利用废菌体的 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及液 体培养基 技术领域 本发明涉及同时高效生产 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及制造这两种 酶中使用的液体培养基。
背景技术 近年来， 为了有效利用纤维素资源， 人们探索了有效分解纤维素的方法。 人们已经 了解到自然界中纤维素主要是被微生物分解的， 细菌和丝状菌等各种各样的微生物生产纤 维素分解酶。
这些微生物将纤维素分解酶分泌到菌体外， 纤维素经该酶作用后， 主要经纤维低 聚糖 (Cellooligosaccharides)、 纤维二糖被分解为葡萄糖。 纤维素分解酶一般称为纤维素 酶。
人工制造纤维素酶时， 作为分泌纤维素酶的微生物已知有木霉属的微生物， 并被 广泛利用。而且， 也已经知道利用含有碳源和氮源等营养素的培养基培养属于木霉属的微 生物， 可使其分泌纤维素酶的方法。
然而， 以前用于制造纤维素酶的方法， 作为碳源能够使用的材料受到限制， 高价的 结晶纤维素， 或者即使假如为价格便宜的纤维素资源， 也要进行加热处理或碱处理等前处 理， 所以需要较高的成本。
例如， 专利文献 1 报道了将废纸于硫酸亚铁溶液中蒸煮， 可接种纤维素酶生产菌 的纤维素酶生产用底物。另外， 专利文献 2 报道了将微粉碎的甘蔗渣于氢氧化钠中蒸煮， 然 后再用次氯酸盐溶液处理， 作为可接种纤维素酶生产菌里氏木霉 (Trichoderma reesei) 的 生产纤维素酶用底物的制造方法。
另外， 利用这些以往方法得到的纤维素酶主要含 β- 葡聚糖酶， 而木聚糖酶活性 低， 对于像甘蔗渣和稻秸等那样的含木聚糖的纤维素资源的分解能力差。 因此， 对于目的是 有效利用天然存在的各种各样的纤维素资源来说效率低。
专利文献 3 报道了包括对属于里氏木霉的变异株进行液体培养， 对得到的纤维素 酶进行提取的工序在内的纤维素酶的制造方法。 作为培养基的碳源， 罗列了纤维素粉末、 纤 维二糖、 滤纸、 一般纸类、 锯末、 麦糠、 稻壳、 甘蔗渣、 大豆粕、 咖啡粕等化学构造和性质不同 的各种材料 ( 第 0011 段落 )。
然而， 其中培养操作实际使用的材料只是纤维二糖 ( 实施例 1) 和微晶纤维素 ( 实 施例 2)， 而有关其他材料， 即天然纤维素材料， 没有证实纤维素酶的生成。
专利文献 4 报道了使用除去了固体构成成分以及进行非挥发成分的浓缩， 对浓缩 物进行高压釜处理等予处理的黑麦稀乙醇蒸馏废液， 对属于木霉属的微生物进行培养， 制 造木聚糖酶的方法。
然而， 由于本技术中作为碳源使用的黑麦获得困难， 还必须进行复杂的前处理， 因 此需要高成本， 另外， 使用该方法反倒使 β- 葡聚糖酶的产量降低了。
另外， 在通过培养微生物的医药品原料、 营养补充原料、 健康需求的原料、 嗜好性 原料、 食药品的原料及其中间体等生产中， 在提取目的成分后剩下的菌体、 培养基等都作为 废品被处理掉了。然而， 为了废弃菌体、 培养基， 为了不给环境造成恶劣影响必须要进行失 活和分离等无害化处理， 势必需要劳力和费用。
为 了 解 决 这 样 的 问 题， 例 如， 专 利 文 献 5 报 道 了 可 将 由 Propionibacter 属 或 Pseudomonas 属等发酵生产后的废菌体作为蘑菇子实体栽培用培养基或培养基再利用。
然而， 利用废菌体作为用于同时高效生产 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶的培养基至今 还没有报道。
以往技术文献
专利文献
专利文献 1 ： 日本特开 2003-137901
专利文献 2 ： 日本特公平 5-33984 号公报
专利文献 3 ： 日本特开平 9-163980 号公报
专利文献 4 ： 日本特开平 11-113568 号公报
专利文献 5 ： 日本特开 2003-47338 发明内容 发明要解决的课题
本发明正是要解决上述以往的问题的发明， 发明的目的就在于以低成本制造对含 有木聚糖的纤维素资源具有优良分解能力的纤维素酶。
用于解决课题的手段
本发明者等对同时高效生产 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶， 分解 ( 糖化 ) 纤维素资源 的酶的制造方法以及该酶的制造进行不断的锐意研究， 结果发现通过作为液体培养基的营 养源使用废菌体， 对属于木霉属的微生物进行培养的可同时高效生产 β- 葡聚糖酶和木聚 糖酶的制造方法以及对制造该酶有用的液体培养基。
本发明提供一种 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法， 包括使用含有废菌体的液 体培养基作为有机氮源， 对属于木霉属的微生物进行培养的工序。
在某一实施方式中， 所述废菌体在所述液体培养基中的浓度为 1％ W/V 以上。
在某一实施方式中， 所述废菌体在所述液体培养基中的浓度为 2 ～ 10％ W/V。
在某一实施方式中， 所述废菌体的原料是属于木霉属的微生物。
在某一实施方式中， 所述属于木霉属的微生物是里氏木霉。
在某一实施方式中， 所述液体培养基还含有作为碳源的天然纤维素材料以及作为 氮源的氨态氮或氨基态氮。
在某一实施方式中， 所述天然纤维素材料在所述液体培养基中的浓度为 2％ W/V 以上。
在某一实施方式中， 所述天然纤维素材料为选自纸浆、 啤酒粕、 麦茶抽提粕、 小麦 麦糠和苹果渣饼中的至少一种。
在某一实施方式中， 在培养的过程中对所述液体培养基追加废菌体。
另外本发明提供一种液体培养基， 其含有废菌体作为有机氮源， 用于培养属于木
霉属的微生物。
在某一实施方式中， 含有 1％ W/V 以上的所述废菌体。
另外， 本发明提供一种 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶， 其是任意前述方法制造的。
另外， 本发明提供一种纤维素资源的分解或糖化方法， 其特征在于， 使用所述的 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶。
发明的效果
本发明由于有效利用了废菌体， 使产业废弃物减少， 有益于环境问题的解决。另 外， 由于可同时高效生产作为纤维素分解酶的 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶， 对于甘蔗渣和稻 秸等天然纤维素资源的糖化极其有用。 特别是对由纤维素资源制造酒精的生物量乙醇制造 有用。 附图说明
图 1 是表示在含有 3％的复写纸的液体培养基中的、 相对于废菌体浓度的培养上 清液的酶活性变化的图。
图 2 是表示在含有 1％的结晶纤维素的液体培养基中的、 相对于废菌体浓度的培 养上清液的酶活性变化的图。 图 3 是表示在使用实施例 1 得到的 1.5 ％废菌体的培养基以及参考例 1 得到的 1.5％废菌体的培养基的各个上清液， 对稻秸糖化时， 对生成的葡萄糖浓度进行比较的图。
图 4 是表示在使用实施例 1 得到的 1.5 ％废菌体的培养基以及参考例 1 得到的 1.5％废菌体的培养基的各个上清液， 对纤维素原料糖化时， 对生成的葡萄糖浓度进行比较 的图。
图 5 是表示在含 3％啤酒粕的液体培养基中， 使用 0.2％多价胨得到的酶活性， 以 及相对于废菌体浓度的培养上清液的酶活性的变化的图。
图 6 是表示在含 5％麦茶抽提粕的液体培养基中， 使用 0.2％多价胨得到的酶活 性， 以及相对于废菌体浓度的培养上清液的酶活性的变化的图。
图 7 是表示在含 5％小麦麦糠的液体培养基中， 相对于废菌体浓度的培养上清液 的酶活性的变化的图。
图 8 是表示在含 4％苹果渣饼的液体培养基中， 相对于废菌体浓度的培养上清液 的酶活性的变化的图。
图 9 是表示在含 3 ％复写纸的液体培养基中， 相对于玉米浸渍液 (Corn Steep Liquor) 浓度的培养上清液的酶活性的变化的图。
图 10 是表示在含 3％复写纸的液体培养基中， 相对于多价胨浓度的培养上清液的 酶活性的变化的图。
具体实施方式
液体培养基
本发明的液体培养基是含有属于木霉属微生物成长的营养的材料。 这样的液体培 养基是将培养基的营养成分溶解或悬浮于 100ml 水的液体培养基 ( 一般称为 Mandel 培养 基 ) 为基础调配的， 含有作为介质的水、 作为有机氮源的废菌体等 ； 根据需要， 含有作为碳源的天然纤维素材料等 ； 根据需要， 含有作为氮源的氨态氮或氨基态氮等。 以下给出了本发 明理想的培养基组成的一个例子。
培养基组成 ( 本发明 ) ：
含有废菌体： 1g、 天然纤维素材料： 3 ～ 5g、 (NH4)2SO4 ： 0.14g、 KH2PO4 ： 1.5g、 CaCl2·2H2O ： 0.03g、 MgSO4·7H2O ： 0.03g、吐 温 80 ： 0.1ml、微 量 元 素 液 (H3BO4 6mg、 (NH4)6Mo7O24· 4H2O 26mg、 FeCl3· 6H2O 100mg、 CuSO4· 5H2O 40mg、 MnCl2· 4H2O 8mg、 ZnSO4· 7H2O 200mg 液 ) ： 0.1ml、 水： 100ml( 用磷酸或氢氧化钠将 PH 调整为 4.8)
另外， 作为参考， 以下给出了 Mandel 培养基的培养基组成的典型例子。
培养基组成 (Mandel 培养基 ) ：
含有多价胨 ： 0.2g、 结 晶 纤 维 素 (Fluka BioChemika 生 产、 商品名微晶纤维素 PH101) ： 1g、 (NH4)2SO4 ： 0.14g、 KH2PO4 ： 1.5g、 CaCl2·2H2O ： 0.03g、 MgSO4·7H2O ： 0.03g、 吐温 80 ： 0.1ml、 微量元素液 (H3BO4 6mg、 (NH4)6Mo7O24·4H2O 26mg、 FeCl3·6H2O 100mg、 CuSO4·5H2O 40mg、 MnCl2·4H2O 8mg、 ZnSO4·7H2O 200mg 液 ) ： 0.1ml、 水： 100ml( 用磷酸或氢氧化钠将 PH 调整为 4.8)
需要说明的是， 有时取代作为有机氮源的多价胨， 而使用玉米浸渍液 (corn steep liquor)。
所谓废菌体指的是使微生物增殖生产像酶那样的物质生产过程中， 提取目的成分 之后残留的菌体和培养基等残渣， 或者其加工物。作为废菌体原料的微生物只要是确认对 人体是安全的种类， 没有特别限定。
例 如、属 于 木 霉 属 (Trichoderma)、曲 霉 属 (Aspergillus)、顶 孢 霉 属 (Acremonium)、分 枝 孢 属 (Sporotrichum)、青 霉 属 (Penicillium)、踝 节 菌 属 (Talaromyces)、 腐质霉属 (Humicola)、 Neocallimastix 属、 嗜热真菌属 (Thermomyces 属 ) 或梭菌属 (Clostridium)、 链霉属 (Streptomyces) 的微生物对人体是安全的， 可以用作本 发明的液体培养基。其中优选的微生物是属于木霉属的微生物。优选的属于木霉属的微生 物为里氏木霉或绿色木霉 (Trichoderma viride)。特别优选里氏木霉。
废菌体的制造方法， 首先是将作为原料的微生物接种于适当的培养基中， 在适当 的条件下进行培养， 获得培养液。培养中使用的培养基优选 Mandel 培养基那样的液体培养 基。因为从培养液中容易分离菌体。在一优选的实施方式中， 用于制造废菌体的培养与本 说明书中说明的本发明方法使用的培养相同。
然后， 将培养后得到的培养液分离为上清液和菌体。分离方法可以使用通常的方 法， 例如， 过滤法以及离心分离法等。培养液或上清液在分离工序前或后对微生物用高压 釜， 例如， 于 121℃进行 15 分钟加热灭菌杀死菌体。 该微生物的加热灭菌可以在添加到培养 基前进行， 也可以在添加到培养基后通过对培养基加热灭菌来进行。加热工序和分离工序 可以进行多次。
由培养液分离的湿菌体残渣可直接作为废菌体使用。 也可以使该湿菌体进一步干 燥， 做成干燥菌体残渣后作为废菌体使用。 干燥方法可以使用通常方法， 例如， 自然干燥法、 热风干燥法、 减压干燥法以及喷雾干燥法等。
液体培养基中的废菌体浓度优选 1％ W/V 以上。液体培养基中的废菌体的浓度更 优选 2 ～ 10％ W/V、 进一步优选 2 ～ 8％ W/V、 3 ～ 6％ W/V。当废菌体浓度达不到 1％ W/V时， 纤维素酶、 特别是木聚糖酶的产量有时增大量不大。
所谓天然纤维素材料指的是原样保持天然存在的分子构造的非水溶性纤维素。 例 如， 纸、 纸浆、 啤酒粕、 麦茶抽提粕、 小麦麦糠、 苹果渣饼那样的果实渣饼等就属于天然纤维 素材料。 反之， 例如， 像纤维二糖和微晶纤维素那样的结晶纤维素是纤维素通过纤维素酶分 解， 以具有特定结构的方式进行精制得到的纯化合物， 不属于这里所说的天然纤维素材料。
所谓纸浆指的是制造纸类的原料中使用的纤维。 纸浆的种类优选像化学纸浆和废 纸纸浆那样纤维素纯度高的纸浆。优选的纸浆是来自于将纸类分解、 切断等之后得到的纸 类的纸浆。
作为优选的纸类的具体例子， 如高级纸、 低级纸、 复写用纸、 报纸以及瓦楞纸板纸 等。纸类只要优选的含有纸浆的都可以， 可以是印刷过或用笔写过的纸以及一般称为废 纸的纸。例如， 可以使用旧书、 杂志以及用过的笔记本纸、 活页纸、 信封、 便笺、 明信片、 绵纸 (tissue paper) 等。
液体培养基中的纸浆浓度优选 2％ W/V 以上。如果纸浆浓度达不到 2％ W/V， 则纤 维素酶、 特别是 β- 葡聚糖酶的产量有时增大量不大。液体培养基中的纸浆浓度优选 3％ W/V 以上、 更优选 4％ W/V 以上、 5％ W/V 以上、 6％ W/V 以上、 7％ W/V 以上。另外， 为了容易 进行液体培养基的搅拌混合， 纸类最好是用撕碎机 (shredder) 裁断后使用。 所谓啤酒粕指的是啤酒制造工序中的副产品， 是使大麦发芽了的麦芽糖化后， 将 麦汁过滤除去后剩下的残渣。 对大麦的种类、 副原料的种类等没有限制， 另外本发明的啤酒 粕也包括使麦芽的使用比率降低了的发泡酒等制造工序中的副产品残渣。
啤酒粕在啤酒制造工序中大量产生， 容易获得。而且由于啤酒粕是食品制造的副 产物， 都严格进行原料阶段的品质检查以及制造工序管理， 所以卫生品质上非常安全。 作为 啤酒粕的种类， 例如有生啤酒粕、 脱水啤酒粕、 干燥啤酒粕。
液体培养基中的啤酒粕开始浓度优选 2％ W/V 以上。如果啤酒粕浓度低于 2％ W/ V， 纤维素酶、 特别是 β- 葡聚糖酶的产量有时增大量不大。液体培养基中的啤酒粕浓度优 选 3％ W/V 以上、 更优选 4％ W/V 以上、 5％ W/V 以上、 6％ W/V 以上、 7％ W/V 以上。
所谓麦茶抽提粕指的是用水等抽提溶剂从焙煎了的麦粒抽提出水溶性成分后剩 下的残渣。麦茶抽提粕在麦茶的制造工程中大量产生， 容易获得。而且由于麦茶抽提粕是 食品制造的副产物， 都严格进行原料阶段的品质检查以及制造工序管理， 所以卫生品质上 非常安全。
可作为麦茶抽提粕原料的麦子只要是适于制造麦茶的， 其种类没有特别限定。一 般在麦茶的制造中都用大麦， 例如， 六条大麦、 二条大麦、 去壳大麦燕麦等。 其中优选六条大 麦和二条大麦。也可以将它们混合后使用。
麦茶抽提粕的制造方法， 首先对大麦等的麦粒进行焙煎。焙煎方法一般有热风焙 煎、 砂炒焙煎、 远红外焙煎等。焙煎时的温度为 100 ～ 700℃、 优选 200 ～ 600℃， 焙煎时间 为 1 ～ 60 分钟， 优选 5 ～ 60 分钟。
然后将焙煎了的麦粒浸渍于抽提溶剂中， 优选地加热到 80℃以上。抽提溶剂一般 使用水。通过用热水煮， 麦粒中含有的水溶性成分被抽提到水中。在从麦粒抽提的水溶性 成分中含有风味成分和淀粉等。
抽提时间没有特别限定， 优选于 20 分钟至 1 小时范围内进行。
然后， 分离抽提液作为麦茶， 剩下的物质为麦茶抽提粕。抽提液的分离可以用倾 析、 过滤、 离心分离等通常的方法进行。而麦茶抽提粕， 根据需要可进行洗净、 脱水、 干燥等 处理。
液体培养基中的麦茶抽提粕的浓度优选 3％ W/V 以上。如果麦茶抽提粕的浓度达 不到 3％ W/V， 纤维素酶、 特别是 β- 葡聚糖酶的产量有时增大量不大。液体培养基中的麦 茶抽提粕的浓度更优选 4％ W/V 以上、 更优选 5％ W/V 以上、 6％ W/V 以上、 7％ W/V 以上、 8％ W/V 以上。
所谓小麦麦糠指的是小麦的外皮和胚芽的混合物。而从小麦去除小麦麦糠 ( 即外 皮和胚芽 ) 后细微化后的产物是小麦粉。小麦麦糠作为例如工业上获得食用小麦粉的制造 面粉工序的副产物而大量产生， 很容易得到。 而这样的小麦麦糠由于是制造食品的副产物， 所以都严格进行原料阶段的品质检查以及制造工序管理， 卫生品质上非常安全， 优选地用 于本发明的方法中。
用于制备小麦麦糠的小麦的种类没有特别限定， 如北进 ( ホクシン， Hokushin)、 福清 ( ふくさやか， Fukusayaka)、 农林 61 号、 南部小麦 ( ナンブコムギ， Nanbukomugi)、 北 之香 ( キタノカオリ， Kitanokaori)、 春富 ( ハルユタカ， haruyutaka)、 春之恋 ( 春よ恋 ) 等。 一般小麦麦糠的粒子形状为薄片状。薄片状的小麦麦糠可原样使用。也可以将它 们适当粉碎， 使粒子细化后使用， 还可以造粒使其形成粒子的块状后使用。小麦麦糠的形 态， 可以是例如、 大的麦糠、 小的麦糠、 粉末等。 也可以使用作为食品原料以及健康食品等市 场上销售的产品。
液体培养基中的小麦麦糠浓度优选为 3％ W/V 以上。 如果小麦麦糠的浓度低于 3％ W/V， 纤维素酶、 特别是 β- 葡聚糖酶的产量有时增大量不大。液体培养基中的小麦麦糠浓 度更优选 4％ W/V 以上， 更优选在 5％ W/V 以上、 6％ W/V 以上、 7％ W/V 以上、 8％ W/V 以上。
所谓果实渣饼指的是在果汁等的制造工序中的副产品， 将果实压榨后， 滤去果汁 后剩下的残渣。果实渣饼在果汁等的制造工序中大量产生， 容易获得。而且由于果实渣饼 是食品制造的副产物， 所以都严格进行原料阶段的品质检查以及制造工序管理， 卫生品质 上非常安全。果实渣饼优选苹果、 梨、 桃、 樱桃、 草莓等那样的蔷薇科果实的渣饼。优选苹果 渣饼， 因为能够高效生产所期望的酶。
苹果的品种只要迄今为止用于制造苹果果汁的苹果就可以， 例如、 “富士” 、 “律轻 ( つがる )” 、 “王林” 、 “红金苹果 ( ジヨナゴ一ル )” 、 “红星苹果 (Starking delicious)” 、 “陆奥” 等。苹果的果实无论是完全成熟的， 还是未完全成熟的都可以。
果实渣饼的制造方法， 首先将果实洗净。 此时如果有不适合作原料的果就去除掉。 将洗净的果实送入破碎机， 进行破碎。破碎的果实通过泵等输送到油压搾汁机， 进行搾汁。 然后从搾汁机回收渣饼。果实渣饼根据需要还可进行洗净、 脱水、 干燥等处理。
液体培养基中果实渣饼的浓度优选 2％ W/V 以上。果实渣饼的浓度如果低于 2％ W/V， 纤维素酶、 特别是 β- 葡聚糖酶的产量有时增大量不大。液体培养基中果实渣饼的浓 度更优选 3％ W/V 以上、 更优选 3％ W/V 以上、 4％ W/V 以上、 5％ W/V 以上、 6％ W/V 以上。
液体培养基中天然纤维素材料的浓度越高越好。即， 其上限为可以对液体培养基 进行搅拌混合的限度的量。因为如果液体培养基不能搅拌， 微生物就不能均一地混合在液
体培养基中， 培养就不能正常进行。 液体培养基中纸浆浓度的上限根据搅拌设备的性能， 可 以为 20、 15、 10 或 8％ W/V。
天然纤维素材料中， 除纸、 纸浆以外的材料， 例如、 啤酒粕、 麦茶抽提粕、 小麦麦糠 和果实的渣饼等优选地在导入液体培养基时进行前处理。优选的前处理为， 例如粉碎处理 和脱木质素处理。 如从这些天然纤维素材料除去木质素， 则坚固的细胞壁被破坏， 使得纤维 素容易利用， 酶的生产也变得容易。 另外通过对天然纤维素进行粉碎处理， 可以更有效地进 行脱木质素处理。
脱木质素处理的方法虽然没有特别限定， 例如可举出以下方法 ： 在像氢氧化钠那 样的强碱性物质存在下， 或者在像硫酸或磷酸那样的强酸性物质存在下， 高温加热， 使其分 解的方法 ； 通过微生物使其分解的方法 ； 在高温· 高压下通过水热处理使其分解的方法。 如 果考虑到对处理设备和环境的负荷， 优选高温·高压下通过水热处理使其分解的方法。
另外， 还可以进一步进行加热杀菌等对液体培养基的原料通常进行的前处理。
所谓氨态氮指的是氨或由氨衍生的铵盐中含有的氮。 而所谓的氨基态氮指的是胺 或由胺衍生的氨基化合物中含有的氮。 含有氨态氮或氨基态氮的化合物， 例如为硫酸铵、 硝 酸铵、 磷酸氢二铵、 氯化铵、 氨水、 尿素、 氨基酸及其盐 ( 例如， 亮氨酸、 谷氨酸钠 )。 其中， 作为氮源适用于本发明的液体培养基的特别优选的化合物是硫酸铵。其理 由是价格低， 而且很容易得到。
液体培养基中氨态氮或氨基态氮的浓度， 以铵的摩尔数表示， 为 30 ～ 660mM。 优选 40 ～ 580mM。如果浓度低于 30mM， 纤维素酶、 特别是 β- 葡聚糖酶的产量有时增大量不大。 另外， 该浓度如果超过 660mM， 酶的生产率将降低。 另外， 液体培养基中氨态氮或氨基态氮的 浓度优选地根据液体培养基中天然纤维素材料浓度进行增减， 例如， 天然纤维素材料浓度 为 4％ W/V 时， 如果考虑到成本等因素， 优选 50mM。
β- 葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法
人们已经了解木霉属丝状菌是纤维素糖化所需要的纤维素酶的生产菌。 本发明中 使用的属于木霉属的微生物只要是能生产纤维素酶， 没有特别限定。属于木霉属的微生物 优选里氏木霉或绿色木霉。特别优选里氏木霉。
丝 状 菌 里 氏 木 霉 和 绿 色 木 霉 的 菌 学 性 质 例 如 在 E.G.Simmons， Abst.2nd International Mycological Congress( 美国福罗里达州 Tampa， 1077 年 8 月 )618 页中有 报道。
液体培养使用通常的通气搅拌培养设备， 使用上述本发明的液体培养基， 培养温 度为 20 ～ 33℃， 优选为 28 ～ 30℃， 培养 pH 为 4 ～ 6， 培养 4 ～ 10 天。从培养最初就使用 上述液体培养基的情况下， 液体培养基中含有的成分 ( 例如、 碳源和氮源 ) 的浓度相当于本 发明的培养方法中上述成分的初期浓度。
在培养过程中也可以向液体培养基中追加废菌体。由于随着培养进行， 培养基中 的废菌体被分解， 有时通过补充废菌体可以提高纤维素酶的产率。
在追加废菌体的情况下， 在培养过程中也可以根据需要适当追加天然纤维素材 料、 氨态氮或氨基态氮。
然后通过离心分离、 过滤等众所周知的方法从该培养液中除去菌体， 可得到木霉 属丝状菌培养上清液。 在木霉属丝状菌培养液或培养上清液中含有高浓度的目的的纤维素
酶， 即 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶。
得到的培养液或培养上清液的 β- 葡聚糖酶活性在 30U/ml 以上， 优选在 50U/ml 以上， 更优选在 60U/ml 以上， 更优选在 70U/ml 以上。而该培养液或培养上清液的木聚糖酶 活性在 25U/ml 以上， 优选在 30U/ml 以上， 更优选在 40U/ml 以上， 更优选在 50U/ml 以上。 培 养液或培养上清液的 β- 葡聚糖酶活性、 木聚糖酶活性中的任一个如果低于上述下限， 对 于目的是有效利用天然存在的各种各样纤维素资源的效果就要降低。
另外， 上述半纤维素酶活性可以通过以来自 “oat spelts” 的木聚糖为底物的酶加 水分解后生成的还原糖与 DNS 反应， 以 540nm 的吸光度的增加量进行定量。
更具体来说， 向 1.9ml 1％木聚糖底物溶液中 ( 将 Sigma 公司生产的 “Xylan， from oat spelts” 溶解在 200mM 醋酸缓冲液 (pH4.5) 中 ) 加入 0.1ml 培养液或培养上清液， 然后 于 40℃下准确进行 10 分钟酶反应后， 加 4mlDNS 试剂 ( 含有 0.75％二硝基水杨酸、 1.2％氢 氧化钠、 22.5％酒石酸钠钾 4 水和物、 0.3％乳糖 1 水和物 )， 进行充分混合， 停止反应。 为了 对反应停止液中含有的还原糖量进行定量， 将反应停止液于沸腾水浴中准确加热 15 分钟。 然后冷却到室温后， 通过测定 540nm 的吸光度以相当于木糖的还原糖量进行定量。 1 单位的 半纤维素酶活性以于 40℃下反应 10 分钟的条件下， 1 分钟生成相当于 1μmol 木糖的还原 糖的酶量表示。
本发明中所谓的 “对属于木霉属的微生物进行培养” 指的是像技术常识那样对该 微生物进行培养的操作。即， 在以制造 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶为目的， 进行液体培养的方 法中， 只要至少存在在上述本发明的液体培养基中培养属于木霉属的微生物的过程， 该培 养方法属于本发明的方法。
一旦进行培养， 液体培养基的营养由于属于木霉属的微生物的消費而减少。 因此， 在培养末期， 培养基中的碳源和氮源 ( 包括有机氮源 ) 的浓度低于规定的浓度， 结果可能在 不属于本发明液体培养基的培养基中培养属于木霉属的微生物。即便在这样场合， 例如在 开始培养时刻， 使用的液体培养基属于含有规定浓度的碳源、 氮源的本发明的液体培养基 时， 至少在培养初期是在本发明的液体培养基中培养属于木霉属的微生物， 所以该培养方 法当然属于本发明方法。
另外， 在这样特别是从培养开始时刻起就大量含有碳源的情况下， 如上所述， 考虑 到对液体培养基进行搅拌混合时的方便性， 优选地将碳源、 氮源浓度的上限限制在某一程 度。
相反， 即使在培养初期， 培养基中的碳源或氮源浓度比规定浓度低， 使用不属于本 发明的液体培养基的培养基进行培养， 只要例如， 在培养开始后再追加， 使培养基中的碳源 或氮源浓度达到规定浓度以上时， 由于之后在本发明的液体培养基中培养了属于木霉属的 微生物， 所以该培养方法也属于本发明方法。
纤维素原料的分解或糖化方法
通过本发明的方法得到的 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶可用于对纤维素原料进行分 解或糖化。这里所说的纤维素原料可为合成纤维素或天然纤维素资源。所谓合成纤维素表 示作为纤维素粉末已经流通的材料。所谓天然纤维素资源可举出甘蔗渣、 稻秸、 麦秸、 啤酒 粕、 木材等。本发明由于可以同时高效生产 β- 葡聚糖酶和木聚糖酶， 所以特别适于对甘蔗 渣、 稻秸、 麦秸、 啤酒粕等天然纤维素资源的糖化。纤维素资源的分解或糖化方法只要是使用众所周知的方法就可以， 没有特别限 制， 举一例子， 使作为底物的纤维素原料悬浮于水性介质中， 添加上述培养液或培养上清 液， 一边搅拌或震荡， 一边加温进行糖化反应的方法。 代替显示纤维素分解活性的上述培养 液或培养上清液， 也可以使用其干燥物、 或使干燥物分散或溶解于水后的液体。
纤维素原料最好预先进行脱木质素。悬浊方法、 搅拌方法、 上述混合液的添加方 法、 添加顺序、 它们的浓度等反应条件可以按照能够以更高收率获得葡萄糖那样进行适当 调整。
此时的反应液的 pH 和温度只要是处于不使酶失活的范围内就可以， 一般来说， 在 常压下进行反应时， 温度可设定在 30 ～ 70℃、 pH 为 3 ～ 7 的范围。另外， 该压力、 温度、 pH 也可以像上述那样， 按照能够以更高收率获得葡萄糖那样进行适当调整， 然而常压下， 在醋 酸或磷酸缓冲液中， 优选在温度 50 ～ 60℃、 pH4 ～ 6 的范围下进行。反应时间一般为 6 ～ 147 小时、 优选 24 ～ 72 小时。
通过纤维素的糖化， 可以得到含有葡萄糖的水溶液。 得到的水溶液可以根据需要， 实施脱色、 脱盐、 除酶等精制处理。 精制方法只要是众所周知的方法没有特别的限制， 例如， 可以使用活性碳处理、 离子交换树脂处理、 色谱分析处理、 精密过滤、 超滤、 反渗透过滤等过 滤处理、 晶析处理等， 可以单独使用这些处理方法， 也可以使用 2 种以上处理方式组合。 通过上述方法精制了的葡萄糖为主要成分的水溶液可以直接使用， 也可以根据需 要， 通过干燥使其固化。 干燥方法只要是众所周知的方法， 没有特别限制， 例如， 可以使用喷 雾干燥、 冷冻干燥、 鼓式干燥、 薄膜干燥、 板式干燥、 气流干燥、 真空干燥等， 可以单独使用这 些方法， 也可以使用 2 种以上处理方式组合。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体说明， 但本发明并不限定于这些实施例。
实施例 1
将里氏木霉 QM9414 接种在 Mandel 培养基中， 在与本实施例中说明的同样条件进 行培养， 得到培养液。将得到的培养液经离心分离机 (BECMAN COULTER 公司生产 “Avanti HP-25” ) 分离， 进行集菌。使该菌体残渣于约 60℃下干燥约 24 小时， 获得废菌体。
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。然后在带挡板的 500mL 容量三角烧瓶中像下述那样准备 100mM 的液 体培养基 ： 将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为复写纸 3％ (3g/100ml)， 另外添 加 1％作为无机氮源的硫酸铵， 而将作为有机氮源的多价胨换成上述废菌体， 废菌体浓度按 照分别达到 0.5％、 1.0％、 1.5％、 2.0％、 3.0％的方式添加， 再用磷酸或氢氧化钠将 pH 调整 到 4.8。接下来液体培养基用高压釜在 121℃下进行 15 分钟的加热灭菌。然后将 1 白金圏 的培养了的里氏木霉接种于该液体培养基， 于 28℃、 180rpm 下震荡培养 7 天。在第 7 天， 对 培养液进行离心分离， 测定上清液的 β- 葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。
( 酶活性的测定 )
对上述得到的培养液进行酶活性测定。
β- 葡聚糖酶活性， 使用 Mega-Zyme 公司生产的 β- 葡聚糖酶测定试剂盒， 通过对 以色素标记了的 β- 葡聚糖为底物进行酶分解生成的染色片段进行吸光度测定。具体来 说， 向 0.1mL 偶氮大麦葡聚糖底物溶液中加入 0.1mL 培养液， 于 40℃下准确进行 10 分钟酶
反应后， 加 0.6mL 停止液 ( 含有 4％醋酸钠、 0.4％醋酸锌、 80％甲氧基乙醇 (pH5)〕 ， 放置 5 分钟， 停止反应。然后离心分离后， 测定上清液 590nm 的吸光度。1 单位的 β- 葡聚糖酶活 性以在 40℃、 反应 10 分钟条件下， 以 1 分钟内生成相当于 1μmol 葡萄糖的还原糖的酶量表 示。
而木聚糖酶活性， 通过以来自 “oat spelts” 的木聚糖作为底物的酶加水分解生成 的还原糖与 DNS 反应， 通过 540nm 吸光度的增加值进行定量。更具体来说， 向 1.9ml 的 1％ 木聚糖底物溶液 [ 将 Sigma 公司生产的 “Xylan， from oat spelts” 溶解于 200mM 醋酸缓冲 液 (pH4.5)] 中加入 0.1mL 培养液， 于 40℃下准确进行 10 分钟酶反应后， 加入 4mLDNS 试剂 ( 含有 0.75％二硝基水杨酸、 1.2％氢氧化钠、 22.5％酒石酸钠钾 4 水和物、 0.3％乳糖 1 水 和物 ) 充分混合， 使反应停止。为了对反应停止液中含有的还原糖量进行定量， 将反应停止 液于沸腾水浴中准确加热 15 分钟。然后冷却至室温后， 通过测定 540nm 的吸光度， 以相当 于木糖的还原糖量进行定量。1 单位的木聚糖酶活性以于 40℃、 10 分钟的反应条件下， 1分 钟生成相当于 1μmol 木糖的还原糖的酶量表示。结果如图 1 所示。
参考例 1
将 Mandel 培养基的作为碳源的结晶纤维素 (Fluka BioChemika 生产、 商品名微 晶纤维素 PH101) 的浓度调整为 1％， 而将作为有机氮源的多价胨换成像实施例 1 那样得到 的废菌体， 分别按照浓度达到 0.5％、 1.0％、 1.5％、 2.0％、 3.0％的方式进行添加， 像实施例 1 那样准备液体培养基。将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上 于 28℃下， 培养 7 天， 使孢子充分形成， 将 1 白金圏的该孢子接种于液体培养基， 于 28℃、 180rpm 下， 震荡培养 7 天。在第 7 天， 对培养液进行离心分离， 像实施例 1 那样测定 β- 葡 聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图 2 所示。
实施例 2
使用实施例 1 中得到的培养上清液 (3％复写纸、 1.5％的废菌体 ) 以及参考例 1 中 得到的培养上清液 (1％微结晶纤维素培养基、 1.5％的废菌体 )， 进行纤维素原料的糖化试 验。 作为供糖化用的纤维素原料， 准备稻秸和日本造纸化学公司生产的纤维素 “KC-FLOCK” 。 稻秸用以下方法进行脱木质素处理。
对稻秸进行微粉碎， 然后悬浮于 0.3N 的 NaOH 中， 于 120℃下处理 15 分钟， 用水充 分洗净后， 进行干燥。 纤维素原料的糖化， 将由纤维素原料 ： 0.8g、 培养上清液 ： 9.0ml、 1M 醋 酸缓冲液 (pH4.8) ： 0.2ml 构成的溶液 ( 纤维素原料 8％溶液 ) 于 50℃、 pH4.8 下震荡 48 小 时， 进行糖化， 对生成的葡萄糖用葡萄糖 Cl-Test Wako( 和光纯药工业 ) 进行测定。结果如 图 3 和图 4 所示。
实施例 3
从啤酒的制造过程中收集啤酒粕， 于 0.3N 氢氧化钠水溶液中在 121℃下通过 15 分 钟的高压釜处理除去木质素， 充分水洗后， 使其干燥。
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。然后在带挡板的 500mL 容量三角烧瓶中像下述那样准备 100mM 的液 体培养基 ： 将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为上述脱木质素处理后的啤酒粕 3％ (3g/100ml)， 另外添加 1％作为无机氮源的硫酸铵， 而将有机氮源换成 0.2％多价胨， 或 者与实施例 1 同样地得到的废菌体， 按照废菌体浓度分别达到 0.5％、 1.0％、 2.0％、 3.0％那样添加之后， 用磷酸或氢氧化钠将 pH 调整到 4.8。将 1 白金圏的培养的里氏木霉接种于 该液体培养基， 于 28℃、 180rpm 下震荡培养 7 天。在第 7 天， 对培养液进行离心分离， 用与 实施例 1 同样地方法测定上清液的 β- 葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图 5 所示。
实施例 4
使用丸粒麦茶 ( アサヒビ一ルモルト公司生产 ) 与开水， 熬出麦茶。除去作为水 溶液的麦茶， 将剩下的粕水洗后， 使其干燥， 得到麦茶抽提粕。
将得到的麦茶抽提粕进行粉碎处理， 于 0.3N 氢氧化钠水溶液中在 121℃下通过 15 分钟的高压釜处理除去木质素， 充分水洗后， 使其干燥。
得到的麦茶抽提粕于 0.3N 氢氧化钠水溶液中在 121℃下通过 15 分钟的高压釜处 理除去木质素， 充分水洗后， 使其干燥。
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。然后将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为 5％的上述脱木 质素处理后麦茶粕 (3g/100ml)， 其他使用与实施例 3 同样的方法操作， 对得到的培养液进 行酶活性测定。结果如图 6 所示。
实施例 5 对小麦麦糠 ( 昭和产业社制 ) 进行粉碎处理， 于 0.3N 氢氧化钠水溶液中在 121℃ 下通过 15 分钟的高压釜处理除去木质素， 充分水洗后， 使其干燥。
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。 然后在 500mL 容量带挡板的三角烧瓶中像下述那样准备 100mM 的液体 培养基 ： 将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为上述脱木质素处理后的小麦麦糠 5％ (5g/100mL)， 另外添加 1％作为无机氮源的硫酸铵， 而将作为有机氮源的多价胨换成像 实施例 1 那样得到的废菌体， 按照浓度分别达到 0.5％、 1.0％、 2.0％、 3.0％、 4.0％、 5.0％ 那样添加之后， 用磷酸或氢氧化钠将 pH 调整到 4.8。然后将 1 白金圏的培养的里氏木霉接 种于该液体培养基， 于 28℃、 180rpm 下震荡培养 7 天。在第 7 天， 对培养液进行离心分离， 用与实施例 1 同样的方法测定上清液的 β- 葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图 7 所 示。
实施例 6
使用粉碎装置 (AMOS 公司生产 “锤磨机” ) 将苹果果实 ( 品种 “富士” ) 粉碎， 接着 使用苹果搾汁装置 ( 月岛 -ANDRITZ 生产 “轧辊式榨汁过滤机” ) 进行搾汁。从搾汁机回收 渣饼， 进行水洗、 干燥。
得到的苹果渣饼于 0.3N 氢氧化钠水溶液中在 121℃下通过 15 分钟的高压釜处理 除去木质素， 充分水洗后， 进行干燥， 实施粉碎处理， 使其大小均一后使用。
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。然后在 500mL 容量带挡板的三角烧瓶中像下述那样准备 100mM 的液 体培养基 ： 将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为 4％ (4g/100mL) 上述进行了脱 木质素处理的苹果榨汁粕， 另外添加 1％作为无机氮源的硫酸铵， 而将作为有机氮源的多价 胨换成像实施例 1 那样得到的废菌体， 按照浓度分别达到 0.5％、 1.0％、 2.0％、 3.0％那样 添加之后， 用磷酸或氢氧化钠将 pH 调整到 4.8。然后将 1 白金圏培养的里氏木霉接种于该 液体培养基， 于 28℃、 180rpm 下震荡培养 7 天。在第 7 天， 对培养液进行离心分离， 用实施
例 1 同样的方法测定上清液的 β- 葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图 8 所示。
参考例 2
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。然后在 500mL 容量带挡板的三角烧瓶中像下述那样准备 100mM 的液 体培养基 ： 将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为复写纸 3％ (3g/100mL)， 另外添 加 1％作为无机氮源的硫酸铵， 而将作为有机氮源的多价胨换成玉米浸渍液 (Corn Steep Liquor ： CSL)， 按照浓度分别达到 0.5％、 1.0％、 2.0％、 3.0％那样添加之后， 用磷酸或氢氧 化钠将 pH 调整到 4.8。然后将 1 白金圏培养的里氏木霉接种于该液体培养基， 于 28 ℃、 180rpm 下震荡培养 7 天。在第 7 天， 对培养液进行离心分离， 用与实施例 1 同样的方法测定 上清液的 β- 葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图 9 所示。
参考例 3
将里氏木霉 QM9414(NBRC 31329) 于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在 28℃下培养 7 天， 使孢子充分形成。 然后在 500mL 容量带挡板的三角烧瓶中像下述那样准备 100mM 的液体 培养基 ： 将作为 Mandel 培养基碳源的结晶纤维素置换为复写纸 3％ (3g/100mL)， 另外添加 1％作为无机氮源的硫酸铵， 而将作为有机氮源的多价胨按照浓度分别达到 0.5％、 1.0％、 2.0％、 3.0％的方式添加之后， 用磷酸或氢氧化钠将 pH 调整到 4.8。 然后将 1 白金圏培养的 里氏木霉接种于该液体培养基， 于 28℃、 180rpm 下震荡培养 7 天。在第 7 天， 对培养液进行 离心分离， 用与实施例 1 同样的方法测定上清液的 β- 葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结 果如图 10 所示。
产业上利用的可能性
能够同时高效生产对稻秸等天然纤维素资源的糖化极其有用的 β- 葡聚糖酶和 木聚糖酶， 可利用于由纤维素资源制造乙醇的生物量制造乙醇。