接冲突。 因此， FNR 介导的 NADPH 对铁氧还蛋白 ( 或 Fld) 的还原不可能以任何显著的速率在体内发生， 并且目前还未报道发现这种活性。 然而， 溶解 的 FNR 与其余的链分开并且迅速地催化它 (Carrillo 和 Ceccarelli， 2003)。 实际上， 可溶的 + FNR 在介导分离的、 FNR 缺失的类囊体的 NADP 光还原中几乎是无活性的 (Forti 和 Bracale， 1984)。在包含用于光捕获的藻胆蛋白体的蓝细菌物种中， FNR 由三个结构域组成 ： 参与藻 胆蛋白体结合的 N 端结构域， 其后是 FAD 结合结构域和 NADP(H) 结合结构域， 所述 FAD 结合结构域和 NADP(H) 结合结构域一起构成该酶的活性部分 (Carrillo 和 Ceccarelli， 2003)。 备选的起始密码子定位于第二个结构域的开始处以产生两个结构域的可溶的 FNR(Thomas 等， 2006)。当细胞转变为异养生活方式并且需要从 NADPH 到 Fd 或 Fld 传递电子的能力时， 优选地使用此内部 Met(Thomas 等， 2006)。在图 1 中提供了描述该理论模型的图解。在所 有蓝细菌和光合真核细胞中都发现有所述酶。 具有相似特异性但是不同生理作用的其他酶 已经在若干非光合植物组织、 在哺乳动物线粒体以及在若干细菌中得到描述。蓝细菌 FNR 已经被很好的表征 (Sancho， 1987， Schluchter 1992)。此外， 编码 FNR 的 petH 基因已经从 若干蓝细菌菌株中克隆 (Fillat 等， 1993)。可以通过如下所述的心肌黄酶活性测定检测活 性 FNR 的存在。
     因此已知将细菌 Fld 结合到烟草叶绿体中可以补偿 Fd 水平的降低， 产生对氧化剂 和广泛不良胁迫条件增强的耐性。本发明目标在于通过保证在还原条件中维持 Fld 来改善 植物的胁迫耐性。
     发明概述
     在一方面中， 本发明涉及用于产生具有加强的胁迫耐性的植物的方法， 所述方法 包括在植物中表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶 多肽的核酸序列。通过这种方法获得的或可以通过这种方法获得的植物也在本发明的范 围内。本发明进一步涉及包含基因序列的核酸构建体， 其中所述基因序列包括编码蓝细菌 FNR 的核酸序列和叶绿体靶向序列。在另一个方面中， 本发明涉及这样的核酸构建体， 所述 核酸构建体包含编码黄素氧还蛋白多肽 (Fld) 的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原 酶 (FNR) 多肽的核酸序列。在另一个方面中， 本发明涉及具有加强的胁迫耐性的转基因植 物， 所述转基因植物表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还 原酶多肽的核酸序列。在另一方面中， 本发明涉及用于在对胁迫的响应中减小植物中 ROS 量的方法， 所述方法包括在植物中表达黄素氧还蛋白多肽和铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多 肽。
     附图
     在非限制性附图中进一步图示本发明。
     图 1. 在表达来自蓝细菌的 Fld 和 FNR 的双转化体中的提议的电子路径。在正常 生长条件下 ( 上图 )， 铁氧还蛋白 (Fd) 和 Fld 两者都可以介导到生产路径的电子传递， 根据 效率 Fd 很可能是优选的。在胁迫下 ( 下图 )， Fd 水平下降并且 Fld 接管了到 NADP 的光合 电子传递， 同时可溶的 FNR 使用部分形成的 NADPH 以保持 Fld 被还原， 防止形成 ROS 和结束 良性循环。
     图 2. 在野生型 (PH) 和转化体烟草的叶片中的 FNR 累积。相当于 17μg 蛋白的来 自 6 周龄独立转化植物 (pnn) 的叶片提取物通过 SDS-PAGE 分级并印迹到硝酸纤维膜上以 用于使用针对鱼腥蓝细菌 (Anabaena) 还原酶的抗血清免疫检测 FNR。
     图 3. 来自转基因烟草植物的 FNR 的亚细胞定位和胶内心肌黄酶活性。A) 在渗透 休克从野生型和 pFNR 植物分离的完整叶绿体后， 类囊体和基质得到分离。相当于 4μg 叶 绿素的样品通过 SDS-PAGE 分离并且通过免疫印迹分析确定 FNR 的存在。B) 相当于 15μg 总的可溶蛋白的来自野生型和 pFNR 植物的基质， 通过非变性电泳分离并且对心肌黄酶活 性染色。图 4. 在 X4 植物后代中的 FNR 和 Fld 表达水平。相当于 8μg 总的可溶蛋白的来 自 6 周龄烟草植物的叶片提取物通过 SDS-PAGE 分级并印迹到硝酸纤维膜上， 以用于使用针 对鱼腥蓝细菌 FNR 和 Fld 的抗血清的免疫检测。
     图 5. 甲基紫精 (MV) 对 FNR/Fld 表达植物叶盘的作用。将来自 6 周龄烟草植物的 叶盘放置在 20μM MV 上并以 600μmol quanta m-2s-1 照射。A) 温育 7h 后拍摄的照片。B) 在用 MV 处理叶盘后通过测量介质相对电导的增加来评估离子渗漏。C) 在 7h MV 处理后确 定叶绿素和类胡萝卜素。
     图 6.MV 对整个烟草植物的作用。将四周龄植物转移到水培系统。在生长室条件 下在暴露于 100μM MV 24h 后拍摄叶片的照片。
     图 7.A) 检测脂质过氧化物。将来自 6 周龄植物的叶盘放置在 10μM MV 或水上 ( 右手的条 ) 并且在 3h 内用 700μmol quanta m-2s-1 照射。每个值是四次样品重复测量值 的平均值 ± 标准差。B) 来自 FNR/Fld 表达植物的叶盘的叶片提取物的 APX 活性。将来自 6 周龄烟草植物的叶盘放置在 20μM MV 上并用 600μmol quanta m-2s-1 照射。在 1.5 和 3h 的温育后采集样品。
     图 8. 包 含 编 码 豌 豆 FNR 转 运 肽 和 黄 素 氧 还 蛋 白 基 因 的 序 列 之 间 的 框 内 (in-frame) 融合片段的双元载体 pCAMBIA 2200 的图示。插在 pCAMBIA 2200 的 Eco RI 位 点的盒事先构建在 pDH51 中。此 Eco RI 片段包含 CaMV 35S 启动子、 黄素氧还蛋白嵌合基 因和 CaMV35S 聚腺苷酸化信号。 图 9. 包含编码豌豆 FNR 转运肽和鱼腥蓝细菌 FNR 基因的两个 C 端结构域的序列 之间的框内融合片段的双元载体 pCAMBIA 2200 的图示。插在 pCAMBIA2200 的 Eco RI 位点 的盒事先构建在 pDH51 中。此 Eco RI 片段包含 CaMV 35S 启动子、 FNR 嵌合基因和 CaMV35S 聚腺苷酸化信号。
     图 10. 源自 MultiSite Gateway 的双元载体 pBinary-BRACT B1， 4-ubi-FNR/B2， 3-actin-Fld 的图示， 所述载体包含编码豌豆 FNR 转运肽和鱼腥蓝细菌 FNR 基因的两个 C 端 结构域的序列之间的、 编码豌豆 FNR 转运肽和来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 Fld(TP-Fld) 基 因的序列之间的框内融合。在共表达载体中， nos 聚腺苷酸化信号与 ubi 和肌动蛋白启动 子分别在 TP-FNR 和 TP-Fld 构建体的两侧。这些构建体首先通过位点特异性 BP 重组反应 克隆到 pDONR221 载体系列的合适的供体载体中。所得的进入 (entry) 克隆又同时参与和 定制的双元 T-DNA MultiSite Gateway 目的载体即 pDEST-BRACT R1， 4-ubi/R2， 3-actin 的 双 LR 位点特异性重组， 产生包含两个目的基因的表达克隆 pBinary-BRACT B1， 4-ubi-FNR/ B2， 3-actin-Fld。 所述构建体到双元载体中的克隆策略基于 MultiSite Gateway 技术的 BP 和 LR 位点特异性重组反应 (Invitrogen， http://www.invitrogen.com)。
     Hyg ： 选择标记 ( 抗潮霉素 (hygromicin)) ； LB ： 左侧边界 ； nos ： 胭脂碱合成酶 ； RB ： 右侧边界 ； TP ： 转运肽 ； ubi ： 泛素。
     图 11. 用于在植物中共表达 Fld 和 FNR 多肽的双元载体的构建。示意图显示用于 在植物中共表达 FNR 和 Fld 的 pBinary-BRACT B1， 4-ubi-FNR/B2， 3-actin-Fld 双元载体的 构建。 两侧具有 attB 位点特异性重组序列的编码 FNR 和 Fld 到叶绿体靶向转运肽 (TP) 的嵌 合融合的序列的 PCR 产物 (attB1-FNR-attB4 和 attB2-Fld-attB3， 分别 ) 在与合适供体载 体 (pDONR21 P1-P4 和 pDONR p2-P3， 分别 ) 进行的 BP 重组反应中是底物。 所得的 pENTR221
     L1-L4-FNR 和 pENTR221 L2-L3-Fld 进入克隆又同时参与和定制的双元 T-DNA MultiSite Gateway 目的载体即 pDEST-BRACT R1， 4-ubi/R2， 3-actin 的双 LR 位点特异性重组， 产生包 含在组成型启动子控制下的两个目的基因的表达克隆。根据制造商建议的实验方案、 使用 说明和命名法进行所述过程 (Invitrogen， http://www.invitrogen.com)。ccdB ： 用于载体 的阴性选择的基因 ； LB ： 左侧边界 ； nos ： 胭脂碱合成酶 ； RB ： 右侧边界 ； TP ： 转运肽 ； ubi ： 泛 素。
     图 12. 大麦胁迫。 甲基紫精 (MV) 对 FNR/Fld 表达杂合大麦植物的叶条 (strip) 的 作用。从生长在土壤中的 6 周龄大麦植物的叶片上切取 10-15mm 长度的叶条。然后在 20℃ 在黑暗中将叶条在 50μM MV 和 0.05％ Tween-20 中温育 30 分钟以允许 MV 扩散到组织中。 然后将所述叶条放置在塑料托盘中使近轴侧向上向着 450μmol quanta m-2s-1 光源。使对 照保持在包含 0.05％ Tween-20 的蒸馏水中。在 7.5h 的光照后评估 A) 叶绿素和 B) 类胡 萝卜素的含量。FNR(1x) ： 杂合有 FNR 的转基因大麦。Fld(1x) ： 杂合有 Fld 的转基因大麦。 FNR/Fld(1x) ： 杂合有 FNR 和 Fld 转基因大麦。WT ： 野生型大麦。
     详述
     现在将进一步描述本发明。在以下段落中， 更详细地限定本发明的不同方面。这 样限定的各方面可以与任何其他方面结合， 除非清楚地显示与之相反。 尤其是， 任何显示为 优选的或有利的特征可以与显示为优选的或有利的任何其他特征结合。 除非另外说明， 本发明的实施将采用本领域技术内的植物学、 微生物学、 组织培 养、 分子生物学、 化学、 生物化学和重组 DNA 技术的常规技术。这样的技术在文献中得到全 面说明。
     如上所提及， 已知将细菌黄素氧还蛋白 (Fld) 结合到烟草叶绿体中可以补偿 Fd 水平的下降， 产生对氧化剂和广泛不良胁迫条件增加的耐性。本发明人已经惊人地发现将 来源于细菌的具有 Fld 还原活性的第二基因引入表达细菌 Fld 的植物中可以改善该植物 的胁迫耐性。不希望受理论限制， 本发明人相信这是由于将 Fld 维持在还原性条件中。如 在实施例中所示， 本发明人已经使用具有来源于蓝细菌并且编码叶绿体靶向的铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶 (FNR) 多肽的核酸序列的构建体并且在表达叶绿体靶向的 Fld 的植物中表 达所述细菌基因。
     因此， 在一方面中， 本发明涉及用于产生具有增强的胁迫耐性的植物的方法， 所述 方法包括在植物中表达编码 Fld 多肽的核酸序列和编码 FNR 多肽的核酸序列。根据本发明 的这些序列在植物中的表达可以通过如本文所述的不同方式实现。
     在第一个实施方案中， 所述方法包括在植物中如本文所述的表达指导 Fld 多肽和 FNR 共表达的核酸构建体。 因此， 根据如本文详述的不同实施方案的单个构建体可以在转化 有根据本发明不同方面的这种构建体的植物中指导两个基因的共表达。 所得的转基因植物 产生 Fld 和 FNR 多肽。在这种方法中， 用共表达构建体转化植物并且产生并选择表达两种 转基因的稳定的杂合植物。
     以下详细描述可以用于此方法的构建体。
     所述核酸构建体包括编码 Fld 多肽的核酸序列和编码 FNR 多肽的核酸序列。优选 地， Fld 和 FNR 序列来源于细菌。
     在一个实施方案中， 编码 Fld 多肽的核酸序列来源于蓝细菌而黄素氧还蛋白
     多肽是蓝细菌黄素氧还蛋白。备选地， 编码 Fld 多肽的核酸序列来源于异养菌。蓝细 菌 可 以 选 自 Crocosphaera、 蓝 菌 属 (Cyanobium)、 蓝 丝 菌 属 (Cyanothece)、 微囊蓝细菌 属 (Microcystis)、 聚 球 蓝 细 菌 属 (Synechococcus)、 集 胞 蓝 细 菌 属 (Synechocystis)、 Thermosynechococcus、 微 毛 蓝 细 菌 属 (Microchaetaceae)、 Nostocaceae、 鞘丝蓝细菌属 (Lyngbya)、 螺旋蓝细菌属 (Spirulina) 或束毛蓝细菌属 (Trichodesmium)。优选的属包括 聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、 Fremyella、 单歧蓝细菌属 (Tolypothrix)、 鱼腥蓝细菌属 (Anabaena)、 项圈蓝细菌属 (Anabaenopsis)、 蓝束丝蓝细菌属 (Aphanizomenon)、 管链蓝细 菌属 (Aulosira)、 Cylindrospermopsis、 筒孢蓝细菌属 (Cylindrospermum)、 Loefgrenia、 节球蓝细菌属 (Nodularia)、 念球蓝细菌属 (Nostoc) 或腔管蓝细菌属 (Wollea)。优选地， 所述属是鱼腥蓝细菌属而蓝细菌是鱼腥蓝细菌属 PCC7119(Fillat 等 1990)。
     在一个实施方案中， Fld 序列具有选自如在下面的表 1 中所示的序列的核酸序列。 在一个实施方案中， FNR 序列具有选自如在下面的表 2 中所示的序列的核酸序列。
     表1
    
    
    
    
    
    
    表 2.
     在另一个实施方案中， 编码蓝细菌 Fld 的核酸序列包括 SEQ ID NO.1。相应的氨 基酸序列显示在 SEQ ID NO.6 中。SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.6 的变体也在本发明的范围 内。变体保留所述蛋白质的生物学活性。
     在进一步的方面中， 本发明涉及用于产生具有加强的胁迫耐受的植物的方法和增 加植物胁迫耐性的方法， 所述方法包括在植物中表达编码 FNR 多肽的核酸序列。在根据本 发明的植物中表达这些序列可以通过如本文说明的不同的方式实现。在另一个实施方案 中， 所述 FNR 多肽是由 SEQ ID NO ： 8 或 9 代表的多肽， 或显示于表 2 的多肽或其蓝细菌同系 物。如在实施例中所示， 本发明人已经使用带有来源于蓝细菌并且编码叶绿体靶向的铁氧 还蛋白 NADP(H) 还原酶 (FNR) 多肽的核酸序列的构建体并且在植物中表达所述细菌基因。
     在一个实施方案中， 编码 FNR 多肽的核酸序列来源于蓝细菌并且所述 FNR 多肽 是蓝细菌 FNR。所述蓝细菌可以是包含藻胆蛋白体的细菌， 例如选自 Crocosphaera、 蓝菌 属 (Cyanobium)、 蓝丝菌属 (Cyanothece)、 微囊蓝细菌属 (Microcystis)、 聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、 集胞蓝细菌属 (Synechocystis)、 Thermosynechococcus、 微毛蓝细菌属 (Microchaetaceae)、 Nostocaceae、 鞘丝蓝细菌属 (Lyngbya)、 螺旋蓝细菌属 (Spirulina) 或 束 毛 蓝 细 菌 属 (Trichodesmium)。 优 选 的 属 包 括 聚 球 蓝 细 菌 属 (Synechococcus)、 Fremyella、 单 歧 蓝 细 菌 属 (Tolypothrix)、 鱼 腥 蓝 细 菌 属 (Anabaena)、 项圈蓝细菌 属 (Anabaenopsis)、 蓝 束 丝 蓝 细 菌 属 (Aphanizomenon)、 管 链 蓝 细 菌 属 (Aulosira)、 Cylindrospermopsis、 筒 孢 蓝 细 菌 属 (Cylindrospermum)、 Loefgrenia、 节球蓝细菌属 (Nodularia)、 念球蓝细菌属 (Nostoc) 或腔管蓝细菌属 (Wollea)。在一个实施方案中， 属 是鱼腥蓝细菌属并且蓝细菌是鱼腥蓝细菌属 PCC7119(Fillat 等 1990)。优选地， 所述序列 包括编码 C 端两个结构域区域的序列， 但是不包括编码藻胆蛋白体结合结构域的区域。例 如， 编码蓝细菌 FNR 的核酸序列包括 SEQ ID NO.3。相应的氨基酸序列显示在 SEQ ID NO.9 中。SEQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.9 的变体也在本发明的范围内。变体保留所述蛋白质的生 物学活性。
     所述构建体可以是异源基因构建体， 其中 Fld 和 FNR 编码核酸来源于不同的生物。 在另一个实施方案中， Fld 和 FNR 编码核酸两者都来源于相同的生物， 例如蓝细菌。在一个
    实施方案中， 两个核酸序列都来源于鱼腥蓝细菌。 例如， 所述构建体可以包含如在 SEQ ID 1 和 3 中所示的序列或其功能变体。在优选的实施方案中， 以上描述的构建体还包含至少两个叶绿体靶向的序列 ( 编 码转运肽 ) 以使每个多肽靶向到叶绿体。根据本发明， 将肽指引到叶绿体的任何序列是合 适的。实例显示在通过引用并入本文的 PCT/GB2002/004612 的表 2 中。例如， 靶向序列可 以来源于豌豆 FNR。
     因此， 在本发明优选的实施方案中， 所述构建体可以包含一个， 优选地如在 SEQ ID 2 和 4 中所示的序列两者或其功能变体。
     以上描述的构建体指导编码 Fld 和 FNR 多肽的核酸序列从单个的构建体共表达。 优选地， 所述构建体包含至少两个叶绿体靶向序列从而编码叶绿体靶向的多肽。作为实施 例， 图 10 显示根据本发明的融合构建体而图 11 图示该构建体如何制成 ( 也见实施例 )。
     以上描述的构建体也在本发明的范围内。 换言之， 本发明涉及这样的核酸构建体， 所述核酸构建体包含编码 Fld 多肽的核酸序列和编码 FNR 多肽的核酸序列两者。构建体和 优选的序列的多种实施方案陈述于上。
     在本文所述的任何构建体中， 编码 Fld 或 FNR 多肽的野生型序列是优选的， 但是 也可以使用突变体 / 变体序列或片段， 只要这样的序列编码与野生型序列具有同样生物学 活性的多肽。野生型序列的序列变化包括不引起编码的氨基酸序列变化的沉默碱基变化 和 / 或影响氨基酸序列但是不影响多肽生物学活性的碱基变化。变化可以是保守氨基酸置 换， 即当两个残基具有相似性质时置换一个氨基酸残基。因此， 由这样的序列编码的变体 / 突变体多肽保留野生型多肽的生物学活性并且给予胁迫耐性。例如， FNR 核苷酸序列在以 下位置的序列变化 ( 如在 SEQ ID NO.3 中所示 ) 不表现出影响所述多肽的活性 ： 535 ： A/G ； Asn(AAC)/Asp(GAC)， 703 ： A/G ； Met(ATG)/Val(GTG)， 763 ： C/G ； Gln(CAA)/Glu(GAA)。 因 此， 包含这些备选的核苷酸 / 氨基酸的 FNR 核酸序列 / 氨基酸序列的变体在本发明的实施方案 的范围内。
     根据本发明所用的核酸可以是双链或单链的， cDNA、 基因组 DNA 或 RNA。本文所述 的任何序列， 诸如 FNR 和 Fld 基因的序列可以是分离自植物、 细菌或人工合成序列的序列。 取决于设计， 核酸可以是全部或部分合成的。 技术人员将理解当根据本发明的核酸包括 RNA 时， 提及所示序列应当被看作是提及 RNA 的等同物， 其中 U 代替 T。
     此外， 本发明涉及 FNR 或 FLD 多肽的同系物以及它在本发明的方法、 构建体和载体 中的用途。 FNR 或 FLD 多肽的同系物与分别由 SEQ ID NO ： 8 至 10 或 SEQ ID NO ： 6 或 7 代表 的和 / 或分别由显示于表 2 和表 1 中的其直向同源物和旁系同源物代表的氨基酸具有， 以 增加的优选性， 以下整体序列同一性 ： 至少 25％、 26％、 27％、 28％、 29％、 30％、 31％、 32％、 33 ％、 34 ％、 35 ％、 36 ％、 37 ％、 38 ％、 39 ％、 40 ％、 41 ％、 42 ％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％。 使用全局比对算法诸如 GAP 程序中的 Needleman Wunsch 算法 (GCG Wisconsin Package， Accelrys)， 优选地使用缺省参数并且优选地使用成 熟蛋白质的序列 ( 即不考虑分泌信号或转运肽 ) 来确定整体序列同一性。
     根据本发明进一步的实施方案， 提供使用以下各项的方法， 和包含以下各项的构 建体、 宿主细胞、 植物和载体 ：a) 分离的核酸分子， 所述核酸分子选自 ： (i) 由 SEQ ID NO ： 1 或 2 或编码列表于表 1 的同系物的那些代表的核酸 ； (ii) 由 SEQ ID NO ： 1 或 2 或编码列表于表 1 的同系物的那些代表的核酸的互补物； (iii) 编码如由 SEQ ID NO ： 6 或 7 中任一个或列表于表 1 的那些代表的多肽的核 酸， 优选地作为遗传密码简并性的结果， 所述分离的核酸可以来源于如由 SEQ ID NO ： 6或 7( 中任一个 ) 或列表于表 1 的那些代表的多肽序列并且进一步优选地给予相对于对照植物 的加强的胁迫耐性 ；
     (iv) 与 SEQ ID NO ： 1 或 2 的核酸序列中任一个或编码列表于表 1 的同系物 ( 优 选地是 SEQ ID NO ： 1 或 2 的同系物 ) 的核酸序列具有， 以增加的优选性， 以下序列同一性 的核酸 ： 至少 30％、 31％、 32％、 33％、 34％、 35％、 36％、 37％、 38％、 39％、 40％、 41％、 42％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％， 并且所述核酸进一 步优选地给予相对于对照植物的加强的胁迫耐性 ；
    (v) 在严格的杂交条件下与 (i) 至 (iv) 的核酸分子杂交并优选地给予相对于对照 植物的加强的胁迫耐性的核酸分子 ；
     (vi) 编码 FLD 多肽的核酸， 所述 FLD 多肽与由 SEQ ID NO ： 6 或 7( 中任一个 ) 代表 的氨基酸序列以及表 1 中的任何其他氨基酸序列具有， 以增加的优选性， 至少 50％、 51％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 并且优选地给予相对于对照植物的增强的胁迫耐性 ；
     以及
     b) 分离的核酸分子， 所述核酸分子选择 ：
     (i) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸 ；
     (ii) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸的互补 物；
     (iii) 编码如由 SEQ ID NO ： 8 或 9 中任一个或列表于表 2 的那些代表的多肽的核 酸， 优选地作为遗传密码简并性的结果， 所述分离的核酸可以来源于如由 SEQ ID NO ： 8或 9( 中任一个 ) 或列表于表 2 的那些代表的多肽序列并且进一步优选地给予相对于对照植物 的加强的胁迫耐性 ；
     (iv) 与 SEQ ID NO ： 3 或 4 的核酸序列中任一个或编码列表于表 2 的同系物 ( 优 选地是 SEQ ID NO ： 3 或 4 的同系物 ) 的核酸序列具有， 以增加的优选性， 以下序列同一性 的核酸 ： 至少 30％、 31％、 32％、 33％、 34％、 35％、 36％、 37％、 38％、 39％、 40％、 41％、 42％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、
     88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％， 并且所述核酸进一 步优选地给予相对于对照植物的加强的胁迫耐性 ；
     (v) 在严格的杂交条件下与 (i) 至 (iv) 的核酸分子杂交并优选地给予相对于对照 植物的加强的胁迫耐性的核酸分子 ；
     (vi) 编码 FLD 多肽的核酸， 所述 FLD 多肽与由 SEQ ID NO ： 8 或 9( 中任一个 ) 代表 的氨基酸序列以及表 2 中的任何其他氨基酸序列具有， 以增加的优选性， 至少 50％、 51％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 并且优选地结合如本文所述的存在于植物中的 FLD 多肽 给予相对于对照植物的增强的胁迫耐性。
     在进一步的实施方案中， 提供使用以下各项的方法， 以及包含选自以下各项的分 离的核酸分子的构建体、 宿主细胞、 植物和载体 ：
     (i) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸 ；
     (ii) 由 SEQ ID NO ： 3 或 4 或编码列表于表 2 的同系物的那些代表的核酸的互补 物；
     (iii) 编码如由 SEQ ID NO ： 8 或 9 中任一个或列表于表 2 的那些代表的多肽的核 酸， 优选地作为遗传密码简并性的结果， 所述分离的核酸可以来源于如由 SEQ ID NO ： 8或 9( 中任一个 ) 或列表于表 2 的那些代表的多肽序列并且进一步优选地给予相对于对照植物 的加强的胁迫耐性 ；
     (iv) 与 SEQ ID NO ： 3 或 4 的核酸序列中任一个或编码列表于表 2 的同系物 ( 优 选地是 SEQ ID NO ： 3 或 4 的同系物 ) 的核酸序列具有， 以增加的优选性， 以下序列同一性 的核酸 ： 至少 30％、 31％、 32％、 33％、 34％、 35％、 36％、 37％、 38％、 39％、 40％、 41％、 42％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％， 并且所述核酸进一 步优选地给予相对于对照植物的加强的胁迫耐性 ；
     (v) 在严格的杂交条件下与 (i) 至 (iv) 的核酸分子杂交并优选地给予相对于对照 植物的加强的胁迫耐性的核酸分子 ；
     (vi) 编码 FLD 多肽的核酸， 所述 FLD 多肽与由 SEQ ID NO ： 8 或 9( 中任一个 ) 代表 的氨基酸序列以及表 2 中的任何其他氨基酸序列具有， 以增加的优选性， 至少 50％、 51％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 并且优选地结合如本文所述的存在于植物中的 FLD 多肽 给予相对于对照植物的增强的胁迫耐性。
     优选地， 在 SEQ ID NO ： 6 至 9 中任一个的整个多肽序列上对多肽序列进行确定序 列同一性的任何比较， 或者在 SEQ ID NO ： 1 至 4 中任一个的核酸序列的整个编码区上对核酸序列进行确定序列同一性的任何比较。例如， 为确定多肽序列与 SEQ ID NO ： 8 的多肽序 列的序列同一性， 在 SEQ ID NO ： 8 的整个长度上比对序列。
     对照植物是这样的植物， 其不包含本发明的重组 FLD 和 FNR 但是在所有其他方面 尽可能的相同并且被以与本发明的植物相同的方式处理。
     在一个实施方案中， FLD 或 FNR 多肽的功能变体是这样的多肽， 所述多肽分别与如 由 SEQ ID NO ： 6 或 7 的序列代表的 FLD， 或如由 SEQ ID NO ： 8 或 9 的序列代表的 FNR 具有 基本相同的生物学活性。在另一个实施方案中， 功能变体是本文所限定的多肽同系物或由 上文限定的核酸序列同系物编码的那些。
     本文所述的所有核酸构建体可以还包含调节序列。因此， 本文所述的核酸序列可 以在调节序列的操作控制下， 所述调节序列可以控制植物中的基因表达。调节序列可以 是驱动构建体中的基因表达的启动子序列。例如， 可以使用驱动过表达的启动子表达核 酸序列。根据本发明， 过表达是指以比由其内源启动子驱动的内源对应物 ( 植物 FNR 或 Fd) 的表达更高的水平表达转基因。例如， 可以使用强启动子， 诸如花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV35S)、 水稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子或产生加强的表达的任何启动子实施 过表达。备选地， 可以通过使用转录或翻译增强子或激活子来实现加强或增强的表达并且 可以将增强子结合到基因中从而进一步增强表达。 此外， 可以使用可诱导表达系统， 其中表 达被由环境胁迫条件诱导的启动子驱动 ( 例如胡椒病原体诱导的膜蛋白基因 CaPIMPI 或 包含脱水响应元件 (dehydration-responsive element)(DRE) 的启动子， 可由水胁迫、 高 盐浓度和 ABA 诱导的向日葵 HD-Zip 蛋白基因 Hahb4 的启动子 (Dezar 等， 2005)， 或化学可 诱导启动子 ( 诸如类固醇或乙醇可诱导的启动子系统 )。这样的启动子在本领域中例如在 Pastori(2002) 中得到表述。对于技术人员， 其他合适的启动子和可诱导系统也是已知的。
     如技术人员将了解的， 所述构建体也可以包含有助选择转化体的选择性标记， 诸 如给予对抗生素诸如卡那霉素的抗性的标记。
     如上详述， 在本发明方法的一个实施方案中， 使用单个构建体指导 Fld 和 FNr 编码 核酸序列的共表达。
     在另一个实施方案中， 用于产生具有加强的胁迫耐性的植物的方法包括 ：
     a) 在植物中表达核酸构建体， 所述构建体包含编码 Fld 多肽的序列，
     b) 表达核酸构建体， 所述构建体包含编码如本文所述的 FNR 多肽的序列，
     c) 使第一和第二植物杂交， 以及
     d) 产生表达 FNR 和 Fld 两者并且对于 FNR 和 Fld 两者都是纯合的植物。
     根据所述方法的第一步骤， 用包含编码黄素氧还蛋白多肽的序列的核酸构建体转 化第一植物。 这样的构建体已经在 Tognetti 等 (2006) 和 PCT/GB2002/004612 中得到表述， 其二者都通过引用并入本文。 优选的构建体包含源自蓝细菌， 优选地鱼腥蓝细菌， 最优选地 鱼腥蓝细菌 PCC7119 的序列。所述构建体优选地包含将蛋白靶向到叶绿体的转运肽。合适 的构建体也显示在图 8 中。在优选的实施方案中， 所述构建体还包含叶绿体靶向序列， 例如 源自豌豆的序列。所述转运肽将多肽靶向到叶绿体。在优选的实施方案中， 所述构建体包 含如在 SEQ ID NO.1 或 2 中显示的序列。获得表达 Fld 转基因的稳定转化体。
     在第二步中， 用包含编码如本文所述的 FNR 多肽的序列的核酸构建体转化第二植 物。产生表达 FNR 转基因的、 对转基因来说是纯合的稳定的转化体。以下详细描述包含编码 FNR 多肽的核酸序列并且可以用于本文方法的不同实施 方案的核酸构建体。编码 FNR 的核酸序列优选地来源于细菌并且最优选地来源于蓝细菌。
     所 述 蓝 细 菌 可 以 是 包 含 藻 胆 蛋 白 体 的 细 菌， 例 如 选 自 Crocosphaera、 蓝菌属 (Cyanobium)、 蓝 丝 菌 属 (Cyanothece)、 微 囊 蓝 细 菌 属 (Microcystis)、 聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、 集胞蓝细菌属 (Synechocystis)、 Thermosynechococcus、 微毛蓝细菌属 (Microchaetaceae)、 Nostocaceae、 鞘丝蓝细菌属 (Lyngbya)、 螺旋蓝细菌属 (Spirulina) 或 束 毛 蓝 细 菌 属 (Trichodesmium)。 优 选 的 属 包 括 聚 球 蓝 细 菌 属 (Synechococcus)、 Fremyella、 单 歧 蓝 细 菌 属 (Tolypothrix)、 鱼 腥 蓝 细 菌 属 (Anabaena)、 项圈蓝细菌 属 (Anabaenopsis)、 蓝 束 丝 蓝 细 菌 属 (Aphanizomenon)、 管 链 蓝 细 菌 属 (Aulosira)、 Cylindrospermopsis、 筒 孢 蓝 细 菌 属 (Cylindrospermum)、 Loefgrenia、 节球蓝细菌属 (Nodularia)、 念球蓝细菌属 (Nostoc) 或腔管蓝细菌属 (Wollea)。
     如在实施例中所示， 可以使用来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 FNR 基因。缺失掉第三 结构域并且将所得的嵌合基因引入烟草中。因此， 在一个实施方案中， 所述属是鱼腥蓝细 菌。优选地， 所述序列包括编码 C 端两个结构域区域的序列但是不包括编码藻胆蛋白体结 合结构域的区域。FNR 的全长序列显示在 SEQ ID NO.5 中。例如， 所述构建体可以包含 SEQ ID NO.3。所述构建体可以优选地包含编码将所述蛋白靶向到叶绿体的转运肽的序列。转 运肽是叶绿体靶向肽。这优选地源自植物 FNR， 例如豌豆。例如， 所述构建体可以包含 SEQ ID NO.4。作为实施例， 图 9 显示根据本发明的构建体。
     在第三步中， 第一种稳定的转化体与第二种稳定的转化体杂交以产生表达 FNR 和 Fld 两者的稳定的纯合后代植物。如技术人员将了解的， 将 Fld 植物与 FNR 植物杂交将产 生对每个基因是半合子的 “杂种” 。所得的植物需要自交然后选择后代以发现双纯合体 - 即 对于两个转基因都是纯合的植物。技术人员也将了解多倍体需要多于一步 “自交” 。因此， 产生表达 FNR 和 Fld 两者并且对于 FNR 和 Fld 两者都是纯合的植物的步骤包括产生通过步 骤 d) 获得的植物的后代并且选择对于两个转基因都是纯合的植物。如在实施例中所示， 在 使 FNR 植物与 Fld 表达同胞杂交后， 双纯合植物得到选择并显示出相对于单纯合 Fld 植物 的对引起氧化胁迫的氧化还原循环化合物甲基紫精 (MV) 更好的耐性。
     在另一个实施方案中， 用于产生具有加强的胁迫耐性的植物的方法包括 ：
     a) 在植物中表达核酸构建体， 所述构建体包含编码植物中的黄素氧还蛋白多肽或 FNR 多肽的序列，
     b) 用包含分别编码黄素氧还蛋白多肽或 FNR 多肽的序列的核酸构建体转化所述 植物， 以产生表达 FNR 和 Fld 的稳定的纯合植物。
     根据此实施方案， 产生单转化体并且用包含第二基因的核酸构建体再次转化该单 转化体以产生表达 FNR 和 Fld 的稳定的纯合植物。然后选择稳定的纯合植物。
     技术人员将了解， 对不同构建体使用选择性标记基因将帮助促进选择双突变体。
     能够用于此实施方案的构建体也在以上得到描述。
     在另一方面中， 本发明涉及这样的核酸构建体， 所述核酸构建体包含编码蓝细菌 FNR 的核酸序列和叶绿体靶向序列。这样的构建体和不同的实施方案在以上得到描述。
     在另一方面中， 本发明涉及这样的载体， 所述载体包含本文所述的构建体。 所述载 体优选地适于转化植物并且可以使用的载体对技术人员是已知的。 本发明还涉及包含本文所述的构建体或载体的植物宿主细胞。
     本发明还包括这样的宿主细胞， 所述宿主细胞包含编码黄素氧还蛋白多肽的重组 核酸和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的重组核酸序列， 所述两个核酸序列都如上文 所限定。本发明的宿主细胞可以是选自由以下各项组成的组的任何细胞 ： 细菌细胞， 诸如 大肠杆菌或土壤杆菌属 (Agrobacterium) 物种细胞、 酵母细胞、 真菌细胞、 海藻或蓝细菌细 胞， 或植物细胞。 在进一步的实施方案中， 本发明涉及包含在转基因植物细胞中的本发明的 构建体。
     在另一个实施方案中， 本发明的植物细胞是非繁殖细胞， 例如该细胞不能用于总 体上使用标准细胞培养技术从此细胞再生整株植物， 标准细胞培养技术指细胞培养方法但 是排除体外细胞核、 细胞器或染色体转移方法。
     对于本发明， “转基因的” 、 “转基因” 或 “重组” 意味着涉及， 例如， 核酸序列、 表达 盒、 基因构建体或包含核酸序列的载体或转化有根据本发明的核酸序列、 表达盒或载体的 生物， 所有那些构建由这样的重组方法产生， 其中
     (a) 编码在本发明的方法中有用的蛋白的核酸序列， 或
     (b) 与根据本发明的核酸序列可操作相连的遗传控制序列， 例如启动子， 或
     (c)a) 和 b)
     未定位于其天然的遗传环境中或者已经通过重组方法修饰， 修饰可能采用以下形 式， 例如， 置换、 添加、 缺失、 倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然的遗传环境被理解为 是指原始植物中天然的基因组或染色体位置或基因组文库中的存在。在基因组文库的情 况中， 核酸序列的天然遗传环境得到优选地得到至少部分保留。所述环境在核酸序列两侧 的至少一侧上并且具有至少 50bp， 优选地至少 500bp， 尤其优选地至少 1000bp， 最优选地至 少 5000bp 的序列长度。天然存在的表达盒 - 例如核酸序列的天然启动子与相应的编码在 本发明的方法中有用的多肽的核酸序列的天然存在的组合， 如上所述 - 当此表达盒被非天 然、 合成的 (“人工的” ) 方法诸如例如诱变处理修饰时， 成为转基因表达盒。合适的方法在 例如 US 5,565,350 或 WO 00/15815 中得到描述。
     因此对于本发明来说， 转基因植物被理解为是指， 如上， 用于本发明的方法的核酸 不在其在所述植物基因组中的天然位置上， 所述核酸可能同源或异源表达。然而， 如提及 的， 转基因也指， 虽然根据本发明不同实施方案的核酸在其在植物基因组中的天然位置上， 但相对于天然序列所述序列已经被修饰了， 和 / 或天然序列的调节序列已经被修饰了。优 选地将转基因理解为是指在基因组中的非天然位置表达根据本发明的核酸， 即发生核酸的 同源或优选地异源表达。优选的转基因植物在本文中得到提及。
     用于增加植物的胁迫响应或耐性的方法也在本发明的范围内， 所述方法包括在植 物中表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的核 酸序列。该方法使用本文所述的不同构建体和步骤从而产生胁迫耐受植物。相比于野生型 / 对照植物以及相比于只表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸序列却不表达编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的核酸序列的植物， 胁迫响应得到增加。胁迫响应可以增加至少 2 至 10 倍或更多。
     在另一方面中， 本发明涉及通过本文所述方法获得的或可以通过本文所述方法获 得的转基因植物。在另一方面中， 本发明涉及表达本文所述构建体的转基因植物。本发明还涉及具有增强的胁迫耐性的转基因植物， 所述转基因植物表达编码黄素氧还蛋白多肽的 核酸和编码铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽的核酸。
     根据本发明的植物表达编码 FNR 多肽的核酸序列， 例如包括如在 SEQ ID NO.8 或 9 中所示的序列或其功能变体， 并且还表达编码 Fld 多肽的核酸序列， 例如包括在 SEQ ID NO.5、 6 或 7 中所示的序列或其功能变体。
     本发明还延伸至植物的可收获部分诸如但不限于种子、 叶、 果实、 花、 茎、 根、 根茎、 块茎和球根， 所述可收获部分包含编码 FNR 多肽的重组核酸， 优选地也包含编码黄素氧还 蛋白多肽的重组核酸。 此外本发明涉及来源于优选地直接来源于这样的植物的可收获部分 的产品， 诸如干的团块或粉末、 油、 脂肪和脂肪酸、 淀粉或蛋白质。
     在一个实施方案中， 本发明的种子包含本发明的构建体或本发明的载体。在进一 步的实施方案中， 本发明的种子对于本发明的构建体或载体是纯育的。在另一个实施方案 中所述种子包含编码 FNR 多肽的重组核酸并且还包含编码黄素氧还蛋白多肽的重组核酸， 两者都如本文所公开的， 并且所述种子显示增加的胁迫耐性。
     本发明也包括用于产生产品的方法， 所述方法包括 a) 种植本发明的植物和 b) 自 或由本发明的植物或部分包括这些植物的种子产生所述产品。在进一步的实施方案中， 所 述方法包括步骤 a) 种植本发明的植物， b) 从所述植物移去如上所定义的可收获部分以及 c) 自或由本发明的可收获部分产生所述产品。 可以在植物已经生长的地点产生产品， 或者所述植物或其部分可以从该植物已经 生长的地点移走以产生产品。典型地， 在植物长成后， 将所需的可收获部分从所述植物移 走， 如果在重复循环中是可行的， 并且从所述植物的可收获部分制成产品。 每次实施本发明 的方法时， 可以只实施一次种植植物的步骤， 同时允许重复次数的产生产品步骤， 例如通过 重复地移走本发明植物的可收获部分并且如果需要进一步处理这些部分以得到产品。 也有 可能重复种植本发明植物的步骤并储存植物或可收获部分直到之后对累积的植物或植物 部分进行一次所述产品的生产。 可以在时间上有重叠地甚至很大程度上同时地或连续地进 行种植植物和产生所述产品的步骤。通常所述植物在产品被生产前的一段时间长成。
     在一个实施方案中， 通过本发明的方法产生的产品是植物产品， 诸如但不限于， 食 品、 饲料、 食物添加物、 饲料添加物、 纤维、 化妆品或药物。食品被认为是用于营养或补充营 养的组合物。动物饲料和动物饲料添加物， 尤其地， 被认为是食品。在另一个实施方案中， 将本发明的生产方法用于制造农业产品诸如， 但不限于， 植物提取物、 蛋白质、 氨基酸、 碳水 化合物、 脂肪、 油、 聚合物、 维生素等。 植物产品可能在很大程度上由一种或多种农业产品组 成。
     根据本发明不同方面的植物可以是单子叶或双子叶植物。双子叶植物可以选 自这样的科， 其 包括但不限于 ： 菊科 (Asteraceae)、 十字花科 (Brassicaceae)( 例如欧 洲 油 菜 (Brassica napus))、 藜 科 (Chenopodiaceae)、 葫 芦 科 (Cucurbitaceae)、 豆科 (Leguminosae)( 苏木科 (Caesalpiniaceae)、 Aesalpiniaceae、 含羞草科 (Mimosaceae)、 蝶 形花科 (Papilionaceae) 或豆科 (Fabaceae))、 锦葵科 (Malvaceae)、 蔷薇科 (Rosaceae) 或 Solanaceae。例如， 所述植物可以选自莴苣、 向日葵、 拟南芥、 椰菜、 菠菜、 西瓜、 南瓜、 甘蓝、 番茄、 马铃薯、 辣椒、 烟草、 棉花、 油菜 (oilseed rape)、 秋葵、 苹果、 玫瑰、 草莓、 苜蓿、 扁豆、 大豆、 蚕豆 (field(fava)bean)、 豌豆、 小扁豆、 花生、 鹰嘴豆、 杏树、 梨树、 桃树、 葡萄藤或柑
     橘属物种。在一个实施方案中， 所述植物是烟草。在一个实施方案中， 所述植物是大麦。在 一个实施方案中， 所述植物是大豆。在一个实施方案中， 所述植物是棉花。在一个实施方案 中， 所述植物是玉米 ( 玉蜀黍 )。在一个实施方案中， 所述植物是水稻。在一个实施方案中， 所述植物是油菜包括 canola。 在一个实施方案中， 所述植物是小麦。 在一个实施方案中， 所 述植物是甘蔗。在一个实施方案中， 所述植物是糖甜菜。
     同样包括的是生物燃料和生物能作物诸如油菜 (rape)/canola、 亚麻子、 羽扇豆和 柳树、 杨树、 杂交杨树、 柳枝稷、 芒属或裸子植物， 诸如火炬松。同样包括的是这样的作物， 所述作物用于青贮 ( 玉米 )、 牧草或饲料 ( 草、 三叶草、 红豆草 (sanfoin)、 苜蓿 )、 纤维 ( 例 如棉花、 亚麻 )、 建材 ( 例如松树、 橡树 )、 纸浆 ( 例如杨树 )、 用于化学工业的原料 (feeder stocks)( 例如高芥酸油菜、 亚麻子 ) 以及宜人 (amenity) 用途 ( 例如用于高尔夫球场的 草皮 )、 公共及私人花园的装饰物 ( 例如金鱼草、 矮牵牛花、 玫瑰、 天竺葵、 烟草属物种 ) 和 家用植物和切花 ( 非洲紫罗兰、 秋海棠、 菊花、 天竺葵、 锦紫苏属 (Coleus) 吊兰、 千年蕉 (Dracaena)、 橡胶树 )。
     在另一个实施方案中本发明涉及树木， 诸如杨树或桉树。
     单 子 叶 植 物 可 以，例 如，选 自 以 下 科 ： 棕 榈 科 (Arecaceae)、石 蒜 科 (Amaryllidaceae) 或禾本科 (Poaceae)。例如， 所述植物可以是谷类作物， 诸如小麦、 水 稻、 大麦、 玉米、 燕麦、 高粱、 黑麦、 洋葱、 韭菜、 小米、 荞麦、 草皮、 多花黑麦草 (Italian rye grass)、 柳枝稷、 芒、 甘蔗或羊茅属物种。
     优选地， 所述植物是作物植物。作物植物是指用于人或动物消费或使用或其他非 食物 / 饲料用途的商品化规模种植的任何植物。作物植物的非限制实例包括大豆、 甜菜、 糖甜菜、 向日葵、 油菜 ( 包括 canola、 菊苣、 胡萝卜、 木薯、 苜蓿、 车轴草、 油菜子、 亚麻子、 棉 花、 番茄、 马铃薯、 烟草、 杨树、 桉树、 松树、 甘蔗和谷类诸如水稻、 玉米、 小麦、 大麦、 小米、 黑 麦、 黑小麦、 高粱、 双粒小麦、 斯佩耳特小麦 (spelt)、 secale、 单粒小麦、 埃塞俄比亚画眉草 (teff)、 买罗高梁 (milo) 和燕麦。
     优选的植物是烟草、 玉米、 小麦、 水稻、 油菜、 高粱、 大豆、 马铃薯、 番茄、 大麦、 豌豆、 扁豆、 棉花、 蚕豆、 莴苣、 椰菜或其他蔬菜型油菜 (vegetable brassicas) 或杨树。在另一个 实施方案中， 本发明的植物和在本发明的方法中使用的植物选自由以下各项组成的组 ： 玉 米、 水稻、 小麦、 大豆、 棉花、 油菜 ( 包括 canola)、 甘蔗、 糖甜菜和苜蓿。
     用于植物转化的方法， 例如通过土壤杆菌介导的转化或粒子轰击， 以及随后的用 于再生和选择经转化的植物的技术在本领域中是广为人知的。 也在本发明范围内的是经由 生物弹道 (biobalistics) 的叶绿体转化。
     根据本发明的不同方面， 植物胁迫响应得到增强、 加强或改善。 这被理解为是指相 比于在野生型植物中所发现水平的增强。此外， 如在实施例中所示， 相比于只表达编码 Fld 的核序列的转基因植物的胁迫响应， 所述水平也得到增强。技术人员将理解可以测量这种 胁迫响应并且所述增强可以是 2 至 10 倍。有两种类型的胁迫 ： 生物胁迫由其他生物诸如病 原体施加， 而非生物胁迫起因于过度或不足的物理或化学环境， 诸如干旱、 盐度、 高或低的 温度或高光。
     化学活性组分诸如 ROS/RNS 的产生和清除， 对于广泛生物和非生物胁迫和植物中 的生理反应是重要的。 氧化胁迫可以由以下多种环境和生物学因素诱发诸如氧过多、 光、 干旱、 高盐度、 寒冷、 金属离子、 污染物、 异生素、 毒素、 缺氧后的再氧化、 实验操作、 病原体感染 以及植物器官的老化。
     因此， 本发明尤其涉及用于增强或加强植物对氧化胁迫的响应的方法， 例如由极 端温度、 干旱、 紫外光、 辐射、 高盐度、 寒冷、 金属离子、 污染物、 毒素、 或由细菌、 病毒或真菌 导致的病原体感染或其组合引起的氧化胁迫。
     在另一个实施方案中， 本发明的方法和本发明的植物涉及加强的对选自由以下各 项组成的组的胁迫的耐性 ： 干旱、 15℃以下和冰点以上的低温、 冻结温度、 盐胁迫、 营养物限 制、 重金属胁迫、 病原体感染及其组合。
     在另一方面中， 本发明涉及用于在对胁迫的响应中减少植物中 ROS 量的方法， 所 述方法包括在植物中表达黄素氧还蛋白多肽和铁氧还蛋白 NADP(H) 还原酶多肽。根据此方 法， 可以使用如本文所述指导 Fld 和 FNR 两者表达的构建体。备选地， 可以使表达 Fld 的植 物与表达 FNR 的植物杂交从而获得两种基因的共表达。
     在本发明的另外一个方面中， 要求这样的方法的权利， 所述方法用于在胁迫条件 下相比于对照植物增加植物或植物部分例如可收获部分、 花或种子的叶绿素和 / 或类胡萝 卜素水平。
     根据本发明的实施方案， Fld 和 FNR 的相对表达水平可以随直接取决于 Fld 剂量 的效果变化。在优选的实施方案中， Fld 的表达水平与铁氧还蛋白的表达水平至少相同。 实施例 本发明将在以下非限制性实施例中得到描述。
     方法
     载体构建
     构建用于表达 FNR 的 Ti 载体以及在烟草中共表达 Fld 和 FNR
     在蓝细菌中， FNR 是膜内蛋白， 其由三个结构域组成 ： FAD 结合结构域、 NADP(H) 结 合结构域以及与藻胆蛋白体相互作用的整合结构域 (Fillat 等， 1993)， 而前两个结构域可 以通过蛋白水解或诱变与所述内部结构域分离， 产生可溶的两个结构域的蛋白， 所述蛋白 保留全面的 NADPH- 铁氧还蛋白 (Fld) 活性 (Martínez-Júlvez 等， 1996)。这种工程应当保 证蓝细菌 FNR 在转基因植物的叶绿体基质中将保持可溶并且只展示所需的活性。我们因此 处理来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 FNR 基因。使第三个结构域缺失并将所得的嵌合基因引入 烟草。 在使 FNR 植物与表达 Fld 的同胞杂交后， 双纯合植物得到选择并且相比于单纯合 Fld 植物显示对甲基紫精 (MV) 毒性的更大的耐性。
     通过 PCR 扩增克隆到质粒 pTrc99a 中的整个基因 (Fillat 等， 1990)， 使用分别与 位置 1 至 19 和 906 至 925 互补的引物 ( 引物 1)5’ -CCGAGCTCACACCATGACTCAAGCGAA-3’ (S EQ ID NO 11) 和 ( 引物 2)5’ -ACGTCGACCAACTTAGTATGTTTCTAC-3’ (SEQ ID NO 12)， 获得 编码来自鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 FNR( 不具有藻胆蛋白体结合结构域 ) 的区域的 DNA 片 段。为方便进一步操作， 将 SacI 识别位点 (GAGCTC) 引入到引物 1 的 5′端而将 SalI 位点 (GTCGAC) 引入到引物 2 的 3′端。PCR 条件是 ： 94℃ 60s， 54℃ 60s 以及 72℃ 90s， 30 个循 环， 在包含 10mM Tris-HCl pH 8.4、 5mM KCl、 1.5mM MgCl2、 0.2mM 每种 dNTP 以及 2.5 单位 Taq DNA 聚合酶的介质中使用 1ng 模板 DNA 和 50pmol 每个引物。在完成 30 个循环后， 使反
     应在 72℃温育 10min。用 SacI 和 SalI 消化纯化的具有预测长度 (940bp) 的 PCR 片段。将 所述片段克隆到在 BamHI 和 SalI 限制性位点之间编码整个豌豆 FNR 前体的 pUC9 衍生重组 质粒 (Ceccarelli 等， 1991) 的相容位点， 并且编码豌豆 FNR 的成熟区域的 DNA 片段已经通 过用 SacI 和 SalI 消化从所述质粒移去。这产生源自豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细 菌 FNR 的成熟区域的框内融合。
     在两条链上确定嵌合基因的序列， 并且通过使用 BamHI 和 SalI 消化将其从相应 的质粒切除。然后将所述 1120-bp 片段克隆到 pDH51(Pietrzcak 等， 1986) 的 CaMV 35S 启 动子与聚腺苷酸化区域之间。整个盒进一步被作为 EcoRI 片段分离并且插入到双元载体 pCAMBIA 2200(Hajdukiewiez 等， 1994) 的 EcoRI 位点。最后通过电穿孔使所述构建体进入 根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌株 GV3101 pMP 90(Ausubel 等， 1987)。
     构建用于表达 FNR 和 Fld 的 Ti 载体， 以及在大麦中共表达 Fld 和 FNR
     开发出用于根据 Harwood 等 (2009) 的用 FNR 和 Fld 共转化大麦植物的实验步骤的 两个独立载体。所有涉及的分子生物学重组 DNA 技术对技术人员是已知的并且在文献中得 到全面说明。通过 PCR 扩增之前所述的包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细菌 PCC7119 FNR 的 C 端两个结构域的编码区域 (SEQ ID NO.4) 的框内融合的嵌合基因的序列 以产生适于克隆到 pBRACT 系列的双元载体 (Harwood et al， 2009) 中的产物， 所述 pBRACT 系列的双元载体包含 hpt 基因， 所述 hpt 基因在位于左侧边界 (LB) 的 35S 启动子的控制下 给予潮霉素抗性。所述嵌合克隆的基因在位于右侧边界 (RB) 的玉米泛素启动子的控制下。 使包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细菌 PCC7119 的 Fld 编码区域 (SEQ ID NO.2， Tognetti 等， 2006 ； PCT/GB2002/004612) 的框内融合的嵌合构建体， 经历与以上所述 相同的实验步骤。
     所得的包含在所需调节序列的控制下的目的基因的双元载体可以直接用于植物 转化步骤， 例如土壤杆菌介导的植物组织转化或粒子轰击技术。
     构建用于在植物中共表达 Fld 和 FNR 的双元载体
     基于 MultiSite Gateway 克隆系统 (Invitrogen， http://www.invitrogen.com) (Karimi 等 2007 ； Dafny-Yelin 和 Tzfira， 2007)， 开发这样的单构建体， 所述单构建体可以 指导 FNR 和 Fld 多肽在转化有这样的构建体的植物中的共表达。图 11 描述了设计和构建 以上提及的双载体的多步骤过程。遵从由制造商提供的使用说明、 实验方案和指导进行所 述过程。所有涉及的分子生物学重组 DNA 技术对技术人员是已知的并且在文献中得到全面 说明。
     通过 PCR 扩增之前所述的包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细菌 PCC7119 FNR 的 C 端两个结构域的编码区域 (SEQ ID NO.4) 的框内融合的嵌合基因的序列 以产生适于用作在与适当的供体载体的 Gateway BP 重组反应中的底物的产物。设计两个 基因特异性的引物， 正向的和反向的， 从而分别将 attB1 和 attB4 序列结合到其 5′端， 所 述 attB1 和 attB4 序列是与 pDONR221 P1-P4 供体载体中的 attP1 和 attP4 位点的特异性 的 BP 重组反应所需要的。attB1-FNR-attB4 PCR 产物与 pDONR221 P1-P4 载体间的位点特 异性 BP 重组反应产生 pENTR221 L1-L4-FNR 进入克隆， 其中 FNR 构建体的两侧是用于 LR 重 组的 attL1 和 attL4 位点特异性序列。使包含来源于豌豆 FNR 的叶绿体转运肽与鱼腥蓝细 菌 PCC7119 的 Fld 编码区域 (SEQ ID NO.2， Tognetti 等， 2006 ； PCT/GB2002/004612) 的框内融合的嵌合构建体， 经历与以上所述相似的实验步骤， 除了引物结合 attB2 和 attB3 重组特 异性序列而不是之前构建体的 attB1 和 attB4 位点。所得的 attB2-Fld-attB3 PCR 产物与 pDONR221 P2-P3 供体载体间的 BP 重组反应产生 pENTR221 L2-L3-Fld 进入克隆， 其中 Fld 构建体的两侧是 attL2 和 attL3 LR 重组特异性位点。
     将 pENTR221 L1-L4-FNR 和 pENTR221 L2-L3-Fld 进 入 克 隆 用 作 与 任 何 多 种 特 别设计的 pDEST-BRACT 目的载体 (pBRACT) 的 MultiSite Gateway LR 重组反应的底物。 pDEST-BRACT 载体是 MultiSite Gateway 目的载体， 其被改造从而包含两个 Gateway 盒， 所述两个 Gateway 盒用于在预定方向通过单 LR 位点特异性重组反应独立克隆侧翼有相容 attL 序列的两个不同构建体。它们是双元 T-DNA 载体， 其除了左侧和右侧 T-DNA 边界序 列 (LB 和 RB， 分别 ) 外， 还包含完整的植物选择标记表达盒和植物调节区域 ( 启动子、 终 止子、 增强子 )， 其位于每个 Gateway 盒的两侧从而指导被克隆序列的表达。开发的多种 pDEST-BRACT 目的载体的启动子和终止子和 / 或其包含的 attL 序列的同一性不同。 它们可 以被定做成用于在单子叶或双子叶植物中在组成型或诱导型启动子的控制下最优表达所 述转基因。
     所得的表达克隆是包含在所需调节序列控制下的目的基因的双元载体， 其可以直 接用于植物转化步骤， 例如土壤杆菌介导的植物组织转化或粒子轰击技术。
     在烟草中表达 Fld 和 FNR
     植物转化
     使 用 常 规 技 术 (Gallois 和 Marinho， 1995) 实 施 烟 草 (Nicotiana tabacum cv Petit Havana) 叶盘转化并且进一步分析卡那霉素抗性转化体的后代。使表达如 SDS-PAGE 和免疫印迹评估的高水平蓝细菌 FNR 的初级转化体自花授粉， 并且使用纯合后代进行所有 随后的实验。
     同时表达来自鱼腥蓝细菌的 Fld 和 FNR 的转基因植物的产生
     通过异花授粉进行双表达植物的制备。使用在此项目中产生的、 表达来自鱼腥蓝 细菌的 FNR(pFNR) 的转基因植物， 和在叶绿体中高水平表达鱼腥蓝细菌 Fld 的稳定的纯合 系 (pFld， Tognetti 等， 2006) 作为亲本。使表达 pFNR 和 pFld 的初级双杂合转化体自花授 粉并且通过 SDS-PAGE 和免疫印迹选择双纯合植物。
     胁迫处理
     使对照和转基因植物的种子在补充有 3 ％ (w/v) 蔗糖以及在转化体的情况中 100μg ml-1 卡那霉素的 Murashige-Skoog(MS) 琼脂上发芽。 在 4 周 25℃和 100μmol quanta -2 -1 m s (16h 光照 /8h 黑暗 ) 后， 将幼苗放置在土壤上。从生长在土壤上的两月龄烟草植物嫩 的完全展开的叶子打孔出 13mm 直径的叶盘。给叶盘称重并使其顶侧向上地、 单独地漂浮在 24 孔板中的包含所示量的 MV 的 1ml 无菌蒸馏水上， 并于 25℃在黑暗中温育 12h 以允许 MV -2 -1 扩散到叶子中。然后以 700μmol quanta m s 的白光源照射孔。对照在同样条件下保持 在水中。使用 Horiba 模式 B-173 电导计， 在 MV 胁迫期间叶盘的电解质渗漏被测量为介质 的电导率。
     将在土壤中生长了 3 或 4 周的幼苗转移至包含 Hoagland 溶液 (Hoagland 和 Arnon， 1950) 的水培系统中。在 3 天后， 给 Hoagland 溶液补充以 100μMMV。
     分析步骤色素测定 使用标准方法 (Lichtenthaler， 1987) 测定叶子和质体中的叶绿素和类胡萝卜素含量。 检测脂质过氧化物
     使用 FOX 测定量化在植物组织提取物中脂质过氧化物 (LOOHs) 的存在 (DeLong， 等， 2002)。 使用 300μL 包含 0.01％丁羟甲苯的 80 ∶ 20(v/v) 乙醇∶水萃取叶组织 (4cm2)。 将脂质分配到有机相， 涡旋振荡并以 3,000g 离心。 使 50μl 所述植物提取物与 50μl 10mM tris- 苯膦 (TPP， LOOH 还原剂 ) 结合于甲醇和 500U 牛肝过氧化氢酶 (Sigma) 中。搅拌所 述混合物并温育 30min 以使任何存在的 -OOH 被 TPP(+TPP) 完全还原。相同地处理不添加 TPP 的样品 (-TPP)， 除了用甲醇代替 TPP 等分试样以外。在 30min TPP 温育后， 将 900μl 由 90％甲醇 (v/v)、 25mM H2SO4、 4mM 丁基化羟基甲苯 (BHT)、 25μM 硫酸亚铁铵六水合物和 100μM 二甲酚橙组成的 FOX 试剂添加到每个样品， 并在添加 10min 后在 Ultrospec 1100 分 光光度计 (Amersham， Biosciences) 中记录 560nm 处的吸光度。含有和不含有 TPP 的样品 间的吸光度差异显示 LOOH 的存在 ； 然后使用跨越 0-20μM H2O2 范围的标准曲线将 -OOH 值 表达为微摩尔 H2O2 当量。
    酶活性测定
     为鉴定展示 NADPH 依赖的心肌黄酶活性的酶， 通过非变性 PAGE 在 12％聚丙烯酰 胺凝胶上分离相当于 15μg 可溶蛋白的叶片提取物。在电泳后， 通过在 50mM Tris-HCl、 pH + -1 -1 8.5、 0.3mM NADP 、 3mM Glc-6-P、 1 单位 nl Glc-6-P 脱氢酶和 1mg ml 氮蓝四唑中温育给
    所述凝胶染色直到出现紫色的甲
    条带。在非变性凝胶中使用 Mittler 和 Zilinskas(1993) 的方法确定抗坏血酸过氧化物 酶 (APX) 的酶活性。
     结果
     在转基因烟草叶绿体中表达可溶的鱼腥蓝细菌 FNR
     为了在烟草质体中表达可溶的蓝细菌 FNR， 制备这样的嵌合基因， 其中 C 端两个结 构域的鱼腥蓝细菌 FNR 编码区域 (Fillat 等， 1990) 在氨基端被框内融合到编码豌豆 FNR 的叶绿体转运肽的 DNA 序列 ( 详情见方法部分 )。将所述构建体克隆到在组成型 CaMV 35S 基因启动子控制下的土壤杆菌双元载体中， 并且通过土壤杆菌介导的叶盘转化递送到烟草 细胞中。卡那霉素抗性植物从组织培养重新获得并且通过免疫印迹评估 FNR 累积。通过 SDS-PAGE 分离提取自取样的初级转化体 (pFNR) 或提取自野生型烟草样品的蛋白， 并且用 考马斯亮蓝染色， 或印迹到硝酸纤维素膜上并使用标准技术用针对鱼腥蓝细菌 FNR 的抗血 清检测 ( 图 2)。
     在获得自若干转化体的叶子提取物中可以检测到不同水平的成熟尺寸的活性条 带， 暗示质体输入并处理表达的黄素蛋白。当在转基因植物叶绿体的基质中检测到 FNR 的 同时， 在类囊体膜级分中没有免疫反应性 ( 图 3A)。 叶绿体基质级分的心肌黄酶活性显示在 转基因烟草植物中所述酶是有活性的 ( 图 3B)。
     在叶绿体中表达蓝细菌 FNR 的植物在表型上相对野生型同胞看起来是正常的， 并 且展示对 MV 毒性的野生型水平的耐性 ( 数据未示 )。
     在转基因烟草叶绿体中表达鱼腥蓝细菌 FNR 和 Fld为获得双表达植物， 在表达 FNR 或 FLD 的纯合植物间进行异花授粉。所得的后代 如预期的只包括双杂合样品。使其自花授粉并且通过 Western 印迹法选择双纯合 (2x) 植 物 ( 图 4)。
     对甲基紫精的耐性
     进行实验以评估 FNR/Fld 表达叶盘对 MV 的耐性， 如在方法部分所述。在对照叶 盘中视觉上观察到叶组织漂白， 反映出增加的叶绿素降解 ( 图 5A)。通过测量电解质渗漏 评估归因于 MV 暴露的膜损伤。电导值对在相同条件下发生在水中的离子渗漏进行修正 并且被表达为总离子含量 ( 在 MV 处理的结尾在高压灭菌叶盘后获得的最大值 ) 的百分 比。将叶绿素含量表达为在没有 MV 的相同条件下温育的叶盘的总叶绿素的分数。膜变质 (deterioration) 和色素完整性两者在双纯合 FNR/Fld 植物中相比在单纯合 Fld 表达同胞 中都得到显著地更好的保护 ( 图 5B， C)。
     为评估整株植物对 MV 的耐性， 在如在方法中所述的水培系统中测定它们。相比于 只表达 Fld， FNR 和 Fld 的同时表达提供更多的对 MV 诱发的损伤的保护 ( 图 6)。
     为评估 ROS 增长， 通过 FOX 测定测量脂质过氧化 (Delong 等， 2002)。如在方法中 所述用 10μM MV 处理野生型和转基因烟草植物的叶盘。脂质氢过氧化物 (LOOH) 的水平以 μM H2O2cm-2 表示， 并且在双纯合杂交 X416 中比在纯合亲本 pFld 中显著地更低。两者都比 野生型植物更具有耐性 ( 图 7A)。若干蛋白也是 ROS 优选的目标。叶绿体抗坏血酸过氧化 物酶 (APX) 是其中最敏感的之一。将野生型植物暴露于 20μM MV 在仅仅 90min 温育后导 致此酶活性 70-80％的下降。Fld 的表达提供部分保护 (40-50％的残余活性 )。FNR 在 Fld 表达植物中的同时存在导致 APX 活性几乎定量的保持 ( 图 7B)。
     Fld 和 FNR 在大麦中的表达和共表达
     植物转化。产生同时表达来自鱼腥蓝细菌的 Fld 和 FNR 的转基因大麦植物。
     分别使用包含 Fld 和 FNR 基因的 pBract214 载体转化大麦， 如上所述。 将所述载体 独立地转化到根癌土壤杆菌中并且用两种土壤杆菌株系的混合物转化春大麦变种 Golden Promise。基于具有根癌土壤杆菌的未成熟胚芽的感染进行大麦转化， 随后在包含抗生素 潮霉素的培养基上选择转基因组织。该方法导致多产的独立转基因株系的产生 (Harwoodd 等， 2009) 而潮霉素抗性的转化体的后代得到进一步的分析。 将表达蓝细菌 FNR 和 Fld 的初 级杂合转化体， 如用 SDS-PAGE 和免疫印迹所评估的， 用于进一步实验。在对本文所述的实 验方案的修改中， 只用搭载有一个蓝细菌基因构建体的根癌土壤杆菌株系中的每个来进行 胚芽的感染以获得表达 FNR 或 Fld 构建体的独立的杂合转基因株系。
     大麦中的胁迫处理
     使转基因和对照大麦植物在受控的环境条件下生长， 所述受控的环境条件是指白 天 15℃以及夜晚 12℃的温度， 80％的湿度， 由金属卤化物灯 (HQI) 提供的 16h 光周期并且 在成熟植物株冠水平以 500μmol quanta m-2s-1 的强度补充以钨灯。所用的土壤混合物由 以 2 ∶ 2 ∶ 1 的比率混合的 Levington M3 混合肥料 /Perlite/Grit 组成。从生长在土壤 中的 6 周龄大麦植物的叶子上切取 10-15mm 长的叶条。然后使叶条在包含所示量的 MV 和 0.05％ Tween-20 的蒸馏水中在 20℃在黑暗中温育 30 分钟以使 MV 扩散到组织中。然后将 所述叶条近轴侧向上地放置在塑料托盘中并在 450μmol quanta m-2s-1 光源下温育所示的 时间周期。使对照保持在包含 0.05％ Tween-20 的蒸馏水中。然后如在 5.1 中所述的那样评估叶绿素和类胡萝卜素的含量。
     结果
     使根据本文所述方法获得的表达 Fld 和 FNR 的独立杂合大麦植物经历氧化胁迫条 件以评估它们与其野生型对应物相比的相对耐性。图 12 显示当对于 FNR 和 Fld 基因是杂 合的转基因植物和野生型个体的叶条暴露于氧化还原循环除草剂甲基紫精时获得的典型 结果并且然后如方法中所述的那样估计光合色素叶绿素和类胡萝卜素的含量。 色素降解是 光合器官变质的标志。结果显示， 双杂合 FNR/Fld 转基因植物成功地经受了氧化挑战， 其保 存的总的叶绿素和类胡萝卜素的水平分别比野生型 ( 以及单独的 FNR) 对应物高 2 倍和 4 倍。Fld 表达转基因大麦植物显示中间的耐性水平。考虑到由转基因给予的保护效果的剂 量依赖性的事实， 两种转基因 FNR 和 Fld 的杂合植物展示高的耐性水平的事实是显著的。
     结语
     来自相同蓝细菌物种的 Fld 和 FNR 两者在植物中的同时表达给予相对只表达 Fld 的植物的增强的对 MV 毒性的耐性。为简单起见， pn 植物代表初级 FNR 烟草转化体， Xn 植物 是 pn 植物与来自 Tognetti 等 (2006) 的 pfld5-8 的杂交。Xnn 或 Xnnn 是 X4 双杂合植物自 花授粉的分离子 (segregant)。
     参考资料
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     序列表
     本文所述的核酸序列和相应的肽列表于下。
     Seq 1 ： 不带有靶向序列的用于单融合构建体的 Fld 核酸序列
     ATGTCAAAGAAAATTGGTTTATTCTACGGTACTCAAACTGGTAAAACTGAATCAGT
     AGCAGAAATCATTCGAGACGAGTTTGGTAATGATGTGGTGACATTACACGATGTTT
     CCCAGGCAGAAGTAACTGACTTGAATGATTATCAATATTTGATTATTGGCTGTCCT
     ACTTGGAATATTGGCGAACTGCAAAGCGATTGGGAAGGACTCTATTCAGAACTGG
     ATGATGTAGATTTTAATGGTAAATTGGTTGCCTACTTTGGGACTGGTGACCAAATA
     GGTTACGCAGATAATTTTCAGGATGCGATCGGTATTTTGGAAGAAAAAATTTCTCA
     ACGTGGTGGTAAAACTGTCGGCTATTGGTCAACTGATGGATATGATTTTAATGATT
     CCAAGGCACTAAGAAATGGCAAGTTTGTAGGACTAGCTCTTGATGAAGATAATCAA
     TCTGACTTAACAGACGATCGCATCAAAAGTTGGGTTGCTCAATTAAAGTCTGAATT
     TGGTTTGTAA
     Seq 2 ： 带有靶向序列的用于单融合构建体的 Fld 核酸序列
     ATGGCTGCTGCAGTAACAGCCGCAGTCTCCTTGCCATACTCCAACTCCACTTCCC
     TTCCGATCAGAACATCTATTGTTGCACCAGAGAGACTTGTCTTCAAAAAGGTTTCA
     TTGAACAATGTTTCTATAAGTGGAAGGGTAGGCACCATCAGAGCTCTCATAATGTC
     AAAGAAAATTGGTTTATTCTACGGTACTCAAACTGGTAAAACTGAATCAGTAGCAG
     AAATCATTCGAGACGAGTTTGGTAATGATGTGGTGACATTACACGATGTTTCCCAG
     GCAGAAGTAACTGACTTGAATGATTATCAATATTTGATTATTGGCTGTCCTACTTGG
     AATATTGGCGAACTGCAAAGCGATTGGGAAGGACTCTATTCAGAACTGGATGATG
     TAGATTTTAATGGTAAATTGGTTGCCTACTTTGGGACTGGTGACCAAATAGGTTAC
     GCAGATAATTTTCAGGATGCGATCGGTATTTTGGAAGAAAAAATTTCTCAACGTGGTGGTAAAACTGTCGGCTATTGGTCAACTGATGGATATGATTTTAATGATTCCAAGG
     CACTAAGAAATGGCAAGTTTGT AGGACTAGCTCTTGATGAAGATAATCAATCTGAC
     TTAACAGACGATCGCATCAAAAGTTGGGTTGCTCAATTAAAGTCTGAATTTGGTTT
     GTAA
     Seq 3 不带有靶向序列的用于单融合构建体的 FNR 鱼腥蓝细菌属 PCC7119 核酸序 列 ( 编码两个结构域的序列 )
     ATGACTCAAGCGAAAGCCAAACACGCTGATGTTCCTGTTAATCTTTACCGTCCCAA
     TGCTCCATTTATTGGTAAGGTAATCTCTAATGAACCACTGGTAAAAGAAGGCGGGA
     TAGGTATTGT TCAGCACATTAAATTTGATCTAACTGGTGGTAACTTAAAGTACATCG
     AAGGTCAAAGTATTGGTATCATTCCACCAGGAGTGGACAAGAACGGCAAGCCGGA
     AAAATTGAGACTCTACTCCATTGCCTCGACCCGTCACGGCGATGATGTGGATGAT
     AAAACCATCTCACTGTGCGTCCGTCAATTAGAGTACAAACATGCAGAAAGCGGCG
     AAACAGTTTACGGTGTTTGTTCTACTTACTTGACTCACATTGAACCAGGTTGAGAA
     GTGAAAATCACTGGGCCTGTGGGTAAAGAAATGCTGTTACCCGATGATCCTGAAG
     CTAATGTCATCATGTTGGCAACAGGTACTGGTATTGCGCCTATGCGGACTTACCT
     GTGGCGGATGTTCAAGGATGCAGAAAGAGCTGCTGACCCAGAATATCAATTCAAA
     GGATTCTCTTGGTTAGTCTTTGGTGTTCCTACAACTCCTAACATTCTTTATAAAGAA
     GAAGTGGAAGAAATCCAACAAAAATATCCCGATAACTTCCGCCTAACTTACGCTAT
     CAGCCGGGAGCAAAAGAATCCCCAAGGTGGCAGAGTGTACATCCAAGACCGTGT
     GGCAGAACACGCTGATGAACTGTGGCAATTAATCAAGAATGAAAAAACCCACACC
     TACATCTGTGGTTTGCGCGGTATGGAAGAGGGCATTGATGCTGCTTTAAGTGCTG
     CGGCTGCGAAAGAAGGTGTTACCTGGAGTGATTACCAAAAAGACCTCAAGAAAGC
     TGGTCGCTGGCACGTAGAAACATACTAA
     Seq 4 带有靶向序列的用于单融合构建体 ( 包含编码两个结构域的序列的 FNR 构 建体 ) 的 FNR 核酸序列
     ATGGCTGCTGCAGTAACAGCCGCAGTCTCCTTGCCATACTCCAACTCCACTTCCC
     TTCCGATCAGAACATCTATTGTTGCACCAGAGAGACTTGTCTTCAAAAAGGTTTCA
     TTGAACAATGTTTCTATAAGTGGAAGGGTAGGCACCATCAGAGCTCACACCATGA
     CTCAAGCGAAAGCCAAACACGCTGATGTTCCTGTTAATCTTTACCGTCCCAATGCT
     CCATTTATTGGTAAGGTAATCTCTAATGAACCACTGGTAAAAGAAGGCGGGATAG
     GTATTGTTCAGCACATTAAATTTGATCTAACTGGTGGTAACTTAAAGTACATCGAAG
     GTCAAAGTATTGGTATCATTCCACCAGGAGTGGACAAGAACGGCAAGCCGGAAAA
     ATTGAGACTCTACTCCATTGCCTCGACCCGTCACGGCGATGATGTGGATGATAAA
     ACCATCTCACTGTGCGTCCGTCAATTAGAGTACAAACATCCAGAAAGCGGCGAAA
     CAGTTTACGGTGTTTGTTCTACTTACTTGACTCACATTGAACCAGGTTCAGAAGTG
     AAAATCACTGGGCCTGTGGGTAAAGAAATGCTGTTACCCGATGATCCTGAAGCTA
     ATGTCATCATGTTGGCAACAGGTACTGGTATTGCGCCTATGCGGACTTACCTGTG
     GCGGATGTTCAAGGATGCAGAAAGAGCTGCTGACCCAGAATATCAATTCAAAGGA
     TTCTCTTGGTTAGTCTTTGGTGTTCCTACAACTCCTAACATTCTTTATAAAGAAGAACTGGAAGAAATCCAACAAAAATATCCCGATAACTTCCGCCTAACTTACGCTATCAG CCGGGAGCAAAAGAATCCCCAAGGTGGCAGAGTGTACATCCAAGACCGTGTGGC AGAACACGCTGATGAACTGTGGCAATTAATCAAGAATGAAAAAACCCACACCTACA TCTGTGGTTTGCGCGGTATGGAAGAGGGCATTGATGCTGCTTTAAGTGCTGCGGC TGCGAAAGAAGGTGTTACCTGGAGTGATTACCAAAAAGACCTCAAGAAAGCTGGT CGCTGGCACGTAGAAACATACTAA Seq 5 ： FNR 完整的核酸序列 ( 包含 3 个结构域 ) ATGTCTAATCAAGGTGCTTTTGATGGTGCTGCCAACGTAGAATCAGGTAGCCGCG TCTTCGTTTACGAAGTGGTGGGTATGCGTCAGAACGAAGAAACTGATCAAACGAA CTACCCAATTCGTAAAAGTGGCAGTGTGTTCATTAGAGTGCCTTACAACCGCATGA ATCAAGAAATGCAGCGTATCACTCGACTAGGCGGCAAGATTGTTACGATTCAAAC AGTAAGCGCACTACAACAACTCAATGGTAGAACTACCATTGCAACAGTAACAGATG CGTCTAGTGAGATTGCTAAGTCTGAGGGGAATGGTAAAGCCACACCTGTAAAAAC TGATAGTGGAGCTAAAGCGTTCGCTAAACCACCAGCTGAAGAACAGCTTAAGAAA AAAGACAACAAAGGCAACACCATGACTCAAGCGAAAGCCAAACACGCTGATGTTC CTGTTAATCTTTACCGTCCCAATGCTCCATTTATTGGTAAGGTAATCTCTAATGAAC CACTGGTAAAAGAAGGCGGGATAGGTATTGTTCAGCACATTAAATTTGATCTAACT GGTGGTAACTTAAAGTACATCGAAGGTCAAAGTATTGGTATCATTCCACCAGGAGT GGACAAGAACGGCAAGCCGGAAAAATTGAGACTCTACTCCATTGCCTCGACCCGT CACGGCGATGATGTGGATGATAAAACCATCTCACTGTGCGTCCGTCAATTAGAGT ACAAACATCCAGAAAGCGGCGAAACAGTTTACGGTGTTTGTTCTACTTACTTGACT CACATTGAACCAGGTTCAGAAGTGAAAATCACTGGGCCTGTGGGTAAAGAAATGC TGTTACCCGATGATCCTGAAGCTAATGTCATCATGTTGGCAACAGGTACTGGTATT GCGCCTATGCGGACTTACCTGTGGCGGATGTTCAAGGATGCAGAAAGAGCTGCT GACCCAGAATATCAATTCAAAGGATTCTCTTGGTTAGTCTTTGGTGTTCCTACAAC TCCTAACATTCTTTATAAAGAAGAACTGGAAGAAATCCAACAAAAATATCCCGATAA CTTCCGCCTAACTTACGCTATCAGCCGGGAGCAAAAGAATCCCCAAGGTGGCAGA GTGTACATCCAAGACCGTGTGGCAGAACACGCTGATGAACTGTGGCAATTAATCA AGAATGAAAAAACCCACACCTACATCTGTGGTTTGCGCGGTATGGAAGAGGGCAT TGATGCTGCTTTAAGTGCTGCGGCTGCGAAAGAAGGTGTTACCTGGAGTGATTAC CAAAAAGACCTCAAGAAAGCTGGTCGCTGGCACGTAGAAACATACTAA SEQ 6 ： Fld 氨基酸序列 MSKKIGLFYGTQTGKTESVAEIIRDEFGNDVVTLHDVSQAEVTDLNDYQYLIIGCPTWN IGELQSDWEGLYSELDDVDFNGKLVAYFGTGDQIGYADNFQDAIGILEEKISQRGGKT VGYWSTDGYDFNDSKALRNGKFVGLALDEDNQSDLTDDRIKSWVAQLKSEFGL SEQ 7 ：： 带有靶向序列的 Fld 氨基酸序列 MAAAVTAAVSLPYSNSTSLPIRTSIVAPERLVFKKVSLNNVSISGRVGTIRALIMSKKIGL FYGTQTGKTESVAEIIRDEFGNDVVTLHDVSQAEVTDLNDYQYLIIGCPTWNIGELQSD WEGLYSELDDVDFNGKLVAYFGTGDQIGYADNFQDAIGILEEKISQRGGKTVGYWSTDGYDFNDSKALRNGKFVGLALDEDNQSDLTDDRIKSWVAQLKSEFGL Seq 8 ： 不带有靶向序列的 FNR 鱼腥蓝细菌属 PCC7119 氨基酸序列 (2 个结构域 ) MTQAKAKHADVPVNLYRPNAPFIGKVISNEPLVKEGGIGIVQHIKFDLTGGNLKYIEGQ SIGIIPPGVDKNGKPEKLRLYSIASTRHGDDVDDKTISLCVRQLEYKHPESGETVYGVC STYLTHIEPGSEVKITGPVGKEMLLPDDPEANVIMLATGTGIAPMRTYLWRMFKDAER AADPEYQFKGFSWLVFGVPTTPNILYKEELEEIQQKYPDNFRLTYAISREQKNPQGGR VYIQDRVAEHADELWQLIKNEKTHTYICGLRGMEEGIDAALSAAAAKEGVTWSDYQKD LKKAGRWHVETY Seq 9 ： 带有靶向序列的 FNR 鱼腥蓝细菌属 PCC7119 氨基酸序列 (2 个结构域 ) MAAAVTAAVSLPYSNSTSLPIRTSIVAPERLVFKKVSLNNVSISGRVGTIRAHTMTQAK AKHADVPVNLYRPNAPFIGKVISNEPLVKEGGIGIVQHIKFDLTGGNLKYIEGQSIGIIPP GVDKNGKPEKLRLYSIASTRHGDDVDDKTISLCVRQLEYKHPESGETVYGVCSTYLTH IEPGSEVKITGPVGKEMLLPDDPEANVIMLATGTGIAPMRTYLWRMFKDAERAADPEY QFKGFSWLVFGVPTTPNILYKEELEEIQQKYPDNFRLTYAISREQKNPQGGRVYIQDR VAEHADELWQLIKNEKTHTYICGLRGMEEGIDAALSAAAAKEGVTWSDYQKDLKKAG RWHVETY Seq 10 ： 不带有靶向序列的 FNR 完整的氨基酸序列 (3 个结构域序列 ) MSNQGAFDGAANVESGSRVFVYEVVGMRQNEETDQTNYPIRKSGSVFIRVPYNRMN QEMQRITRLGGKIVTIQTVSALQQLNGRTTIATVTDASSEIAKSEGNGKATPVKTDSGA KAFAKPPAEEQLKKKDNKGNTMTQAKAKHADVPVNLYRPNAPFIGKVISNEPLVKEG G IGIVQHIKFDLTGGNLKYIEGQSIGIIPPGVDKNGKPEKLRLYSIASTRHGDDVDDKTIS LCVRQLEYKHPESGETVYGVCSTYLTHIEPGSEVKITGPVGKEMLLPDDPEANVIMLA TGTGIAPMRTYLWRMFKDAERAADPEYQFKGFSWLVFGVPTTPNILYKEELEEIQQKY PDNFRLTYAISREQKNPQGGRVYIQDRVAEHADELWQLIKNEKTHTYICGLRGMEEGI DAALSAAAAKEGVTWSDYQKDLKKAGRWHVETY40CN 102482681 A
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