抗微生物剂 本发明涉及针对革兰氏阳性细菌的抗微生物剂， 特别涉及融合蛋白， 所述融合蛋 白由具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 或 C 端融合于所述酶的其他肽段组 成。 而且， 本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的载体以及包含所 述核酸分子或所述载体的宿主细胞。 此外， 本发明涉及所述融合蛋白作为药物， 特别是用于 治疗或预防革兰氏阳性细菌感染， 作为诊断手段或作为美容用物质的用途。本发明还涉及 处理或防止食品、 食物加工装置、 食品加工厂、 与食品相接触的表面、 医疗装置、 医院和手术 中的表面的革兰氏阳性细菌污染。此外， 本发明涉及包含所述融合蛋白的药物组合物。
与革兰氏阴性细菌相对， 革兰氏阳性细菌不具有外膜。其细胞质膜由高至 25nm 厚 的形成细胞壁的肽聚糖层 ( 对于革兰氏阴性细菌， 其仅为高至 5nm) 所包围。革兰氏阳性细 菌的细胞壁的主要目的是维持细菌形状， 并抵消内部的细菌细胞压力。肽聚糖， 亦称胞壁 质， 是由糖和氨基酸组成的聚合物。其糖组分由交替的 β-(1， 4) 连接的 N- 乙酰葡糖胺和 N- 乙酰胞壁酸残基组成， 其构成糖成分。三至五个氨基酸的肽链附于 N- 乙酰基胞壁酸。肽 链可交联于另一股的肽链， 形成 3D 筛状层。肽链可含有 D- 和 L- 氨基酸残基， 且其组成对 于不同细菌可有差异。
一种特定情况见于分枝杆菌 (Mycobateria) 的案例， 其通常视为革兰氏阳性的。 分枝杆菌近来显示具有外细胞膜 (outer cell membrane)。所有分枝杆菌均具有特征性的 厚细胞壁， 其为疏水的、 蜡状， 并富含分枝菌酸 / 分枝菌酸盐 / 酯。细胞壁由疏水的分枝菌 酸盐 / 酯层和肽聚糖层组成， 两者通过阿拉伯半乳聚糖， 一种多糖， 结合在一起。为了克服 分枝杆菌的厚细胞壁， 新型抗微生物剂与壳多糖酶或类似用于破坏多糖层的蛋白的组合作 用可能是必要的。
已知多种类型具有杀菌或抑菌活性的试剂， 例如抗生素、 细胞内溶素、 抗微生 物肽和防卫素。然而， 微生物对抗生素的增加的抗性对于治疗越来越多由细菌导致的 感染造成困难。对于由革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 肠 球 菌 (Enterococci)、 链 球 菌 (Streptococci)、 单 核 细 胞 增 生 利 斯 特 氏 菌 (Listeria monocytogenes) 和艰难梭菌 (Clostridium difficile)， 特别是由例如甲氧西林抗性的金 黄色葡萄球菌和万古霉素抗性的肠球菌导致的感染产生了特别的困难。
细胞内溶素为细菌噬菌体 ( 或细菌的病毒 ) 编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体 复制的裂解周期中的晚期基因表达过程中合成， 并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体 从受感染的细胞的释放。其为 β(1， 4)- 糖基化酶 ( 溶菌酶 )、 糖基转移酶、 酰胺酶或内肽 酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在 1991 年由 Gasson(GB2243611) 提出。尽管细胞内 溶素的杀灭能力久为人知， 由于抗生素的成功和主宰地位， 这些酶作为抗细菌剂的用途一 直受忽略。仅在多重抗生素耐药性细菌出现后， 用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单概 念方才受到注意。出现了开发完全新颖类型的抗细菌剂的令人瞩目的需求， 且用作酶抗生 素 (enzybiotics)(“酶” 和 “抗生素” 的组合术语 ) 的细胞内溶素完美地符合该需求。在 2001 年， Fischetti 及其同事首次阐明了细菌噬菌体 Cl 细胞内溶素对 A 组链球菌的治疗潜 力 (Nelson 等， 2001)。从此， 多份文献确立了细胞内溶素作为控制细菌感染， 特别是革兰氏
阳性细菌的细菌感染的有吸引力和补充的替代手段。接着， 针对其他革兰氏阳性病原体如 肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)(Loeffler 等， 2001)、 炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)(Schuch 等， 2002)、 无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)(Cheng 等， 2005) 和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(Rashel 等， 2007) 的不同的细胞内溶素证明 了其作为酶抗生素的效力。然而， 亦已知在一些条件下 ( 例如高离子强度 )， 细胞内溶素可 产生稳定的原生质体， 此时内部细菌细胞压力不足以导致细胞破裂。 在这些条件下， 细菌细 胞壁可再生， 而细菌会存活。
抗微生物肽 (AMP) 代表广泛范围的短的、 阳离子性或两亲性 (amphipatic)、 由基 因编码的肽抗生素， 其可见于几乎所有生物。不同的 AMP 显示不同的特性， 且该类型中的 许多肽不仅作为抗生素， 还作为细胞穿透肽的模板正经受彻底的研究。尽管分享一些共同 特征 ( 例如， 阳离子性， 两亲性和小尺寸 )， AMP 序列变化极大， 且已提出至少四种结构组 (α- 螺旋， β- 片层， 延伸型 (extended) 和环状 (looped)) 引起观察到的 AMP 构象的多样 性。 同样， 已提出了几种其作为抗生素的作用模式， 且显示例如许多这些肽的主要靶是细胞 膜， 而对于其他肽， 主要靶是细胞质侵袭和核心代谢功能的扰乱。尽管缺乏特异性靶结合， AMP 可变得足够集中 (concentrated) 以显示协作活性 (cooperative activity)， 例如， 通 过在膜上形成孔， 如对于大部分 AMP 的情况下。然而， 该现象仅在模式磷脂双分子层中观察 到， 且在一些情况下， 需要在膜中 AMP 的浓度高至每六个磷脂分子一个肽分子来使这些事 件发生。所述浓度接近甚至可达到全膜饱和。因为对于 AMP 最低抑制浓度 (MIC) 通常在低 微摩尔范围， 可理解地， 对于这些阈值的相关性及其在体内的重要性产生了怀疑 (Melo 等， Nature reviews， Microbiology， 2009， 245)。
防卫素是一大家族的小的、 阳离子性、 富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽， 见于 脊椎动物和无脊椎动物两者。防卫素根据半胱氨酸的间隔样式 (spacing pattern) 分为五 个组 ： 植物、 无脊椎动物、 α-、 β- 和 θ- 防卫素。后三种主要见于哺乳动物。α- 防卫素 为见于嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的蛋白质。 β- 防卫素为最广泛分布的， 并由白细胞和许 多类型的上皮细胞所分泌。 θ- 防卫素目前很少见， 例如见于猕猴 (rhesus macaques) 的白 血病。防卫素对细菌、 真菌和许多有包膜和无包膜病毒有活性。然而， 有效杀灭细菌所需的 浓度多数情况下较高， 即在微摩尔范围。 许多肽的活性在生理盐条件、 二价阳离子和血清的 存在下受限。取决于疏水氨基酸残基的含量， 防卫素亦显示溶血活性。
因此， 有对针对革兰氏阳性细菌的新型抗微生物剂的需要。
该目标通过权利要求中限定的主题解决。
如本文中使用的术语 “蛋白质” 与术语 “多肽” 所指相同。本文中使用的术语 “蛋 白质” 指氨基酸残基通过肽键以特定序列连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例 如共价附着多种基团如糖和磷酸来修饰。 其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链 相联系， 得到偶合的蛋白质， 其也包含于本文中使用的术语 “蛋白质” 中。有多种方式阐明 多肽链的折叠， 特别是针对 α 螺旋和 β 折叠片层的存在。如本文中使用的术语 “蛋白质” 指所有四种类型的蛋白质， 即全 α、 全 β、 α/β 和 α 加上 β。而且， 术语 “蛋白质” 指复 合物， 其中所述复合物指均聚物 (homomer)。
如本文中使用的术语 “融合蛋白” 指由两个核酸序列融合所得的表达产物。上述 蛋白可例如在重组 DNA 表达系统中产生。而且， 如本文中使用的术语 “融合蛋白” 指第一氨基酸序列如例如酶， 与第二或更进一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更进一步的氨 基酸序列可限定域或任何类型的肽段。优选地， 所述第二和 / 或更进一步的氨基酸序列对 于第一氨基酸序列为外源的， 并不与第一氨基酸序列的任何域实质上同源。
如本文中使用的术语 “肽段” 指连接于蛋白质如酶的任何类型的肽。
如本文中使用的术语 “肽” 指由约 2 至约 100 个氨基酸残基， 更优选约 4 至约 50 个氨基酸残基， 更优选约 5 至 30 个氨基酸残基组成的短多肽， 其中一个氨基酸残基的氨基 基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然出 现的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从 天然蛋白移出， 或者可使用常规的肽合成技术 ( 例如固相合成 ) 或分子生物学技术 ( 参见 Sambrook， J. 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.(1989)) 来制备。天然出现的肽的实例为抗微生物肽、 防卫素、 寿司肽 (sushi peptide)。 合成产生的肽的实例为聚阳离子性、 两亲性 (amphiphatic) 或疏 水性肽。本发明意指的肽并不指用于纯化或定位蛋白质的 His- 标记、 Strep- 标记、 硫氧还 蛋白或麦芽糖结合蛋白 (MBP) 等。
如本文中使用的术语 “细胞内溶素” 指适于水解细菌细胞壁的酶。 “细胞内溶素” 包含至少一个 “酶活性域” (EAD)， 其具有至少一种下述活性 ： 内肽酶、 壳多糖酶、 T4 样胞壁 质酶 (T4 like muraminidase)、 lambda 样胞壁质酶、 N- 乙酰基 - 胞壁酰 -L- 丙氨酸酰胺酶 ( 酰胺酶 )、 胞壁酰 -L- 丙氨酸 - 酰胺酶、 溶菌酶 (muramidase)、 裂解性糖基转移酶 (lytic transglycosylase)(C)、 裂解性糖基转移酶 (M)、 N- 乙酰基溶菌酶、 N- 乙酰 - 氨基葡糖苷酶 ( 溶菌酶 ) 或糖基转移酶如例如 KZ144 和 EL188。此外， 所述细胞内溶素还可包含无酶活性 并结合于宿主细菌细胞壁的区， 所谓 CBD( 细胞壁结合域 )。
如本文中使用的术语 “CAD” 指细胞内溶素的细胞壁结合域。在对革兰氏阳性细 菌具有特异性的细胞内溶素中， CBD 常见于 C 端， 但亦可见于 N 端或蛋白内其他位置。通常 CBD 域介导细胞内溶素对细菌细胞壁的结合， 但不具有表现为水解细胞壁的酶活性。
如本文中使用的术语 “EAD” 指细胞内溶素的酶活性域。EAD 负责水解细菌肽聚糖。 其显示细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD 还可由多于一种酶活性模块构成。
术语 “自溶素” 指与细胞内溶素相关的酶， 但其由细菌编码并涉及例如细胞分裂。 关于自溶素的综述可见于 “Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86” 。
如本文中使用的术语 “细菌素” 指能够抑制其他细菌生长的蛋白质样、 多肽样或肽 样物质。一些细菌素能够降解细菌细胞壁， 如溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )、 变溶 菌素 (mutanolysin)( 降解链球菌细胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。优选地， 所述抑制是特别通过将所述其他细菌吸收于所述细菌素的特定受体所致的。一般而言， 细 菌素由微生物产生。然而， 如本文中使用的术语 “细菌素” 指由微生物产生的分离形式或指 合成产生的形式两者， 且还指基本上保留其亲本细菌素的活性， 但其序列经插入或缺失一 个或多个氨基酸残基而改变的变体。
如本文中使用的术语 “抗微生物肽 (AMP)” 指任何具有杀微生物和 / 或抑微生物活 性的肽。 因此， 如本文中使用的术语 “抗微生物肽” 特别指任何具有抗细菌、 抗真菌、 抗霉菌、 抗寄生物、 抗原生生物、 抗病毒、 抗传染 / 感染 (anti-infectious， anti-infective) 和 / 或杀菌、 杀藻、 杀阿米巴、 杀微生物、 杀细菌、 杀真菌、 杀寄生物、 杀原生生物 (protozoacidal， protozoicidal) 性的肽。
如本文中使用的术语 “防卫素” 指存在于动物， 优选哺乳类， 更优选人之内的肽， 其 中所述防卫素在固有宿主防御系统中起摧毁外源物质如感染性细菌和 / 或感染性病毒和 / 或真菌的作用。防卫素是非抗体杀微生物和 / 或杀肿瘤蛋白质、 肽或多肽。 “防卫素” 的实 例为 “哺乳动物防卫素” 、 “α- 防卫素” 、 “β- 防卫素” 、 indolicidin 和马加宁 (magainin)。 如本文中使用的术语 “防卫素” 指来自动物细胞的分离形式或合成产生的形式两者， 且还指 基本上保留其亲本蛋白质细胞毒活性， 但其序列经一个或多个氨基酸残基的插入或缺失而 改变的变体。
如本文中使用的术语 “寿司肽” 指具有短的共同重复的补体调控蛋白 (CCP)。寿司 肽的寿司模块在许多不同蛋白质中作为蛋白质 - 蛋白质相互作用域起作用。已显示包含寿 司域的肽具有抗微生物活性。
如本文中使用的术语 “阳离子肽” 指具有荷正电的氨基酸残基的肽。优选地， 阳离 子肽具有 9.0 或更高的 pKa 值。通常， 所述阳离子肽的至少四个氨基酸残基可荷正电， 例如 为赖氨酸或精氨酸。 “荷正电” 指所述氨基酸残基的侧链在接近生理环境具有净的正电荷。 可重组产生的天然出现的阳离子肽的实例为防卫素、 马加宁、 蜂毒肽和天蚕素 (cecropin)。 如本文中使用的术语 “聚阳离子肽” 指主要由赖氨酸和 / 或精氨酸残基构成的合 成产生的肽。
如本文中使用的术语 “两亲肽” 指具有亲水性和疏水性功能基团两者的肽。优选 地， 如本文中使用的术语 “两亲肽” 指具有确定排列的亲水性和疏水性基团的肽， 例如两亲 肽可为例如 α- 螺旋， 沿螺旋一侧主要为非极性侧链， 而沿其其余的表面为极性残基。
如本文中使用的术语 “疏水基团” 指基本上不溶于水， 但溶于油相， 且在油相中的 溶解性高于在水中或在水相中的溶解性的化学基团如氨基酸侧链。在水中， 具有疏水侧链 的氨基酸彼此相互作用生成非水环境。 具有疏水侧链的氨基酸的实例为丙氨酸、 缬氨酸、 亮 氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸、 组氨酸、 色氨酸和酪氨酸。
如本文中使用的术语 “缺失” 指从对应的起始序列去除 1、 2、 3、 4、 5 或更多个氨基 酸残基。
如本文中使用的术语 “插入” 或 “添加” 指向对应的起始序列插入或添加 1、 2、 3、 4、 5 或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语 “取代” 指用不同的氨基酸替换位于某个位置的氨基酸残基。
本发明涉及针对革兰氏阳性细菌的新颖的抗细菌剂， 特别涉及包含 (composed of) 具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 端或 C 端或两端融合于该酶的另一 肽段的融合蛋白， 或由具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 端或 C 端或两端 融合于该酶的另一肽段构成的融合蛋白。
本发明的融合蛋白具有下述优点 ： 其可防止稳定原生质体的再生， 并因此防止应 消灭的细菌的存活。细菌导致的原生质体再生在一些条件下 ( 例如高离子强度 ) 发生， 此 时内部细菌细胞压力不足以导致细胞破裂， 并导致细菌的存活。
在本发明的一个方面， 具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶为细胞内溶 素、 自溶素和 / 或细菌素。
在本发明的另一个方面， 根据本发明的酶亦可包含不具酶活性并结合于宿主细菌 细胞壁的区， 所谓的 CBD( 细胞壁结合域 )。
根据本发明的优选的融合蛋白描述于 SEQ ID NO ： 63 至 90。根据 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白可在 N 端包含一个或多个其他氨基酸残基。优选地所述其他氨基酸残基 为甲硫氨酸。
优选地， 所述细胞内溶素由对革兰氏阳性细菌具有特异性的细菌噬菌体编码， 所 述革兰氏阳性细菌如列于下表的包含人或动物病原性菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的 革兰氏阳性细菌 ：
表1：
I. 放线菌门 (Phylum Actinobacteria)
纲： 放线菌纲 (Actinobacteridae)
目： 放线菌目 (Actinomycetales)
科：
放 线 菌 亚 目 (Actinomycineae) ： 放 线 菌 科 (Actinomycetaceae)( 放 线 菌 属 (Actinomyces)， 动弯杆菌属 (Mobiluncus)) 棒杆菌亚目 (Corynebacterineae) ： 分枝杆菌科 (Mycobacteriaceae)( 分枝杆菌 属 (Mycobacterium))， 诺卡氏菌科 (Nocardiaceae)， 棒杆菌科 (Corynebacteriaceae)
弗 兰 克 氏 菌 亚 目 (Frankineae) ： 弗 兰 克 氏 菌 科 (Frankiaceae) 微 球 菌 亚 目 (Micrococcineae) ： 短杆菌科 (Brevibacteriaceae)
丙酸杆菌亚目 (Propionibacteriaceae) ： ( 丙酸杆菌属 (Propionibacterium)) 目： 双歧杆菌目 (Bifidobacteriales)
科：
双 歧 杆 菌 科 (Bifidobacteriaceae)( 双 歧 杆 菌 属 (Bifidobacterium)， 镰 刀 弧 菌 属 (Falcivibrio)，加 德 纳 氏 菌 属 (Gardnerella)) 其 他 亚 纲 ： 微酸菌 亚 纲 (Acidimicrobidae)，科 里 氏 杆 菌 亚 纲 (Coriobacteridae)，红 色 杆 菌 亚 纲 (Rubrobacteridae)， 球形杆菌亚纲 (Sphaerobacteridae)
II. 厚壁菌门 (Phylum Firmicutes)
纲： 芽孢杆菌纲 (Bacilli)
目： 芽孢杆菌目 (Bacillales) ：
科：
芽 孢 杆 菌 科 (Bacillaceae)( 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus))，利 斯 特 氏 菌 科 (Listeriaceae)( 利斯特氏菌属 (Listeria))， 葡萄球菌科 (Staphylococcaceae)( 葡萄球 菌属 (Staphylococcus)， 孪生球菌属 (Gemella)， Jeotgalicoccus)
目： 乳杆菌目 (Lactobacillales) ：
科： 肠 球 菌 科 (Enterococcaceae)( 肠 球 菌 属 (Enterococcus))， 乳杆菌科 (Lactobacillaceae)( 乳杆菌属 (Lactobacillus)， 片球菌属 (Pediococcus))， 明串珠菌科 (Leuconostocaceae)( 明串珠菌属 (Leuconostoc))， 链球菌科 (Streptococcaceae)( 乳球 菌属 (Lactococcus)， 链球菌属 (Streptococcus))
纲： 梭菌纲 (Clostridia)
目 ：梭 菌 目 (Clostridiales)( 梭 菌 属 (Clostridium)，消 化 链 球 菌 属 (Peptostreptococcus)， 月形单胞菌属 (Selenomonas))
目： 盐厌氧菌目 (Halanaerobiales)
目： 热厌氧菌目 (Thermoanaerobacterales)
纲： 柔膜菌纲 (Tenericutes/Mollicutes)
目： 枝 原 体 目 (Mycoplasmatales)( 枝 原 体 属 (Mycoplasma)，脲 原 体 属 (Ureaplasma))
目： 虫原体目 (Entomoplasmatales)( 螺原体属 (Spiroplasma))
目： 厌氧原体目 (Anaeroplasmatales)( 丹毒丝菌属 (Erysipelothrix))
目： 无胆甾原体目 (Acholeplasmatales)( 无胆甾原体属 (Acholeplasma))
目： Haloplasmatales(Haloplasma)
优选地， 所述自溶素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。
优选地， 所述细菌素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。 本 发 明 的 酶 具 有 针 对 包 含 人 或 动 物 病 原 性 菌 株 的 细 菌 组、 科、 属或种的革 兰 氏 阳 性 细 菌 的 细 胞 壁 降 解 活 性， 所述革兰氏阳性细菌如单核细胞增生利斯特氏 菌 (Liisteria monocytogenes)，金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)，粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)，屎 肠 球 菌 (Enterococcus faecium)，肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿 脓 链 球 菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球菌 (Streptococcus mutans)， 马 链 球 菌 (Streptococcus equi)， 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆 菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
优选的细胞内溶素为利斯特氏菌噬菌体细胞内溶素 PlyA118， PlyA500， PlyPSA， PlyA511， PlyP35， PlyP40， 葡萄球菌噬菌体 Phi 11， Phi MR11， LysK， 产气荚膜梭菌 PlyS6， Ply3626， 艰难梭菌 ： CD27L 细胞内溶素， 葡萄球菌 ： B30 细胞内溶素， 噬菌体 Dp-1 Pal 酰 胺酶， C1 细胞内溶素， Cpl-1 细胞内溶素， PlyGBS， 肠球菌 ： PlyV12， 炭疽芽孢杆菌 ： 噬菌体 gamma 细胞内溶素 PlyG。
优选的自溶素描述于 ： Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86.Epub 2008 Feb 11.Review. 优选的自溶素的实例为 AtlA 自溶素。
优选的细菌素为溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )， 变溶菌素 ( 降解链球菌细 胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。
更优选地， 细胞内溶素部分选自下组 ： 根据 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1， 根据 SEQ ID NO ： 58 的 Ply511， 根据 SEQ ID NO ： 59 的 LysK， 根据 SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素和根据
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20。
在本发明另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细 菌素包含氨基酸序列的修饰和 / 或改变。上述改变和 / 或修饰可包含突变如缺失、 插入和 添加、 取代或其组合和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基、 SH 或羧基基团的化学变化。所述本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细菌素呈现相应 的野生型细胞内溶素的裂解活性。然而， 所述活性可与相应的野生型细胞内溶素的活性相 同、 更高或更低。 所述活性可为相应的野生型细胞内溶素活性的约 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190 或约 200％甚至更高。所述活性可由 本领域技术人员通过本领域周知的测定法来测量， 例如平板裂解 (plate lysis) 测定法或 液体裂解 (liquid lysis) 测定法， 其描述于 Briers 等， J.Biochem.Biophys Methods 70 ： 531-533， (2007)) 或 Donovan DM， Lardeo M， Foster-Frey J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec ； 265(1) 或类似公开。
优选地， 本发明的融合蛋白的肽段融合于细胞内溶素的 N 端和 / 或 C 端。在一个 特别优选的实施方案中， 所述肽段仅融合于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 所述肽 段仅融合于酶的 C 端。然而， 还优选的是在 N 端和 C 端均具有肽段的修饰的融合蛋白。所 述在 N 端和在 C 端的肽段可为相同或不同的肽段。所述肽段可通过附加的氨基酸残基 ( 例 如由于克隆原因 ) 连接于酶。优选地， 所述肽段可通过至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附 加氨基酸残基连接于融合蛋白。在一个优选实施方案中， 所述肽段通过附加的氨基酸残基 甘氨酸和 / 或丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶。而且， 本发明的融合蛋白的肽段还在其 N 端包 含其他氨基酸。优选地， 所述肽段包含氨基酸甲硫氨酸 (Met) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。
本发明的融合蛋白的肽段优选共价结合于酶。优选地， 所述肽段由至少 5 个， 更优 选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99 或至少 100 个氨基酸残 基组成。特别优选的是包含约 5 至约 100 个氨基酸残基、 约 5 至约 50 或约 5 至约 30 个氨 基酸残基的肽段。更优选的是包含约 6 至约 42 个氨基酸残基、 约 6 至约 39 个氨基酸残基、 约 6 至约 38 个氨基酸残基、 约 6 至约 31 个氨基酸残基、 约 6 至约 25 个氨基酸残基、 约6至 约 24 个氨基酸残基、 约 6 至约 22 个氨基酸残基、 约 6 至约 21 个氨基酸残基、 约 6 至约 20 个氨基酸残基、 约 6 至约 19 个氨基酸残基、 约 6 至约 16 个氨基酸残基、 约 6 至约 14 个氨基 酸残基、 约 6 至约 12 个氨基酸残基、 约 6 至约 10 个氨基酸残基或约 6 至约 9 个氨基酸残基 的肽段。
优选地， 所述肽段并非标记如 His6 标记、 Strep 标记、 Avi 标记、 Myc 标记、 Gst 标 记、 JS 标记、 半胱氨酸标记、 FLAG 标记或本领域已知的其他标记， 且并非硫氧还蛋白或者麦 芽糖结合蛋白 (MBP)。然而， 本发明的肽段和 / 或细胞内溶素、 自溶素或细菌素可另行包含 这样的一种或多种标记。
更优选地， 所述肽段具有通过融合蛋白首先与肽聚糖层相互作用， 降解肽聚糖， 然 后与细胞质膜相互作用， 使细胞质膜去稳定化 (destabilize)， 从而促进细菌细胞破裂的功能。 在本发明的一个方面， 融合肽段是阳离子肽， 更优选聚阳离子肽。优选地， 所述阳 离子肽包含一个或多个荷正电的赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基。优选地， 在该肽 中多于约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基是荷正电的氨基酸残基。有 利地， 所述阳离子肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 因此增强了本发 明的抗微生物剂和 / 或融合蛋白的阳离子性。在本发明的另一个实施方案中， 所述融合于 酶的阳离子肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个氨基酸残基组成。优选地， 所述阳离子肽的至少约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基为精氨酸或赖氨酸。在本发明的另一个实施方案中， 所述阳 离子肽包含约 3 至约 50 个， 更优选约 5 至约 20 个， 例如约 5 至约 15 个氨基酸残基， 且所述 氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基。优选的阳离子肽描述于 SEQ ID NO ： 13 和 14。
特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子和 / 或 聚阳离子肽段。具体而言， 优选包含至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 或 17 个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子肽段。更优选的是包含至少一个 KRK 基序 (lys-arg-lys)， 优选至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32 或 33 个 KRK 基序的阳离子肽段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含电中性的氨基酸残基， 特别是甘氨酸和 / 或丝 氨酸残基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电 的氨基酸残基， 特别是赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸残基， 更优选赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约 10％至约 20％电中性氨基酸残基， 特别是甘 氨酸和 / 或丝氨酸残基组成的阳离子肽段。 优选的是由约 4％至约 8％丝氨酸残基， 约 33％ 至约 36％精氨酸残基和约 56％至约 63％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至 少一个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 的基序的多肽段， 其中 X 是除了赖氨酸、 精氨酸和组氨酸 之外的任何氨基酸。 特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的多肽 段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 或 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的阳离子肽段。
亦优选的是由约 9 至约 16 ％甘氨酸残基， 约 4 至约 11 ％丝氨酸残基， 约 26 至约 32％精氨酸残基和约 47 至约 55％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个 根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的多肽段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的阳离子 段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残 基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电的氨 基酸残基特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约
10％至约 20％疏水氨基酸残基、 缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半 胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬 氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残基组成的阳离子肽段。
特别优选的是选自由下列序列组成的组的肽段 ：
表2：
肽段 KRKKRK KRKKRKKRK RRRRRRRRR
KKKKKKKK KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKR KKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKK RRRRRRRRRRRRRRRRRRR KKKKKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKK 8 10 12 14 16 18 19 19 19 20 21 21 22 24 25 SEQ ID NO ： 26 SEQ ID NO ： 27 SEQ ID NO ： 28 SEQ ID NO ： 29 SEQ ID NO ： 30 SEQ ID NO ： 31 SEQ ID NO ： 32 SEQ ID NO ： 33 SEQ ID NO ： 34 SEQ ID NO ： 35 SEQ ID NO ： 36 SEQ ID NO ： 37 SEQ ID NO ： 38 SEQ ID NO ： 39 SEQ ID NO ： 40 长度 6 9 9 SEQ ID NO ： SEQ ID NO ： 24 SEQ ID NO ： 13 SEQ ID NO ： 2512CN 102482655 A KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK说明书31 38 39 4210/26 页 SEQ ID NO ： 41 SEQ ID NO ： 42 SEQ ID NO ： 43 SEQ ID NO ： 44KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRKGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK
在本发明的进一步的方面， 所述融合肽段是两亲肽， 其包含一个或多个荷正电的 赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基， 组合于一个或多个疏水的缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和 / 或甘氨酸氨基酸残基。氨基酸残基的侧链为下述顺序的取向 ： 阳离子性和疏水表 面簇集于肽的相反侧。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸为荷正电的 氨基酸。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸残基为疏水氨基酸残基。 有利地， 所述两亲肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 从而增强了后者蛋 白质的两亲性。 在本发明另一个实施方案中， 所述融合于酶的两亲肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或至少 50 个氨基酸残基组成。 在一个优选实施方案中， 所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为精氨酸 或赖氨酸残基， 和 / 或所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为疏水氨基 酸缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨 酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和 / 或甘氨酸。
优选的两亲肽为 SEQ ID NO ： 1 的 Pleurocidin， SEQ ID NO ： 2 的杀菌肽 P1， SEQ ID NO ： 3 的 Buforin II， SEQ ID NO ： 23 的 Buforin I 和 SEQ ID NO ： 4 的马加宁。其他优选的 两亲肽是 Cathelidicine， 例如 SEQ ID NO ： 5 的 LL-37， SEQ ID NO ： 48 的 Nigrocine 2 和 SEQ ID NO ： 49 的 Ascaphine 5。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是抗微生物肽， 其包含净正电荷， 和 50％左 右的疏水氨基酸。所述抗微生物肽具两亲性， 具有约 12 至约 50 个氨基酸残基的长度。
抗微生物肽的实例列于下表 ：
表3：
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段为由 Ding JL， Li P， Ho B Cell Mol Life Sci.2008 Apr ； 65(7-8) ： 1202-19 The Sushi peptides ： structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria 描述的寿司肽。 特别优选的是 SEQ ID NO ： 54 的寿司 1 肽。
优选的寿司肽为寿司肽 S1 和 S3 及其多重物 (multiple) ： FASEB J.2000 Sep ； 14(12) ： 1801-13。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是防卫素， 优选 Cathelicidine、 杀菌肽 P1、 杀菌肽 A 或马加宁 II。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是疏水肽， 例如具有 SEQ ID NO ： 50 的氨基 酸序列的 Apidaecine， 具有 SEQ ID NO ： 55 的氨基酸序列的 WLBU2- 变体和具有 SEQ ID NO ： 56 的氨基酸序列的 Walmagh1。具有氨基酸序列 Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO ： 12) 的疏水肽并非本发明的一部分。
在本发明的另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的肽段包含对氨基酸序列 的修饰和 / 或改变。此类修饰和 / 或改变可包括突变如缺失、 插入和添加、 取代或其组合， 和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基 -、 SH- 或羧基 - 基团的 化学变化。
特别优选的是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白， 且所述融合蛋白选自由下列融合 蛋白组成的组的融合蛋白 ：
表4：
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可在 N 端包含甲硫氨酸。
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可包含例如用于纯化的标记。优选的是 His6 标记， 优选位于融合蛋白的 C 端。该标记可 通过附加的氨基酸残基连接于融合蛋白， 例如由于克隆原因。优选地， 所述标记可通过至 少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。在一个优选实施 方案中， 所述融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。 在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或 亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白 在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述 融合蛋白。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。
在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附 加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端， 且该融合蛋白在 N 端包含附加的氨基酸残基甲硫氨酸 (Met) 或 甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。优选地， 所述 融合蛋白依照 SEQ ID NO ： 108 至 123。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其中所述 His6 标记在其 N 端还包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser)。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨 酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施 方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨
酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu -Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施方案中， 融合蛋 白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨 酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Hi s) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲 硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的 融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端。在另一个优选的实施方案 中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮 氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端， 且所述 His6 标 记在其 N 端包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸 和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser) 或甲硫氨酸和丝氨酸 (Met-Ser)。优选地， 所述融合蛋白是 SEQ ID NO ： 122 和 123。
融合蛋白是通过将至少两个核酸序列使用如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 所述的标准克隆技术来构建的。上述蛋白质可于例如重组 DNA 表达系统中产生。本发明的上述融合蛋白可通过将细胞内溶素及相应的肽段的核酸融 合来获得。
本发明的融合蛋白可融合或连接于其他别的蛋白质。 该其他别的蛋白质的实例是 硫氧还蛋白。
本发明进一步涉及编码本发明的融合蛋白的分离的核酸分子。 本发明进一步涉及 包含本发明的核酸分子的载体。 所述载体可提供所述本发明的融合蛋白的组成型或诱导型 表达。
本发明还涉及用于从微生物， 例如表达所述融合蛋白的经遗传修饰的合适宿主细 胞， 获得所述融合蛋白的方法。 所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母， 或为动物细胞如例 如哺乳动物细胞， 特别是人细胞。 在本发明的一个实施方案中， 所述宿主细胞是巴斯德毕赤 酵母 (Pichia pastoris) 细胞。宿主可仅由于生物技术原因选取， 例如产率、 溶解性、 成本 等， 但亦可从医学角度选取， 例如非病原体细菌或酵母、 人细胞。本发明的另一个方面涉及 用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的融合蛋白的表达的方法， 其中宿主细胞是通 过将编码所述融合蛋白的遗传材料引入所述宿主细胞， 并通过本领域技术人员众所周知的 遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物， 优选药物组合物， 其包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸分子或载体转化的宿主， 所述核酸分子或载体包含编码本发明的融合蛋白的 核苷酸序列。
本发明还涉及本发明的融合蛋白和 / 或经包含本发明的融合蛋白的编码核苷酸 序列的核酸转化的宿主作为药物的用途。在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白 和 / 或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备治疗和 / 或预防与革兰氏阳性细菌 相关的病症、 疾病或病状中的用途， 所述核酸分子包含编码本发明的修饰的融合蛋白的核 苷酸序列。具体而言， 待治疗和 / 或预防的病症、 疾病或病状可由包含人或动物病原性 菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌所造成， 所述革兰氏阴性细菌如单 核细胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes)， 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)， 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)， 屎肠球菌 (Enterococcus faecium)， 肺炎 链球菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球 菌 (Streptococcus mutans)， 马链球菌 (Streptococcus equi)， 艰难梭菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
本发明还涉及包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸转化的宿主的药物， 所述 核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面， 本发明涉及在需要治疗和 / 或预防的受试者中治疗病症、 疾病或 病状的方法， 所述方法包括施与所述受试者有效量的本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经 下述核酸转化的宿主或本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序 列。所述受试者可为人或动物。
具体而言， 所述治疗方法可用于治疗和 / 或预防由革兰氏阳性细菌特别是上述列 举的革兰氏阳性细菌造成的皮肤， 软组织， 呼吸系统， 肺， 消化道， 眼， 耳， 牙齿， 鼻咽， 口， 骨， 阴道， 菌血症 (bacteraemia) 伤口和 / 或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗 ( 或预防 ) 方法中的给药剂量和途径取决于待治疗的具体疾病 / 感染位置。给药途径可例如为经口、 局部 (topical)、 鼻咽、 肠胃外、 静脉内、 直肠或任何其 他的给药途径。
对于将本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经核酸 ( 所述核酸包含编码本发明的融 合蛋白的核苷酸序列 ) 转化的宿主或本发明的组合物施用于感染位置 ( 或有受感染危险的 位置 )， 可使用下述制剂， 所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、 氧化、 免疫应答 等， 直至其抵达感染位置。因此， 所述制剂可为胶囊、 锭剂、 丸剂、 粉末、 栓剂、 乳剂、 悬液、 凝 胶、 洗剂 (lotion)、 乳霜 (cream)、 软膏 (salve)、 可注射溶液、 糖浆、 喷雾剂、 吸入剂或任何 其他医药上合理的盖仑 (galenic) 制剂。优选地， 所述盖仑制剂可包含合适的载体、 稳定 剂、 调味剂、 缓冲液或其他合适的试剂。例如， 对于局部施用， 所述制剂可为洗液、 乳霜、 凝 胶、 软膏或硬膏 (plaster)， 对于鼻咽施用所述制剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。对 于经口施用以治疗和 / 或预防特定感染位置 ( 例如肠中 ) 的情况下， 可能必需保护本发明 的融合蛋白免受胃肠道的严峻消化环境的作用， 直至其抵达感染位置。 因此， 可使用细菌作 为载体， 其在胃中的初始消化步骤中存活， 并之后将本发明的融合蛋白分泌入肠环境。
在本发明的一个具体实施方案中， 本发明的融合蛋白和 / 或经包含核酸分子 ( 所 述核酸分子包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列 ) 的载体转化的宿主在制备用于治 疗和 / 或预防病症、 疾病或病状的药物中的用途， 所述病症、 疾病或病状是由单核细胞增 生利斯特氏菌造成的， 特别是婴儿脓毒性肉芽肿病 (Granulomatosis infantiseptica) ( 新 生 儿 利 斯 特 菌 病 (listeriosis))， 单 核 细 胞 增 多 症 (mononucleosis)， 结膜炎 (conjunctivitis)， 脑膜炎 (meningitis)， granulomatosis septica 和孕妇的利斯特菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由金黄色葡萄球 菌 造 成 的， 特 别 是 皮 肤 感 染 如 脓 皮 病 (pyoderma)， 特 别 是 毛 囊 炎 (folliculitis)， 疖 (furuncle)， 痈 (carbuncle)， 汗腺的脓肿 (abscesses of the sweat glands) 和天疱疮 (pemphigus)， 以及如皮鳞癣综合症 (scaled skin syndrome)。所述皮鳞癣综合症可表现 为三种临床形式 (clinical picture) ： 剥脱性皮炎 (dermatitis exfoliativa)， 大疱性脓 疱病 (impetigo bullosa) 和猩红热样红斑 (scarlatiniform erythroderma)。而且所述 由金黄葡萄球菌造成的病症、 疾病或病状是葡萄球菌肺炎 (Staphylococcus pneumonia)，入院求医癖 (hospitalism)， 特别是手术伤口感染， 产褥期乳腺炎和小肠结肠炎 (mastitis puerperalis and enterokolitis)， 以及食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由酿脓链球菌 造 成 的， 特 别 是 扁 桃 体 炎 (tonsillitis)， 咽 炎 (pharyngitis)， 猩 红 热 (scarlet)， 丹 毒 (erysipelas)，风 湿 热 (rheumatic fever) 和 急 性 肾 小 球 肾 炎 (acute glomerulonephritis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎链球菌造成 的， 特别是肺炎 (pneumonia)， 匐行性角膜溃疡 (ulcus serpens corneae)， 中耳炎 (otitis media)， 脑膜炎 (meningitis)， 腹膜炎 (peritonitis)， 乳突炎 (mastoiditis) 和骨髓炎 (osteomyelitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由产气荚膜梭菌造 成的， 特别是气性坏疽 (gas gangrene)， 坏死性 / 溃疡性肠炎 (enteritis necroticans ulcerosa) 和食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肉毒梭菌造成的， 特别是肉毒中毒 (botulism)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由艰难梭菌造成的， 特别是假膜性小肠结肠炎 (pseudomembranoes enterokolitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由炭疽芽孢杆菌造 成的， 特别是皮肤炭疽 (cutaneous anthrax)， 吸入炭疽 (inhalation anthrax)， 和胃肠炭 疽 (gastrointestinal anthrax)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由粪肠球菌或屎肠 球菌造成的， 如医院内感染 (nosokomial infections)， 和心内膜炎 (endokarditis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由蜡状芽孢杆菌造 成的， 特别是食物中毒， 支气管肺炎 (bronchialpneumonia)， 败血病 (septicaemia) 和脑膜 炎。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由鸟分枝杆菌， 副结 核分枝杆菌 (Mycobacterium paratuberculosis) 和结核分枝杆菌造成的， 特别是结核病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎枝原体造成 的， 特别是肺炎， 上呼吸道疾病和鼓膜感染
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由放线菌造成的， 特 别是人、 牲畜、 猫和犬中的放线菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由白喉棒杆菌造成 的， 特别是扁桃体、 鼻、 鼻咽或中耳的局部白喉 (localized diphtheria of the tonsils， the nose， the nasopharynx or the middle ear)， 喉、 气管和支气管的进行性白喉 (progressive diphtheria of the larynx， the trachea and the bronchi)， 毒性或恶性 白喉 (toxic or maligne diphtheria)， 皮肤和伤口白喉 (skin and wound diphtheria)。
优选地， 如果待治疗 ( 或预防 ) 的感染是由多重抗性的细菌菌株， 特别是针对一种 或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时， 将本发明的融合蛋白用于医疗， 所述抗生素为 ： 链霉素、 四环素、 头孢噻吩、 青霉素、 庆大霉素、 头孢噻肟、 头孢菌素、 头孢他啶或亚胺培南。此外， 本发明的融合蛋白可通过将其与常规的抗菌剂如抗生素、 硫醚抗生素、 细菌素或细胞 内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包 (pharmaceutical pack)， 其中至少 一个隔室包含本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转化的宿主或 本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法， 所述方法包括将药学上可接受 的稀释剂、 赋形剂或载体与本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转 化的宿主混合， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至另一个方面本发明的组合物是美容用组合物 (cosmetic composition)。 几 种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。 为了预防上述刺激或者为 了消除所述细菌病原体的次要病候 (minor manifestation)， 可使用特定的美容用制备物， 其包含足够量的本发明的融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阳性细菌。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白作为诊断手段用于医药、 食品或饲 料或环境诊断， 特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染特别是由革兰氏阳性细菌造成的细 菌感染。在此方面， 本发明的融合蛋白可用作工具特异性降解病原性细菌， 特别是革兰氏 阳性病原性细菌。通过本发明的融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如 Triton X-100 或其他减弱细菌细胞外膜 (envelope) 的添加剂如多粘菌素 B 来支持。 需要特定细胞 降解作为后续使用基于核酸的方法如 PCR、 核酸杂交或 NASBA( 基于核酸序列的扩增 )， 免疫 方法如 IMS、 免疫荧光或 ELISA 技术， 或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独 特细菌组或种具有特异性的蛋白质的酶测定法 ( 例如， β- 半乳糖苷酶之于肠细菌， 凝固酶 之于凝固酶阳性菌株 ) 对细菌进行特异性检测的起始步骤。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白用于处理或防止革兰氏阳性细菌对 食品、 食物加工装置、 食品加工厂、 与食品接触的表面如架子和食物储藏区域以及病原性、 偶发病原性 (facultative pathogenic) 或其他不受欢迎的细菌可潜在地侵染食物材料的 所有其他情况、 医疗设备和医院和手术中所有类型的表面的污染时。
具体而言， 本发明的融合蛋白可预防性地用作消毒剂 (sanitizing agent)。所述 消毒剂 (sanitizing agent) 可在手术之前或之后使用， 或者例如在血液透析过程中使用。 而且， 早产婴儿和免疫妥协的个体， 或有假体装置需要的那些受试者， 可用本发明的融合蛋 白治疗。所述治疗可为预防性的， 或在急性感染过程中进行。在相同背景下， 医院内感染， 特别是由抗生素抗性菌株如甲氧西林抗性的金黄葡萄球菌， 万古霉素抗性的粪肠球菌， 万 古霉素抗性的屎肠球菌， 肺炎链球菌， 疮疱丙酸杆菌， 多种耐药性结核分枝杆菌造成的感染 可预防性地或在急性期中用本发明的融合蛋白来治疗。因此， 本发明的融合蛋白可用作消 毒剂 (disinfectant) 且与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、 tensid、 溶剂、 抗生素、 硫 醚抗生素或细菌素组合使用。
对于本发明的融合蛋白作为消毒剂例如在医院、 牙科手术、 兽医、 厨房或浴室中 的用途， 所述融合蛋白可以以例如液体、 粉末、 凝胶或湿巾 (wet wipe) 或消毒薄片产品 (disinfection sheet product) 成分的形式制备为组合物。 所述组合物还可包含合适的载 体、 添加剂、 稀释剂和 / 或赋形剂以分别用于其相应的用途和形式， 但还可包含支持抗微生 物活性的试剂如 EDTA 或增强融合蛋白抗微生物活性的试剂。所述融合蛋白还可与常见的消毒剂如醇类、 醛类、 氧化剂、 酚类、 季铵化合物或 UV 光一同使用。对于消毒例如表面、 物品 和 / 或装置， 可将所述融合蛋白施于所述表面、 物品和 / 或装置。该施用可例如用任何手段 如布或抹布以所述消毒组合物润湿来进行， 或通过喷雾、 倾倒来进行。 所述融合蛋白可根据 相应的施用和 “反应时间” 而以不同的浓度使用以获得完全的抗微生物活性。
根据后文给出的具体描述本发明应用的其他范围将会是显而易见的， 然而， 应理 解的是， 具体的描述和具体实施例， 虽然代表了本发明的优选实施方案， 但仅作为例证而给 出， 因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员根据该具体描述 将会是显而易见的。 应理解的是， 前述一般描述和后述具体描述均仅为例示性和解释性的， 并不对权利要求书中要求保护的本发明有所限制。
下述实施例解释本发明， 但并不视为限定性的。除非另行指出， 使用如 Sambrock 等， 1989， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York 所述的标准分子生物学方法。
实施例 1 ： 用多种肽段在 N 端或 C 端修饰的 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 酶的克隆、 表达和纯化
酶 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1 是来源于肺炎链球菌噬菌体 Cpl-1 的细胞内溶素。 细胞内 溶素 Cpl-1 由 SEQ ID NO ： 91 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 91 的核酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具 有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 58 的 Ply511 是来源于单核细胞增生利斯特氏菌噬菌体 A511 的细胞 内溶素。细胞内溶素 Ply511 由 SEQ ID NO ： 92 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 92 的核酸分 子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核 酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 59 的 LysK 是来源于金黄葡萄球菌噬菌体 K 的细胞内溶素。细胞内溶 素 LysK 由 SEQ ID NO ： 93 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 93 的核酸分子是合成产生的， 在核 酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素 (Lss) 是来源于模仿葡萄球菌 (Staphylococcus simulans) 的细菌素。细菌素 Lss 由 SEQ ID NO ： 94 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 94 的核 酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而 在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20 是来源于疮疱丙酸杆菌噬菌体的细胞内溶素。细胞内 溶素 PA6-gp20 由 SEQ ID NO ： 123 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 123 的核酸分子是合成产 生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
使用表 5 中的下述肽段用于产生与酶 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 的融合蛋白 ：
表5：
合成产生了编码相应肽段的核酸分子， 该核酸分子的 5’ 端带有 Nde I(5′ -CAT ATG-3′ ) 限制性位点并且该核酸分子的 3’ 端带有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位 点， 但编码用于与细菌素 Lss 连接的 PK 和 PK2 的核酸分子除外， 对于其产生了在该核酸分
子的 5’ 端的 Nco I 限制性位点加上两个附加核苷酸 (5′ -CCA TGG GC-3′ )。
融合蛋白是通过如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 描述的标准克隆技术连接至少两个核酸分子来构建的。因此在用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 的消化中切割这些编码肽段的核酸分子， 而在编码用于与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸分子的情况下， 用限制性酶 Nco I 和 BamH I 进行消化。然后将经切割的编 码肽段的核酸连接入之前也用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 消化而切割的 pET21b 表达 载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。将切割的编码与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸 分子连接入之前也用相应的限制性酶 Nco I 和 BamH I 消化而切割的经修饰的 pET32b 表达 载体 ( 未修饰的载体可从 Novagen， Darmstadt， Germany 获得 )。pET32b 表达载体的修饰指 缺失编码 S 标记和中央 His6 标记的序列。
之 后， 在 用 限 制 性 酶 Bam I 和 Xho I 的 消 化 中 切 割 编 码 酶 Cpl-1、 Ply511、 PA6-gp20、 LysK 和 Lss 的核酸分子， 从而使得该细胞内溶素可分别连接入 pET21b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany) 和修饰的 pET32b 表达载体， 所述载体之前也经相应的限制 性酶 BamH I 和 Xho I 消化而切割。
对于连接于 LysK 和溶葡萄球菌素的 C 端的肽段 PK， 所得的融合蛋白在 N 端具有 His6 标记， 其中所述 His6 标记通过接头连接于 N 端。对于相应的核酸分子的克隆， 使用 pET32b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。
如此， 将编码肽段的核酸分子在编码相应的酶的核酸分子的 5’ 端连接入相应的载 体。 此外， 将编码相应的酶的核酸分子连接入相应的质粒， 从而使得编码由六个组氨酸残基 组成的 His6 标记的核酸分子与编码所述细胞内溶素的核酸分子的 3’ 端相联。
因为一些融合蛋白可能在细菌中表达时具毒性， 或由于蛋白降解而为非纯系的， 策略可为将这些融合蛋白融合或连接于其他附加的蛋白质来进行表达。这些其他附加的 蛋白质的实例是硫氧还蛋白， 其显示在大肠杆菌中介导有毒的抗微生物肽的表达 (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4from multiple joined genes in Escherichia coli.Zhou L， Zhao Z， Li B， Cai Y， Zhang S.Protein Expr Purif.2009 Apr ； 64(2) ： 225-230)。在融合蛋白由 N 端 PK 或 PK2 肽和细菌素 Lss 组成的情 况下， 将该肽连接入经修饰的 pET32 b 表达载体， 从而使得附加的硫氧还蛋白与该肽的 5’ 端相联。该硫氧还蛋白可使用肠激酶从表达的融合蛋白去除， 因此在编码该肽的核酸分子 和编码硫氧还蛋白的核酸分子之间导入肠激酶限制性位点。
细胞内溶素 - 肽 - 融合物的序列通过 DNA 测序来控制， 并将正确的克隆转化入大 肠杆菌 BL21(DE3) 和大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中以 供蛋白表达。
SEQ ID NO ： 107 至 122 和 124 的融合蛋白的重组表达是在大肠杆菌 BL21(DE3) 和 大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中进行的。生长细胞直至 达到 0.5-0.8 的 OD600nm 光密度。然后用 1mM IPTG( 异丙基硫代半乳糖苷 ) 诱导融合蛋白 的表达， 且表达在 37℃进行 4 小时的时间。
大肠杆菌 BL21 细胞通过以 6000g 离心 20 分钟收获， 并通过在冰上声处理来破 坏。通过离心分离大肠杆菌粗提取物的可溶性和不溶性级分 (Sorvall， SS34， 30min， 15 2+ 000rpm)。所有的蛋白质通过 Ni 亲和层析 (Akta FPLC， GE Healthcare) 使用 pET21b 或pET32b 载体编码的 C 端 His6 标记来纯化。
如上所述， 一些蛋白是使用修饰的 pET32b 载体 ( 缺失了 S 标记和中央 His6 标记 ) 来表达的， 其在目标蛋白的 N 端融合了硫氧还蛋白。该载体还在目标蛋白之前包含肠激酶 切割位点。该位点允许硫氧还蛋白和目标蛋白之间的蛋白水解切割， 目标蛋白可通过剩余 的 C 端 His6 标记纯化。对于融合蛋白的抗微生物功能， 可能需要通过蛋白水解切割去除硫 氧还蛋白。 因此， 用 2-4 单位 /mg 重组肠激酶 (Novagen， Darmstadt， Germany) 遵循生产商提 供的实验方案切割融合蛋白以去除硫氧还蛋白。在肠激酶切割之后， 通过如下所述的 His6 标记纯化来纯化融合蛋白。
Ni2+ 亲和层析在 4 个下述步骤中进行， 所有均在室温进行 ：
1. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer(20mM 咪唑， 1M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 在 3-5ml/ 分钟的流速平衡 Histrap FF 5ml 柱 (GE Healthcare)。
2. 将总裂解液 ( 含所需的融合蛋白 ) 以 3-5ml/ 分钟的流速加载于 Histrap FF 5ml 柱上。
3. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer 洗涤柱以去除未结合的样品， 继以用 10％ Elution buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 以 3-5ml/ 分钟的 流速的第二洗涤步骤。
4. 用 4 个柱体积的 Elution Buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 的至 100％的线性梯度以 3-5ml/ 分钟的流速将结合的融合蛋白从柱洗脱。
如在 SDS-PAGE 凝胶上肉眼确定， 融合蛋白在 Elution Buffer(20mM Hepes pH 7.4 ； 0.5M NaCl ； 500mM 咪唑 ) 中的纯化的储液为至少 90％纯 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 用多种肽段在 N 端修饰的酶 Cpl-1 的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生具有 N 端肽段 Pseudin 1， WLBU2- 变体， LL-37， Indolicidin， 马加宁， Pleurocidin， 灭菌肽 A(A.aegypti)， Buforin II， Sarcotoxin IA 和 PK 的融合蛋 白 Cpl 1。 使用下文所示的平板测试来测试所述融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺 炎链球菌 DSMZ 14378 的抗微生物活性。测得的融合蛋白活性示于表 6。
表 6 中表示的结果显示所有融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺炎链球菌 DSMZ 14378 的高抗微生物活性。
平板测定法 ：
取指数生长的细胞， 例如葡萄球菌、 利斯特氏菌、 丙酸杆菌或葡萄球菌 (1ml)， 将其在冰上冷却并用蒸馏水洗涤。将细菌重悬于 20mM Tris pH 7.0， 1mM MgCl2， 0.5M Saccharose。将融合蛋白在重悬缓冲液中稀释， 添加蔗糖至 0.5M 的终浓度， 并用相应的细 菌在室温温育 60 分钟 ( 融合蛋白终浓度为约 10μg/ml)。在此之后， 将细菌铺板于合适的 含有 0.5M 蔗糖的琼脂平板 ( 例如对于链球菌 ： Columbia 血琼脂 )， 且在温育之后对所得的 菌落进行计数。
在 37℃过夜温育之后， 对剩余的菌落进行计数。 基于计数所得的细胞数， 计算作为 对数单位的抗细菌活性 ( ＝ log10N0/Ni， 其中 N0 ＝未经处理所得细胞数 ； Ni ＝经处理所得细 胞数 )。所有样品重复至少四次。
表6：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 3 ： 在 N 端用五肽修饰的 Ply511 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 12 的 N 端肽段五肽的 Ply511 融合蛋白。 使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的抗微生物活性。 测得的融合蛋白的活性示 于表 7。
表示于表 7 的结果显示融合蛋白五肽 ： Ply511 针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的高抗微生物活性。
表7：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 4 ： 在 N 端或 C 端用聚阳离子肽修饰的 Lss 和 LysK 酶的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生分别具有 SEQ ID NO ： 13 的 N 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融 合蛋白， 具有 SEQ ID NO ： 31 的 N 端肽段 PK2 的 Lss 融合蛋白， 以及分别具有 C 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试， 以及使用如下文所述的裂解 测试来测试所述融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)DSMZ 20041 的抗微生物活性。
裂解测试
对修饰的 LysK 和溶葡萄球菌素使用裂解测试以检查这些融合蛋白的抗微生物作 用。
将葡萄球菌细胞生长于 BHI 培养基直至 600nm 处的光密度达到 0.7-1， 表明指数生 长。通过离心收获细胞， 并将其重悬于裂解缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)， 60mM NaCl， 2mM CaCl2。将细胞重悬至 600nm 处光密度为 1.0， 并用融合蛋白温育。用分光光度法在 600nm 处测量活性。
测得的融合蛋白的活性示于表 8。
表示于表 8 的结果显示具有 N 端肽 PK 或 PK2 的 Lss 融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 DSMZ 20041 的高抗微生物活性。但同时其他融合蛋白亦针对所 述两种测试的细菌菌株显示抗微生物活性。
表8
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 5 ： 用疏水肽段 Walmagh 1 修饰的 PA6-gp20 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 56 的 N 端肽段 Walmagh 1 的 PA6-gp20 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌 DSMZ 1897 和疮疱丙酸杆菌 DSMZ 16379 的抗微生物活性。测得的融合蛋白的活性示于表 9。
表示于表 9 的结果显示所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌的两种细菌菌株的高抗 微生物活性。
表9：
缩写 ： ++ ： 2-3log ；
亦用如上所述的活性测定法测试了表 6 至 9 中不具有任何标记和接头的融合蛋 白。其均显示针对表 6 至 9 中所用的细菌菌株的抗微生物活性。
与革兰氏阴性细菌相对， 革兰氏阳性细菌不具有外膜。其细胞质膜由高至 25nm 厚 的形成细胞壁的肽聚糖层 ( 对于革兰氏阴性细菌， 其仅为高至 5nm) 所包围。革兰氏阳性细 菌的细胞壁的主要目的是维持细菌形状， 并抵消内部的细菌细胞压力。肽聚糖， 亦称胞壁 质， 是由糖和氨基酸组成的聚合物。其糖组分由交替的 β-(1， 4) 连接的 N- 乙酰葡糖胺和 N- 乙酰胞壁酸残基组成， 其构成糖成分。三至五个氨基酸的肽链附于 N- 乙酰基胞壁酸。肽 链可交联于另一股的肽链， 形成 3D 筛状层。肽链可含有 D- 和 L- 氨基酸残基， 且其组成对 于不同细菌可有差异。
一种特定情况见于分枝杆菌 (Mycobateria) 的案例， 其通常视为革兰氏阳性的。 分枝杆菌近来显示具有外细胞膜 (outer cell membrane)。所有分枝杆菌均具有特征性的 厚细胞壁， 其为疏水的、 蜡状， 并富含分枝菌酸 / 分枝菌酸盐 / 酯。细胞壁由疏水的分枝菌 酸盐 / 酯层和肽聚糖层组成， 两者通过阿拉伯半乳聚糖， 一种多糖， 结合在一起。为了克服 分枝杆菌的厚细胞壁， 新型抗微生物剂与壳多糖酶或类似用于破坏多糖层的蛋白的组合作 用可能是必要的。
已知多种类型具有杀菌或抑菌活性的试剂， 例如抗生素、 细胞内溶素、 抗微生 物肽和防卫素。然而， 微生物对抗生素的增加的抗性对于治疗越来越多由细菌导致的 感染造成困难。对于由革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 肠 球 菌 (Enterococci)、 链 球 菌 (Streptococci)、 单 核 细 胞 增 生 利 斯 特 氏 菌 (Listeria monocytogenes) 和艰难梭菌 (Clostridium difficile)， 特别是由例如甲氧西林抗性的金 黄色葡萄球菌和万古霉素抗性的肠球菌导致的感染产生了特别的困难。
细胞内溶素为细菌噬菌体 ( 或细菌的病毒 ) 编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体 复制的裂解周期中的晚期基因表达过程中合成， 并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体 从受感染的细胞的释放。其为 β(1， 4)- 糖基化酶 ( 溶菌酶 )、 糖基转移酶、 酰胺酶或内肽 酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在 1991 年由 Gasson(GB2243611) 提出。尽管细胞内 溶素的杀灭能力久为人知， 由于抗生素的成功和主宰地位， 这些酶作为抗细菌剂的用途一 直受忽略。仅在多重抗生素耐药性细菌出现后， 用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单概 念方才受到注意。出现了开发完全新颖类型的抗细菌剂的令人瞩目的需求， 且用作酶抗生 素 (enzybiotics)(“酶” 和 “抗生素” 的组合术语 ) 的细胞内溶素完美地符合该需求。在 2001 年， Fischetti 及其同事首次阐明了细菌噬菌体 Cl 细胞内溶素对 A 组链球菌的治疗潜 力 (Nelson 等， 2001)。从此， 多份文献确立了细胞内溶素作为控制细菌感染， 特别是革兰氏
阳性细菌的细菌感染的有吸引力和补充的替代手段。接着， 针对其他革兰氏阳性病原体如 肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)(Loeffler 等， 2001)、 炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)(Schuch 等， 2002)、 无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)(Cheng 等， 2005) 和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(Rashel 等， 2007) 的不同的细胞内溶素证明 了其作为酶抗生素的效力。然而， 亦已知在一些条件下 ( 例如高离子强度 )， 细胞内溶素可 产生稳定的原生质体， 此时内部细菌细胞压力不足以导致细胞破裂。 在这些条件下， 细菌细 胞壁可再生， 而细菌会存活。
抗微生物肽 (AMP) 代表广泛范围的短的、 阳离子性或两亲性 (amphipatic)、 由基 因编码的肽抗生素， 其可见于几乎所有生物。不同的 AMP 显示不同的特性， 且该类型中的 许多肽不仅作为抗生素， 还作为细胞穿透肽的模板正经受彻底的研究。尽管分享一些共同 特征 ( 例如， 阳离子性， 两亲性和小尺寸 )， AMP 序列变化极大， 且已提出至少四种结构组 (α- 螺旋， β- 片层， 延伸型 (extended) 和环状 (looped)) 引起观察到的 AMP 构象的多样 性。 同样， 已提出了几种其作为抗生素的作用模式， 且显示例如许多这些肽的主要靶是细胞 膜， 而对于其他肽， 主要靶是细胞质侵袭和核心代谢功能的扰乱。尽管缺乏特异性靶结合， AMP 可变得足够集中 (concentrated) 以显示协作活性 (cooperative activity)， 例如， 通 过在膜上形成孔， 如对于大部分 AMP 的情况下。然而， 该现象仅在模式磷脂双分子层中观察 到， 且在一些情况下， 需要在膜中 AMP 的浓度高至每六个磷脂分子一个肽分子来使这些事 件发生。所述浓度接近甚至可达到全膜饱和。因为对于 AMP 最低抑制浓度 (MIC) 通常在低 微摩尔范围， 可理解地， 对于这些阈值的相关性及其在体内的重要性产生了怀疑 (Melo 等， Nature reviews， Microbiology， 2009， 245)。
防卫素是一大家族的小的、 阳离子性、 富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽， 见于 脊椎动物和无脊椎动物两者。防卫素根据半胱氨酸的间隔样式 (spacing pattern) 分为五 个组 ： 植物、 无脊椎动物、 α-、 β- 和 θ- 防卫素。后三种主要见于哺乳动物。α- 防卫素 为见于嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的蛋白质。 β- 防卫素为最广泛分布的， 并由白细胞和许 多类型的上皮细胞所分泌。 θ- 防卫素目前很少见， 例如见于猕猴 (rhesus macaques) 的白 血病。防卫素对细菌、 真菌和许多有包膜和无包膜病毒有活性。然而， 有效杀灭细菌所需的 浓度多数情况下较高， 即在微摩尔范围。 许多肽的活性在生理盐条件、 二价阳离子和血清的 存在下受限。取决于疏水氨基酸残基的含量， 防卫素亦显示溶血活性。
因此， 有对针对革兰氏阳性细菌的新型抗微生物剂的需要。
该目标通过权利要求中限定的主题解决。
如本文中使用的术语 “蛋白质” 与术语 “多肽” 所指相同。本文中使用的术语 “蛋 白质” 指氨基酸残基通过肽键以特定序列连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例 如共价附着多种基团如糖和磷酸来修饰。 其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链 相联系， 得到偶合的蛋白质， 其也包含于本文中使用的术语 “蛋白质” 中。有多种方式阐明 多肽链的折叠， 特别是针对 α 螺旋和 β 折叠片层的存在。如本文中使用的术语 “蛋白质” 指所有四种类型的蛋白质， 即全 α、 全 β、 α/β 和 α 加上 β。而且， 术语 “蛋白质” 指复 合物， 其中所述复合物指均聚物 (homomer)。
如本文中使用的术语 “融合蛋白” 指由两个核酸序列融合所得的表达产物。上述 蛋白可例如在重组 DNA 表达系统中产生。而且， 如本文中使用的术语 “融合蛋白” 指第一氨基酸序列如例如酶， 与第二或更进一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更进一步的氨 基酸序列可限定域或任何类型的肽段。优选地， 所述第二和 / 或更进一步的氨基酸序列对 于第一氨基酸序列为外源的， 并不与第一氨基酸序列的任何域实质上同源。
如本文中使用的术语 “肽段” 指连接于蛋白质如酶的任何类型的肽。
如本文中使用的术语 “肽” 指由约 2 至约 100 个氨基酸残基， 更优选约 4 至约 50 个氨基酸残基， 更优选约 5 至 30 个氨基酸残基组成的短多肽， 其中一个氨基酸残基的氨基 基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然出 现的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从 天然蛋白移出， 或者可使用常规的肽合成技术 ( 例如固相合成 ) 或分子生物学技术 ( 参见 Sambrook， J. 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.(1989)) 来制备。天然出现的肽的实例为抗微生物肽、 防卫素、 寿司肽 (sushi peptide)。 合成产生的肽的实例为聚阳离子性、 两亲性 (amphiphatic) 或疏 水性肽。本发明意指的肽并不指用于纯化或定位蛋白质的 His- 标记、 Strep- 标记、 硫氧还 蛋白或麦芽糖结合蛋白 (MBP) 等。
如本文中使用的术语 “细胞内溶素” 指适于水解细菌细胞壁的酶。 “细胞内溶素” 包含至少一个 “酶活性域” (EAD)， 其具有至少一种下述活性 ： 内肽酶、 壳多糖酶、 T4 样胞壁 质酶 (T4 like muraminidase)、 lambda 样胞壁质酶、 N- 乙酰基 - 胞壁酰 -L- 丙氨酸酰胺酶 ( 酰胺酶 )、 胞壁酰 -L- 丙氨酸 - 酰胺酶、 溶菌酶 (muramidase)、 裂解性糖基转移酶 (lytic transglycosylase)(C)、 裂解性糖基转移酶 (M)、 N- 乙酰基溶菌酶、 N- 乙酰 - 氨基葡糖苷酶 ( 溶菌酶 ) 或糖基转移酶如例如 KZ144 和 EL188。此外， 所述细胞内溶素还可包含无酶活性 并结合于宿主细菌细胞壁的区， 所谓 CBD( 细胞壁结合域 )。
如本文中使用的术语 “CAD” 指细胞内溶素的细胞壁结合域。在对革兰氏阳性细 菌具有特异性的细胞内溶素中， CBD 常见于 C 端， 但亦可见于 N 端或蛋白内其他位置。通常 CBD 域介导细胞内溶素对细菌细胞壁的结合， 但不具有表现为水解细胞壁的酶活性。
如本文中使用的术语 “EAD” 指细胞内溶素的酶活性域。EAD 负责水解细菌肽聚糖。 其显示细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD 还可由多于一种酶活性模块构成。
术语 “自溶素” 指与细胞内溶素相关的酶， 但其由细菌编码并涉及例如细胞分裂。 关于自溶素的综述可见于 “Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86” 。
如本文中使用的术语 “细菌素” 指能够抑制其他细菌生长的蛋白质样、 多肽样或肽 样物质。一些细菌素能够降解细菌细胞壁， 如溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )、 变溶 菌素 (mutanolysin)( 降解链球菌细胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。优选地， 所述抑制是特别通过将所述其他细菌吸收于所述细菌素的特定受体所致的。一般而言， 细 菌素由微生物产生。然而， 如本文中使用的术语 “细菌素” 指由微生物产生的分离形式或指 合成产生的形式两者， 且还指基本上保留其亲本细菌素的活性， 但其序列经插入或缺失一 个或多个氨基酸残基而改变的变体。
如本文中使用的术语 “抗微生物肽 (AMP)” 指任何具有杀微生物和 / 或抑微生物活 性的肽。 因此， 如本文中使用的术语 “抗微生物肽” 特别指任何具有抗细菌、 抗真菌、 抗霉菌、 抗寄生物、 抗原生生物、 抗病毒、 抗传染 / 感染 (anti-infectious， anti-infective) 和 / 或杀菌、 杀藻、 杀阿米巴、 杀微生物、 杀细菌、 杀真菌、 杀寄生物、 杀原生生物 (protozoacidal， protozoicidal) 性的肽。
如本文中使用的术语 “防卫素” 指存在于动物， 优选哺乳类， 更优选人之内的肽， 其 中所述防卫素在固有宿主防御系统中起摧毁外源物质如感染性细菌和 / 或感染性病毒和 / 或真菌的作用。防卫素是非抗体杀微生物和 / 或杀肿瘤蛋白质、 肽或多肽。 “防卫素” 的实 例为 “哺乳动物防卫素” 、 “α- 防卫素” 、 “β- 防卫素” 、 indolicidin 和马加宁 (magainin)。 如本文中使用的术语 “防卫素” 指来自动物细胞的分离形式或合成产生的形式两者， 且还指 基本上保留其亲本蛋白质细胞毒活性， 但其序列经一个或多个氨基酸残基的插入或缺失而 改变的变体。
如本文中使用的术语 “寿司肽” 指具有短的共同重复的补体调控蛋白 (CCP)。寿司 肽的寿司模块在许多不同蛋白质中作为蛋白质 - 蛋白质相互作用域起作用。已显示包含寿 司域的肽具有抗微生物活性。
如本文中使用的术语 “阳离子肽” 指具有荷正电的氨基酸残基的肽。优选地， 阳离 子肽具有 9.0 或更高的 pKa 值。通常， 所述阳离子肽的至少四个氨基酸残基可荷正电， 例如 为赖氨酸或精氨酸。 “荷正电” 指所述氨基酸残基的侧链在接近生理环境具有净的正电荷。 可重组产生的天然出现的阳离子肽的实例为防卫素、 马加宁、 蜂毒肽和天蚕素 (cecropin)。 如本文中使用的术语 “聚阳离子肽” 指主要由赖氨酸和 / 或精氨酸残基构成的合 成产生的肽。
如本文中使用的术语 “两亲肽” 指具有亲水性和疏水性功能基团两者的肽。优选 地， 如本文中使用的术语 “两亲肽” 指具有确定排列的亲水性和疏水性基团的肽， 例如两亲 肽可为例如 α- 螺旋， 沿螺旋一侧主要为非极性侧链， 而沿其其余的表面为极性残基。
如本文中使用的术语 “疏水基团” 指基本上不溶于水， 但溶于油相， 且在油相中的 溶解性高于在水中或在水相中的溶解性的化学基团如氨基酸侧链。在水中， 具有疏水侧链 的氨基酸彼此相互作用生成非水环境。 具有疏水侧链的氨基酸的实例为丙氨酸、 缬氨酸、 亮 氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸、 组氨酸、 色氨酸和酪氨酸。
如本文中使用的术语 “缺失” 指从对应的起始序列去除 1、 2、 3、 4、 5 或更多个氨基 酸残基。
如本文中使用的术语 “插入” 或 “添加” 指向对应的起始序列插入或添加 1、 2、 3、 4、 5 或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语 “取代” 指用不同的氨基酸替换位于某个位置的氨基酸残基。
本发明涉及针对革兰氏阳性细菌的新颖的抗细菌剂， 特别涉及包含 (composed of) 具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 端或 C 端或两端融合于该酶的另一 肽段的融合蛋白， 或由具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 端或 C 端或两端 融合于该酶的另一肽段构成的融合蛋白。
本发明的融合蛋白具有下述优点 ： 其可防止稳定原生质体的再生， 并因此防止应 消灭的细菌的存活。细菌导致的原生质体再生在一些条件下 ( 例如高离子强度 ) 发生， 此 时内部细菌细胞压力不足以导致细胞破裂， 并导致细菌的存活。
在本发明的一个方面， 具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶为细胞内溶 素、 自溶素和 / 或细菌素。
如本文中使用的术语 “两亲肽” 指具有亲水性和疏水性功能基团两者的肽。优选 地， 如本文中使用的术语 “两亲肽” 指具有确定排列的亲水性和疏水性基团的肽， 例如两亲 肽可为例如 α- 螺旋， 沿螺旋一侧主要为非极性侧链， 而沿其其余的表面为极性残基。
如本文中使用的术语 “疏水基团” 指基本上不溶于水， 但溶于油相， 且在油相中的 溶解性高于在水中或在水相中的溶解性的化学基团如氨基酸侧链。在水中， 具有疏水侧链 的氨基酸彼此相互作用生成非水环境。 具有疏水侧链的氨基酸的实例为丙氨酸、 缬氨酸、 亮 氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸、 组氨酸、 色氨酸和酪氨酸。
如本文中使用的术语 “缺失” 指从对应的起始序列去除 1、 2、 3、 4、 5 或更多个氨基 酸残基。
如本文中使用的术语 “插入” 或 “添加” 指向对应的起始序列插入或添加 1、 2、 3、 4、 5 或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语 “取代” 指用不同的氨基酸替换位于某个位置的氨基酸残基。
本发明涉及针对革兰氏阳性细菌的新颖的抗细菌剂， 特别涉及包含 (composed of) 具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 端或 C 端或两端融合于该酶的另一 肽段的融合蛋白， 或由具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶和在 N 端或 C 端或两端 融合于该酶的另一肽段构成的融合蛋白。
本发明的融合蛋白具有下述优点 ： 其可防止稳定原生质体的再生， 并因此防止应 消灭的细菌的存活。细菌导致的原生质体再生在一些条件下 ( 例如高离子强度 ) 发生， 此 时内部细菌细胞压力不足以导致细胞破裂， 并导致细菌的存活。
在本发明的一个方面， 具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的酶为细胞内溶 素、 自溶素和 / 或细菌素。
在本发明的另一个方面， 根据本发明的酶亦可包含不具酶活性并结合于宿主细菌 细胞壁的区， 所谓的 CBD( 细胞壁结合域 )。
根据本发明的优选的融合蛋白描述于 SEQ ID NO ： 63 至 90。根据 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白可在 N 端包含一个或多个其他氨基酸残基。优选地所述其他氨基酸残基 为甲硫氨酸。
优选地， 所述细胞内溶素由对革兰氏阳性细菌具有特异性的细菌噬菌体编码， 所 述革兰氏阳性细菌如列于下表的包含人或动物病原性菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的 革兰氏阳性细菌 ：
表1：
I. 放线菌门 (Phylum Actinobacteria)
纲： 放线菌纲 (Actinobacteridae)
目： 放线菌目 (Actinomycetales)
科：
放 线 菌 亚 目 (Actinomycineae) ： 放 线 菌 科 (Actinomycetaceae)( 放 线 菌 属 (Actinomyces)， 动弯杆菌属 (Mobiluncus)) 棒杆菌亚目 (Corynebacterineae) ： 分枝杆菌科 (Mycobacteriaceae)( 分枝杆菌 属 (Mycobacterium))， 诺卡氏菌科 (Nocardiaceae)， 棒杆菌科 (Corynebacteriaceae)
弗 兰 克 氏 菌 亚 目 (Frankineae) ： 弗 兰 克 氏 菌 科 (Frankiaceae) 微 球 菌 亚 目 (Micrococcineae) ： 短杆菌科 (Brevibacteriaceae)
丙酸杆菌亚目 (Propionibacteriaceae) ： ( 丙酸杆菌属 (Propionibacterium)) 目： 双歧杆菌目 (Bifidobacteriales)
科：
双 歧 杆 菌 科 (Bifidobacteriaceae)( 双 歧 杆 菌 属 (Bifidobacterium)， 镰 刀 弧 菌 属 (Falcivibrio)，加 德 纳 氏 菌 属 (Gardnerella)) 其 他 亚 纲 ： 微酸菌 亚 纲 (Acidimicrobidae)，科 里 氏 杆 菌 亚 纲 (Coriobacteridae)，红 色 杆 菌 亚 纲 (Rubrobacteridae)， 球形杆菌亚纲 (Sphaerobacteridae)
II. 厚壁菌门 (Phylum Firmicutes)
纲： 芽孢杆菌纲 (Bacilli)
目： 芽孢杆菌目 (Bacillales) ：
科：
芽 孢 杆 菌 科 (Bacillaceae)( 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus))，利 斯 特 氏 菌 科 (Listeriaceae)( 利斯特氏菌属 (Listeria))， 葡萄球菌科 (Staphylococcaceae)( 葡萄球 菌属 (Staphylococcus)， 孪生球菌属 (Gemella)， Jeotgalicoccus)
目： 乳杆菌目 (Lactobacillales) ：
科： 肠 球 菌 科 (Enterococcaceae)( 肠 球 菌 属 (Enterococcus))， 乳杆菌科 (Lactobacillaceae)( 乳杆菌属 (Lactobacillus)， 片球菌属 (Pediococcus))， 明串珠菌科 (Leuconostocaceae)( 明串珠菌属 (Leuconostoc))， 链球菌科 (Streptococcaceae)( 乳球 菌属 (Lactococcus)， 链球菌属 (Streptococcus))
纲： 梭菌纲 (Clostridia)
目 ：梭 菌 目 (Clostridiales)( 梭 菌 属 (Clostridium)，消 化 链 球 菌 属 (Peptostreptococcus)， 月形单胞菌属 (Selenomonas))
目： 盐厌氧菌目 (Halanaerobiales)
目： 热厌氧菌目 (Thermoanaerobacterales)
纲： 柔膜菌纲 (Tenericutes/Mollicutes)
目： 枝 原 体 目 (Mycoplasmatales)( 枝 原 体 属 (Mycoplasma)，脲 原 体 属 (Ureaplasma))
目： 虫原体目 (Entomoplasmatales)( 螺原体属 (Spiroplasma))
目： 厌氧原体目 (Anaeroplasmatales)( 丹毒丝菌属 (Erysipelothrix))
目： 无胆甾原体目 (Acholeplasmatales)( 无胆甾原体属 (Acholeplasma))
目： Haloplasmatales(Haloplasma)
优选地， 所述自溶素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。
优选地， 所述细菌素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。 本 发 明 的 酶 具 有 针 对 包 含 人 或 动 物 病 原 性 菌 株 的 细 菌 组、 科、 属或种的革 兰 氏 阳 性 细 菌 的 细 胞 壁 降 解 活 性， 所述革兰氏阳性细菌如单核细胞增生利斯特氏 菌 (Liisteria monocytogenes)，金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)，粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)，屎 肠 球 菌 (Enterococcus faecium)，肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿 脓 链 球 菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球菌 (Streptococcus mutans)， 马 链 球 菌 (Streptococcus equi)， 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆 菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
优选的细胞内溶素为利斯特氏菌噬菌体细胞内溶素 PlyA118， PlyA500， PlyPSA， PlyA511， PlyP35， PlyP40， 葡萄球菌噬菌体 Phi 11， Phi MR11， LysK， 产气荚膜梭菌 PlyS6， Ply3626， 艰难梭菌 ： CD27L 细胞内溶素， 葡萄球菌 ： B30 细胞内溶素， 噬菌体 Dp-1 Pal 酰 胺酶， C1 细胞内溶素， Cpl-1 细胞内溶素， PlyGBS， 肠球菌 ： PlyV12， 炭疽芽孢杆菌 ： 噬菌体 gamma 细胞内溶素 PlyG。
优选的自溶素描述于 ： Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86.Epub 2008 Feb 11.Review. 优选的自溶素的实例为 AtlA 自溶素。
优选的细菌素为溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )， 变溶菌素 ( 降解链球菌细 胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。
更优选地， 细胞内溶素部分选自下组 ： 根据 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1， 根据 SEQ ID NO ： 58 的 Ply511， 根据 SEQ ID NO ： 59 的 LysK， 根据 SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素和根据
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20。
在本发明另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细 菌素包含氨基酸序列的修饰和 / 或改变。上述改变和 / 或修饰可包含突变如缺失、 插入和 添加、 取代或其组合和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基、 SH 或羧基基团的化学变化。所述本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细菌素呈现相应 的野生型细胞内溶素的裂解活性。然而， 所述活性可与相应的野生型细胞内溶素的活性相 同、 更高或更低。 所述活性可为相应的野生型细胞内溶素活性的约 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190 或约 200％甚至更高。所述活性可由 本领域技术人员通过本领域周知的测定法来测量， 例如平板裂解 (plate lysis) 测定法或 液体裂解 (liquid lysis) 测定法， 其描述于 Briers 等， J.Biochem.Biophys Methods 70 ： 531-533， (2007)) 或 Donovan DM， Lardeo M， Foster-Frey J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec ； 265(1) 或类似公开。
优选地， 本发明的融合蛋白的肽段融合于细胞内溶素的 N 端和 / 或 C 端。在一个 特别优选的实施方案中， 所述肽段仅融合于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 所述肽 段仅融合于酶的 C 端。然而， 还优选的是在 N 端和 C 端均具有肽段的修饰的融合蛋白。所 述在 N 端和在 C 端的肽段可为相同或不同的肽段。所述肽段可通过附加的氨基酸残基 ( 例 如由于克隆原因 ) 连接于酶。优选地， 所述肽段可通过至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附 加氨基酸残基连接于融合蛋白。在一个优选实施方案中， 所述肽段通过附加的氨基酸残基 甘氨酸和 / 或丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶。而且， 本发明的融合蛋白的肽段还在其 N 端包 含其他氨基酸。优选地， 所述肽段包含氨基酸甲硫氨酸 (Met) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。
本发明的融合蛋白的肽段优选共价结合于酶。优选地， 所述肽段由至少 5 个， 更优 选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99 或至少 100 个氨基酸残 基组成。特别优选的是包含约 5 至约 100 个氨基酸残基、 约 5 至约 50 或约 5 至约 30 个氨 基酸残基的肽段。更优选的是包含约 6 至约 42 个氨基酸残基、 约 6 至约 39 个氨基酸残基、 约 6 至约 38 个氨基酸残基、 约 6 至约 31 个氨基酸残基、 约 6 至约 25 个氨基酸残基、 约6至 约 24 个氨基酸残基、 约 6 至约 22 个氨基酸残基、 约 6 至约 21 个氨基酸残基、 约 6 至约 20 个氨基酸残基、 约 6 至约 19 个氨基酸残基、 约 6 至约 16 个氨基酸残基、 约 6 至约 14 个氨基 酸残基、 约 6 至约 12 个氨基酸残基、 约 6 至约 10 个氨基酸残基或约 6 至约 9 个氨基酸残基 的肽段。
优选地， 所述肽段并非标记如 His6 标记、 Strep 标记、 Avi 标记、 Myc 标记、 Gst 标 记、 JS 标记、 半胱氨酸标记、 FLAG 标记或本领域已知的其他标记， 且并非硫氧还蛋白或者麦 芽糖结合蛋白 (MBP)。然而， 本发明的肽段和 / 或细胞内溶素、 自溶素或细菌素可另行包含 这样的一种或多种标记。
更优选地， 所述肽段具有通过融合蛋白首先与肽聚糖层相互作用， 降解肽聚糖， 然 后与细胞质膜相互作用， 使细胞质膜去稳定化 (destabilize)， 从而促进细菌细胞破裂的功能。 在本发明的一个方面， 融合肽段是阳离子肽， 更优选聚阳离子肽。优选地， 所述阳 离子肽包含一个或多个荷正电的赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基。优选地， 在该肽 中多于约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基是荷正电的氨基酸残基。有 利地， 所述阳离子肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 因此增强了本发 明的抗微生物剂和 / 或融合蛋白的阳离子性。在本发明的另一个实施方案中， 所述融合于 酶的阳离子肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个氨基酸残基组成。优选地， 所述阳离子肽的至少约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基为精氨酸或赖氨酸。在本发明的另一个实施方案中， 所述阳 离子肽包含约 3 至约 50 个， 更优选约 5 至约 20 个， 例如约 5 至约 15 个氨基酸残基， 且所述 氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基。优选的阳离子肽描述于 SEQ ID NO ： 13 和 14。
特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子和 / 或 聚阳离子肽段。具体而言， 优选包含至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 或 17 个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子肽段。更优选的是包含至少一个 KRK 基序 (lys-arg-lys)， 优选至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32 或 33 个 KRK 基序的阳离子肽段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含电中性的氨基酸残基， 特别是甘氨酸和 / 或丝 氨酸残基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电 的氨基酸残基， 特别是赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸残基， 更优选赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约 10％至约 20％电中性氨基酸残基， 特别是甘 氨酸和 / 或丝氨酸残基组成的阳离子肽段。 优选的是由约 4％至约 8％丝氨酸残基， 约 33％ 至约 36％精氨酸残基和约 56％至约 63％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至 少一个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 的基序的多肽段， 其中 X 是除了赖氨酸、 精氨酸和组氨酸 之外的任何氨基酸。 特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的多肽 段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 或 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的阳离子肽段。
亦优选的是由约 9 至约 16 ％甘氨酸残基， 约 4 至约 11 ％丝氨酸残基， 约 26 至约 32％精氨酸残基和约 47 至约 55％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个 根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的多肽段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的阳离子 段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残 基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电的氨 基酸残基特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约
10％至约 20％疏水氨基酸残基、 缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半 胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬 氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残基组成的阳离子肽段。
特别优选的是选自由下列序列组成的组的肽段 ：
表2：
肽段 KRKKRK KRKKRKKRK RRRRRRRRR
KKKKKKKK KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKR KKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKK RRRRRRRRRRRRRRRRRRR KKKKKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKK 8 10 12 14 16 18 19 19 19 20 21 21 22 24 25 SEQ ID NO ： 26 SEQ ID NO ： 27 SEQ ID NO ： 28 SEQ ID NO ： 29 SEQ ID NO ： 30 SEQ ID NO ： 31 SEQ ID NO ： 32 SEQ ID NO ： 33 SEQ ID NO ： 34 SEQ ID NO ： 35 SEQ ID NO ： 36 SEQ ID NO ： 37 SEQ ID NO ： 38 SEQ ID NO ： 39 SEQ ID NO ： 40 长度 6 9 9 SEQ ID NO ： SEQ ID NO ： 24 SEQ ID NO ： 13 SEQ ID NO ： 2512CN 102482655 A KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK说明书31 38 39 4210/26 页 SEQ ID NO ： 41 SEQ ID NO ： 42 SEQ ID NO ： 43 SEQ ID NO ： 44KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRKGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK
在本发明的进一步的方面， 所述融合肽段是两亲肽， 其包含一个或多个荷正电的 赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基， 组合于一个或多个疏水的缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和 / 或甘氨酸氨基酸残基。氨基酸残基的侧链为下述顺序的取向 ： 阳离子性和疏水表 面簇集于肽的相反侧。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸为荷正电的 氨基酸。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸残基为疏水氨基酸残基。 有利地， 所述两亲肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 从而增强了后者蛋 白质的两亲性。 在本发明另一个实施方案中， 所述融合于酶的两亲肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或至少 50 个氨基酸残基组成。 在一个优选实施方案中， 所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为精氨酸 或赖氨酸残基， 和 / 或所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为疏水氨基 酸缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨 酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和 / 或甘氨酸。
优选的两亲肽为 SEQ ID NO ： 1 的 Pleurocidin， SEQ ID NO ： 2 的杀菌肽 P1， SEQ ID NO ： 3 的 Buforin II， SEQ ID NO ： 23 的 Buforin I 和 SEQ ID NO ： 4 的马加宁。其他优选的 两亲肽是 Cathelidicine， 例如 SEQ ID NO ： 5 的 LL-37， SEQ ID NO ： 48 的 Nigrocine 2 和 SEQ ID NO ： 49 的 Ascaphine 5。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是抗微生物肽， 其包含净正电荷， 和 50％左 右的疏水氨基酸。所述抗微生物肽具两亲性， 具有约 12 至约 50 个氨基酸残基的长度。
抗微生物肽的实例列于下表 ：
表3：
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段为由 Ding JL， Li P， Ho B Cell Mol Life Sci.2008 Apr ； 65(7-8) ： 1202-19 The Sushi peptides ： structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria 描述的寿司肽。 特别优选的是 SEQ ID NO ： 54 的寿司 1 肽。
优选的寿司肽为寿司肽 S1 和 S3 及其多重物 (multiple) ： FASEB J.2000 Sep ； 14(12) ： 1801-13。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是防卫素， 优选 Cathelicidine、 杀菌肽 P1、 杀菌肽 A 或马加宁 II。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是疏水肽， 例如具有 SEQ ID NO ： 50 的氨基 酸序列的 Apidaecine， 具有 SEQ ID NO ： 55 的氨基酸序列的 WLBU2- 变体和具有 SEQ ID NO ： 56 的氨基酸序列的 Walmagh1。具有氨基酸序列 Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO ： 12) 的疏水肽并非本发明的一部分。
在本发明的另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的肽段包含对氨基酸序列 的修饰和 / 或改变。此类修饰和 / 或改变可包括突变如缺失、 插入和添加、 取代或其组合， 和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基 -、 SH- 或羧基 - 基团的 化学变化。
特别优选的是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白， 且所述融合蛋白选自由下列融合 蛋白组成的组的融合蛋白 ：
表4：
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可在 N 端包含甲硫氨酸。
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可包含例如用于纯化的标记。优选的是 His6 标记， 优选位于融合蛋白的 C 端。该标记可 通过附加的氨基酸残基连接于融合蛋白， 例如由于克隆原因。优选地， 所述标记可通过至 少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。在一个优选实施 方案中， 所述融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。 在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或 亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白 在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述 融合蛋白。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。
在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附 加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端， 且该融合蛋白在 N 端包含附加的氨基酸残基甲硫氨酸 (Met) 或 甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。优选地， 所述 融合蛋白依照 SEQ ID NO ： 108 至 123。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其中所述 His6 标记在其 N 端还包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser)。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨 酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施 方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨
酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu -Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施方案中， 融合蛋 白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨 酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Hi s) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲 硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的 融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端。在另一个优选的实施方案 中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮 氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端， 且所述 His6 标 记在其 N 端包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸 和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser) 或甲硫氨酸和丝氨酸 (Met-Ser)。优选地， 所述融合蛋白是 SEQ ID NO ： 122 和 123。
融合蛋白是通过将至少两个核酸序列使用如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 所述的标准克隆技术来构建的。上述蛋白质可于例如重组 DNA 表达系统中产生。本发明的上述融合蛋白可通过将细胞内溶素及相应的肽段的核酸融 合来获得。
本发明的融合蛋白可融合或连接于其他别的蛋白质。 该其他别的蛋白质的实例是 硫氧还蛋白。
本发明进一步涉及编码本发明的融合蛋白的分离的核酸分子。 本发明进一步涉及 包含本发明的核酸分子的载体。 所述载体可提供所述本发明的融合蛋白的组成型或诱导型 表达。
本发明还涉及用于从微生物， 例如表达所述融合蛋白的经遗传修饰的合适宿主细 胞， 获得所述融合蛋白的方法。 所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母， 或为动物细胞如例 如哺乳动物细胞， 特别是人细胞。 在本发明的一个实施方案中， 所述宿主细胞是巴斯德毕赤 酵母 (Pichia pastoris) 细胞。宿主可仅由于生物技术原因选取， 例如产率、 溶解性、 成本 等， 但亦可从医学角度选取， 例如非病原体细菌或酵母、 人细胞。本发明的另一个方面涉及 用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的融合蛋白的表达的方法， 其中宿主细胞是通 过将编码所述融合蛋白的遗传材料引入所述宿主细胞， 并通过本领域技术人员众所周知的 遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物， 优选药物组合物， 其包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸分子或载体转化的宿主， 所述核酸分子或载体包含编码本发明的融合蛋白的 核苷酸序列。
本发明还涉及本发明的融合蛋白和 / 或经包含本发明的融合蛋白的编码核苷酸 序列的核酸转化的宿主作为药物的用途。在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白 和 / 或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备治疗和 / 或预防与革兰氏阳性细菌 相关的病症、 疾病或病状中的用途， 所述核酸分子包含编码本发明的修饰的融合蛋白的核 苷酸序列。具体而言， 待治疗和 / 或预防的病症、 疾病或病状可由包含人或动物病原性 菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌所造成， 所述革兰氏阴性细菌如单 核细胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes)， 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)， 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)， 屎肠球菌 (Enterococcus faecium)， 肺炎 链球菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球 菌 (Streptococcus mutans)， 马链球菌 (Streptococcus equi)， 艰难梭菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
本发明还涉及包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸转化的宿主的药物， 所述 核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面， 本发明涉及在需要治疗和 / 或预防的受试者中治疗病症、 疾病或 病状的方法， 所述方法包括施与所述受试者有效量的本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经 下述核酸转化的宿主或本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序 列。所述受试者可为人或动物。
具体而言， 所述治疗方法可用于治疗和 / 或预防由革兰氏阳性细菌特别是上述列 举的革兰氏阳性细菌造成的皮肤， 软组织， 呼吸系统， 肺， 消化道， 眼， 耳， 牙齿， 鼻咽， 口， 骨， 阴道， 菌血症 (bacteraemia) 伤口和 / 或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗 ( 或预防 ) 方法中的给药剂量和途径取决于待治疗的具体疾病 / 感染位置。给药途径可例如为经口、 局部 (topical)、 鼻咽、 肠胃外、 静脉内、 直肠或任何其 他的给药途径。
对于将本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经核酸 ( 所述核酸包含编码本发明的融 合蛋白的核苷酸序列 ) 转化的宿主或本发明的组合物施用于感染位置 ( 或有受感染危险的 位置 )， 可使用下述制剂， 所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、 氧化、 免疫应答 等， 直至其抵达感染位置。因此， 所述制剂可为胶囊、 锭剂、 丸剂、 粉末、 栓剂、 乳剂、 悬液、 凝 胶、 洗剂 (lotion)、 乳霜 (cream)、 软膏 (salve)、 可注射溶液、 糖浆、 喷雾剂、 吸入剂或任何 其他医药上合理的盖仑 (galenic) 制剂。优选地， 所述盖仑制剂可包含合适的载体、 稳定 剂、 调味剂、 缓冲液或其他合适的试剂。例如， 对于局部施用， 所述制剂可为洗液、 乳霜、 凝 胶、 软膏或硬膏 (plaster)， 对于鼻咽施用所述制剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。对 于经口施用以治疗和 / 或预防特定感染位置 ( 例如肠中 ) 的情况下， 可能必需保护本发明 的融合蛋白免受胃肠道的严峻消化环境的作用， 直至其抵达感染位置。 因此， 可使用细菌作 为载体， 其在胃中的初始消化步骤中存活， 并之后将本发明的融合蛋白分泌入肠环境。
在本发明的一个具体实施方案中， 本发明的融合蛋白和 / 或经包含核酸分子 ( 所 述核酸分子包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列 ) 的载体转化的宿主在制备用于治 疗和 / 或预防病症、 疾病或病状的药物中的用途， 所述病症、 疾病或病状是由单核细胞增 生利斯特氏菌造成的， 特别是婴儿脓毒性肉芽肿病 (Granulomatosis infantiseptica) ( 新 生 儿 利 斯 特 菌 病 (listeriosis))， 单 核 细 胞 增 多 症 (mononucleosis)， 结膜炎 (conjunctivitis)， 脑膜炎 (meningitis)， granulomatosis septica 和孕妇的利斯特菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由金黄色葡萄球 菌 造 成 的， 特 别 是 皮 肤 感 染 如 脓 皮 病 (pyoderma)， 特 别 是 毛 囊 炎 (folliculitis)， 疖 (furuncle)， 痈 (carbuncle)， 汗腺的脓肿 (abscesses of the sweat glands) 和天疱疮 (pemphigus)， 以及如皮鳞癣综合症 (scaled skin syndrome)。所述皮鳞癣综合症可表现 为三种临床形式 (clinical picture) ： 剥脱性皮炎 (dermatitis exfoliativa)， 大疱性脓 疱病 (impetigo bullosa) 和猩红热样红斑 (scarlatiniform erythroderma)。而且所述 由金黄葡萄球菌造成的病症、 疾病或病状是葡萄球菌肺炎 (Staphylococcus pneumonia)，入院求医癖 (hospitalism)， 特别是手术伤口感染， 产褥期乳腺炎和小肠结肠炎 (mastitis puerperalis and enterokolitis)， 以及食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由酿脓链球菌 造 成 的， 特 别 是 扁 桃 体 炎 (tonsillitis)， 咽 炎 (pharyngitis)， 猩 红 热 (scarlet)， 丹 毒 (erysipelas)，风 湿 热 (rheumatic fever) 和 急 性 肾 小 球 肾 炎 (acute glomerulonephritis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎链球菌造成 的， 特别是肺炎 (pneumonia)， 匐行性角膜溃疡 (ulcus serpens corneae)， 中耳炎 (otitis media)， 脑膜炎 (meningitis)， 腹膜炎 (peritonitis)， 乳突炎 (mastoiditis) 和骨髓炎 (osteomyelitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由产气荚膜梭菌造 成的， 特别是气性坏疽 (gas gangrene)， 坏死性 / 溃疡性肠炎 (enteritis necroticans ulcerosa) 和食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肉毒梭菌造成的， 特别是肉毒中毒 (botulism)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由艰难梭菌造成的， 特别是假膜性小肠结肠炎 (pseudomembranoes enterokolitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由炭疽芽孢杆菌造 成的， 特别是皮肤炭疽 (cutaneous anthrax)， 吸入炭疽 (inhalation anthrax)， 和胃肠炭 疽 (gastrointestinal anthrax)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由粪肠球菌或屎肠 球菌造成的， 如医院内感染 (nosokomial infections)， 和心内膜炎 (endokarditis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由蜡状芽孢杆菌造 成的， 特别是食物中毒， 支气管肺炎 (bronchialpneumonia)， 败血病 (septicaemia) 和脑膜 炎。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由鸟分枝杆菌， 副结 核分枝杆菌 (Mycobacterium paratuberculosis) 和结核分枝杆菌造成的， 特别是结核病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎枝原体造成 的， 特别是肺炎， 上呼吸道疾病和鼓膜感染
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由放线菌造成的， 特 别是人、 牲畜、 猫和犬中的放线菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由白喉棒杆菌造成 的， 特别是扁桃体、 鼻、 鼻咽或中耳的局部白喉 (localized diphtheria of the tonsils， the nose， the nasopharynx or the middle ear)， 喉、 气管和支气管的进行性白喉 (progressive diphtheria of the larynx， the trachea and the bronchi)， 毒性或恶性 白喉 (toxic or maligne diphtheria)， 皮肤和伤口白喉 (skin and wound diphtheria)。
优选地， 如果待治疗 ( 或预防 ) 的感染是由多重抗性的细菌菌株， 特别是针对一种 或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时， 将本发明的融合蛋白用于医疗， 所述抗生素为 ： 链霉素、 四环素、 头孢噻吩、 青霉素、 庆大霉素、 头孢噻肟、 头孢菌素、 头孢他啶或亚胺培南。此外， 本发明的融合蛋白可通过将其与常规的抗菌剂如抗生素、 硫醚抗生素、 细菌素或细胞 内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包 (pharmaceutical pack)， 其中至少 一个隔室包含本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转化的宿主或 本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法， 所述方法包括将药学上可接受 的稀释剂、 赋形剂或载体与本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转 化的宿主混合， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至另一个方面本发明的组合物是美容用组合物 (cosmetic composition)。 几 种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。 为了预防上述刺激或者为 了消除所述细菌病原体的次要病候 (minor manifestation)， 可使用特定的美容用制备物， 其包含足够量的本发明的融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阳性细菌。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白作为诊断手段用于医药、 食品或饲 料或环境诊断， 特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染特别是由革兰氏阳性细菌造成的细 菌感染。在此方面， 本发明的融合蛋白可用作工具特异性降解病原性细菌， 特别是革兰氏 阳性病原性细菌。通过本发明的融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如 Triton X-100 或其他减弱细菌细胞外膜 (envelope) 的添加剂如多粘菌素 B 来支持。 需要特定细胞 降解作为后续使用基于核酸的方法如 PCR、 核酸杂交或 NASBA( 基于核酸序列的扩增 )， 免疫 方法如 IMS、 免疫荧光或 ELISA 技术， 或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独 特细菌组或种具有特异性的蛋白质的酶测定法 ( 例如， β- 半乳糖苷酶之于肠细菌， 凝固酶 之于凝固酶阳性菌株 ) 对细菌进行特异性检测的起始步骤。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白用于处理或防止革兰氏阳性细菌对 食品、 食物加工装置、 食品加工厂、 与食品接触的表面如架子和食物储藏区域以及病原性、 偶发病原性 (facultative pathogenic) 或其他不受欢迎的细菌可潜在地侵染食物材料的 所有其他情况、 医疗设备和医院和手术中所有类型的表面的污染时。
具体而言， 本发明的融合蛋白可预防性地用作消毒剂 (sanitizing agent)。所述 消毒剂 (sanitizing agent) 可在手术之前或之后使用， 或者例如在血液透析过程中使用。 而且， 早产婴儿和免疫妥协的个体， 或有假体装置需要的那些受试者， 可用本发明的融合蛋 白治疗。所述治疗可为预防性的， 或在急性感染过程中进行。在相同背景下， 医院内感染， 特别是由抗生素抗性菌株如甲氧西林抗性的金黄葡萄球菌， 万古霉素抗性的粪肠球菌， 万 古霉素抗性的屎肠球菌， 肺炎链球菌， 疮疱丙酸杆菌， 多种耐药性结核分枝杆菌造成的感染 可预防性地或在急性期中用本发明的融合蛋白来治疗。因此， 本发明的融合蛋白可用作消 毒剂 (disinfectant) 且与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、 tensid、 溶剂、 抗生素、 硫 醚抗生素或细菌素组合使用。
对于本发明的融合蛋白作为消毒剂例如在医院、 牙科手术、 兽医、 厨房或浴室中 的用途， 所述融合蛋白可以以例如液体、 粉末、 凝胶或湿巾 (wet wipe) 或消毒薄片产品 (disinfection sheet product) 成分的形式制备为组合物。 所述组合物还可包含合适的载 体、 添加剂、 稀释剂和 / 或赋形剂以分别用于其相应的用途和形式， 但还可包含支持抗微生 物活性的试剂如 EDTA 或增强融合蛋白抗微生物活性的试剂。所述融合蛋白还可与常见的消毒剂如醇类、 醛类、 氧化剂、 酚类、 季铵化合物或 UV 光一同使用。对于消毒例如表面、 物品 和 / 或装置， 可将所述融合蛋白施于所述表面、 物品和 / 或装置。该施用可例如用任何手段 如布或抹布以所述消毒组合物润湿来进行， 或通过喷雾、 倾倒来进行。 所述融合蛋白可根据 相应的施用和 “反应时间” 而以不同的浓度使用以获得完全的抗微生物活性。
根据后文给出的具体描述本发明应用的其他范围将会是显而易见的， 然而， 应理 解的是， 具体的描述和具体实施例， 虽然代表了本发明的优选实施方案， 但仅作为例证而给 出， 因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员根据该具体描述 将会是显而易见的。 应理解的是， 前述一般描述和后述具体描述均仅为例示性和解释性的， 并不对权利要求书中要求保护的本发明有所限制。
下述实施例解释本发明， 但并不视为限定性的。除非另行指出， 使用如 Sambrock 等， 1989， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York 所述的标准分子生物学方法。
实施例 1 ： 用多种肽段在 N 端或 C 端修饰的 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 酶的克隆、 表达和纯化
酶 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1 是来源于肺炎链球菌噬菌体 Cpl-1 的细胞内溶素。 细胞内 溶素 Cpl-1 由 SEQ ID NO ： 91 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 91 的核酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具 有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 58 的 Ply511 是来源于单核细胞增生利斯特氏菌噬菌体 A511 的细胞 内溶素。细胞内溶素 Ply511 由 SEQ ID NO ： 92 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 92 的核酸分 子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核 酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 59 的 LysK 是来源于金黄葡萄球菌噬菌体 K 的细胞内溶素。细胞内溶 素 LysK 由 SEQ ID NO ： 93 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 93 的核酸分子是合成产生的， 在核 酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素 (Lss) 是来源于模仿葡萄球菌 (Staphylococcus simulans) 的细菌素。细菌素 Lss 由 SEQ ID NO ： 94 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 94 的核 酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而 在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20 是来源于疮疱丙酸杆菌噬菌体的细胞内溶素。细胞内 溶素 PA6-gp20 由 SEQ ID NO ： 123 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 123 的核酸分子是合成产 生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
使用表 5 中的下述肽段用于产生与酶 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 的融合蛋白 ：
表5：
合成产生了编码相应肽段的核酸分子， 该核酸分子的 5’ 端带有 Nde I(5′ -CAT ATG-3′ ) 限制性位点并且该核酸分子的 3’ 端带有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位 点， 但编码用于与细菌素 Lss 连接的 PK 和 PK2 的核酸分子除外， 对于其产生了在该核酸分
子的 5’ 端的 Nco I 限制性位点加上两个附加核苷酸 (5′ -CCA TGG GC-3′ )。
融合蛋白是通过如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 描述的标准克隆技术连接至少两个核酸分子来构建的。因此在用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 的消化中切割这些编码肽段的核酸分子， 而在编码用于与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸分子的情况下， 用限制性酶 Nco I 和 BamH I 进行消化。然后将经切割的编 码肽段的核酸连接入之前也用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 消化而切割的 pET21b 表达 载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。将切割的编码与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸 分子连接入之前也用相应的限制性酶 Nco I 和 BamH I 消化而切割的经修饰的 pET32b 表达 载体 ( 未修饰的载体可从 Novagen， Darmstadt， Germany 获得 )。pET32b 表达载体的修饰指 缺失编码 S 标记和中央 His6 标记的序列。
之 后， 在 用 限 制 性 酶 Bam I 和 Xho I 的 消 化 中 切 割 编 码 酶 Cpl-1、 Ply511、 PA6-gp20、 LysK 和 Lss 的核酸分子， 从而使得该细胞内溶素可分别连接入 pET21b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany) 和修饰的 pET32b 表达载体， 所述载体之前也经相应的限制 性酶 BamH I 和 Xho I 消化而切割。
对于连接于 LysK 和溶葡萄球菌素的 C 端的肽段 PK， 所得的融合蛋白在 N 端具有 His6 标记， 其中所述 His6 标记通过接头连接于 N 端。对于相应的核酸分子的克隆， 使用 pET32b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。
如此， 将编码肽段的核酸分子在编码相应的酶的核酸分子的 5’ 端连接入相应的载 体。 此外， 将编码相应的酶的核酸分子连接入相应的质粒， 从而使得编码由六个组氨酸残基 组成的 His6 标记的核酸分子与编码所述细胞内溶素的核酸分子的 3’ 端相联。
因为一些融合蛋白可能在细菌中表达时具毒性， 或由于蛋白降解而为非纯系的， 策略可为将这些融合蛋白融合或连接于其他附加的蛋白质来进行表达。这些其他附加的 蛋白质的实例是硫氧还蛋白， 其显示在大肠杆菌中介导有毒的抗微生物肽的表达 (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4from multiple joined genes in Escherichia coli.Zhou L， Zhao Z， Li B， Cai Y， Zhang S.Protein Expr Purif.2009 Apr ； 64(2) ： 225-230)。在融合蛋白由 N 端 PK 或 PK2 肽和细菌素 Lss 组成的情 况下， 将该肽连接入经修饰的 pET32 b 表达载体， 从而使得附加的硫氧还蛋白与该肽的 5’ 端相联。该硫氧还蛋白可使用肠激酶从表达的融合蛋白去除， 因此在编码该肽的核酸分子 和编码硫氧还蛋白的核酸分子之间导入肠激酶限制性位点。
细胞内溶素 - 肽 - 融合物的序列通过 DNA 测序来控制， 并将正确的克隆转化入大 肠杆菌 BL21(DE3) 和大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中以 供蛋白表达。
SEQ ID NO ： 107 至 122 和 124 的融合蛋白的重组表达是在大肠杆菌 BL21(DE3) 和 大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中进行的。生长细胞直至 达到 0.5-0.8 的 OD600nm 光密度。然后用 1mM IPTG( 异丙基硫代半乳糖苷 ) 诱导融合蛋白 的表达， 且表达在 37℃进行 4 小时的时间。
大肠杆菌 BL21 细胞通过以 6000g 离心 20 分钟收获， 并通过在冰上声处理来破 坏。通过离心分离大肠杆菌粗提取物的可溶性和不溶性级分 (Sorvall， SS34， 30min， 15 2+ 000rpm)。所有的蛋白质通过 Ni 亲和层析 (Akta FPLC， GE Healthcare) 使用 pET21b 或pET32b 载体编码的 C 端 His6 标记来纯化。
如上所述， 一些蛋白是使用修饰的 pET32b 载体 ( 缺失了 S 标记和中央 His6 标记 ) 来表达的， 其在目标蛋白的 N 端融合了硫氧还蛋白。该载体还在目标蛋白之前包含肠激酶 切割位点。该位点允许硫氧还蛋白和目标蛋白之间的蛋白水解切割， 目标蛋白可通过剩余 的 C 端 His6 标记纯化。对于融合蛋白的抗微生物功能， 可能需要通过蛋白水解切割去除硫 氧还蛋白。 因此， 用 2-4 单位 /mg 重组肠激酶 (Novagen， Darmstadt， Germany) 遵循生产商提 供的实验方案切割融合蛋白以去除硫氧还蛋白。在肠激酶切割之后， 通过如下所述的 His6 标记纯化来纯化融合蛋白。
Ni2+ 亲和层析在 4 个下述步骤中进行， 所有均在室温进行 ：
1. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer(20mM 咪唑， 1M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 在 3-5ml/ 分钟的流速平衡 Histrap FF 5ml 柱 (GE Healthcare)。
2. 将总裂解液 ( 含所需的融合蛋白 ) 以 3-5ml/ 分钟的流速加载于 Histrap FF 5ml 柱上。
3. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer 洗涤柱以去除未结合的样品， 继以用 10％ Elution buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 以 3-5ml/ 分钟的 流速的第二洗涤步骤。
4. 用 4 个柱体积的 Elution Buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 的至 100％的线性梯度以 3-5ml/ 分钟的流速将结合的融合蛋白从柱洗脱。
如在 SDS-PAGE 凝胶上肉眼确定， 融合蛋白在 Elution Buffer(20mM Hepes pH 7.4 ； 0.5M NaCl ； 500mM 咪唑 ) 中的纯化的储液为至少 90％纯 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 用多种肽段在 N 端修饰的酶 Cpl-1 的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生具有 N 端肽段 Pseudin 1， WLBU2- 变体， LL-37， Indolicidin， 马加宁， Pleurocidin， 灭菌肽 A(A.aegypti)， Buforin II， Sarcotoxin IA 和 PK 的融合蛋 白 Cpl 1。 使用下文所示的平板测试来测试所述融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺 炎链球菌 DSMZ 14378 的抗微生物活性。测得的融合蛋白活性示于表 6。
表 6 中表示的结果显示所有融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺炎链球菌 DSMZ 14378 的高抗微生物活性。
平板测定法 ：
取指数生长的细胞， 例如葡萄球菌、 利斯特氏菌、 丙酸杆菌或葡萄球菌 (1ml)， 将其在冰上冷却并用蒸馏水洗涤。将细菌重悬于 20mM Tris pH 7.0， 1mM MgCl2， 0.5M Saccharose。将融合蛋白在重悬缓冲液中稀释， 添加蔗糖至 0.5M 的终浓度， 并用相应的细 菌在室温温育 60 分钟 ( 融合蛋白终浓度为约 10μg/ml)。在此之后， 将细菌铺板于合适的 含有 0.5M 蔗糖的琼脂平板 ( 例如对于链球菌 ： Columbia 血琼脂 )， 且在温育之后对所得的 菌落进行计数。
在 37℃过夜温育之后， 对剩余的菌落进行计数。 基于计数所得的细胞数， 计算作为 对数单位的抗细菌活性 ( ＝ log10N0/Ni， 其中 N0 ＝未经处理所得细胞数 ； Ni ＝经处理所得细 胞数 )。所有样品重复至少四次。
表6：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 3 ： 在 N 端用五肽修饰的 Ply511 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 12 的 N 端肽段五肽的 Ply511 融合蛋白。 使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的抗微生物活性。 测得的融合蛋白的活性示 于表 7。
表示于表 7 的结果显示融合蛋白五肽 ： Ply511 针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的高抗微生物活性。
表7：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 4 ： 在 N 端或 C 端用聚阳离子肽修饰的 Lss 和 LysK 酶的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生分别具有 SEQ ID NO ： 13 的 N 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融 合蛋白， 具有 SEQ ID NO ： 31 的 N 端肽段 PK2 的 Lss 融合蛋白， 以及分别具有 C 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试， 以及使用如下文所述的裂解 测试来测试所述融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)DSMZ 20041 的抗微生物活性。
裂解测试
对修饰的 LysK 和溶葡萄球菌素使用裂解测试以检查这些融合蛋白的抗微生物作 用。
将葡萄球菌细胞生长于 BHI 培养基直至 600nm 处的光密度达到 0.7-1， 表明指数生 长。通过离心收获细胞， 并将其重悬于裂解缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)， 60mM NaCl， 2mM CaCl2。将细胞重悬至 600nm 处光密度为 1.0， 并用融合蛋白温育。用分光光度法在 600nm 处测量活性。
测得的融合蛋白的活性示于表 8。
表示于表 8 的结果显示具有 N 端肽 PK 或 PK2 的 Lss 融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 DSMZ 20041 的高抗微生物活性。但同时其他融合蛋白亦针对所 述两种测试的细菌菌株显示抗微生物活性。
表8
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 5 ： 用疏水肽段 Walmagh 1 修饰的 PA6-gp20 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 56 的 N 端肽段 Walmagh 1 的 PA6-gp20 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌 DSMZ 1897 和疮疱丙酸杆菌 DSMZ 16379 的抗微生物活性。测得的融合蛋白的活性示于表 9。
表示于表 9 的结果显示所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌的两种细菌菌株的高抗 微生物活性。
表9：
缩写 ： ++ ： 2-3log ；
亦用如上所述的活性测定法测试了表 6 至 9 中不具有任何标记和接头的融合蛋 白。其均显示针对表 6 至 9 中所用的细菌菌株的抗微生物活性。
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根据本发明的优选的融合蛋白描述于 SEQ ID NO ： 63 至 90。根据 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白可在 N 端包含一个或多个其他氨基酸残基。优选地所述其他氨基酸残基 为甲硫氨酸。
优选地， 所述细胞内溶素由对革兰氏阳性细菌具有特异性的细菌噬菌体编码， 所 述革兰氏阳性细菌如列于下表的包含人或动物病原性菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的 革兰氏阳性细菌 ：
表1：
I. 放线菌门 (Phylum Actinobacteria)
纲： 放线菌纲 (Actinobacteridae)
目： 放线菌目 (Actinomycetales)
科：
放 线 菌 亚 目 (Actinomycineae) ： 放 线 菌 科 (Actinomycetaceae)( 放 线 菌 属 (Actinomyces)， 动弯杆菌属 (Mobiluncus)) 棒杆菌亚目 (Corynebacterineae) ： 分枝杆菌科 (Mycobacteriaceae)( 分枝杆菌 属 (Mycobacterium))， 诺卡氏菌科 (Nocardiaceae)， 棒杆菌科 (Corynebacteriaceae)
弗 兰 克 氏 菌 亚 目 (Frankineae) ： 弗 兰 克 氏 菌 科 (Frankiaceae) 微 球 菌 亚 目 (Micrococcineae) ： 短杆菌科 (Brevibacteriaceae)
丙酸杆菌亚目 (Propionibacteriaceae) ： ( 丙酸杆菌属 (Propionibacterium)) 目： 双歧杆菌目 (Bifidobacteriales)
科：
双 歧 杆 菌 科 (Bifidobacteriaceae)( 双 歧 杆 菌 属 (Bifidobacterium)， 镰 刀 弧 菌 属 (Falcivibrio)，加 德 纳 氏 菌 属 (Gardnerella)) 其 他 亚 纲 ： 微酸菌 亚 纲 (Acidimicrobidae)，科 里 氏 杆 菌 亚 纲 (Coriobacteridae)，红 色 杆 菌 亚 纲 (Rubrobacteridae)， 球形杆菌亚纲 (Sphaerobacteridae)
II. 厚壁菌门 (Phylum Firmicutes)
纲： 芽孢杆菌纲 (Bacilli)
目： 芽孢杆菌目 (Bacillales) ：
科：
芽 孢 杆 菌 科 (Bacillaceae)( 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus))，利 斯 特 氏 菌 科 (Listeriaceae)( 利斯特氏菌属 (Listeria))， 葡萄球菌科 (Staphylococcaceae)( 葡萄球 菌属 (Staphylococcus)， 孪生球菌属 (Gemella)， Jeotgalicoccus)
目： 乳杆菌目 (Lactobacillales) ：
科： 肠 球 菌 科 (Enterococcaceae)( 肠 球 菌 属 (Enterococcus))， 乳杆菌科 (Lactobacillaceae)( 乳杆菌属 (Lactobacillus)， 片球菌属 (Pediococcus))， 明串珠菌科 (Leuconostocaceae)( 明串珠菌属 (Leuconostoc))， 链球菌科 (Streptococcaceae)( 乳球 菌属 (Lactococcus)， 链球菌属 (Streptococcus))
纲： 梭菌纲 (Clostridia)
弗 兰 克 氏 菌 亚 目 (Frankineae) ： 弗 兰 克 氏 菌 科 (Frankiaceae) 微 球 菌 亚 目 (Micrococcineae) ： 短杆菌科 (Brevibacteriaceae)
丙酸杆菌亚目 (Propionibacteriaceae) ： ( 丙酸杆菌属 (Propionibacterium)) 目： 双歧杆菌目 (Bifidobacteriales)
科：
双 歧 杆 菌 科 (Bifidobacteriaceae)( 双 歧 杆 菌 属 (Bifidobacterium)， 镰 刀 弧 菌 属 (Falcivibrio)，加 德 纳 氏 菌 属 (Gardnerella)) 其 他 亚 纲 ： 微酸菌 亚 纲 (Acidimicrobidae)，科 里 氏 杆 菌 亚 纲 (Coriobacteridae)，红 色 杆 菌 亚 纲 (Rubrobacteridae)， 球形杆菌亚纲 (Sphaerobacteridae)
II. 厚壁菌门 (Phylum Firmicutes)
纲： 芽孢杆菌纲 (Bacilli)
目： 芽孢杆菌目 (Bacillales) ：
科：
芽 孢 杆 菌 科 (Bacillaceae)( 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus))，利 斯 特 氏 菌 科 (Listeriaceae)( 利斯特氏菌属 (Listeria))， 葡萄球菌科 (Staphylococcaceae)( 葡萄球 菌属 (Staphylococcus)， 孪生球菌属 (Gemella)， Jeotgalicoccus)
目： 乳杆菌目 (Lactobacillales) ：
科： 肠 球 菌 科 (Enterococcaceae)( 肠 球 菌 属 (Enterococcus))， 乳杆菌科 (Lactobacillaceae)( 乳杆菌属 (Lactobacillus)， 片球菌属 (Pediococcus))， 明串珠菌科 (Leuconostocaceae)( 明串珠菌属 (Leuconostoc))， 链球菌科 (Streptococcaceae)( 乳球 菌属 (Lactococcus)， 链球菌属 (Streptococcus))
纲： 梭菌纲 (Clostridia)
目 ：梭 菌 目 (Clostridiales)( 梭 菌 属 (Clostridium)，消 化 链 球 菌 属 (Peptostreptococcus)， 月形单胞菌属 (Selenomonas))
目： 盐厌氧菌目 (Halanaerobiales)
目： 热厌氧菌目 (Thermoanaerobacterales)
纲： 柔膜菌纲 (Tenericutes/Mollicutes)
目： 枝 原 体 目 (Mycoplasmatales)( 枝 原 体 属 (Mycoplasma)，脲 原 体 属 (Ureaplasma))
目： 虫原体目 (Entomoplasmatales)( 螺原体属 (Spiroplasma))
目： 厌氧原体目 (Anaeroplasmatales)( 丹毒丝菌属 (Erysipelothrix))
目： 无胆甾原体目 (Acholeplasmatales)( 无胆甾原体属 (Acholeplasma))
目： Haloplasmatales(Haloplasma)
优选地， 所述自溶素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。
优选地， 所述细菌素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。 本 发 明 的 酶 具 有 针 对 包 含 人 或 动 物 病 原 性 菌 株 的 细 菌 组、 科、 属或种的革 兰 氏 阳 性 细 菌 的 细 胞 壁 降 解 活 性， 所述革兰氏阳性细菌如单核细胞增生利斯特氏 菌 (Liisteria monocytogenes)，金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)，粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)，屎 肠 球 菌 (Enterococcus faecium)，肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿 脓 链 球 菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球菌 (Streptococcus mutans)， 马 链 球 菌 (Streptococcus equi)， 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆 菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
优选的细胞内溶素为利斯特氏菌噬菌体细胞内溶素 PlyA118， PlyA500， PlyPSA， PlyA511， PlyP35， PlyP40， 葡萄球菌噬菌体 Phi 11， Phi MR11， LysK， 产气荚膜梭菌 PlyS6， Ply3626， 艰难梭菌 ： CD27L 细胞内溶素， 葡萄球菌 ： B30 细胞内溶素， 噬菌体 Dp-1 Pal 酰 胺酶， C1 细胞内溶素， Cpl-1 细胞内溶素， PlyGBS， 肠球菌 ： PlyV12， 炭疽芽孢杆菌 ： 噬菌体 gamma 细胞内溶素 PlyG。
优选的自溶素描述于 ： Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86.Epub 2008 Feb 11.Review. 优选的自溶素的实例为 AtlA 自溶素。
优选的细菌素为溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )， 变溶菌素 ( 降解链球菌细 胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。
更优选地， 细胞内溶素部分选自下组 ： 根据 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1， 根据 SEQ ID NO ： 58 的 Ply511， 根据 SEQ ID NO ： 59 的 LysK， 根据 SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素和根据
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20。
在本发明另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细 菌素包含氨基酸序列的修饰和 / 或改变。上述改变和 / 或修饰可包含突变如缺失、 插入和 添加、 取代或其组合和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基、 SH 或羧基基团的化学变化。所述本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细菌素呈现相应 的野生型细胞内溶素的裂解活性。然而， 所述活性可与相应的野生型细胞内溶素的活性相 同、 更高或更低。 所述活性可为相应的野生型细胞内溶素活性的约 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190 或约 200％甚至更高。所述活性可由 本领域技术人员通过本领域周知的测定法来测量， 例如平板裂解 (plate lysis) 测定法或 液体裂解 (liquid lysis) 测定法， 其描述于 Briers 等， J.Biochem.Biophys Methods 70 ： 531-533， (2007)) 或 Donovan DM， Lardeo M， Foster-Frey J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec ； 265(1) 或类似公开。
优选地， 本发明的融合蛋白的肽段融合于细胞内溶素的 N 端和 / 或 C 端。在一个 特别优选的实施方案中， 所述肽段仅融合于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 所述肽 段仅融合于酶的 C 端。然而， 还优选的是在 N 端和 C 端均具有肽段的修饰的融合蛋白。所 述在 N 端和在 C 端的肽段可为相同或不同的肽段。所述肽段可通过附加的氨基酸残基 ( 例 如由于克隆原因 ) 连接于酶。优选地， 所述肽段可通过至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附 加氨基酸残基连接于融合蛋白。在一个优选实施方案中， 所述肽段通过附加的氨基酸残基 甘氨酸和 / 或丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶。而且， 本发明的融合蛋白的肽段还在其 N 端包 含其他氨基酸。优选地， 所述肽段包含氨基酸甲硫氨酸 (Met) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。
本发明的融合蛋白的肽段优选共价结合于酶。优选地， 所述肽段由至少 5 个， 更优 选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99 或至少 100 个氨基酸残 基组成。特别优选的是包含约 5 至约 100 个氨基酸残基、 约 5 至约 50 或约 5 至约 30 个氨 基酸残基的肽段。更优选的是包含约 6 至约 42 个氨基酸残基、 约 6 至约 39 个氨基酸残基、 约 6 至约 38 个氨基酸残基、 约 6 至约 31 个氨基酸残基、 约 6 至约 25 个氨基酸残基、 约6至 约 24 个氨基酸残基、 约 6 至约 22 个氨基酸残基、 约 6 至约 21 个氨基酸残基、 约 6 至约 20 个氨基酸残基、 约 6 至约 19 个氨基酸残基、 约 6 至约 16 个氨基酸残基、 约 6 至约 14 个氨基 酸残基、 约 6 至约 12 个氨基酸残基、 约 6 至约 10 个氨基酸残基或约 6 至约 9 个氨基酸残基 的肽段。
优选地， 所述肽段并非标记如 His6 标记、 Strep 标记、 Avi 标记、 Myc 标记、 Gst 标 记、 JS 标记、 半胱氨酸标记、 FLAG 标记或本领域已知的其他标记， 且并非硫氧还蛋白或者麦 芽糖结合蛋白 (MBP)。然而， 本发明的肽段和 / 或细胞内溶素、 自溶素或细菌素可另行包含 这样的一种或多种标记。
更优选地， 所述肽段具有通过融合蛋白首先与肽聚糖层相互作用， 降解肽聚糖， 然 后与细胞质膜相互作用， 使细胞质膜去稳定化 (destabilize)， 从而促进细菌细胞破裂的功能。 在本发明的一个方面， 融合肽段是阳离子肽， 更优选聚阳离子肽。优选地， 所述阳 离子肽包含一个或多个荷正电的赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基。优选地， 在该肽 中多于约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基是荷正电的氨基酸残基。有 利地， 所述阳离子肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 因此增强了本发 明的抗微生物剂和 / 或融合蛋白的阳离子性。在本发明的另一个实施方案中， 所述融合于 酶的阳离子肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个氨基酸残基组成。优选地， 所述阳离子肽的至少约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基为精氨酸或赖氨酸。在本发明的另一个实施方案中， 所述阳 离子肽包含约 3 至约 50 个， 更优选约 5 至约 20 个， 例如约 5 至约 15 个氨基酸残基， 且所述 氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基。优选的阳离子肽描述于 SEQ ID NO ： 13 和 14。
特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子和 / 或 聚阳离子肽段。具体而言， 优选包含至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 或 17 个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子肽段。更优选的是包含至少一个 KRK 基序 (lys-arg-lys)， 优选至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32 或 33 个 KRK 基序的阳离子肽段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含电中性的氨基酸残基， 特别是甘氨酸和 / 或丝 氨酸残基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电 的氨基酸残基， 特别是赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸残基， 更优选赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约 10％至约 20％电中性氨基酸残基， 特别是甘 氨酸和 / 或丝氨酸残基组成的阳离子肽段。 优选的是由约 4％至约 8％丝氨酸残基， 约 33％ 至约 36％精氨酸残基和约 56％至约 63％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至 少一个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 的基序的多肽段， 其中 X 是除了赖氨酸、 精氨酸和组氨酸 之外的任何氨基酸。 特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的多肽 段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 或 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的阳离子肽段。
亦优选的是由约 9 至约 16 ％甘氨酸残基， 约 4 至约 11 ％丝氨酸残基， 约 26 至约 32％精氨酸残基和约 47 至约 55％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个 根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的多肽段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的阳离子 段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残 基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电的氨 基酸残基特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约
10％至约 20％疏水氨基酸残基、 缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半 胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬 氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残基组成的阳离子肽段。
特别优选的是选自由下列序列组成的组的肽段 ：
表2：
肽段 KRKKRK KRKKRKKRK RRRRRRRRR
KKKKKKKK KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKR KKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKK RRRRRRRRRRRRRRRRRRR KKKKKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKK 8 10 12 14 16 18 19 19 19 20 21 21 22 24 25 SEQ ID NO ： 26 SEQ ID NO ： 27 SEQ ID NO ： 28 SEQ ID NO ： 29 SEQ ID NO ： 30 SEQ ID NO ： 31 SEQ ID NO ： 32 SEQ ID NO ： 33 SEQ ID NO ： 34 SEQ ID NO ： 35 SEQ ID NO ： 36 SEQ ID NO ： 37 SEQ ID NO ： 38 SEQ ID NO ： 39 SEQ ID NO ： 40 长度 6 9 9 SEQ ID NO ： SEQ ID NO ： 24 SEQ ID NO ： 13 SEQ ID NO ： 2512CN 102482655 A KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK说明书31 38 39 4210/26 页 SEQ ID NO ： 41 SEQ ID NO ： 42 SEQ ID NO ： 43 SEQ ID NO ： 44KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRKGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK
在本发明的进一步的方面， 所述融合肽段是两亲肽， 其包含一个或多个荷正电的 赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基， 组合于一个或多个疏水的缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和 / 或甘氨酸氨基酸残基。氨基酸残基的侧链为下述顺序的取向 ： 阳离子性和疏水表 面簇集于肽的相反侧。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸为荷正电的 氨基酸。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸残基为疏水氨基酸残基。 有利地， 所述两亲肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 从而增强了后者蛋 白质的两亲性。 在本发明另一个实施方案中， 所述融合于酶的两亲肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或至少 50 个氨基酸残基组成。 在一个优选实施方案中， 所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为精氨酸 或赖氨酸残基， 和 / 或所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为疏水氨基 酸缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨 酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和 / 或甘氨酸。
优选的两亲肽为 SEQ ID NO ： 1 的 Pleurocidin， SEQ ID NO ： 2 的杀菌肽 P1， SEQ ID NO ： 3 的 Buforin II， SEQ ID NO ： 23 的 Buforin I 和 SEQ ID NO ： 4 的马加宁。其他优选的 两亲肽是 Cathelidicine， 例如 SEQ ID NO ： 5 的 LL-37， SEQ ID NO ： 48 的 Nigrocine 2 和 SEQ ID NO ： 49 的 Ascaphine 5。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是抗微生物肽， 其包含净正电荷， 和 50％左 右的疏水氨基酸。所述抗微生物肽具两亲性， 具有约 12 至约 50 个氨基酸残基的长度。
抗微生物肽的实例列于下表 ：
表3：
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段为由 Ding JL， Li P， Ho B Cell Mol Life Sci.2008 Apr ； 65(7-8) ： 1202-19 The Sushi peptides ： structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria 描述的寿司肽。 特别优选的是 SEQ ID NO ： 54 的寿司 1 肽。
优选的寿司肽为寿司肽 S1 和 S3 及其多重物 (multiple) ： FASEB J.2000 Sep ； 14(12) ： 1801-13。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是防卫素， 优选 Cathelicidine、 杀菌肽 P1、 杀菌肽 A 或马加宁 II。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是疏水肽， 例如具有 SEQ ID NO ： 50 的氨基 酸序列的 Apidaecine， 具有 SEQ ID NO ： 55 的氨基酸序列的 WLBU2- 变体和具有 SEQ ID NO ： 56 的氨基酸序列的 Walmagh1。具有氨基酸序列 Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO ： 12) 的疏水肽并非本发明的一部分。
在本发明的另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的肽段包含对氨基酸序列 的修饰和 / 或改变。此类修饰和 / 或改变可包括突变如缺失、 插入和添加、 取代或其组合， 和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基 -、 SH- 或羧基 - 基团的 化学变化。
特别优选的是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白， 且所述融合蛋白选自由下列融合 蛋白组成的组的融合蛋白 ：
表4：
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可在 N 端包含甲硫氨酸。
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可包含例如用于纯化的标记。优选的是 His6 标记， 优选位于融合蛋白的 C 端。该标记可 通过附加的氨基酸残基连接于融合蛋白， 例如由于克隆原因。优选地， 所述标记可通过至 少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。在一个优选实施 方案中， 所述融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。 在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或 亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白 在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述 融合蛋白。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。
在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附 加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端， 且该融合蛋白在 N 端包含附加的氨基酸残基甲硫氨酸 (Met) 或 甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。优选地， 所述 融合蛋白依照 SEQ ID NO ： 108 至 123。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其中所述 His6 标记在其 N 端还包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser)。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨 酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施 方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨
酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu -Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施方案中， 融合蛋 白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨 酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Hi s) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲 硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的 融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端。在另一个优选的实施方案 中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮 氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端， 且所述 His6 标 记在其 N 端包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸 和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser) 或甲硫氨酸和丝氨酸 (Met-Ser)。优选地， 所述融合蛋白是 SEQ ID NO ： 122 和 123。
融合蛋白是通过将至少两个核酸序列使用如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 所述的标准克隆技术来构建的。上述蛋白质可于例如重组 DNA 表达系统中产生。本发明的上述融合蛋白可通过将细胞内溶素及相应的肽段的核酸融 合来获得。
本发明的融合蛋白可融合或连接于其他别的蛋白质。 该其他别的蛋白质的实例是 硫氧还蛋白。
本发明进一步涉及编码本发明的融合蛋白的分离的核酸分子。 本发明进一步涉及 包含本发明的核酸分子的载体。 所述载体可提供所述本发明的融合蛋白的组成型或诱导型 表达。
本发明还涉及用于从微生物， 例如表达所述融合蛋白的经遗传修饰的合适宿主细 胞， 获得所述融合蛋白的方法。 所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母， 或为动物细胞如例 如哺乳动物细胞， 特别是人细胞。 在本发明的一个实施方案中， 所述宿主细胞是巴斯德毕赤 酵母 (Pichia pastoris) 细胞。宿主可仅由于生物技术原因选取， 例如产率、 溶解性、 成本 等， 但亦可从医学角度选取， 例如非病原体细菌或酵母、 人细胞。本发明的另一个方面涉及 用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的融合蛋白的表达的方法， 其中宿主细胞是通 过将编码所述融合蛋白的遗传材料引入所述宿主细胞， 并通过本领域技术人员众所周知的 遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物， 优选药物组合物， 其包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸分子或载体转化的宿主， 所述核酸分子或载体包含编码本发明的融合蛋白的 核苷酸序列。
本发明还涉及本发明的融合蛋白和 / 或经包含本发明的融合蛋白的编码核苷酸 序列的核酸转化的宿主作为药物的用途。在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白 和 / 或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备治疗和 / 或预防与革兰氏阳性细菌 相关的病症、 疾病或病状中的用途， 所述核酸分子包含编码本发明的修饰的融合蛋白的核 苷酸序列。具体而言， 待治疗和 / 或预防的病症、 疾病或病状可由包含人或动物病原性 菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌所造成， 所述革兰氏阴性细菌如单 核细胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes)， 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)， 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)， 屎肠球菌 (Enterococcus faecium)， 肺炎 链球菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球 菌 (Streptococcus mutans)， 马链球菌 (Streptococcus equi)， 艰难梭菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
本发明还涉及包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸转化的宿主的药物， 所述 核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面， 本发明涉及在需要治疗和 / 或预防的受试者中治疗病症、 疾病或 病状的方法， 所述方法包括施与所述受试者有效量的本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经 下述核酸转化的宿主或本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序 列。所述受试者可为人或动物。
具体而言， 所述治疗方法可用于治疗和 / 或预防由革兰氏阳性细菌特别是上述列 举的革兰氏阳性细菌造成的皮肤， 软组织， 呼吸系统， 肺， 消化道， 眼， 耳， 牙齿， 鼻咽， 口， 骨， 阴道， 菌血症 (bacteraemia) 伤口和 / 或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗 ( 或预防 ) 方法中的给药剂量和途径取决于待治疗的具体疾病 / 感染位置。给药途径可例如为经口、 局部 (topical)、 鼻咽、 肠胃外、 静脉内、 直肠或任何其 他的给药途径。
对于将本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经核酸 ( 所述核酸包含编码本发明的融 合蛋白的核苷酸序列 ) 转化的宿主或本发明的组合物施用于感染位置 ( 或有受感染危险的 位置 )， 可使用下述制剂， 所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、 氧化、 免疫应答 等， 直至其抵达感染位置。因此， 所述制剂可为胶囊、 锭剂、 丸剂、 粉末、 栓剂、 乳剂、 悬液、 凝 胶、 洗剂 (lotion)、 乳霜 (cream)、 软膏 (salve)、 可注射溶液、 糖浆、 喷雾剂、 吸入剂或任何 其他医药上合理的盖仑 (galenic) 制剂。优选地， 所述盖仑制剂可包含合适的载体、 稳定 剂、 调味剂、 缓冲液或其他合适的试剂。例如， 对于局部施用， 所述制剂可为洗液、 乳霜、 凝 胶、 软膏或硬膏 (plaster)， 对于鼻咽施用所述制剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。对 于经口施用以治疗和 / 或预防特定感染位置 ( 例如肠中 ) 的情况下， 可能必需保护本发明 的融合蛋白免受胃肠道的严峻消化环境的作用， 直至其抵达感染位置。 因此， 可使用细菌作 为载体， 其在胃中的初始消化步骤中存活， 并之后将本发明的融合蛋白分泌入肠环境。
在本发明的一个具体实施方案中， 本发明的融合蛋白和 / 或经包含核酸分子 ( 所 述核酸分子包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列 ) 的载体转化的宿主在制备用于治 疗和 / 或预防病症、 疾病或病状的药物中的用途， 所述病症、 疾病或病状是由单核细胞增 生利斯特氏菌造成的， 特别是婴儿脓毒性肉芽肿病 (Granulomatosis infantiseptica) ( 新 生 儿 利 斯 特 菌 病 (listeriosis))， 单 核 细 胞 增 多 症 (mononucleosis)， 结膜炎 (conjunctivitis)， 脑膜炎 (meningitis)， granulomatosis septica 和孕妇的利斯特菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由金黄色葡萄球 菌 造 成 的， 特 别 是 皮 肤 感 染 如 脓 皮 病 (pyoderma)， 特 别 是 毛 囊 炎 (folliculitis)， 疖 (furuncle)， 痈 (carbuncle)， 汗腺的脓肿 (abscesses of the sweat glands) 和天疱疮 (pemphigus)， 以及如皮鳞癣综合症 (scaled skin syndrome)。所述皮鳞癣综合症可表现 为三种临床形式 (clinical picture) ： 剥脱性皮炎 (dermatitis exfoliativa)， 大疱性脓 疱病 (impetigo bullosa) 和猩红热样红斑 (scarlatiniform erythroderma)。而且所述 由金黄葡萄球菌造成的病症、 疾病或病状是葡萄球菌肺炎 (Staphylococcus pneumonia)，入院求医癖 (hospitalism)， 特别是手术伤口感染， 产褥期乳腺炎和小肠结肠炎 (mastitis puerperalis and enterokolitis)， 以及食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由酿脓链球菌 造 成 的， 特 别 是 扁 桃 体 炎 (tonsillitis)， 咽 炎 (pharyngitis)， 猩 红 热 (scarlet)， 丹 毒 (erysipelas)，风 湿 热 (rheumatic fever) 和 急 性 肾 小 球 肾 炎 (acute glomerulonephritis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎链球菌造成 的， 特别是肺炎 (pneumonia)， 匐行性角膜溃疡 (ulcus serpens corneae)， 中耳炎 (otitis media)， 脑膜炎 (meningitis)， 腹膜炎 (peritonitis)， 乳突炎 (mastoiditis) 和骨髓炎 (osteomyelitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由产气荚膜梭菌造 成的， 特别是气性坏疽 (gas gangrene)， 坏死性 / 溃疡性肠炎 (enteritis necroticans ulcerosa) 和食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肉毒梭菌造成的， 特别是肉毒中毒 (botulism)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由艰难梭菌造成的， 特别是假膜性小肠结肠炎 (pseudomembranoes enterokolitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由炭疽芽孢杆菌造 成的， 特别是皮肤炭疽 (cutaneous anthrax)， 吸入炭疽 (inhalation anthrax)， 和胃肠炭 疽 (gastrointestinal anthrax)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由粪肠球菌或屎肠 球菌造成的， 如医院内感染 (nosokomial infections)， 和心内膜炎 (endokarditis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由蜡状芽孢杆菌造 成的， 特别是食物中毒， 支气管肺炎 (bronchialpneumonia)， 败血病 (septicaemia) 和脑膜 炎。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由鸟分枝杆菌， 副结 核分枝杆菌 (Mycobacterium paratuberculosis) 和结核分枝杆菌造成的， 特别是结核病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎枝原体造成 的， 特别是肺炎， 上呼吸道疾病和鼓膜感染
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由放线菌造成的， 特 别是人、 牲畜、 猫和犬中的放线菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由白喉棒杆菌造成 的， 特别是扁桃体、 鼻、 鼻咽或中耳的局部白喉 (localized diphtheria of the tonsils， the nose， the nasopharynx or the middle ear)， 喉、 气管和支气管的进行性白喉 (progressive diphtheria of the larynx， the trachea and the bronchi)， 毒性或恶性 白喉 (toxic or maligne diphtheria)， 皮肤和伤口白喉 (skin and wound diphtheria)。
优选地， 如果待治疗 ( 或预防 ) 的感染是由多重抗性的细菌菌株， 特别是针对一种 或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时， 将本发明的融合蛋白用于医疗， 所述抗生素为 ： 链霉素、 四环素、 头孢噻吩、 青霉素、 庆大霉素、 头孢噻肟、 头孢菌素、 头孢他啶或亚胺培南。此外， 本发明的融合蛋白可通过将其与常规的抗菌剂如抗生素、 硫醚抗生素、 细菌素或细胞 内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包 (pharmaceutical pack)， 其中至少 一个隔室包含本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转化的宿主或 本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法， 所述方法包括将药学上可接受 的稀释剂、 赋形剂或载体与本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转 化的宿主混合， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至另一个方面本发明的组合物是美容用组合物 (cosmetic composition)。 几 种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。 为了预防上述刺激或者为 了消除所述细菌病原体的次要病候 (minor manifestation)， 可使用特定的美容用制备物， 其包含足够量的本发明的融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阳性细菌。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白作为诊断手段用于医药、 食品或饲 料或环境诊断， 特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染特别是由革兰氏阳性细菌造成的细 菌感染。在此方面， 本发明的融合蛋白可用作工具特异性降解病原性细菌， 特别是革兰氏 阳性病原性细菌。通过本发明的融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如 Triton X-100 或其他减弱细菌细胞外膜 (envelope) 的添加剂如多粘菌素 B 来支持。 需要特定细胞 降解作为后续使用基于核酸的方法如 PCR、 核酸杂交或 NASBA( 基于核酸序列的扩增 )， 免疫 方法如 IMS、 免疫荧光或 ELISA 技术， 或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独 特细菌组或种具有特异性的蛋白质的酶测定法 ( 例如， β- 半乳糖苷酶之于肠细菌， 凝固酶 之于凝固酶阳性菌株 ) 对细菌进行特异性检测的起始步骤。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白用于处理或防止革兰氏阳性细菌对 食品、 食物加工装置、 食品加工厂、 与食品接触的表面如架子和食物储藏区域以及病原性、 偶发病原性 (facultative pathogenic) 或其他不受欢迎的细菌可潜在地侵染食物材料的 所有其他情况、 医疗设备和医院和手术中所有类型的表面的污染时。
具体而言， 本发明的融合蛋白可预防性地用作消毒剂 (sanitizing agent)。所述 消毒剂 (sanitizing agent) 可在手术之前或之后使用， 或者例如在血液透析过程中使用。 而且， 早产婴儿和免疫妥协的个体， 或有假体装置需要的那些受试者， 可用本发明的融合蛋 白治疗。所述治疗可为预防性的， 或在急性感染过程中进行。在相同背景下， 医院内感染， 特别是由抗生素抗性菌株如甲氧西林抗性的金黄葡萄球菌， 万古霉素抗性的粪肠球菌， 万 古霉素抗性的屎肠球菌， 肺炎链球菌， 疮疱丙酸杆菌， 多种耐药性结核分枝杆菌造成的感染 可预防性地或在急性期中用本发明的融合蛋白来治疗。因此， 本发明的融合蛋白可用作消 毒剂 (disinfectant) 且与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、 tensid、 溶剂、 抗生素、 硫 醚抗生素或细菌素组合使用。
对于本发明的融合蛋白作为消毒剂例如在医院、 牙科手术、 兽医、 厨房或浴室中 的用途， 所述融合蛋白可以以例如液体、 粉末、 凝胶或湿巾 (wet wipe) 或消毒薄片产品 (disinfection sheet product) 成分的形式制备为组合物。 所述组合物还可包含合适的载 体、 添加剂、 稀释剂和 / 或赋形剂以分别用于其相应的用途和形式， 但还可包含支持抗微生 物活性的试剂如 EDTA 或增强融合蛋白抗微生物活性的试剂。所述融合蛋白还可与常见的消毒剂如醇类、 醛类、 氧化剂、 酚类、 季铵化合物或 UV 光一同使用。对于消毒例如表面、 物品 和 / 或装置， 可将所述融合蛋白施于所述表面、 物品和 / 或装置。该施用可例如用任何手段 如布或抹布以所述消毒组合物润湿来进行， 或通过喷雾、 倾倒来进行。 所述融合蛋白可根据 相应的施用和 “反应时间” 而以不同的浓度使用以获得完全的抗微生物活性。
根据后文给出的具体描述本发明应用的其他范围将会是显而易见的， 然而， 应理 解的是， 具体的描述和具体实施例， 虽然代表了本发明的优选实施方案， 但仅作为例证而给 出， 因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员根据该具体描述 将会是显而易见的。 应理解的是， 前述一般描述和后述具体描述均仅为例示性和解释性的， 并不对权利要求书中要求保护的本发明有所限制。
下述实施例解释本发明， 但并不视为限定性的。除非另行指出， 使用如 Sambrock 等， 1989， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York 所述的标准分子生物学方法。
实施例 1 ： 用多种肽段在 N 端或 C 端修饰的 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 酶的克隆、 表达和纯化
酶 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1 是来源于肺炎链球菌噬菌体 Cpl-1 的细胞内溶素。 细胞内 溶素 Cpl-1 由 SEQ ID NO ： 91 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 91 的核酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具 有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 58 的 Ply511 是来源于单核细胞增生利斯特氏菌噬菌体 A511 的细胞 内溶素。细胞内溶素 Ply511 由 SEQ ID NO ： 92 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 92 的核酸分 子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核 酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 59 的 LysK 是来源于金黄葡萄球菌噬菌体 K 的细胞内溶素。细胞内溶 素 LysK 由 SEQ ID NO ： 93 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 93 的核酸分子是合成产生的， 在核 酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素 (Lss) 是来源于模仿葡萄球菌 (Staphylococcus simulans) 的细菌素。细菌素 Lss 由 SEQ ID NO ： 94 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 94 的核 酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而 在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20 是来源于疮疱丙酸杆菌噬菌体的细胞内溶素。细胞内 溶素 PA6-gp20 由 SEQ ID NO ： 123 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 123 的核酸分子是合成产 生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
使用表 5 中的下述肽段用于产生与酶 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 的融合蛋白 ：
表5：
合成产生了编码相应肽段的核酸分子， 该核酸分子的 5’ 端带有 Nde I(5′ -CAT ATG-3′ ) 限制性位点并且该核酸分子的 3’ 端带有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位 点， 但编码用于与细菌素 Lss 连接的 PK 和 PK2 的核酸分子除外， 对于其产生了在该核酸分
子的 5’ 端的 Nco I 限制性位点加上两个附加核苷酸 (5′ -CCA TGG GC-3′ )。
融合蛋白是通过如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 描述的标准克隆技术连接至少两个核酸分子来构建的。因此在用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 的消化中切割这些编码肽段的核酸分子， 而在编码用于与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸分子的情况下， 用限制性酶 Nco I 和 BamH I 进行消化。然后将经切割的编 码肽段的核酸连接入之前也用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 消化而切割的 pET21b 表达 载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。将切割的编码与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸 分子连接入之前也用相应的限制性酶 Nco I 和 BamH I 消化而切割的经修饰的 pET32b 表达 载体 ( 未修饰的载体可从 Novagen， Darmstadt， Germany 获得 )。pET32b 表达载体的修饰指 缺失编码 S 标记和中央 His6 标记的序列。
之 后， 在 用 限 制 性 酶 Bam I 和 Xho I 的 消 化 中 切 割 编 码 酶 Cpl-1、 Ply511、 PA6-gp20、 LysK 和 Lss 的核酸分子， 从而使得该细胞内溶素可分别连接入 pET21b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany) 和修饰的 pET32b 表达载体， 所述载体之前也经相应的限制 性酶 BamH I 和 Xho I 消化而切割。
对于连接于 LysK 和溶葡萄球菌素的 C 端的肽段 PK， 所得的融合蛋白在 N 端具有 His6 标记， 其中所述 His6 标记通过接头连接于 N 端。对于相应的核酸分子的克隆， 使用 pET32b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。
如此， 将编码肽段的核酸分子在编码相应的酶的核酸分子的 5’ 端连接入相应的载 体。 此外， 将编码相应的酶的核酸分子连接入相应的质粒， 从而使得编码由六个组氨酸残基 组成的 His6 标记的核酸分子与编码所述细胞内溶素的核酸分子的 3’ 端相联。
因为一些融合蛋白可能在细菌中表达时具毒性， 或由于蛋白降解而为非纯系的， 策略可为将这些融合蛋白融合或连接于其他附加的蛋白质来进行表达。这些其他附加的 蛋白质的实例是硫氧还蛋白， 其显示在大肠杆菌中介导有毒的抗微生物肽的表达 (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4from multiple joined genes in Escherichia coli.Zhou L， Zhao Z， Li B， Cai Y， Zhang S.Protein Expr Purif.2009 Apr ； 64(2) ： 225-230)。在融合蛋白由 N 端 PK 或 PK2 肽和细菌素 Lss 组成的情 况下， 将该肽连接入经修饰的 pET32 b 表达载体， 从而使得附加的硫氧还蛋白与该肽的 5’ 端相联。该硫氧还蛋白可使用肠激酶从表达的融合蛋白去除， 因此在编码该肽的核酸分子 和编码硫氧还蛋白的核酸分子之间导入肠激酶限制性位点。
细胞内溶素 - 肽 - 融合物的序列通过 DNA 测序来控制， 并将正确的克隆转化入大 肠杆菌 BL21(DE3) 和大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中以 供蛋白表达。
SEQ ID NO ： 107 至 122 和 124 的融合蛋白的重组表达是在大肠杆菌 BL21(DE3) 和 大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中进行的。生长细胞直至 达到 0.5-0.8 的 OD600nm 光密度。然后用 1mM IPTG( 异丙基硫代半乳糖苷 ) 诱导融合蛋白 的表达， 且表达在 37℃进行 4 小时的时间。
大肠杆菌 BL21 细胞通过以 6000g 离心 20 分钟收获， 并通过在冰上声处理来破 坏。通过离心分离大肠杆菌粗提取物的可溶性和不溶性级分 (Sorvall， SS34， 30min， 15 2+ 000rpm)。所有的蛋白质通过 Ni 亲和层析 (Akta FPLC， GE Healthcare) 使用 pET21b 或pET32b 载体编码的 C 端 His6 标记来纯化。
如上所述， 一些蛋白是使用修饰的 pET32b 载体 ( 缺失了 S 标记和中央 His6 标记 ) 来表达的， 其在目标蛋白的 N 端融合了硫氧还蛋白。该载体还在目标蛋白之前包含肠激酶 切割位点。该位点允许硫氧还蛋白和目标蛋白之间的蛋白水解切割， 目标蛋白可通过剩余 的 C 端 His6 标记纯化。对于融合蛋白的抗微生物功能， 可能需要通过蛋白水解切割去除硫 氧还蛋白。 因此， 用 2-4 单位 /mg 重组肠激酶 (Novagen， Darmstadt， Germany) 遵循生产商提 供的实验方案切割融合蛋白以去除硫氧还蛋白。在肠激酶切割之后， 通过如下所述的 His6 标记纯化来纯化融合蛋白。
Ni2+ 亲和层析在 4 个下述步骤中进行， 所有均在室温进行 ：
1. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer(20mM 咪唑， 1M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 在 3-5ml/ 分钟的流速平衡 Histrap FF 5ml 柱 (GE Healthcare)。
2. 将总裂解液 ( 含所需的融合蛋白 ) 以 3-5ml/ 分钟的流速加载于 Histrap FF 5ml 柱上。
3. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer 洗涤柱以去除未结合的样品， 继以用 10％ Elution buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 以 3-5ml/ 分钟的 流速的第二洗涤步骤。
4. 用 4 个柱体积的 Elution Buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 的至 100％的线性梯度以 3-5ml/ 分钟的流速将结合的融合蛋白从柱洗脱。
如在 SDS-PAGE 凝胶上肉眼确定， 融合蛋白在 Elution Buffer(20mM Hepes pH 7.4 ； 0.5M NaCl ； 500mM 咪唑 ) 中的纯化的储液为至少 90％纯 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 用多种肽段在 N 端修饰的酶 Cpl-1 的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生具有 N 端肽段 Pseudin 1， WLBU2- 变体， LL-37， Indolicidin， 马加宁， Pleurocidin， 灭菌肽 A(A.aegypti)， Buforin II， Sarcotoxin IA 和 PK 的融合蛋 白 Cpl 1。 使用下文所示的平板测试来测试所述融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺 炎链球菌 DSMZ 14378 的抗微生物活性。测得的融合蛋白活性示于表 6。
表 6 中表示的结果显示所有融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺炎链球菌 DSMZ 14378 的高抗微生物活性。
平板测定法 ：
取指数生长的细胞， 例如葡萄球菌、 利斯特氏菌、 丙酸杆菌或葡萄球菌 (1ml)， 将其在冰上冷却并用蒸馏水洗涤。将细菌重悬于 20mM Tris pH 7.0， 1mM MgCl2， 0.5M Saccharose。将融合蛋白在重悬缓冲液中稀释， 添加蔗糖至 0.5M 的终浓度， 并用相应的细 菌在室温温育 60 分钟 ( 融合蛋白终浓度为约 10μg/ml)。在此之后， 将细菌铺板于合适的 含有 0.5M 蔗糖的琼脂平板 ( 例如对于链球菌 ： Columbia 血琼脂 )， 且在温育之后对所得的 菌落进行计数。
在 37℃过夜温育之后， 对剩余的菌落进行计数。 基于计数所得的细胞数， 计算作为 对数单位的抗细菌活性 ( ＝ log10N0/Ni， 其中 N0 ＝未经处理所得细胞数 ； Ni ＝经处理所得细 胞数 )。所有样品重复至少四次。
表6：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 3 ： 在 N 端用五肽修饰的 Ply511 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 12 的 N 端肽段五肽的 Ply511 融合蛋白。 使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的抗微生物活性。 测得的融合蛋白的活性示 于表 7。
表示于表 7 的结果显示融合蛋白五肽 ： Ply511 针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的高抗微生物活性。
表7：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 4 ： 在 N 端或 C 端用聚阳离子肽修饰的 Lss 和 LysK 酶的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生分别具有 SEQ ID NO ： 13 的 N 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融 合蛋白， 具有 SEQ ID NO ： 31 的 N 端肽段 PK2 的 Lss 融合蛋白， 以及分别具有 C 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试， 以及使用如下文所述的裂解 测试来测试所述融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)DSMZ 20041 的抗微生物活性。
裂解测试
对修饰的 LysK 和溶葡萄球菌素使用裂解测试以检查这些融合蛋白的抗微生物作 用。
将葡萄球菌细胞生长于 BHI 培养基直至 600nm 处的光密度达到 0.7-1， 表明指数生 长。通过离心收获细胞， 并将其重悬于裂解缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)， 60mM NaCl， 2mM CaCl2。将细胞重悬至 600nm 处光密度为 1.0， 并用融合蛋白温育。用分光光度法在 600nm 处测量活性。
测得的融合蛋白的活性示于表 8。
表示于表 8 的结果显示具有 N 端肽 PK 或 PK2 的 Lss 融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 DSMZ 20041 的高抗微生物活性。但同时其他融合蛋白亦针对所 述两种测试的细菌菌株显示抗微生物活性。
表8
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 5 ： 用疏水肽段 Walmagh 1 修饰的 PA6-gp20 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 56 的 N 端肽段 Walmagh 1 的 PA6-gp20 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌 DSMZ 1897 和疮疱丙酸杆菌 DSMZ 16379 的抗微生物活性。测得的融合蛋白的活性示于表 9。
表示于表 9 的结果显示所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌的两种细菌菌株的高抗 微生物活性。
表9：
缩写 ： ++ ： 2-3log ；
亦用如上所述的活性测定法测试了表 6 至 9 中不具有任何标记和接头的融合蛋 白。其均显示针对表 6 至 9 中所用的细菌菌株的抗微生物活性。
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目： 盐厌氧菌目 (Halanaerobiales)
目： 热厌氧菌目 (Thermoanaerobacterales)
纲： 柔膜菌纲 (Tenericutes/Mollicutes)
目： 枝 原 体 目 (Mycoplasmatales)( 枝 原 体 属 (Mycoplasma)，脲 原 体 属 (Ureaplasma))
目： 虫原体目 (Entomoplasmatales)( 螺原体属 (Spiroplasma))
目： 厌氧原体目 (Anaeroplasmatales)( 丹毒丝菌属 (Erysipelothrix))
目： 无胆甾原体目 (Acholeplasmatales)( 无胆甾原体属 (Acholeplasma))
目： Haloplasmatales(Haloplasma)
优选地， 所述自溶素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。
优选地， 所述细菌素是由革兰氏阳性细菌编码的， 所述革兰氏阳性细菌如列于表 1 的包含人或动物病原性菌株的细菌组、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌。 本 发 明 的 酶 具 有 针 对 包 含 人 或 动 物 病 原 性 菌 株 的 细 菌 组、 科、 属或种的革 兰 氏 阳 性 细 菌 的 细 胞 壁 降 解 活 性， 所述革兰氏阳性细菌如单核细胞增生利斯特氏 菌 (Liisteria monocytogenes)，金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)，粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)，屎 肠 球 菌 (Enterococcus faecium)，肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿 脓 链 球 菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球菌 (Streptococcus mutans)， 马 链 球 菌 (Streptococcus equi)， 艰 难 梭 菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆 菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
优选的细胞内溶素为利斯特氏菌噬菌体细胞内溶素 PlyA118， PlyA500， PlyPSA， PlyA511， PlyP35， PlyP40， 葡萄球菌噬菌体 Phi 11， Phi MR11， LysK， 产气荚膜梭菌 PlyS6， Ply3626， 艰难梭菌 ： CD27L 细胞内溶素， 葡萄球菌 ： B30 细胞内溶素， 噬菌体 Dp-1 Pal 酰 胺酶， C1 细胞内溶素， Cpl-1 细胞内溶素， PlyGBS， 肠球菌 ： PlyV12， 炭疽芽孢杆菌 ： 噬菌体 gamma 细胞内溶素 PlyG。
优选的自溶素描述于 ： Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86.Epub 2008 Feb 11.Review. 优选的自溶素的实例为 AtlA 自溶素。
优选的细菌素为溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )， 变溶菌素 ( 降解链球菌细 胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。
更优选地， 细胞内溶素部分选自下组 ： 根据 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1， 根据 SEQ ID NO ： 58 的 Ply511， 根据 SEQ ID NO ： 59 的 LysK， 根据 SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素和根据
优选的细胞内溶素为利斯特氏菌噬菌体细胞内溶素 PlyA118， PlyA500， PlyPSA， PlyA511， PlyP35， PlyP40， 葡萄球菌噬菌体 Phi 11， Phi MR11， LysK， 产气荚膜梭菌 PlyS6， Ply3626， 艰难梭菌 ： CD27L 细胞内溶素， 葡萄球菌 ： B30 细胞内溶素， 噬菌体 Dp-1 Pal 酰 胺酶， C1 细胞内溶素， Cpl-1 细胞内溶素， PlyGBS， 肠球菌 ： PlyV12， 炭疽芽孢杆菌 ： 噬菌体 gamma 细胞内溶素 PlyG。
优选的自溶素描述于 ： Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W， Joris B， Charlier P， Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008 Mar ； 32(2) ： 259-86.Epub 2008 Feb 11.Review. 优选的自溶素的实例为 AtlA 自溶素。
优选的细菌素为溶葡萄球菌素 ( 降解葡萄球菌细胞壁 )， 变溶菌素 ( 降解链球菌细 胞壁 ) 和 Enterolysin( 降解肠球菌细胞壁 )。
更优选地， 细胞内溶素部分选自下组 ： 根据 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1， 根据 SEQ ID NO ： 58 的 Ply511， 根据 SEQ ID NO ： 59 的 LysK， 根据 SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素和根据
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20。
在本发明另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细 菌素包含氨基酸序列的修饰和 / 或改变。上述改变和 / 或修饰可包含突变如缺失、 插入和 添加、 取代或其组合和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基、 SH 或羧基基团的化学变化。所述本发明的融合蛋白的细胞内溶素、 自溶素和细菌素呈现相应 的野生型细胞内溶素的裂解活性。然而， 所述活性可与相应的野生型细胞内溶素的活性相 同、 更高或更低。 所述活性可为相应的野生型细胞内溶素活性的约 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190 或约 200％甚至更高。所述活性可由 本领域技术人员通过本领域周知的测定法来测量， 例如平板裂解 (plate lysis) 测定法或 液体裂解 (liquid lysis) 测定法， 其描述于 Briers 等， J.Biochem.Biophys Methods 70 ： 531-533， (2007)) 或 Donovan DM， Lardeo M， Foster-Frey J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec ； 265(1) 或类似公开。
优选地， 本发明的融合蛋白的肽段融合于细胞内溶素的 N 端和 / 或 C 端。在一个 特别优选的实施方案中， 所述肽段仅融合于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 所述肽 段仅融合于酶的 C 端。然而， 还优选的是在 N 端和 C 端均具有肽段的修饰的融合蛋白。所 述在 N 端和在 C 端的肽段可为相同或不同的肽段。所述肽段可通过附加的氨基酸残基 ( 例 如由于克隆原因 ) 连接于酶。优选地， 所述肽段可通过至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附 加氨基酸残基连接于融合蛋白。在一个优选实施方案中， 所述肽段通过附加的氨基酸残基 甘氨酸和 / 或丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶。而且， 本发明的融合蛋白的肽段还在其 N 端包 含其他氨基酸。优选地， 所述肽段包含氨基酸甲硫氨酸 (Met) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。
本发明的融合蛋白的肽段优选共价结合于酶。优选地， 所述肽段由至少 5 个， 更优 选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99 或至少 100 个氨基酸残 基组成。特别优选的是包含约 5 至约 100 个氨基酸残基、 约 5 至约 50 或约 5 至约 30 个氨 基酸残基的肽段。更优选的是包含约 6 至约 42 个氨基酸残基、 约 6 至约 39 个氨基酸残基、 约 6 至约 38 个氨基酸残基、 约 6 至约 31 个氨基酸残基、 约 6 至约 25 个氨基酸残基、 约6至 约 24 个氨基酸残基、 约 6 至约 22 个氨基酸残基、 约 6 至约 21 个氨基酸残基、 约 6 至约 20 个氨基酸残基、 约 6 至约 19 个氨基酸残基、 约 6 至约 16 个氨基酸残基、 约 6 至约 14 个氨基 酸残基、 约 6 至约 12 个氨基酸残基、 约 6 至约 10 个氨基酸残基或约 6 至约 9 个氨基酸残基 的肽段。
优选地， 所述肽段并非标记如 His6 标记、 Strep 标记、 Avi 标记、 Myc 标记、 Gst 标 记、 JS 标记、 半胱氨酸标记、 FLAG 标记或本领域已知的其他标记， 且并非硫氧还蛋白或者麦 芽糖结合蛋白 (MBP)。然而， 本发明的肽段和 / 或细胞内溶素、 自溶素或细菌素可另行包含 这样的一种或多种标记。
更优选地， 所述肽段具有通过融合蛋白首先与肽聚糖层相互作用， 降解肽聚糖， 然 后与细胞质膜相互作用， 使细胞质膜去稳定化 (destabilize)， 从而促进细菌细胞破裂的功能。 在本发明的一个方面， 融合肽段是阳离子肽， 更优选聚阳离子肽。优选地， 所述阳 离子肽包含一个或多个荷正电的赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基。优选地， 在该肽 中多于约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基是荷正电的氨基酸残基。有 利地， 所述阳离子肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 因此增强了本发 明的抗微生物剂和 / 或融合蛋白的阳离子性。在本发明的另一个实施方案中， 所述融合于 酶的阳离子肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个氨基酸残基组成。优选地， 所述阳离子肽的至少约 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或约 100％的氨基酸残基为精氨酸或赖氨酸。在本发明的另一个实施方案中， 所述阳 离子肽包含约 3 至约 50 个， 更优选约 5 至约 20 个， 例如约 5 至约 15 个氨基酸残基， 且所述 氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基。优选的阳离子肽描述于 SEQ ID NO ： 13 和 14。
特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子和 / 或 聚阳离子肽段。具体而言， 优选包含至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 或 17 个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子肽段。更优选的是包含至少一个 KRK 基序 (lys-arg-lys)， 优选至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32 或 33 个 KRK 基序的阳离子肽段。
特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子和 / 或 聚阳离子肽段。具体而言， 优选包含至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 或 17 个根据 SEQ ID NO ： 62(KRKKRK) 的基序的阳离子肽段。更优选的是包含至少一个 KRK 基序 (lys-arg-lys)， 优选至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32 或 33 个 KRK 基序的阳离子肽段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含电中性的氨基酸残基， 特别是甘氨酸和 / 或丝 氨酸残基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电 的氨基酸残基， 特别是赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸残基， 更优选赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约 10％至约 20％电中性氨基酸残基， 特别是甘 氨酸和 / 或丝氨酸残基组成的阳离子肽段。 优选的是由约 4％至约 8％丝氨酸残基， 约 33％ 至约 36％精氨酸残基和约 56％至约 63％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至 少一个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 的基序的多肽段， 其中 X 是除了赖氨酸、 精氨酸和组氨酸 之外的任何氨基酸。 特别优选的是包含至少一个根据 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的多肽 段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 45(KRXKR) 或 SEQ ID NO ： 46(KRSKR) 的基序的阳离子肽段。
亦优选的是由约 9 至约 16 ％甘氨酸残基， 约 4 至约 11 ％丝氨酸残基， 约 26 至约 32％精氨酸残基和约 47 至约 55％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个 根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的多肽段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的阳离子 段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残 基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电的氨 基酸残基特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约
亦优选的是由约 9 至约 16 ％甘氨酸残基， 约 4 至约 11 ％丝氨酸残基， 约 26 至约 32％精氨酸残基和约 47 至约 55％赖氨酸残基组成的多肽段。特别优选的是包含至少一个 根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的多肽段。更优选的是包含至少约 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或约 20 个根据 SEQ ID NO ： 47(KRGSG) 的基序的阳离子 段。
在本发明的另一个优选的实施方案中， 所述阳离子肽段除了荷正电的氨基酸残基 特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基之外， 还包含疏水氨基酸残基特别是缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残 基。优选的是由约 70％至约 100％， 或约 80％至约 95％， 或约 85％至约 90％荷正电的氨 基酸残基特别是赖氨酸和 / 或精氨酸残基， 以及约 0％至约 30％， 或约 5％至约 20％， 或约
10％至约 20％疏水氨基酸残基、 缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半 胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和甘氨酸残基， 更优选丙氨酸、 缬 氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸和 / 或色氨酸残基组成的阳离子肽段。
特别优选的是选自由下列序列组成的组的肽段 ：
表2：
肽段 KRKKRK KRKKRKKRK RRRRRRRRR
KKKKKKKK KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKR KKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKK RRRRRRRRRRRRRRRRRRR KKKKKKKKKKKKKKKKKKK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKK 8 10 12 14 16 18 19 19 19 20 21 21 22 24 25 SEQ ID NO ： 26 SEQ ID NO ： 27 SEQ ID NO ： 28 SEQ ID NO ： 29 SEQ ID NO ： 30 SEQ ID NO ： 31 SEQ ID NO ： 32 SEQ ID NO ： 33 SEQ ID NO ： 34 SEQ ID NO ： 35 SEQ ID NO ： 36 SEQ ID NO ： 37 SEQ ID NO ： 38 SEQ ID NO ： 39 SEQ ID NO ： 40 长度 6 9 9 SEQ ID NO ： SEQ ID NO ： 24 SEQ ID NO ： 13 SEQ ID NO ： 2512CN 102482655 A KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK说明书31 38 39 4210/26 页 SEQ ID NO ： 41 SEQ ID NO ： 42 SEQ ID NO ： 43 SEQ ID NO ： 44KRKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRKGSGSGKRKKRKKRK KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK
在本发明的进一步的方面， 所述融合肽段是两亲肽， 其包含一个或多个荷正电的 赖氨酸、 精氨酸和 / 或组氨酸氨基酸残基， 组合于一个或多个疏水的缬氨酸、 异亮氨酸、 亮 氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯 氨酸和 / 或甘氨酸氨基酸残基。氨基酸残基的侧链为下述顺序的取向 ： 阳离子性和疏水表 面簇集于肽的相反侧。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸为荷正电的 氨基酸。优选地， 所述肽中多于约 30、 40、 50、 60 或 70％的氨基酸残基为疏水氨基酸残基。 有利地， 所述两亲肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的 N 端和 / 或 C 端， 从而增强了后者蛋 白质的两亲性。 在本发明另一个实施方案中， 所述融合于酶的两亲肽由至少 5 个， 更优选至少 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或至少 50 个氨基酸残基组成。 在一个优选实施方案中， 所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为精氨酸 或赖氨酸残基， 和 / 或所述两亲肽的氨基酸残基的至少约 30、 40、 50、 60 或 70％为疏水氨基 酸缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 丙氨酸、 酪氨酸、 组氨 酸、 苏氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸和 / 或甘氨酸。
优选的两亲肽为 SEQ ID NO ： 1 的 Pleurocidin， SEQ ID NO ： 2 的杀菌肽 P1， SEQ ID NO ： 3 的 Buforin II， SEQ ID NO ： 23 的 Buforin I 和 SEQ ID NO ： 4 的马加宁。其他优选的 两亲肽是 Cathelidicine， 例如 SEQ ID NO ： 5 的 LL-37， SEQ ID NO ： 48 的 Nigrocine 2 和 SEQ ID NO ： 49 的 Ascaphine 5。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是抗微生物肽， 其包含净正电荷， 和 50％左 右的疏水氨基酸。所述抗微生物肽具两亲性， 具有约 12 至约 50 个氨基酸残基的长度。
抗微生物肽的实例列于下表 ：
表3：
优选的两亲肽为 SEQ ID NO ： 1 的 Pleurocidin， SEQ ID NO ： 2 的杀菌肽 P1， SEQ ID NO ： 3 的 Buforin II， SEQ ID NO ： 23 的 Buforin I 和 SEQ ID NO ： 4 的马加宁。其他优选的 两亲肽是 Cathelidicine， 例如 SEQ ID NO ： 5 的 LL-37， SEQ ID NO ： 48 的 Nigrocine 2 和 SEQ ID NO ： 49 的 Ascaphine 5。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是抗微生物肽， 其包含净正电荷， 和 50％左 右的疏水氨基酸。所述抗微生物肽具两亲性， 具有约 12 至约 50 个氨基酸残基的长度。
抗微生物肽的实例列于下表 ：
表3：
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段为由 Ding JL， Li P， Ho B Cell Mol Life Sci.2008 Apr ； 65(7-8) ： 1202-19 The Sushi peptides ： structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria 描述的寿司肽。 特别优选的是 SEQ ID NO ： 54 的寿司 1 肽。
优选的寿司肽为寿司肽 S1 和 S3 及其多重物 (multiple) ： FASEB J.2000 Sep ； 14(12) ： 1801-13。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是防卫素， 优选 Cathelicidine、 杀菌肽 P1、 杀菌肽 A 或马加宁 II。
优选的寿司肽为寿司肽 S1 和 S3 及其多重物 (multiple) ： FASEB J.2000 Sep ； 14(12) ： 1801-13。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是防卫素， 优选 Cathelicidine、 杀菌肽 P1、 杀菌肽 A 或马加宁 II。
在本发明的另一个方面， 所述融合肽段是疏水肽， 例如具有 SEQ ID NO ： 50 的氨基 酸序列的 Apidaecine， 具有 SEQ ID NO ： 55 的氨基酸序列的 WLBU2- 变体和具有 SEQ ID NO ： 56 的氨基酸序列的 Walmagh1。具有氨基酸序列 Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO ： 12) 的疏水肽并非本发明的一部分。
在本发明的另一个优选实施方案中， 本发明的融合蛋白的肽段包含对氨基酸序列 的修饰和 / 或改变。此类修饰和 / 或改变可包括突变如缺失、 插入和添加、 取代或其组合， 和 / 或氨基酸残基的化学改变， 例如生物素化、 乙酰化、 PEG 化、 氨基 -、 SH- 或羧基 - 基团的 化学变化。
特别优选的是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的融合蛋白， 且所述融合蛋白选自由下列融合 蛋白组成的组的融合蛋白 ：
表4：
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可在 N 端包含甲硫氨酸。
本发明的融合蛋白， 并且因此特别是 SEQ ID NO ： 63 至 90 的特别优选的融合蛋白， 还可包含例如用于纯化的标记。优选的是 His6 标记， 优选位于融合蛋白的 C 端。该标记可 通过附加的氨基酸残基连接于融合蛋白， 例如由于克隆原因。优选地， 所述标记可通过至 少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。在一个优选实施 方案中， 所述融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。 在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸 (Lys-Gly) 或 亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白 在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述 融合蛋白。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于所述融合蛋白。
在一个更优选的实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附 加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端。在另一个优选实施方案中， 融合蛋白在其 C 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸 (Leu-Glu) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸 (Gly-Ser) 连接于酶的 N 端， 且该融合蛋白在 N 端包含附加的氨基酸残基甲硫氨酸 (Met) 或 甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或丙氨酸、 甲硫氨酸和甘氨酸 (Ala-Met-Gly)。优选地， 所述 融合蛋白依照 SEQ ID NO ： 108 至 123。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其中所述 His6 标记在其 N 端还包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸和甘氨酸 (Met-Gly) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser)。
在另一个优选的实施方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨 基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨 酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施 方案中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨
酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu -Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白。在另一个优选的实施方案中， 融合蛋 白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨 酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Hi s) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲 硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的 融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端。在另一个优选的实施方案 中， 融合蛋白在其 N 端包含 His6 标记， 其通过附加的氨基酸残基丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮 氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸和组氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His) 或丝氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 组氨酸和甲硫氨酸 (Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met) 连接于融合蛋白， 且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基丝氨酸连接于酶的 C 端， 且所述 His6 标 记在其 N 端包含附加的氨基酸残基丝氨酸和丝氨酸 (Ser-Ser) 或甲硫氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸 和丝氨酸 (Met-Gly-Ser-Ser) 或甲硫氨酸和丝氨酸 (Met-Ser)。优选地， 所述融合蛋白是 SEQ ID NO ： 122 和 123。
融合蛋白是通过将至少两个核酸序列使用如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 所述的标准克隆技术来构建的。上述蛋白质可于例如重组 DNA 表达系统中产生。本发明的上述融合蛋白可通过将细胞内溶素及相应的肽段的核酸融 合来获得。
本发明的融合蛋白可融合或连接于其他别的蛋白质。 该其他别的蛋白质的实例是 硫氧还蛋白。
本发明进一步涉及编码本发明的融合蛋白的分离的核酸分子。 本发明进一步涉及 包含本发明的核酸分子的载体。 所述载体可提供所述本发明的融合蛋白的组成型或诱导型 表达。
本发明还涉及用于从微生物， 例如表达所述融合蛋白的经遗传修饰的合适宿主细 胞， 获得所述融合蛋白的方法。 所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母， 或为动物细胞如例 如哺乳动物细胞， 特别是人细胞。 在本发明的一个实施方案中， 所述宿主细胞是巴斯德毕赤 酵母 (Pichia pastoris) 细胞。宿主可仅由于生物技术原因选取， 例如产率、 溶解性、 成本 等， 但亦可从医学角度选取， 例如非病原体细菌或酵母、 人细胞。本发明的另一个方面涉及 用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的融合蛋白的表达的方法， 其中宿主细胞是通 过将编码所述融合蛋白的遗传材料引入所述宿主细胞， 并通过本领域技术人员众所周知的 遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物， 优选药物组合物， 其包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸分子或载体转化的宿主， 所述核酸分子或载体包含编码本发明的融合蛋白的 核苷酸序列。
本发明还涉及本发明的融合蛋白和 / 或经包含本发明的融合蛋白的编码核苷酸 序列的核酸转化的宿主作为药物的用途。在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白 和 / 或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备治疗和 / 或预防与革兰氏阳性细菌 相关的病症、 疾病或病状中的用途， 所述核酸分子包含编码本发明的修饰的融合蛋白的核 苷酸序列。具体而言， 待治疗和 / 或预防的病症、 疾病或病状可由包含人或动物病原性 菌株的细菌组 (group)、 科、 属或种的革兰氏阳性细菌所造成， 所述革兰氏阴性细菌如单 核细胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes)， 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)， 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)， 屎肠球菌 (Enterococcus faecium)， 肺炎 链球菌 (Streptococcus pneumoniae)， 酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)， 变异链球 菌 (Streptococcus mutans)， 马链球菌 (Streptococcus equi)， 艰难梭菌 (Clostridium difficile)， 肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)， 破伤风梭菌 (Clostridium tetani)， 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)， 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis)， 蜡 状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)， 疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)， 鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)， 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)， 白喉棒杆 菌 (Corynebacterium diphteriae)， 肺 炎 枝 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)， 放线菌属 (Actinomyces)。
本发明还涉及包含本发明的融合蛋白和 / 或经下述核酸转化的宿主的药物， 所述 核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面， 本发明涉及在需要治疗和 / 或预防的受试者中治疗病症、 疾病或 病状的方法， 所述方法包括施与所述受试者有效量的本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经 下述核酸转化的宿主或本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序 列。所述受试者可为人或动物。
具体而言， 所述治疗方法可用于治疗和 / 或预防由革兰氏阳性细菌特别是上述列 举的革兰氏阳性细菌造成的皮肤， 软组织， 呼吸系统， 肺， 消化道， 眼， 耳， 牙齿， 鼻咽， 口， 骨， 阴道， 菌血症 (bacteraemia) 伤口和 / 或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗 ( 或预防 ) 方法中的给药剂量和途径取决于待治疗的具体疾病 / 感染位置。给药途径可例如为经口、 局部 (topical)、 鼻咽、 肠胃外、 静脉内、 直肠或任何其 他的给药途径。
对于将本发明的融合蛋白和 / 或有效量的经核酸 ( 所述核酸包含编码本发明的融 合蛋白的核苷酸序列 ) 转化的宿主或本发明的组合物施用于感染位置 ( 或有受感染危险的 位置 )， 可使用下述制剂， 所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、 氧化、 免疫应答 等， 直至其抵达感染位置。因此， 所述制剂可为胶囊、 锭剂、 丸剂、 粉末、 栓剂、 乳剂、 悬液、 凝 胶、 洗剂 (lotion)、 乳霜 (cream)、 软膏 (salve)、 可注射溶液、 糖浆、 喷雾剂、 吸入剂或任何 其他医药上合理的盖仑 (galenic) 制剂。优选地， 所述盖仑制剂可包含合适的载体、 稳定 剂、 调味剂、 缓冲液或其他合适的试剂。例如， 对于局部施用， 所述制剂可为洗液、 乳霜、 凝 胶、 软膏或硬膏 (plaster)， 对于鼻咽施用所述制剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。对 于经口施用以治疗和 / 或预防特定感染位置 ( 例如肠中 ) 的情况下， 可能必需保护本发明 的融合蛋白免受胃肠道的严峻消化环境的作用， 直至其抵达感染位置。 因此， 可使用细菌作 为载体， 其在胃中的初始消化步骤中存活， 并之后将本发明的融合蛋白分泌入肠环境。
在本发明的一个具体实施方案中， 本发明的融合蛋白和 / 或经包含核酸分子 ( 所 述核酸分子包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列 ) 的载体转化的宿主在制备用于治 疗和 / 或预防病症、 疾病或病状的药物中的用途， 所述病症、 疾病或病状是由单核细胞增 生利斯特氏菌造成的， 特别是婴儿脓毒性肉芽肿病 (Granulomatosis infantiseptica) ( 新 生 儿 利 斯 特 菌 病 (listeriosis))， 单 核 细 胞 增 多 症 (mononucleosis)， 结膜炎 (conjunctivitis)， 脑膜炎 (meningitis)， granulomatosis septica 和孕妇的利斯特菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由金黄色葡萄球 菌 造 成 的， 特 别 是 皮 肤 感 染 如 脓 皮 病 (pyoderma)， 特 别 是 毛 囊 炎 (folliculitis)， 疖 (furuncle)， 痈 (carbuncle)， 汗腺的脓肿 (abscesses of the sweat glands) 和天疱疮 (pemphigus)， 以及如皮鳞癣综合症 (scaled skin syndrome)。所述皮鳞癣综合症可表现 为三种临床形式 (clinical picture) ： 剥脱性皮炎 (dermatitis exfoliativa)， 大疱性脓 疱病 (impetigo bullosa) 和猩红热样红斑 (scarlatiniform erythroderma)。而且所述 由金黄葡萄球菌造成的病症、 疾病或病状是葡萄球菌肺炎 (Staphylococcus pneumonia)，入院求医癖 (hospitalism)， 特别是手术伤口感染， 产褥期乳腺炎和小肠结肠炎 (mastitis puerperalis and enterokolitis)， 以及食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由酿脓链球菌 造 成 的， 特 别 是 扁 桃 体 炎 (tonsillitis)， 咽 炎 (pharyngitis)， 猩 红 热 (scarlet)， 丹 毒 (erysipelas)，风 湿 热 (rheumatic fever) 和 急 性 肾 小 球 肾 炎 (acute glomerulonephritis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎链球菌造成 的， 特别是肺炎 (pneumonia)， 匐行性角膜溃疡 (ulcus serpens corneae)， 中耳炎 (otitis media)， 脑膜炎 (meningitis)， 腹膜炎 (peritonitis)， 乳突炎 (mastoiditis) 和骨髓炎 (osteomyelitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由产气荚膜梭菌造 成的， 特别是气性坏疽 (gas gangrene)， 坏死性 / 溃疡性肠炎 (enteritis necroticans ulcerosa) 和食物中毒。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肉毒梭菌造成的， 特别是肉毒中毒 (botulism)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由艰难梭菌造成的， 特别是假膜性小肠结肠炎 (pseudomembranoes enterokolitis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由炭疽芽孢杆菌造 成的， 特别是皮肤炭疽 (cutaneous anthrax)， 吸入炭疽 (inhalation anthrax)， 和胃肠炭 疽 (gastrointestinal anthrax)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由粪肠球菌或屎肠 球菌造成的， 如医院内感染 (nosokomial infections)， 和心内膜炎 (endokarditis)。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由蜡状芽孢杆菌造 成的， 特别是食物中毒， 支气管肺炎 (bronchialpneumonia)， 败血病 (septicaemia) 和脑膜 炎。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由鸟分枝杆菌， 副结 核分枝杆菌 (Mycobacterium paratuberculosis) 和结核分枝杆菌造成的， 特别是结核病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由肺炎枝原体造成 的， 特别是肺炎， 上呼吸道疾病和鼓膜感染
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由放线菌造成的， 特 别是人、 牲畜、 猫和犬中的放线菌病。
在本发明的另一个具体实施方案中， 所述病症、 疾病或病状是由白喉棒杆菌造成 的， 特别是扁桃体、 鼻、 鼻咽或中耳的局部白喉 (localized diphtheria of the tonsils， the nose， the nasopharynx or the middle ear)， 喉、 气管和支气管的进行性白喉 (progressive diphtheria of the larynx， the trachea and the bronchi)， 毒性或恶性 白喉 (toxic or maligne diphtheria)， 皮肤和伤口白喉 (skin and wound diphtheria)。
优选地， 如果待治疗 ( 或预防 ) 的感染是由多重抗性的细菌菌株， 特别是针对一种 或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时， 将本发明的融合蛋白用于医疗， 所述抗生素为 ： 链霉素、 四环素、 头孢噻吩、 青霉素、 庆大霉素、 头孢噻肟、 头孢菌素、 头孢他啶或亚胺培南。此外， 本发明的融合蛋白可通过将其与常规的抗菌剂如抗生素、 硫醚抗生素、 细菌素或细胞 内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包 (pharmaceutical pack)， 其中至少 一个隔室包含本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转化的宿主或 本发明的组合物， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法， 所述方法包括将药学上可接受 的稀释剂、 赋形剂或载体与本发明的一种或多种融合蛋白和 / 或一种或多种经下述核酸转 化的宿主混合， 所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至另一个方面本发明的组合物是美容用组合物 (cosmetic composition)。 几 种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。 为了预防上述刺激或者为 了消除所述细菌病原体的次要病候 (minor manifestation)， 可使用特定的美容用制备物， 其包含足够量的本发明的融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阳性细菌。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白作为诊断手段用于医药、 食品或饲 料或环境诊断， 特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染特别是由革兰氏阳性细菌造成的细 菌感染。在此方面， 本发明的融合蛋白可用作工具特异性降解病原性细菌， 特别是革兰氏 阳性病原性细菌。通过本发明的融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如 Triton X-100 或其他减弱细菌细胞外膜 (envelope) 的添加剂如多粘菌素 B 来支持。 需要特定细胞 降解作为后续使用基于核酸的方法如 PCR、 核酸杂交或 NASBA( 基于核酸序列的扩增 )， 免疫 方法如 IMS、 免疫荧光或 ELISA 技术， 或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独 特细菌组或种具有特异性的蛋白质的酶测定法 ( 例如， β- 半乳糖苷酶之于肠细菌， 凝固酶 之于凝固酶阳性菌株 ) 对细菌进行特异性检测的起始步骤。
在另一个方面， 本发明涉及本发明的融合蛋白用于处理或防止革兰氏阳性细菌对 食品、 食物加工装置、 食品加工厂、 与食品接触的表面如架子和食物储藏区域以及病原性、 偶发病原性 (facultative pathogenic) 或其他不受欢迎的细菌可潜在地侵染食物材料的 所有其他情况、 医疗设备和医院和手术中所有类型的表面的污染时。
具体而言， 本发明的融合蛋白可预防性地用作消毒剂 (sanitizing agent)。所述 消毒剂 (sanitizing agent) 可在手术之前或之后使用， 或者例如在血液透析过程中使用。 而且， 早产婴儿和免疫妥协的个体， 或有假体装置需要的那些受试者， 可用本发明的融合蛋 白治疗。所述治疗可为预防性的， 或在急性感染过程中进行。在相同背景下， 医院内感染， 特别是由抗生素抗性菌株如甲氧西林抗性的金黄葡萄球菌， 万古霉素抗性的粪肠球菌， 万 古霉素抗性的屎肠球菌， 肺炎链球菌， 疮疱丙酸杆菌， 多种耐药性结核分枝杆菌造成的感染 可预防性地或在急性期中用本发明的融合蛋白来治疗。因此， 本发明的融合蛋白可用作消 毒剂 (disinfectant) 且与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、 tensid、 溶剂、 抗生素、 硫 醚抗生素或细菌素组合使用。
对于本发明的融合蛋白作为消毒剂例如在医院、 牙科手术、 兽医、 厨房或浴室中 的用途， 所述融合蛋白可以以例如液体、 粉末、 凝胶或湿巾 (wet wipe) 或消毒薄片产品 (disinfection sheet product) 成分的形式制备为组合物。 所述组合物还可包含合适的载 体、 添加剂、 稀释剂和 / 或赋形剂以分别用于其相应的用途和形式， 但还可包含支持抗微生 物活性的试剂如 EDTA 或增强融合蛋白抗微生物活性的试剂。所述融合蛋白还可与常见的消毒剂如醇类、 醛类、 氧化剂、 酚类、 季铵化合物或 UV 光一同使用。对于消毒例如表面、 物品 和 / 或装置， 可将所述融合蛋白施于所述表面、 物品和 / 或装置。该施用可例如用任何手段 如布或抹布以所述消毒组合物润湿来进行， 或通过喷雾、 倾倒来进行。 所述融合蛋白可根据 相应的施用和 “反应时间” 而以不同的浓度使用以获得完全的抗微生物活性。
根据后文给出的具体描述本发明应用的其他范围将会是显而易见的， 然而， 应理 解的是， 具体的描述和具体实施例， 虽然代表了本发明的优选实施方案， 但仅作为例证而给 出， 因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员根据该具体描述 将会是显而易见的。 应理解的是， 前述一般描述和后述具体描述均仅为例示性和解释性的， 并不对权利要求书中要求保护的本发明有所限制。
下述实施例解释本发明， 但并不视为限定性的。除非另行指出， 使用如 Sambrock 等， 1989， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York 所述的标准分子生物学方法。
实施例 1 ： 用多种肽段在 N 端或 C 端修饰的 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 酶的克隆、 表达和纯化
酶 SEQ ID NO ： 57 的 Cpl-1 是来源于肺炎链球菌噬菌体 Cpl-1 的细胞内溶素。 细胞内 溶素 Cpl-1 由 SEQ ID NO ： 91 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 91 的核酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具 有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 58 的 Ply511 是来源于单核细胞增生利斯特氏菌噬菌体 A511 的细胞 内溶素。细胞内溶素 Ply511 由 SEQ ID NO ： 92 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 92 的核酸分 子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核 酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 59 的 LysK 是来源于金黄葡萄球菌噬菌体 K 的细胞内溶素。细胞内溶 素 LysK 由 SEQ ID NO ： 93 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 93 的核酸分子是合成产生的， 在核 酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 60 的溶葡萄球菌素 (Lss) 是来源于模仿葡萄球菌 (Staphylococcus simulans) 的细菌素。细菌素 Lss 由 SEQ ID NO ： 94 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 94 的核 酸分子是合成产生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而 在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
SEQ ID NO ： 61 的 PA6-gp20 是来源于疮疱丙酸杆菌噬菌体的细胞内溶素。细胞内 溶素 PA6-gp20 由 SEQ ID NO ： 123 的核酸分子编码。SEQ ID NO ： 123 的核酸分子是合成产 生的， 在核酸分子的 5’ 端具有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位点， 而在核酸分子的 3’ 端具有 Xho I(5′ -CTC GAG-3′ ) 限制性位点。
使用表 5 中的下述肽段用于产生与酶 Cpl-1、 Ply511、 LysK、 溶葡萄球菌素 (Lss) 和 PA6-gp20 的融合蛋白 ：
表5：
合成产生了编码相应肽段的核酸分子， 该核酸分子的 5’ 端带有 Nde I(5′ -CAT ATG-3′ ) 限制性位点并且该核酸分子的 3’ 端带有 BamH I(5′ -GGA TCC-3′ ) 限制性位 点， 但编码用于与细菌素 Lss 连接的 PK 和 PK2 的核酸分子除外， 对于其产生了在该核酸分
子的 5’ 端的 Nco I 限制性位点加上两个附加核苷酸 (5′ -CCA TGG GC-3′ )。
融合蛋白是通过如例如 Sambrook 等 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 描述的标准克隆技术连接至少两个核酸分子来构建的。因此在用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 的消化中切割这些编码肽段的核酸分子， 而在编码用于与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸分子的情况下， 用限制性酶 Nco I 和 BamH I 进行消化。然后将经切割的编 码肽段的核酸连接入之前也用相应的限制性酶 Nde I 和 BamH I 消化而切割的 pET21b 表达 载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。将切割的编码与 Lss 连接的肽段 PK 和 PK2 的核酸 分子连接入之前也用相应的限制性酶 Nco I 和 BamH I 消化而切割的经修饰的 pET32b 表达 载体 ( 未修饰的载体可从 Novagen， Darmstadt， Germany 获得 )。pET32b 表达载体的修饰指 缺失编码 S 标记和中央 His6 标记的序列。
之 后， 在 用 限 制 性 酶 Bam I 和 Xho I 的 消 化 中 切 割 编 码 酶 Cpl-1、 Ply511、 PA6-gp20、 LysK 和 Lss 的核酸分子， 从而使得该细胞内溶素可分别连接入 pET21b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany) 和修饰的 pET32b 表达载体， 所述载体之前也经相应的限制 性酶 BamH I 和 Xho I 消化而切割。
对于连接于 LysK 和溶葡萄球菌素的 C 端的肽段 PK， 所得的融合蛋白在 N 端具有 His6 标记， 其中所述 His6 标记通过接头连接于 N 端。对于相应的核酸分子的克隆， 使用 pET32b 表达载体 (Novagen， Darmstadt， Germany)。
如此， 将编码肽段的核酸分子在编码相应的酶的核酸分子的 5’ 端连接入相应的载 体。 此外， 将编码相应的酶的核酸分子连接入相应的质粒， 从而使得编码由六个组氨酸残基 组成的 His6 标记的核酸分子与编码所述细胞内溶素的核酸分子的 3’ 端相联。
因为一些融合蛋白可能在细菌中表达时具毒性， 或由于蛋白降解而为非纯系的， 策略可为将这些融合蛋白融合或连接于其他附加的蛋白质来进行表达。这些其他附加的 蛋白质的实例是硫氧还蛋白， 其显示在大肠杆菌中介导有毒的抗微生物肽的表达 (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4from multiple joined genes in Escherichia coli.Zhou L， Zhao Z， Li B， Cai Y， Zhang S.Protein Expr Purif.2009 Apr ； 64(2) ： 225-230)。在融合蛋白由 N 端 PK 或 PK2 肽和细菌素 Lss 组成的情 况下， 将该肽连接入经修饰的 pET32 b 表达载体， 从而使得附加的硫氧还蛋白与该肽的 5’ 端相联。该硫氧还蛋白可使用肠激酶从表达的融合蛋白去除， 因此在编码该肽的核酸分子 和编码硫氧还蛋白的核酸分子之间导入肠激酶限制性位点。
细胞内溶素 - 肽 - 融合物的序列通过 DNA 测序来控制， 并将正确的克隆转化入大 肠杆菌 BL21(DE3) 和大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中以 供蛋白表达。
SEQ ID NO ： 107 至 122 和 124 的融合蛋白的重组表达是在大肠杆菌 BL21(DE3) 和 大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 细胞 (Novagen， Darmstadt， Germany) 中进行的。生长细胞直至 达到 0.5-0.8 的 OD600nm 光密度。然后用 1mM IPTG( 异丙基硫代半乳糖苷 ) 诱导融合蛋白 的表达， 且表达在 37℃进行 4 小时的时间。
大肠杆菌 BL21 细胞通过以 6000g 离心 20 分钟收获， 并通过在冰上声处理来破 坏。通过离心分离大肠杆菌粗提取物的可溶性和不溶性级分 (Sorvall， SS34， 30min， 15 2+ 000rpm)。所有的蛋白质通过 Ni 亲和层析 (Akta FPLC， GE Healthcare) 使用 pET21b 或pET32b 载体编码的 C 端 His6 标记来纯化。
如上所述， 一些蛋白是使用修饰的 pET32b 载体 ( 缺失了 S 标记和中央 His6 标记 ) 来表达的， 其在目标蛋白的 N 端融合了硫氧还蛋白。该载体还在目标蛋白之前包含肠激酶 切割位点。该位点允许硫氧还蛋白和目标蛋白之间的蛋白水解切割， 目标蛋白可通过剩余 的 C 端 His6 标记纯化。对于融合蛋白的抗微生物功能， 可能需要通过蛋白水解切割去除硫 氧还蛋白。 因此， 用 2-4 单位 /mg 重组肠激酶 (Novagen， Darmstadt， Germany) 遵循生产商提 供的实验方案切割融合蛋白以去除硫氧还蛋白。在肠激酶切割之后， 通过如下所述的 His6 标记纯化来纯化融合蛋白。
Ni2+ 亲和层析在 4 个下述步骤中进行， 所有均在室温进行 ：
1. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer(20mM 咪唑， 1M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 在 3-5ml/ 分钟的流速平衡 Histrap FF 5ml 柱 (GE Healthcare)。
2. 将总裂解液 ( 含所需的融合蛋白 ) 以 3-5ml/ 分钟的流速加载于 Histrap FF 5ml 柱上。
3. 用多至 10 个柱体积的 Washing Buffer 洗涤柱以去除未结合的样品， 继以用 10％ Elution buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 以 3-5ml/ 分钟的 流速的第二洗涤步骤。
4. 用 4 个柱体积的 Elution Buffer(500mM 咪唑， 0.5M NaCl 和 20mM Hepes， 在 pH 7.4) 的至 100％的线性梯度以 3-5ml/ 分钟的流速将结合的融合蛋白从柱洗脱。
如在 SDS-PAGE 凝胶上肉眼确定， 融合蛋白在 Elution Buffer(20mM Hepes pH 7.4 ； 0.5M NaCl ； 500mM 咪唑 ) 中的纯化的储液为至少 90％纯 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 用多种肽段在 N 端修饰的酶 Cpl-1 的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生具有 N 端肽段 Pseudin 1， WLBU2- 变体， LL-37， Indolicidin， 马加宁， Pleurocidin， 灭菌肽 A(A.aegypti)， Buforin II， Sarcotoxin IA 和 PK 的融合蛋 白 Cpl 1。 使用下文所示的平板测试来测试所述融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺 炎链球菌 DSMZ 14378 的抗微生物活性。测得的融合蛋白活性示于表 6。
表 6 中表示的结果显示所有融合蛋白针对肺炎链球菌 DSMZ 11967 和肺炎链球菌 DSMZ 14378 的高抗微生物活性。
平板测定法 ：
取指数生长的细胞， 例如葡萄球菌、 利斯特氏菌、 丙酸杆菌或葡萄球菌 (1ml)， 将其在冰上冷却并用蒸馏水洗涤。将细菌重悬于 20mM Tris pH 7.0， 1mM MgCl2， 0.5M Saccharose。将融合蛋白在重悬缓冲液中稀释， 添加蔗糖至 0.5M 的终浓度， 并用相应的细 菌在室温温育 60 分钟 ( 融合蛋白终浓度为约 10μg/ml)。在此之后， 将细菌铺板于合适的 含有 0.5M 蔗糖的琼脂平板 ( 例如对于链球菌 ： Columbia 血琼脂 )， 且在温育之后对所得的 菌落进行计数。
在 37℃过夜温育之后， 对剩余的菌落进行计数。 基于计数所得的细胞数， 计算作为 对数单位的抗细菌活性 ( ＝ log10N0/Ni， 其中 N0 ＝未经处理所得细胞数 ； Ni ＝经处理所得细 胞数 )。所有样品重复至少四次。
表6：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 3 ： 在 N 端用五肽修饰的 Ply511 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 12 的 N 端肽段五肽的 Ply511 融合蛋白。 使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的抗微生物活性。 测得的融合蛋白的活性示 于表 7。
表示于表 7 的结果显示融合蛋白五肽 ： Ply511 针对单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 15675 和单核细胞增生利斯特氏菌 DSMZ 20600 的高抗微生物活性。
表7：
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 4 ： 在 N 端或 C 端用聚阳离子肽修饰的 Lss 和 LysK 酶的抗微生物活性
如实施例 1 所述产生分别具有 SEQ ID NO ： 13 的 N 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融 合蛋白， 具有 SEQ ID NO ： 31 的 N 端肽段 PK2 的 Lss 融合蛋白， 以及分别具有 C 端肽段 PK 的 Lss 和 LysK 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试， 以及使用如下文所述的裂解 测试来测试所述融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)DSMZ 20041 的抗微生物活性。
裂解测试
对修饰的 LysK 和溶葡萄球菌素使用裂解测试以检查这些融合蛋白的抗微生物作 用。
将葡萄球菌细胞生长于 BHI 培养基直至 600nm 处的光密度达到 0.7-1， 表明指数生 长。通过离心收获细胞， 并将其重悬于裂解缓冲液 (20mM Tris-HCl(pH 7.4)， 60mM NaCl， 2mM CaCl2。将细胞重悬至 600nm 处光密度为 1.0， 并用融合蛋白温育。用分光光度法在 600nm 处测量活性。
测得的融合蛋白的活性示于表 8。
表示于表 8 的结果显示具有 N 端肽 PK 或 PK2 的 Lss 融合蛋白针对金黄葡萄球菌 DSMZ 346 和表皮葡萄球菌 DSMZ 20041 的高抗微生物活性。但同时其他融合蛋白亦针对所 述两种测试的细菌菌株显示抗微生物活性。
表8
缩写 ： +： 1log ； ++ ： 2-3log ； +++ ： 4 或更多个 log
实施例 5 ： 用疏水肽段 Walmagh 1 修饰的 PA6-gp20 酶的抗微生物活性
如实施例 1 中所述产生具有 SEQ ID NO ： 56 的 N 端肽段 Walmagh 1 的 PA6-gp20 融合蛋白。使用实施例 2 中所述的平板测试来测试所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌 DSMZ 1897 和疮疱丙酸杆菌 DSMZ 16379 的抗微生物活性。测得的融合蛋白的活性示于表 9。
表示于表 9 的结果显示所述融合蛋白针对疮疱丙酸杆菌的两种细菌菌株的高抗 微生物活性。
表9：
缩写 ： ++ ： 2-3log ；
亦用如上所述的活性测定法测试了表 6 至 9 中不具有任何标记和接头的融合蛋 白。其均显示针对表 6 至 9 中所用的细菌菌株的抗微生物活性。
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