来源于生物质聚合物的脂肪酸脂产物 相关申请的交叉引用
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技术领域 本文公开的内容涉及由纤维素类生物质产生脂肪酸酯和其他脂肪酸衍生物的方 法和组合物。
背景技术
脂肪酸合成对于许多药学上和工业上的重要化合物的生产十分关键， 包括 ω-3 脂肪酸 (EPA 和 DHA)、 油类、 生物柴油、 脂肪醇和蜡。生物柴油是优于汽油、 乙醇和 “较高级” 链醇 ( 包括丁醇 ) 的燃料， 由于其无毒、 不溶于水、 能量密集并且不会产生石油衍生的柴油 的主要污染物 (SOx、 NOx、 重金属和芳香族化合物 )， 因而已被大量生产。 但是， 与种植植物油作物、 提取油类和对其进行改进以用作燃料相关的环境和经济成本巨大 (Hill 等， 2006)。 因此， 对由微生物生产油类的兴趣浓厚， 大量研究集中于积累大量脂类的那些微生物。目 前， 由这些有机体产生油类需要使用昂贵的提取方法， 仍然需要由能够产生脂类但是无需 使用昂贵的提取方法的微生物生产油类。
尽管大肠杆菌 (E.coli) 没有积累脂质的固有能力 ( 与脂质积累微生物例如产油 酵母、 藻类相比而言 )， 已知其能够分泌低水平的脂肪酸， 这种特性消除了通常与由脂质积 累作物或者微生物产生乙醇、 丁醇、 较高级链醇和生物柴油相关的产物提取成本 (Hall 和 Rat ledge 1977 ； Brown 1969 ； Knights 等， 1970 ； Jiang 和 Cronan 1994)。利用大肠杆菌 产生这些分子比生产基于脂肪酸之生物燃料的传统方法具有优势， 所述传统方法依赖于生 物催化的严格条件并且产生无用的副产物 ( 例如甘油 )。但是， 由于产物具有毒性并且效 价低， 前面阐述的大肠杆菌生产生物燃料的能力达不到工业相关所需的生产水平 (Atsumi 等， 2008 ； Fischer et al.2008)。
已经显示大肠杆菌能够通过利用内源产生的乙醇使外源加入的脂肪酸酯化， 从而 产生脂肪酸乙酯 (FAEE)(Kalscheuer 等， 2006)。然而由于脂肪酸的高成本， 该方法将是经 济上不可行的。而且， 其他小组已经证实， 通过外源性添加乙醇到生长培养基而改善天然 E.coli 脂肪酸生物合成和 β- 氧化途径， 会产生 FAEE(WO 2007/136762， WO 2008/119082， WO2009/009391)。然而， 需要在不添加外源性底物的情况下使能够制备生物柴油等效物的 E.coli 细胞保持工程化。
尽管由糖类生产第二代生物燃料 ( 例如 FAEE) 比由糖类生产乙醇具有优势， 从大 量可获得的生物质储备物中获得这种糖类提供甚至更大的进步。不幸地是， 从纤维素类生 物质中获得糖类需要使用昂贵的酶， 以从预处理的纤维素和半纤维素中释放糖类。
因此， 进一步需要合并的生物加工过程， 其中细胞由投入的纤维素类生物质制备 生物柴油等效物和其他脂肪酸衍生的化化学物质， 而无需加入外源底物或者酶。发明概述
本文中描述的是合并的生物加工方法和宿主细胞。 所述宿主细胞能够制备生物柴 油等效物和其他脂肪酸衍生物。 在特定的实施方案中， 宿主细胞能够使植物生物质降解， 并 利用其作为唯一碳源， 制备生物柴油等效物和其他脂肪酸衍生物。
因此， 一个方面包括一种由碳源制备脂肪酸乙酯的方法， 包括提供宿主细胞， 其中 所述宿主细胞含有编码硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 酰基转移酶、 醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶 的一种或多种重组核酸， 在培养基中培养所述宿主细胞以形成培养物， 使得一种或多种重 组核酸在细胞中表达， 其中所述培养基含有宿主细胞的碳源， 以及从培养物中提取脂肪酸 乙酯。
另一个方面进一步包括一种由生物质聚合物制备脂肪酸乙酯的方法， 包括首先提 供宿主细胞， 其中所述宿主细胞含有编码硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 酰基转移酶、 醇脱氢 酶、 丙酮酸脱羧酶和一种或多种生物质聚合物降解酶的一种或多种重组核酸， 其中所述一 种或多种生物质聚合物降解酶由宿主细胞分泌， 接着在培养基中培养所述宿主细胞以形成 培养物， 使得一种或多种重组核酸在细胞中表达， 其中所述培养基含有生物质聚合物作为 宿主细胞的碳源， 然后从培养物中提取脂肪酸乙酯。 在某些实施方案中， 宿主细胞含有编码 脂酰 -coA 脱氢酶的内源性核酸。在某些实施方案中， 宿主细胞被修饰为使得脂酰 -coA 脱 氢酶的表达相对于未修饰细胞中的表达水平减弱。在其他实施方案中， 宿主细胞是细菌细 胞、 真菌细胞、 藻青菌细胞、 植物细胞、 动物细胞或者人体细胞。在进一步的实施方案中， 宿 主细胞是大肠杆菌细胞或者酵母细胞。 在某些实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 硫酯 酶是来自大肠杆菌的 ltesA， 脂酰 -coA 合成酶是来自大肠杆菌的 fadD， 醇脱氢酶是来自运 动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis) 的 adhB， 丙酮酸脱羧酶是来自运动发酵单胞菌的 pdc， 或者酰基转移酶是来自不动细菌属 (Acinetobacter) 菌株 ADP1 的蜡酯合酶 atfA。在某些 实施方案中， 生物质聚合物是半纤维素。在某些实施方案中， 半纤维素是木聚糖。在某些实 施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是木聚糖酶和含有木聚糖内切酶催化结构域的 蛋白。在进一步的实施方案中， 木聚糖酶是来自卵形拟杆菌 (Bacteroides ovatus) 的 xsa 或者来自纤维弧菌 (Cellvibrio japonicus) 的 Gly43F。 在另一个实施方案中， 木聚糖内切 酶催化结构域是来源于粪堆梭菌 (Clostridium stercorarium) 的 xyn10B。在某些实施方 案中， 生物质聚合物是纤维素。 在进一步的实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是 含有纤维二糖水解酶催化结构域的蛋白、 β- 葡萄糖苷酶和含有纤维素酶催化结构域的蛋 白。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 纤维二糖水解酶催化结构域是来源 于纤维弧菌的 cel6A， β- 葡萄糖苷酶是纤维弧菌的 cel3B， 或者纤维素酶催化结构域是来 源于芽孢杆菌 (Bacillus sp.)D04 的 cel。 在某些实施方案中， 培养基不含游离的脂肪酸或 者醇。在某些实施方案中， 生物质聚合物是甘露聚糖。在进一步的实施方案中， 一种或多种 生物质聚合物降解酶是甘露聚糖内切酶、 甘露聚糖外切酶和 α- 半乳糖苷酶。在进一步的 实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 甘露聚糖内切酶是纤维弧菌的 Man26A， 甘露聚糖 外切酶是纤维弧菌的 Man5D， 或者 α- 半乳糖苷酶是纤维弧菌的 Aga27A。
本发明的另一个方面包括一种经基因修饰的宿主细胞， 其含有编码硫酯酶、 脂 酰 -coA 合成酶、 酰基转移酶、 醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的一种或多种重组核酸。
本发明的另一个方面包括一种经基因修饰的宿主细胞， 其含有编码硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 酰基转移酶、 醇脱氢酶、 丙酮酸脱羧酶和一种或多种生物质聚合物降解酶 的一种或多种重组核酸， 其中所述一种或多种生物质聚合物降解酶是分泌酶。在某些实施 方案中， 宿主细胞含有编码脂酰 -coA 脱氢酶的内源性核酸。在进一步的实施方案中， 宿主 细胞被修饰为使得脂酰 -coA 脱氢酶的表达相对于未修饰细胞中的表达水平减弱。在其他 实施方案中， 宿主细胞是细菌细胞、 真菌细胞、 藻青菌细胞、 植物细胞、 动物细胞或者人体细 胞。在进一步的实施方案中， 宿主细胞是大肠杆菌细胞或者酵母细胞。在某些实施方案 中， 以下一种或多种是准确的 ： 硫酯酶是大肠杆菌的 ltesA， 脂酰 -coA 合成酶是大肠杆菌的 fadD， 醇脱氢酶是运动发酵单胞菌的 adhB， 丙酮酸脱羧酶是运动发酵单胞菌的 pdc， 或者酰 基转移酶是不动细菌属菌株 ADP1 的蜡酯合酶 atfA。在某些实施方案中， 宿主细胞还含有 编码天然分泌的蛋白的重组核酸， 其中所述分泌蛋白与一种或多种生物质聚合物降解酶融 合。在进一步的实施方案中， 天然分泌的蛋白是大肠杆菌的 OsmY。在某些实施方案中， 一 种或多种生物质聚合物降解酶是木聚糖酶和含有木聚糖内切酶催化结构域的蛋白。在一 个进一步的实施方案中， 木聚糖酶是卵形拟杆菌的 xsa 或者纤维弧菌的 Gly43F。在另一个 实施方案中， 木聚糖内切酶催化结构域是来源于粪堆梭菌的 xyn10B。在进一步的实施方案 中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是含有纤维二糖水解酶催化结构域的蛋白、 β- 葡萄糖 苷酶和含有纤维素酶催化结构域的蛋白。在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确 的： 纤维二糖水解酶催化结构域是来源于纤维弧菌的 cel6A， β- 葡萄糖苷酶是纤维弧菌的 cel3B， 或者纤维素酶催化结构域是来源于芽孢杆菌 D04 的 cel。在某些实施方案中， 生物 质聚合物是甘露聚糖。在进一步的实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是甘露聚 糖内切酶、 甘露聚糖外切酶和 α- 半乳糖苷酶。在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是 准确的 ： 甘露聚糖内切酶是纤维弧菌的 Man26A， 甘露聚糖外切酶是纤维弧菌的 Man5D， 或者 α- 半乳糖苷酶是纤维弧菌的 Aga27A。
在另一个方面中， 本发明包括一种由生物质聚合物制备脂肪醇的方法， 其包括 提供宿主细胞， 其中所述宿主细胞含有编码硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 形成脂肪醇的脂 酰 -coA 还原酶和一种或多种生物质聚合物降解酶的一种或多种重组核酸， 其中所述一种 或多种生物质聚合物降解酶由宿主细胞分泌， 在培养基中培养所述宿主细胞以形成培养 物， 使得一种或多种重组核酸在细胞中表达， 其中所述培养基含有生物质聚合物作为宿主 细胞的碳源， 以及从培养物中提取脂肪醇。 在某些实施方案中， 宿主细胞含有编码脂酰 -coA 脱氢酶的内源性核酸。在某些实施方案中， 宿主细胞被修饰为使得脂酰 -coA 脱氢酶的表达 相对于未修饰细胞中的表达水平减弱。在其他实施方案中， 宿主细胞是细菌细胞、 真菌细 胞、 藻青菌细胞、 植物细胞、 动物细胞或者人体细胞。 在进一步的实施方案中， 宿主细胞是大 肠杆菌细胞或者酵母细胞。 在某些实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 硫酯酶是大肠杆 菌的 ltesA， 脂酰 -coA 合成酶是大肠杆菌的 fadD， 或者形成脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶是小 鼠 (Mus musculus) 的 mfar1。在某些实施方案中， 生物质聚合物是半纤维素。在某些实施 方案中， 半纤维素是木聚糖。 在某些实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是木聚糖 酶和含有木聚糖内切酶催化结构域的蛋白。在一个进一步的实施方案中， 木聚糖酶是卵形 拟杆菌的 xsa 或者纤维弧菌的 Gly43F。在另一个实施方案中， 木聚糖内切酶催化结构域是 来源于粪堆梭菌的 xyn10B。在某些实施方案中， 生物质聚合物是纤维素。在进一步的实施 方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是含有纤维二糖水解酶催化结构域的蛋白、 β- 葡萄糖苷酶和含有纤维素酶催化结构域的蛋白。在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是 准确的 ： 纤维二糖水解酶催化结构域是来源于纤维弧菌的 cel6A， β- 葡萄糖苷酶是纤维弧 菌的 cel3B， 或者纤维素酶催化结构域是来源于芽孢杆菌 D04 的 cel。在某些实施方案中， 生物质聚合物是甘露聚糖。在进一步的实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是甘 露聚糖内切酶、 甘露聚糖外切酶和 α- 半乳糖苷酶。在进一步的实施方案中， 以下一种或多 种是准确的 ： 甘露聚糖内切酶是纤维弧菌的 Man26A， 甘露聚糖外切酶是纤维弧菌的 Man5D， 或者 α- 半乳糖苷酶是纤维弧菌的 Aga27A。
在另一个方面中， 本发明包括一种经基因修饰的宿主细胞， 含有编码硫酯酶、 脂 酰 -coA 合成酶、 形成脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶和一种或多种生物质聚合物降解酶的一种 或多种重组核酸， 其中所述一种或多种生物质聚合物降解酶是分泌酶。 在某些实施方案中， 宿主细胞含有编码脂酰 -coA 脱氢酶的内源性核酸。在某些实施方案中， 宿主细胞被修饰为 使得脂酰 -coA 脱氢酶的表达相对于未修饰细胞中的表达水平减弱。在其他实施方案中， 宿 主细胞是细菌细胞、 真菌细胞、 藻青菌细胞、 植物细胞、 动物细胞或者人体细胞。 在进一步的 实施方案中， 宿主细胞是大肠杆菌细胞或者酵母细胞。 在某些实施方案中， 以下一种或多种 是准确的 ： 硫酯酶是大肠杆菌的 ltesA， 脂酰 -coA 合成酶是大肠杆菌的 fadD， 或者形成脂肪 醇的脂酰 -coA 还原酶是小鼠的 mfar1。在某些实施方案中， 宿主细胞还含有编码天然分泌 的蛋白的重组核酸， 其中所述分泌蛋白与一种或多种生物质聚合物降解酶融合。在进一步 的实施方案中， 天然分泌的蛋白是大肠杆菌的 OsmY。 在某些实施方案中， 一种或多种生物质 聚合物降解酶是木聚糖酶和含有木聚糖内切酶催化结构域的蛋白。 在一个进一步的实施方 案中， 木聚糖酶是卵形拟杆菌的 xsa 或者纤维弧菌的 Gly43F。 在另一个实施方案中， 木聚糖 内切酶催化结构域是来源于粪堆梭菌的 xyn10B。在进一步的实施方案中， 一种或多种生物 质聚合物降解酶是含有纤维二糖水解酶催化结构域的蛋白、 β- 葡萄糖苷酶和含有纤维素 酶催化结构域的蛋白。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 纤维二糖水解酶 催化结构域是来源于纤维弧菌的 cel6A， β- 葡萄糖苷酶是纤维弧菌的 cel3B， 或者纤维素 酶催化结构域是来源于芽孢杆菌 D04 的 cel。在某些实施方案中， 生物质聚合物是甘露聚 糖。 在进一步的实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是甘露聚糖内切酶、 甘露聚糖 外切酶和 α- 半乳糖苷酶。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 甘露聚糖内 切酶是纤维弧菌的 Man26A， 甘露聚糖外切酶是纤维弧菌的 Man5D， 或者 α- 半乳糖苷酶是纤 维弧菌的 Aga27A。
在另一个方面中， 本发明包括一种由生物质聚合物制备脂肪醛的方法， 包括提供 宿主细胞， 其中所述宿主细胞含有编码硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 脂酰 -coA 还原酶和一种 或多种生物质聚合物降解酶的一种或多种重组核酸， 其中所述一种或多种生物质聚合物降 解酶由宿主细胞分泌， 在培养基中培养所述宿主细胞以形成培养物， 使得一种或多种重组 核酸在细胞中表达， 其中所述培养基含有生物质聚合物作为宿主细胞的碳源， 以及从培养 物中提取脂肪醛。在某些实施方案中， 宿主细胞含有编码脂酰 -coA 脱氢酶的内源性核酸。 在某些实施方案中， 宿主细胞被修饰为使得脂酰 -coA 脱氢酶的表达相对于未修饰细胞中 的表达水平减弱。 在其他实施方案中， 宿主细胞是细菌细胞、 真菌细胞、 藻青菌细胞、 植物细 胞、 动物细胞或者人体细胞。 在进一步的实施方案中， 宿主细胞是大肠杆菌细胞或者酵母细 胞。在某些实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 硫酯酶是大肠杆菌的 ltesA， 脂酰 -coA合成酶是大肠杆菌的 fadD， 或者脂酰 -coA 还原酶是不动杆菌 (Acinetobacter baylyi) 的 acr1。在某些实施方案中， 生物质聚合物是半纤维素。在某些实施方案中， 半纤维素是木 聚糖。在某些实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是木聚糖酶和含有木聚糖内切 酶催化结构域的蛋白。在一个进一步的实施方案中， 木聚糖酶是卵形拟杆菌的 xsa 或者纤 维弧菌的 Gly43F。在另一个实施方案中， 木聚糖内切酶催化结构域是来源于粪堆梭菌的 xyn10B。在某些实施方案中， 生物质聚合物是纤维素。在进一步的实施方案中， 一种或多种 生物质聚合物降解酶是含有纤维二糖水解酶催化结构域的蛋白、 β- 葡萄糖苷酶和含有纤 维素酶催化结构域的蛋白。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 纤维二糖水 解酶催化结构域是来源于纤维弧菌的 cel6A， β- 葡萄糖苷酶是纤维弧菌的 cel3B， 或者纤 维素酶催化结构域是来源于芽孢杆菌 D04 的 cel。 在某些实施方案中， 生物质聚合物是甘露 聚糖。 在进一步的实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是甘露聚糖内切酶、 甘露聚 糖外切酶和 α- 半乳糖苷酶。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 甘露聚糖 内切酶是纤维弧菌的 Man26A， 甘露聚糖外切酶是纤维弧菌的 Man5D， 或者 α- 半乳糖苷酶是 纤维弧菌的 Aga27A。
在另一个方面中， 本发明包括一种经基因修饰的宿主细胞， 含有编码硫酯酶、 脂 酰 -coA 合成酶、 脂酰 -coA 还原酶和一种或多种生物质聚合物降解酶的一种或多种重组核 酸， 其中所述一种或多种生物质聚合物降解酶是分泌酶。 在某些实施方案中， 宿主细胞含有 编码脂酰 -coA 脱氢酶的内源性核酸。 在某些实施方案中， 宿主细胞被修饰为使得脂酰 -coA 脱氢酶的表达相对于未修饰细胞中的表达水平减弱。在其他实施方案中， 宿主细胞是细菌 细胞、 真菌细胞、 藻青菌细胞、 植物细胞、 动物细胞或者人体细胞。在进一步的实施方案中， 宿主细胞是大肠杆菌细胞或者酵母细胞。 在某些实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 硫 酯酶是大肠杆菌的 ltesA， 脂酰 -coA 合成酶是大肠杆菌的 fadD， 或者脂酰 -coA 还原酶是不 动杆菌的 acr1。在某些实施方案中， 宿主细胞还含有编码天然分泌的蛋白的重组核酸， 其 中所述分泌蛋白与一种或多种生物质聚合物降解酶融合。在进一步的实施方案中， 天然分 泌的蛋白是大肠杆菌的 OsmY。在某些实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是木聚 糖酶和含有木聚糖内切酶催化结构域的蛋白。在一个进一步的实施方案中， 木聚糖酶是卵 形拟杆菌的 xsa 或者纤维弧菌的 Gly43F。在另一个实施方案中， 木聚糖内切酶催化结构域 是来源于粪堆梭菌的 xyn10B。在进一步的实施方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是 含有纤维二糖水解酶催化结构域的蛋白、 β- 葡萄糖苷酶和含有纤维素酶催化结构域的蛋 白。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 纤维二糖水解酶催化结构域是来源 于纤维弧菌的 cel6A， β- 葡萄糖苷酶是纤维弧菌的 cel3B， 或者纤维素酶催化结构域是来 源于芽孢杆菌 D04 的 cel。在某些实施方案中， 生物质聚合物是甘露聚糖。在进一步的实施 方案中， 一种或多种生物质聚合物降解酶是甘露聚糖内切酶、 甘露聚糖外切酶和 α- 半乳 糖苷酶。 在进一步的实施方案中， 以下一种或多种是准确的 ： 甘露聚糖内切酶是纤维弧菌的 Man26A， 甘露聚糖外切酶是纤维弧菌的 Man5D， 或者 α- 半乳糖苷酶是纤维弧菌的 Aga27A。
在另一个方面中， 本发明包括利用甘露聚糖的方法和宿主细胞， 其中生物质聚合 物是甘露聚糖并且生物质聚合物降解酶是甘露聚糖内切酶、 甘露聚糖外切酶和 α- 半乳糖 苷酶。一个进一步的实施方案包括由甘露聚糖制备脂肪酸乙酯、 脂肪醇或者脂肪醛的方法 和宿主细胞。在另一个方面中， 本发明包括制备脂肪酸酯的方法和宿主细胞。在一个实施方案 中， 本发明包括由生物质聚合物制备脂肪酸乙酯的方法和宿主细胞。 在一个实施方案中， 宿 主细胞含有编码硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 形成脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶和酰基转移酶的 一种或多种重组核酸。
在一个方面中， 本发明包括由光照制备脂肪酸乙酯、 脂肪醇或者脂肪醛的方法。 在 一个实施方案中， 对能够利用光照作为碳源的有机体进行基因工程化， 以使其含有本发明 其他方面中如上面所描述的产生脂肪酸乙酯、 脂肪醇或者脂肪醛的酶途径。在另一个实施 方案中， 对本发明上述方面的宿主细胞进一步进行基因工程化， 以使其含有使宿主细胞能 够利用光照作为碳源并且能够由光照直接产生脂肪酸乙酯、 脂肪醇或者脂肪醛的酶途径。
附图简述
图 1 显示由半纤维素或者葡萄糖产生脂肪酸衍生的化分子的工程途径并且描述 了本研究中使用的合成操纵子 ( 图 1A)。通过去除形成乙酸盐的反应使天然大肠杆菌代谢 途径流 ( 黑色箭头线 ) 增加， 从而提高游离脂肪酸和酰基 -CoA 的产量 ( 去除的是 pta、 ackA 和 poxB)。通过 β- 氧化作用去除脂肪酸和脂酰 -CoA 的分解代谢， 使流量进一步增加。由 非天然途径 ( 灰色箭头线 ) 产生多种大肠杆菌非天然产物， 包括脂肪酸乙酯、 醇和醛。醇和 醛可以由脂酰 -CoA 直接产生 ( 分别利用 mFar1 或者 acr1)， 而酯需要引入产生乙醇的途径 ( 由 pdc 和 adhB 编码 )。最终， 通过表达并分泌木聚糖内切酶 Xyn10B 和一种来源于粪堆梭 菌的木聚糖酶， 以使我们的生产生物燃料的大肠杆菌能够利用半纤维素作为碳源， 完成对 合并的生物加工过程的阐述。标示了过量表达的基因或者操纵子， 三角形表示 lacUV5 启动 子。 图 1B 显示脂肪酸乙酯途径的示例， 图 1C 显示脂肪醇途径的示例， 图 1D 显示脂肪醛途径 的示例， 图 1E 显示脂肪酸酯 / 蜡酯途径的示例。缩写 ： Pyr- 丙酮酸 ； AcAld- 乙醛 ； EtOH- 乙 醇。 图 2 显示由工程化的大肠杆菌菌株产生的总游离脂肪酸。标示了过量表达和敲 除的基因。WT ： 野生型 DH1 ； LT ： 硫酯酶 ； LT-ΔfadD ： ΔfadD， LtesA ； LT-ΔfadE ： ΔfadE， LtesA ； LT-ΔfadD-ΔACE ： Δpta， ΔpoxB， ΔackA， ΔfadD， LtesA。
图 3 显示由多种菌株产生的生物柴油等效物。 HE-LAAP ： ΔfadE， LtesA， atfA， pdc， adhB ； faa2 ： ΔfadE， LtesA， atfA， pdc， adhB， faa2 ； HE-atf” ： ΔfadE， LtesA， atfA， pdc， adhB， fadDm2 ； A1A ： ΔfadE， LtesA， atfA， pdc， adhB， fadDm1 ； A2A ： ΔfadE， LtesA， 2 个拷贝 的 atfA， pdc， adhB， fadDm1。
图 4 显示由菌株 KS5 和 KS11 产生的脂肪醇。检测出了 C12 至 C18 脂肪醇。KS5 ： ΔfadE， mFar1 ； KS11 ： ΔfadE， acr1。
图 5 显示木聚糖利用菌株的生长 ( 图 5A 和 5B)。在图 5A 中， 将编码木聚糖内切 酶或者 β- 木糖苷酶的基因各自转化到大肠杆菌中或者一个质粒上， 以测试对木聚糖的利 用。 在图 5B 中， 蓝色菱形 GB-X 是质粒 pGB-X 在 BL21 背景中表达的木聚糖酶 xynB ； 绿色三角 形 GB-XX 是质粒 pGB-XX 在 BL21 背景中表达的木聚糖酶 xynB 和木聚糖内切酶 xsa。两种菌 株均生长于 0.2％木聚糖 M9 基础培养基中。 图 5C 显示产生的 FAEE ： HE-XH ： DH1， ΔfadE， 表 达 xynB、 xsa、 LtesA、 atfA、 pdc 和 adhB， 生长于 0.2％木糖中 ； PE2-XX ： DH1， ΔfadE， Δpta， ΔpoxB， ΔackA， 表达 xynB、 xsa、 LtesA、 atfA、 pdc 和 adhB， 生长于 0.2％木糖和 2％木聚糖 中。
图 6 显示 Ltes-A 表达菌株中游离脂肪酸链长度的分布。
图 7 显示重组大肠杆菌在羧甲基纤维素中的生长。
图 8 显示重组大肠杆菌共培养物在半乳甘露聚糖中的生长。
图 9 显示由大肠杆菌产生的脂肪酸酯。图 9A 显示产生的十四酸十六烷基酯。图 9B 显示产生的十六酸十六烷基酯。图 9C 显示产生的十六酸十八烷基酯。
图 10 显示含有携带 OsmY-XynB 和 OsmY-Xsa 的质粒的大肠杆菌以及含有携带 OsmY-XynB 和无标签的 Xsa 的质粒的大肠杆菌在含有木聚糖作为唯一碳源的培养基中生长 的比较。
图 11 显示表达纤维素酶和 β- 葡萄糖苷酶的大肠杆菌在再生非晶形纤维素 (RAC) 中的生长。对照大肠杆菌不表达纤维素酶。
图 12 显示表达 OsmY-XynB 和 Gly43F 的大肠杆菌在含有木聚糖或者木糖作为唯一 碳源的培养基中的生长。
发明详述
本文公开的内容涉及合并的生物加工方法和宿主细胞。在特定的实施方案中， 宿 主细胞能够产生生物柴油等效物和其他脂肪酸衍生物。在其他实施方案中， 宿主细胞具有 使生物质聚合物直接转化或者通过光照转化成生物柴油等效物和其他脂肪酸衍生物的能 力。在一个方面中， 本发明提供了一种由生物质聚合物生产生物柴油等效物和其他脂肪酸 衍生物的方法， 其包括提供一种经基因工程化的宿主细胞， 在含有碳源的培养基中培养所 述宿主细胞， 使得细胞中的重组核酸表达， 以及从培养物中提取生物柴油等效物和其他脂 肪酸衍生物。
本发明的宿主细胞
本文中交叉使用 “宿主细胞” 和 “宿主微生物” ， 其是指能够通过插入重组 DNA 或者 RNA 而被转化的生物活细胞。这种重组 DNA 或者 RNA 可以处于表达载体中。因此， 本文中描 述的宿主微生物或者细胞可以是原核有机体 ( 例如真细菌王国的有机体 (organism of the kingdom Eubacteria))。 本领域普通技术人员将领会的是， 原核细胞没有膜围绕的核， 而真 核细胞具有膜围绕的核。
本发明中可以使用任何原核或者真核宿主细胞， 只要其经核酸序列转化后保持活 力。在优选的实施方案中， 宿主微生物是细菌， 在一些实施方案中， 细菌是大肠杆菌。在其 他实施方案中， 细菌是藻青菌。 细菌宿主细胞的额外示例包括但不限于属于埃希氏菌、 肠杆 菌、 固氮菌、 欧文氏菌、 芽孢杆菌、 假单胞菌、 克雷白氏杆菌、 变形杆菌、 沙门氏菌、 沙雷氏菌、 志贺氏菌、 根瘤菌、 透明颤菌、 聚球藻、 集胞藻、 副球菌分类等级的那些菌种。优选必要核酸 序列的转化、 随后蛋白 ( 即酶 ) 的表达或者得到的中间物不会对宿主细胞产生不利影响。
适宜的真核细胞包括但不限于真菌、 植物、 昆虫或者哺乳动物细胞。 适宜的真菌细 胞是酵母细胞， 例如酵母属的酵母细胞。在一些实施方案中， 真核细胞来源于藻类， 例如莱 茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)、 斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus)、 普通小球藻 (Chlorella vulgaris) 或者杜氏盐藻 (Dunaliella salina)。
本发明的宿主细胞经基因修饰， 其中重组核酸已经引入宿主细胞中， 并且自然界 不存在经基因修饰的宿主细胞。适宜的宿主细胞是能够表达一种或多种核酸构建体的宿 主细胞， 所述核酸构建体编码能够催化期望的生物合成反应的一种或多种酶。在优选的实施方案中， 一种或多种酶包括但不限于硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 酰基转移酶、 醇脱氢酶、 丙酮酸脱羧酶、 一种或多种生物质聚合物降解酶、 形成脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶或者脂 酰 -coA 还原酶。在优选的实施方案中， 一种或多种酶能够催化产生生物柴油等效物和其他 脂肪酸衍生物的反应。
本文中使用的 “重组核酸” 或者 “异源核酸” 是指核酸聚合物， 其中以下的至少一 个是准确的 ： (a) 核酸序列对于特定的宿主微生物是外来的 ( 即在宿主微生物中不能天然 找到 ) ； (b) 在特定的宿主微生物中可以天然找到其序列， 但是以非天然 ( 例如多于预期 ) 量存在 ； 或者 (c) 核酸序列包含天然相互无关联的两个或者多个子序列。例如， 对于情况 (c)， 重组核酸序列将具有来源于无关联基因的两个或者多个序列， 其排列形成新的功能性 核酸。 具体地， 本发明描述了将表达载体引入宿主细胞， 其中所述表达载体含有编码在宿主 细胞中通常不能找到的酶的核酸序列， 或者含有编码在细胞中通常能够找到但是处于不同 调控序列控制下的酶的核酸。对于宿主细胞的基因组而言， 编码酶的核酸序列是重组的。
在一些实施方案中， 宿主细胞天然产生制备脂肪酸衍生的化合物的任何前体。编 码期望酶的这些基因可以是宿主细胞异源性的， 或者这些基因可以是宿主细胞内源性的但 是与异源启动子和 / 或控制区可操作连接， 以使宿主细胞中基因的表达量较高。在其他实 施方案中， 宿主细胞不能天然产生期望的脂肪酸分子， 其包含能够表达产生那些分子所必 需的一种或多种基因的异源核酸构建体。
本文中对于核酸分子或者多肽以及特定的细胞或微生物使用的 “内源性” 是指细 胞中的核酸序列或者肽， 其不必利用重组工程技术引入细胞中， 例如当细胞初始从自然界 分离时存在于细胞中的基因。
能够催化期望反应的每种期望酶可以是宿主细胞天然的或者异源性的。 当酶是宿 主细胞天然的酶时， 可选地对宿主细胞进行基因修饰， 以调节酶的表达。 这种修饰可以包括 对宿主细胞中编码酶的染色体基因进行修饰， 或者将编码酶基因的核酸构建体引入宿主细 胞中。修饰的一个作用是调节宿主细胞中酶的表达， 例如与未修饰宿主细胞中酶的表达相 比， 宿主细胞中酶的表达量增加。 可选地， 对酶表达的修饰可以使与未修饰细胞中酶的表达 量相比， 酶的表达量减少。例如， 宿主细胞可以含有编码脂酰 -coA 脱氢酶的天然核酸。在 本发明的一些方面中， 可以对宿主细胞进行基因修饰， 以使编码脂酰 -coA 脱氢酶的表达相 对于未修饰宿主细胞中的表达水平减弱或者降低。
基因修饰包括任何类型的修饰， 具体地包括通过重组技术和 / 或经典突变进行的 修饰。如本文中所使用， 导致基因的表达、 基因功能或者基因产物 ( 即基因所编码的蛋白 ) 的功能减弱的基因修饰可以被称为失活 ( 完全或者部分 )、 缺失、 干扰、 阻断、 沉默或者下 调， 或者基因表达量减少。 例如， 导致基因所编码的蛋白功能降低的基因修饰可以是由于基 因的完全缺失 ( 即基因不存在， 因而蛋白不存在 )、 导致蛋白不完整或者不翻译 ( 例如蛋白 不表达 ) 的基因突变， 或者使蛋白天然功能降低或者丧失 ( 例如所表达蛋白的酶活性或者 作用降低或者无 ) 的基因突变。更具体地， 所涉及本文中讨论的使酶的作用或者活性降低 一般是指本发明微生物中导致酶的表达和 / 或功能性 ( 生物学活性 ) 降低的任何基因修 饰， 其包括酶活性降低 ( 例如特异性 )、 对酶的抑制或者降解增加， 以及酶的表达减弱或者 消失。 例如， 可以通过阻断或者减少酶的产生、 降低酶活性或者抑制酶活性， ， 使得本发明的 酶的作用或者活性降低。还可以联合进行这些修饰中的一些修饰。阻断或者减少酶的产生可以包括使编码酶的基因处于需要培养基中存在一种诱导化合物的启动子控制下。 通过设 定条件以使培养基中的诱导物开始耗尽， 可以关闭编码酶的基因 ( 因而酶合成 ) 的表达。 阻 断或者降低酶活性还可以包括利用与第 4,743,546 号美国专利中所描述类似的切除技术 方法。 为了利用该方法， 将编码目的酶的基因克隆到特异的基因序列之间， 使得能够将基因 从基因组中特异地、 受控地切除。可以通过例如如第 4,743,546 号美国专利中改变培养物 的培养温度或者通过一些其他物理或者营养信号来促进切除。
“基因工程化” 或者 “基因修饰” 是指产生原核或者真核宿主细胞的任何重组 DNA 或者 RNA 方法， 所述宿主细胞表达升高水平、 较低水平或者突变形式的蛋白。换言之， 宿主 细胞已经利用重组多聚核苷酸分子进行了转染、 转经或者转导， 因而已经发生改变， 引起 细胞改变期望蛋白的表达。用于对宿主细胞进行基因工程化的方法和载体是本领域熟知 的， 例如多种技术描述于 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel 等， eds. (Wiley&Sons， New York， 1988， 每季度更新 ) 中。基因工程技术包括但不限于表达载体、 定 向同源重组和基因活化 ( 参见例如第 5,272,071 号美国专利 )， 以及通过工程化转录因子反 式激活 ( 参见例如 Segal 等， 1999， Proc Natl Acad Sci USA 96(6) ： 2758-63)。
使基因表达或者功能增强的基因修饰可以被称为基因的扩增、 过量产生、 过量表 达、 活化、 增强、 增加或者上调。更具体地， 所涉及本文中讨论的酶或者其他蛋白的作用 ( 或 者活性 ) 增强一般是指所述微生物中导致酶或者蛋白的表达和 / 或功能性 ( 生物学活性 ) 增强的任何基因修饰， 其包括酶活性 ( 例如特异性或者体内酶促活性 ) 较高、 对酶的抑制或 者降解减少以及酶的过量表达。 例如， 可以使基因拷贝数增加， 可以通过利用提供高于天然 启动子的表达水平的启动子， 使得表达水平增加， 或者可以通过基因工程或者经典突变使 基因发生改变从而增强酶的生物学活性。还可以联合进行这些修饰中的一些修饰。
一般来讲， 根据本发明， 突变体或者经修饰酶特定特性的增强或者降低是相对于 来源于相同有机体 ( 来源于相同来源或者亲本序列 ) 的野生型酶的相同特性而言， 其在相 同或者等效条件下测定或者确定。类似地， 经基因修饰的微生物的特性 ( 例如蛋白的表达 和 / 或生物学活性， 或者产物的产量 ) 的增强或者降低是相对于在相同或者等效条件下相 同物种 ( 优选相同菌株 ) 野生型微生物的相同特性而言。这种条件包括测定蛋白活性 ( 例 如表达或者生物学活性 ) 或者微生物的其他特性的测定或者培养条件 ( 例如培养基组分、 温度、 pH 值等 )， 以及所使用的测定类型、 被测的宿主微生物等。如上面所讨论， 等效条件是 类似但不必相同 ( 例如可以允许条件的保守性改变 ) 的条件， 与相同条件相比， 其基本不会 改变对微生物生长或者酶的表达或生物学活性的作用。
优选与野生型微生物中野生型蛋白的活性相比， 经基因修饰的宿主细胞 ( 具有使 特定蛋白 ( 例如酶 ) 的活性增强或者降低的基因修饰 ) 在蛋白活性 ( 例如表达、 产生和 / 或生物学活性 ) 上分别增强或者降低至少大约 5％， 更优选至少大约 10％， 更优选至少大约 15％， 更优选至少大约 20％， 更优选至少大约 25％， 更优选至少大约 30％， 更优选至少大约 35％， 更优选至少大约 40％， 更优选至少大约 45％， 更优选至少大约 50％， 更优选至少大约 55％， 更优选至少大约 60％， 更优选至少大约 65％， 更优选至少大约 70％， 更优选至少大约 75％， 更优选至少大约 80％， 更优选至少大约 85％， 更优选至少大约 90％， 更优选至少大约 95％， 或者 5％和 100％之间的任何整数百分数 ( 例如 6％、 7％、 8％等 )。 当将分离的经修饰 核酸分子或者蛋白的活性直接与分离的野生型核酸分子或者蛋白的活性进行比较时 ( 例如如果将体内与体外相比较 )， 优选具有相同差异。
在本发明的另一个方面中， 与野生型微生物中野生型蛋白的活性相比， 经基因修 饰的宿主细胞 ( 具有使特定蛋白 ( 例如酶 ) 的活性增强或者降低的基因修饰 ) 在蛋白活性 ( 例如表达、 产生和 / 或生物学活性 ) 上分别增强或者降低至少大约 2 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 更优选至少大约 5 倍， 或者从至少大约 2 倍开始的任何整数倍 ( 例如 3 倍、 4 倍、 5 倍、 6倍 等 )。
本发明的酶和编码酶的构建体
本发明的酶包括宿主细胞中直接或者间接制备生物柴油等效物或者其他脂肪酸 衍生物的途径中涉及的任何酶。 本发明的酶可以例如催化产生进一步反应的中间产物或者 底物， 所述进一步反应在宿主细胞中产生生物柴油等效物或者其他脂肪酸衍生物。在一些 实施方案中， 本发明的酶是分泌酶。本发明的酶包括但不限于硫酯酶、 脂酰 -coA 合成酶、 酰 基转移酶、 醇脱氢酶、 丙酮酸脱羧酶、 形成脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶、 脂酰 -coA 还原酶或者 酰基 -coA 脱氢酶， 以及一种或多种生物质聚合物降解酶， 例如木聚糖酶、 木聚糖内切酶、 纤 维二糖水解酶、 β- 葡萄糖苷酶、 纤维素酶、 甘露聚糖内切酶、 甘露聚糖外切酶或者 α- 半乳 糖苷酶。 硫酯酶包括特异地在硫醇基团处显示酯酶活性 ( 在水存在下使酯分解为酸和醇 ) 的任何酶。例如， 硫酯酶可以是大肠杆菌的 ltesA(GenBank 登录号 AAC73596)。其他硫酯酶 包括但不限于列于下面表 1 中的那些酶。
表1
脂酰 -coA 合成酶包括催化酰基 -CoA+n 丙二酰基 -CoA+2n NADH+2n NADPH+4n H 长 链 酰 基 -CoA+n CoA+n CO2+2n NAD++2nNADP+ 化 学 反 应 的 任 何 酶。 该 酶 也 被 称 为脂酰 -coA 连接酶。例如， 脂酰 -coA 合成酶可以是大肠杆菌的 fadD(GenBank 登录号 AP_002424)。在其他实施方案中， 脂酰 -coA 合成酶可以是酿酒酵母 (S.cerevisiae) 的 faa1( 登录号 NP_014962.1)、 faa2( 登录号 NP_010931.1)、 faa3( 登录号 NP_012257.1) 或
+者 faa4( 登录号 NP_013974.1)。
酰基转移酶包括作用于酰基基团的任何类型的转移酶。 例如酰基转移酶或以是不 动细菌属菌株 ADP1 的蜡酯合酶 atfA(GenBank 登录号 AF529086)。 在另一个实施方案中， 酰 基转移酶可以是酿酒酵母的 dgat。
醇脱氢酶包括促进酶和醛或者酮之间相互转化同时使 NAD+ 还原成 NADH 的任何 酶。例如， 醇脱氢酶可以是运动发酵单胞菌的 adhB。
丙酮酸脱羧酶包括催化丙酮酸脱羧基成为乙醛和二氧化碳的任何同源四聚体酶。 例如， 丙酮酸脱羧酶可以是运动发酵单胞菌的 pde。
形成脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶是使脂酰 -coA 还原成脂肪醇的任何酶。 例如， 形成 脂肪醇的脂酰 -coA 还原酶可以是小鼠的 mFar1。 在其他实施方案中， 其可以是家蚕 (Bombyx mori) 的 BmFAR(GenBank 登录号 BAC79425)、 小鼠的 mFAR2 或者人的 hFAR。
脂酰 -coA 还原酶是催化化学反应的任何酶。例如， 脂酰 -coA 还原酶可以是不动 细菌属菌株 ADP1 的 acr1(GenBank 登录号 YP_047869)。在其他实施方案中， 脂酰 -coA 还原 酶可以是大肠杆菌的 yqhD(GenBank 登录号 AP_003562)。
酰基 -coA 脱氢酶是其反应使得在酰基 -CoA 硫酯底物的 C2 和 C3 之间引入反式双 键的任何酶。例如， 酰基 -coA 脱氢酶可以是大肠杆菌的 fadE。
生物质聚合物降解酶包括能够使任意生物质聚合物降解的任何酶。本文中描述 的 “生物质聚合物” 是生物材料中含有的任何聚合物。生物材料可以是活的或者死的。生 物质聚合物包括例如纤维素、 木聚糖、 半纤维素、 木质素、 甘露聚糖和通常能够在生物质 中找到的其他材料。生物质聚合物来源的非限定性示例包括禾本类 ( 例如柳枝稷、 芒属 (Miscanthus))、 稻谷壳、 甘蔗渣、 棉花、 黄麻、 大麻、 亚麻、 竹、 剑麻、 马尼拉麻、 稻草、 树叶、 剪 下的草、 玉米秸秆、 玉米棒、 酒槽、 豆科植物、 高粱、 甘蔗、 甜菜浆、 木片、 锯末和生物质作用 ( 例如海甘蓝 (Crambe))。
生物质聚合物降解酶可以包括但不限于木聚糖酶 ( 例如卵形拟杆菌的 xsa 或者 纤维弧菌的 Gly43F)、 木聚糖内切酶催化结构域 ( 例如来源于粪堆梭菌的 xyn10B)、 纤维二 糖水解酶催化结构域 ( 例如来源于纤维弧菌的 cel6A)、 β- 葡萄糖苷酶 ( 例如纤维弧菌的 cel3B)、 纤维素酶催化结构域 ( 例如来源于芽孢杆菌 D04 的 cel)、 甘露聚糖内切酶 ( 例如纤 维弧菌的 Man26A)、 甘露聚糖外切酶 ( 例如纤维弧菌的 Man5D) 或者 α- 半乳糖苷酶 ( 例如 纤维弧菌的 Aga27A)。
本 发 明 的 酶 的 额 外 示 例 可 以 不 限 于 在 Kalscheuer，和 SteinbüchelMicroBiology(2006)152 2529-2539、 Ingram 等 Appl Environ MicroBiol(1987)53 2420-2425、 WO 2008/100251、 WO 2008/119082、 WO2007/136762 和 WO 2009/009391 中找到。
本文中描述的酶可以用其同源酶容易地替代。本文中使用的 “同源酶” 是指具有 与本说明书或者所引用参考文献中任何一种酶具有至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％或者至少 99％一致性的多肽序列的酶。同源酶保留被认为是酶 保守性的氨基酸残基。同源酶的非保守性氨基酸残基可以置换为或者发现是不同的氨基 酸， 或者发生氨基酸插入或者缺失， 只要其对同源酶的酶活性无影响或者影响不大。 同源酶 具有与本说明书或者所引用参考文献中任何一种酶的酶活性基本相同的酶活性， 因为其将 催化相同的反应。该酶的特异性可以增强或者降低。同源酶可以天然找到或者是其工程化突变体。本文中描述的该酶还可以替换为异构酶， 其可以具有不同的氨基酸序列但是催化 相同的化学反应。
本发明的核酸构建体包含编码一种或多种本发明酶的核酸序列。 本发明酶的核酸 与启动子以及可选地控制序列处于可操作连接， 以使本发明的酶在在适宜条件下培养的宿 主细胞中表达。启动子和控制序列是每种宿主细胞物种特异性的。在一些实施方案中， 表 达载体包含核酸构建体。 设计并且制备核酸构建体和表达载体的方法是本领域技术人员熟 知的。
本文中使用的术语 “核酸序列” 、 “核酸的序列” 及其变体应当是属于多聚脱氧核糖 核苷酸 ( 含有 2- 脱氧 -D- 核糖 )、 多聚核糖核苷酸 ( 含有 D- 核糖 )、 嘌呤或者嘧啶碱基 N- 糖 苷的任何其他类型的多聚核苷酸， 以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物 ( 只要聚合物含有 如 DNA 和 RNA 中发现的核苷碱基， 其构型允许碱基配对和碱基堆积 )。因此， 这些术语包括 已知类型的核酸序列修饰， 例如一个或者多个天然核苷酸置换为其类似物 ； 核苷酸间修饰， 例如具有不带电荷的键 ( 例如膦酸甲酯、 磷酸三脂、 氨基磷酸酯、 氨基甲酸酯等 )、 具有带负 电荷的键 ( 例如磷硫酰、 二硫代磷酸脂等 )、 具有带正电荷的键 ( 例如氨烷基氨基磷酸酯、 氨 烷基磷酸三酯 )、 含有悬挂基团 ( 例如蛋白 ( 包括核酸酶、 毒素、 抗体、 信号肽、 多聚 L- 赖氨 酸等 )、 具有嵌入剂 ( 例如吖啶、 补骨脂素等 ) 和含有螯合剂 ( 例如金属、 放射性金属、 硼、 氧化性金属等 )。本文中使用的核苷酸和多聚核苷酸符号是由 IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature(Biochem.9 ： 4022， 1970) 建议的那些符号。
编码对象酶的核酸序列通过本领域技术人员已知的任何适宜方法制备， 包括例如 直接化学合成或者克隆。对于直接化学合成， 形成核酸聚合物通常包括在正在延长的核苷 酸链的 5’ 末端 - 羟基基团处依次加入 3’ 封闭和 5’ 封闭的核苷酸单体， 其中通过正在延长 链的 5’ 末端 - 羟基基团对所加入单体的 3’ 位进行亲核攻击来完成加入， 通常是磷的衍生 物， 例如磷酸三酯、 亚磷酰胺等。这种方法是本领域普通技术人员已知的， 其描述于相关文 章和文献中 ( 例如 Matteuci 等， (1980)Tet.Lett.521 ： 719 ； 第 4,500,707 号、 第 5,436,327 号和第 5,700,637 号美国专利中 )。另外， 期望的序列可以通过下列方式从天然源来分 离： 使用合适的限制酶分裂 DNA， 使用凝胶电泳法来分离片段， 此后通过本领域技术人员已 知的技术从凝胶中回收期望的核酸序列， 例如使用聚合酶链式反应 (PCR ； e.g.， U.S.Pat. No.4,683,195)。
可以将编码期望酶的每个核酸序列融合入表达载体中。 “表达载体” 或者 “载体” 是指转导、 转化或者感染宿主细胞， 使得细胞表达细胞非天然性核酸和 / 或蛋白或者以非 天然性方式表达核酸和 / 或蛋白的化合物和 / 或组合物。 “表达载体” 含有将要由宿主微生 物表达的核酸序列 ( 通常是 RNA 或者 DNA)。可选地， 表达载体还包含帮助核酸进入宿主细 胞内的材料， 例如病毒、 脂质体、 蛋白涂层等。涉及用于本发明中的表达载体包括核酸序列 以及可选地任何优选或者所需操纵元件可以插入其中的那些表达载体。此外， 表达载体必 须能够转移至宿主微生物中并在其中复制。优选表达载体是质粒， 具体地是具有已经清楚 记载的限制性位点并且含有核酸序列转录优选或者所需的操纵元件的质粒。 这种质粒以及 其他表达载体是本领域普通技术人员熟知的。
可以通过已知方法融合单个核酸序列， 所述方法包括例如使用限制性酶 ( 例如 BamHI、 EcoRI、 Hhal、 Xhol、 Xmal 等 ) 切割表达载体 ( 例如质粒 ) 中的特异性位点。限制性酶产生单链末端， 其可以与核酸序列退火， 所述核酸序列具有或者合成以具有与被切割表 达载体的末端互补的末端序列。利用合适的酶进行退火， 例如 DNA 连接酶。本领域普通技 术人员将领会的是， 表达载体和期望的核酸序列通常均被相同的酶切割， 因而保证了表达 载体的末端与核酸序列的末端是相互互补的。此外， 可以利用 DNA 接头来帮助核酸序列连 接入表达载体中。
还可以通过利用本领域普通技术人员已知的方法 ( 例如第 4,683,195 号美国专 利 ) 使一系列单个核酸序列联合。例如， 可以最初在各自的 PCR 中产生每个期望的核酸序 列。其后设计特异性引物以使 PCR 产物的末端含有互补序列。当将 PCR 产物混合、 变性和 重新退火时， 3’ 末端具有配对序列的链重叠， 并且可以作为互相的引物。用 DNA 聚合酶使该 重叠部分延伸， 产生初始序列被 “剪接” 到一起的分子。通过这种方法， 可以将一系列单个 核酸序列 “剪接” 到一起并随后同时转导入宿主细胞中。因此使多个核酸序列中的每个均 能够表达。
接着将单个核酸序列或者 “剪接” 的核酸序列融合到表达载体中。本发明中将核 酸序列融合到表达载体中的过程不受限制。 本领域普通技术人员熟悉将核酸序列融合到表 达载体中的必要步骤。通常表达载体含有期望核酸序列， 其前面是一个或者多个调控区以 及核糖体结合位点， 例如长度为 3-9 个核苷酸并且位于大肠杆菌起始密码子上游 3-11 个 核苷酸处的核苷酸序列 ( 参见 Shine 等， (1975)Nature 254 ： 34 and Steitz， Biological Regulation and Development ： Gene Expression(ed.R.F.Goldberger)， vol.1， p.349， 1979， Plenum Publishing， NY)。
调控区包括例如含有启动子和操纵子的那些区域。 启动子与期望核酸序列可操作 连接， 从而通过 RNA 聚合酶起始核酸序列的转录。操纵子是与启动子相邻的核酸序列， 其含 有阻遏子可以结合的蛋白结合结构域。不存在阻遏蛋白时， 通过启动子起始转录。当存在 时， 操纵子蛋白结合结构域特异性阻遏蛋白与操纵子结合， 从而抑制转录。用这种方法， 基 于所使用的具体调控区和相应阻遏蛋白的存在或者缺失， 来达到对转录的控制。示例包括 乳糖启动子 ( 当与乳糖接触时， Lad 阻遏蛋白改变构象， 从而阻止 Lad 阻遏蛋白与操纵子相 结合 )、 色氨酸启动子 ( 当与色氨酸结合时， TrpR 阻遏蛋白具有不与操纵子结合的构象 )。 另一个示例是 tac 启动子 ( 参见 deBoer 等， (1983)Proc Natl Acad Sci USA， 80 ： 21-25)。 本领域普通技术人员将领会的是， 这本发明可以使用这些和其他表达载体， 并且本发明在 该方面不受限制。
尽管可以使用任何适宜的表达载体融合期望序列， 易于利用的载体包括但不限 于： 质粒 ( 例如 pSC101、 pBR322、 pBBR1MCS-3、 pUR、 pEX、 pMR100、 pCR4、 pBAD24、 pUC19) 和细 菌噬菌体 ( 例如 M13 噬菌体和 λ 噬菌体 )。当然， 这些表达载体仅适用于特定的宿主细胞。 但是， 本领域普通技术人员通过常规实验可以容易地确定任何一种特定的表达载体是否适 用于任何一种特定的宿主细胞。 例如， 可以将表达载体引入宿主细胞， 接着对宿主细胞的活 力和载体中所含序列的表达进行监测。此外， 可以参考描述表达载体和其对于任何一种特 定宿主细胞的适宜性的相关文章和参考文献。
制备并培养本发明的宿主细胞的方法
本发明的表达载体必须引入或者转移至宿主细胞中。 将表达载体转移至宿主细胞 中的方法是本领域普通技术人员熟知的。例如， 用表达载体转化大肠杆菌的一种方法涉及氯化钙处理， 其中通过钙沉淀物将表达载体引入。 还可以依照类似步骤使用其他盐， 例如磷 酸钙。此外， 还可以利用电穿孔 ( 即利用电流来增加细胞对核酸序列的通透性 ) 转染宿主 微生物。此外， 核酸序列的微注射能够转染宿主微生物。还可以使用其他方法， 例如脂质复 合物、 脂质体和树枝状聚合物。本领域普通技术人员可以利用这些或者其他方法用期望序 列转染宿主细胞。
可以利用多种方法鉴定经转染的宿主细胞。例如， 可以利用适宜稀释将可以经转 染的宿主细胞分离成单个细胞， 并随后单独培养并测定期望核酸序列的表达。 此外， 当使用 质粒时， 常用的做法涉及基于抗微生物抗性对细胞进行筛选， 所述抗性由有意包含入表达 载体的基因赋予， 例如 amp、 gpt、 neo 和 hyg 基因。
用至少一种表达载体转化宿主细胞。当仅使用单一的表达载体时 ( 不加入中间 物 )， 载体将含有所有必需的核酸序列。
一旦已经用表达载体转化宿主细胞， 使宿主细胞生长。本发明的方法包括培养宿 主细胞以使细胞中的重组核酸表达。对于微生物宿主， 该过程需在在适宜的培养基中培养 细胞。通常细胞在合适的培养基中于 35℃生长。本发明的优选生长培养基是常用的商业 制备培养基， 例如 Luria Bertani(LB) 肉汤、 沙氏葡萄糖 (SD) 肉汤或者酵母培养基 (YM) 肉 汤。还可以使用其他限定或者合成培养基， 并且特定宿主细胞生长的合适培养基将是微生 物学或者发酵科学领域技术人员已知的。
根据本发明的一些方面， 培养基含有宿主细胞的碳源。这种 “碳源” 一般是指适于 用作原核或者简单真核细胞生长源的底物或者化合物。碳源可以以多种形式存在， 包括但 不限于聚合物、 碳水化合物、 酸、 醇、 醛、 酮、 氨基酸、 肽等。这些包括例如多种单糖 ( 例如葡 萄糖、 木糖和阿拉伯糖 )、 二糖 ( 例如蔗糖 )、 寡糖、 多糖、 生物质聚合物 ( 例如纤维素和半纤 维素 )、 饱和或者不饱和脂肪酸、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 乙酸盐、 乙醇等， 或者其混合物。碳源还 可以是光合作用的产物， 包括但不限于葡萄糖。
除了合适碳源之外， 发酵培养基必须含有适宜的矿物质、 盐、 辅助因子、 缓冲液和 其他组分， 这些物质是本领域技术人员已知的， 其适于培养物生长并且促进产生脂肪酸衍 生的化分子所必需的酶促途径。 反应可以在有氧或者厌氧条件下进行， 其中有氧、 缺氧或者 厌氧条件优选基于微生物的需要。随着宿主细胞生长和 / 或繁殖， 产生 FAEE、 脂肪醇、 脂肪 醛和其他脂肪酸衍生物所必需的酶表达。
本发明的生物柴油等效物和其他脂肪酸衍生物
本发明提供了生物柴油等效物和其他脂肪酸衍生物的生产。 生物柴油等效物和其 他脂肪酸衍生物包括但不限于脂肪酸乙酯、 脂肪酸酯、 蜡酯、 脂肪醇和脂肪醛。
本发明提供了通过本发明的方法产生的分离的脂肪酸衍生的化合物。 分离脂肪酸 衍生的化合物包括分离宿主细胞的至少一部分或全部、 及其部分， 从其中制备脂肪酸衍生 的化合物， 这来自分离的脂肪酸衍生的化合物。分离的脂肪酸衍生的化合物可以不含或者 基本不含由至少部分或者所有宿主细胞及其组分形成的杂质。 当残余杂质的性质不会干扰 脂肪酸衍生的化合物作为燃料 ( 例如燃烧反应中的燃料 ) 的用途时， 分离的脂肪酸衍生的 化合物基本不含杂质。
本发明还提供了一种可燃烧的组合物， 其包含分离的脂肪酸衍生的化合物和细胞 组分， 其中所述细胞组分基本不会干扰组合物的燃烧。 细胞组分包括整个细胞或者其部分。细胞组分来源于产生脂肪酸衍生的化合物的宿主细胞。
本发明的脂肪酸衍生的化合物可以作为能量的化学来源用作燃料， 所述燃料可以 用作石油衍生的化燃料、 乙醇等的替代物。本发明的脂肪酸衍生的化合物还可以用于合成 大量用作可再生型燃料的烷烃、 醇和酯。 此外， 脂肪酸衍生的化合物还可以用作治疗物或者 高价值油的前体， 例如可可脂等效物。
还将理解的是， 虽然已经结合本发明优选的特定实施方案对本发明进行了描述， 但是前面的描述意在说明而不能限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、 优势和 修饰对于本发明所属技术领域的技术人员而言将是清楚的。
已经对本发明进行描述后， 提供下面的实施例以说明方式而非限定方式来说明本 发明。 实施例 实施例 1- 通过胞质硫酯酶的表达解除对脂肪酸的生物合成的抑制
大肠杆菌中的脂肪酸生物合成 ( 如图 1 中显示 ) 受到经典产物抑制的负调控， 其中产物， 即与酰基载体蛋白 (ACP) 结合的脂酰链， 抑制脂肪酸合成酶产生新的脂肪酸 (Jiang 和 Cronan 1994 ； Magnuson et al.1993)。 因此， 细胞不会产生多于构建膜和分裂所 需的脂肪。接着脂肪酸通过 PlsB 或者 PlsC 从 ACP 中释放， 继续形成膜脂质。尽管胞质硫 酯酶的表达能够通过切割硫酯酶键以及产生 holo-ACP 和游离脂肪酸， 解除对脂酰 -ACP 的 抑制， 但是所显示的效价极低 (ng/L)(Jiang 和 Cronan 1994)。
通过使通常在外周质中发现的天然大肠杆菌硫酯酶 ltesA 在胞质中表达， 使产生 12 的游离脂肪酸与先前水平相比增加 10 倍至 500 倍 ( 图 2)。尽管检测出了某个范围的游 离脂肪酸 (C8 至 C18)， LfesA 对 C14 脂酰 ACP 最有特异性 ( 图 6)。
为了进一步增加游离脂肪酸的有效产生， 去除与 β- 氧化相关的竞争途径。脂肪 酸降解的前两个酶促步骤需要 FadD 和 FadE， 因此将这两个基因敲除， 并使 ltesA 在胞质中 表达。产物效价明显增加 4 至 4 倍， 达到～ 5mM( 图 2)。通过去除形成乙酸盐的反应 ( 由 poxB、 pta 和 ackA 编码 ) 的进一步优化尝试使得产生 3mM 的游离脂肪酸， 表明去除该竞争 途径不会极大地帮助过量产生脂肪酸 ( 图 2)。最佳菌株 LT-ΔfadE 由 2％葡萄糖产生理论 极限值的大约 15％的脂肪酸 ( 图 2)。
实施例 2- 来源于脂肪酸的重要分子的产生
尽管脂肪酸本身具有重要价值， 可以对其进行修饰， 以制备其他重要的分子， 包括 生物柴油等效物 ( 脂肪酸乙酯 (FAEE))、 长链醇和长链醛， 二者均可以用作生物燃料的高价 值专业化学品。
FAEE 的产生
目前每年生产超过 5 百万吨生物柴油， 其构成了～ $4B 的市场 (REN21， 2008)。以 前已经显示大肠杆菌能够通过利用内源产生的乙醇使外源加入的脂肪酸酯化， 从而产生生 物柴油等效物 (Kalscheuer 等， 2006)， 该过程由于脂肪酸成本高而在经济上不可行。已经 显示产生的脂肪酸水平高达 5mM， 构建能够通过表达运动发酵单胞菌的 pdc 和 adhB 产生乙 醇的菌株， 所述 pdc 和 adhB 分别编码丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。这些菌株显示 24 小时后 8 产生～ 10 mM 的乙醇， 这与以前的发现相近 (Ingram 等， 1987)。联合进行产生游离脂肪酸
( 表达 ltesA)、 产生乙醇 ( 表达 pdc 和 adhB) 和产生酯 ( 通过表达蜡酯合酶 atfA) 的相关 基因修饰使得产生 0.14mM(37mg/L) 的 FAEE( 菌株 HE-LAAP ； 图 3)。由于该菌株积累大量 不能转化为期望产物的游离脂肪酸 ( 数据未显示 )， 细胞的内源性酰基 -CoA 连接酶 (fadD) 的能力有限是合理的。Faa2( 酿酒酵母的酰基 -CoA 连接酶 ) 的过量表达使 FAEE 的产量增 加大约 2.5 倍， 至 0.37mM(96mg/L)( 菌株 HE-LAAP-faa2 ； 图 3)。通过过量表达 fadD 突变体 ( 具有 F61L 和 M3351 两个突变位点 ) 使得额外增加 2 倍， 至 0.63(161mg/L)( 图 3)。修复 fadD 中的一个突变使产量增加 50％， 至 0.91mM( 图 3)。表达额外一个拷贝的 atfA 使得产 生 1.7mM(427mg/L) 的 FAEE( 菌株 HE-LAAP-fadDm2-atfA ； 图 3)， 这是理论产量的 13％。
表 1. 多种大肠杆菌菌株的乙醇产量
脂肪酸酯的产生
以与如上面所描述产生 FAEE 的类似方式产生脂肪酸酯或者蜡酯。 使 ltesA 和 fadD 过量表达， 并表达外源 atfA。 但是， 不使用产生乙醇的途径中的外源基因。 相反， 表达 mfar1 以产生长链醇。接着 AtfA 可以利用这些较长链醇作为底物产生蜡酯 ( 图 1E)。产生了十四 酸十六烷基酯、 十六酸十六烷基酯和十六酸十八烷基酯 ( 图 9)。
脂肪醇和醛的产生
脂肪醇和醛的市场巨大， 其主要用于肥皂、 去污剂、 化妆品添加剂、 信息素和调味 化合物中， 以及潜在地用作生物燃料， 其价值是大约 $1500/ 吨 (2004ICIS 价格 )， 每年生产 大约 2MT， 创造 $3B 的市场 (Ahmad 2006)。可以通过脂肪酸或 FAME 的氢化作用或者通过由 石油化学品前体合成， 从而产生脂肪醇， 这两个过程均需要极端的反应条件， 并且不遵守绿 色化学的原则。以前已经描述了形成脂肪醇的脂酰 -CoA 还原酶 ( 植物和哺乳动物来源 ) 的表征和表达 (Metz 等， 2000 ； Cheng 和 Russell 2004)。此处显示了由在 fadE 敲除菌株中 表达 mFar1(KS5) 或者 acr1(KS11) 的经工程化大肠杆菌菌株产生 C12 至 C18n- 醇的脂肪醇 ( 图 1C 和 4)。
其后研究产生脂肪醛， 因为其是能量最密集型燃料烷烃和烯烃的前体。产生烷烃 / 烯烃的生物合成途径需要已经部分纯化的脱羰基酶从脂肪醛中去除末端羰基基团 (Wang 和 Kolattukudy 1995 ； Dennis 和 Kolattukudy1991)。通过在 ltesA 和 fadD 过量表达的 fadE 敲除菌株中表达 acr1(KS11)， 产生脂肪醛 ( 图 1D)。为了阻止内源性大肠杆菌醇脱氢 酶将脂肪醛转化为脂肪醇， 敲除或者减少这些内源性脱氢酶基因的表达或者表达脱羰基酶 以竞争醇的还原反应也是必需的。 将对 acr1 ； ΔfadE 菌株背景中的大肠杆菌敲除文库进行 以鉴定其缺失使得产生脂肪醛的基因。 筛选，
实施例 3- 合并的生物加工过程 ： 利用生物质聚合物生产生物柴油
尽管由糖类生产第二代生物燃料 ( 例如 FAEE) 比由糖类生产乙醇具有优势， 从大 量可获得的生物质备选物中寻找这种糖类提供甚至更大的进步。不幸地是， 从纤维素类生 物质中寻找糖类需要使用昂贵的酶， 以从预处理的纤维素和半纤维素中释放糖类。生产生 物燃料的有机体产生糖基水解酶的合并的生物加工过程无需加入这些昂贵的酶并且因此
减少了成本 (Lynd 等， 2005)。
通过在大肠杆菌中表达编码粪堆梭菌木聚糖内切酶催化结构域 (Xyn10B) 和 卵形拟杆菌木聚糖 (Xsa) 的基因， 来完成合并的生物加工过程 (Adelsberger 等， 2004 ； Whitehead 和 Hespell 1990)。半纤维素酶通过与 OsmY 蛋白融合而分泌， 以将半纤维素水 解为木糖， 后者通过大肠杆菌天然代谢途径分解代谢 (Qian 等 )。但是， 不必要将两种酶均 与 OsmY 融合。显示了用编码木聚糖降解酶转化的大肠杆菌单独或者同时在木聚糖中的生 长 ( 图 5A 和 B)。这些基因以及生物柴油基因的表达使得产生 FAEE( 图 5C)。还可以利用 这种合并的生物加工方案由木聚糖或者其他生物质聚合物产生 FAE。
发现 Xsa 蛋白上的 OsmY 对于在木糖寡糖中生长十分重要， 将两个质粒转化到 BL21 细胞中， 所述两个质粒均含有 OsmY-XynB 融合基因， 其后连接 Osm-Y-Xsa 融合基因或者未融 合的 Xsa。基因处于丙酸盐启动子控制下。细胞在添加了 200μg/mL 羧苄青霉素的 LB 培养 基中生长过夜至饱和。第二天， 用 50μL 过夜生长物接种 5mL 新鲜的 LB 培养基， 并于 37℃ 生长。在指数生长期 (OD 值 0.3-0.8) 中， 接种到 5mL 含有 0.2％木聚糖作为唯一碳源 ( 和 200μg/mL 羧苄青霉素 ) 的 M9 培养基之前， 通过加入丙酸钠至 10mM， 诱导细胞 1-2.5 小时， 并于 37℃振荡孵育。 通过在 600nm 下监测培养物的散射情况， 对生长进行测定 ( 图 10)。 将 显示这些重组大肠杆菌在经离子性液体处理的柳枝稷的半纤维素组分中的生长。
表达不同于 Xsa 的酶显示出在木聚糖中的生长加快。重组大肠杆菌菌株 MG165 在 LB 培养基中于 37℃生长 13 小时， 所述菌株 MG165 含有一种质粒， 所述质粒具有与大肠杆 菌基因 OsmY 融合并且处于大肠杆菌 cspD 启动子控制下的粪堆梭菌 XynB， 以及编码纤维弧 菌 Gly43F 并且处于大肠杆菌 cstA 启动子控制下的基因。用 20μL 的 13 小时生长培养物 接种 800μL 含有 0.5％山毛榉材木聚糖或者 0.5％木糖作为唯一碳源的 MOPS-M9 基础培养 基， 并在 TECAN 读板仪中于 37℃孵育。通过 OD 值的增加观察细胞生长 ( 图 12)。重组大肠 杆菌在木聚糖中的生长几乎与在木糖中的生长同样快。未观察到缺少 OsmY-XynB 基因或者 Gly43F 基因的细胞在木聚糖培养基中的生长。
显示了大肠杆菌在纤维素中的生长。对于纤维素的利用， 用含有纤维弧菌的两种 酶 ( 不与 OsmY 融合表达的 Cel3B(β- 葡萄糖苷酶 ) 和与 OsmY 融合的 Cel6A( 纤维二糖水 解酶 ) 催化结构域 (JBact， vol 190， p.5455)) 以及芽孢杆菌 D04 纤维素酶的催化结构域的 经密码子优化形式 (J Biol Chem， vol 270， p.26012) 的质粒转化大肠杆菌。所有基因均处 于 lacUV5 启动子的控制下。大肠杆菌在转移至含有 0.2％羧甲基纤维素的 M9 培养基中之 前在 LB 培养基中生长和诱导 ( 图 7)。
此外， 表达纤维素酶和 β- 葡萄糖苷酶的大肠杆菌显示能够在磷溶胀纤维素 (PASC) 中生长。制备具有以下的质粒 ： 纤维弧菌的 β- 葡萄糖苷酶基因 cel3A， 其处于在大 肠杆菌 MG1655 基因组中发现的 wrbA 基因启动子的控制下 ； 芽孢杆菌菌株 D04 的 cel 基因 中发现的葡萄糖苷水解酶催化结构域的经密码子优化形式， 其 N 末端与大肠杆菌的 OsmY 蛋 白融合， 处于在大肠杆菌 MG1655 基因组中发现的 cspD 基因启动子的控制下 ； 低拷贝复制起 ** 点 (SC101 ) ； 和氨苄青霉素抗性基因 bla。将质粒转化到 BL21 细胞中， 并使细胞在添加了 100μg/mL 羧苄青霉素的 LB 培养基中于 37℃生长大约 18 小时。
用 1mL 过夜生长物接种含有 100μg/mL 羧苄青霉素并且不含碳源或者含有 0.5％ 再生非晶形纤维素 (RAC)( 如 Metabolic Engineering， vol 9， p.87， 2007 中的描述制备 )的 MOPS-M9 培养基 (7ml)， 所述过夜生长物含有上面所述质粒或者缺少纤维素酶或 β- 葡萄 糖苷酶基因并且仅携带抗生素抗性的对照质粒。培养物于 37℃振荡孵育。
不时地对培养物进行取样， 并在 LB 培养基中稀释至 10-6 的浓度。将 100μL 该稀 释液涂于不含抗生素的 LB 琼脂板上， 并使板于 37℃孵育过夜。对菌落进行计数。在纤维素 存在下在产生纤维素酶的菌株中观察到显著生长 ( ～ 2×)， 而没有纤维素产生或者没有碳 源时几乎不生长或者不生长 ( 图 11)。将显示这些重组大肠杆菌在经离子性液体处理的柳 枝稷的纤维素组分中的生长。
显示了大肠杆菌在甘露聚糖中的生长。对于甘露聚糖的利用， 使用纤维弧菌的三 种酶， 即 Man26A( 甘露聚糖内切酶 )、 Man5D( 甘露聚糖外切酶 ) 和 Aga27A(α- 半乳糖苷酶， 一种脱支酶 ) 的催化结构域 (J Bact， vol 190， p.5455)。所有催化结构域均与 OsmY 蛋白 融合。催化结构域在多种微生物的共培养物中各自表达， 所述多种微生物共同作用以将槐 豆树脂降解成甘露糖和半乳糖 ( 图 8)。分泌单个酶的大肠杆菌的共增养物。在含有 0.2％ 槐豆树胶 ( 半乳甘露聚糖 ) 的 M9 培养基中生长。可以用在一个质粒上的所有 3 种催化结 构域转化大肠杆菌。
可以对大肠杆菌进行工程化， 以表达使半纤维素和纤维素降解的酶 (OsmY-XynB 融 合 基 因， 其 后 连 接 OsmY-Xsa 融 合 基 因 或 者 未 融 合 的 Xsa) 以 及 不 与 OsmY 融 合 的 Cel3B(β- 葡萄糖苷酶 ) 和与 OsmY 融合的 Cel6A( 纤维二糖水解酶 ) 催化结构域。这些大 肠杆菌将显示能够同时利用经离子性液体处理的柳枝稷的纤维素和半纤维素组分。
可以对经工程化以利用纤维素和甘露聚糖的这些大肠杆菌进行进一步操作， 以如 实施例 2 中的描述产生脂肪酸乙酯、 脂肪醇、 脂肪醛和其他脂肪酸衍生的化合物， 将纤维素 和甘露聚糖直接转化成这些有价值的产物。 此外， 在一种微生物中联合木聚糖、 纤维素和甘 露聚糖降解途径将使一个细胞能够利用全部生物质作为碳源。
此处显示了脂肪酸生物合成途径的重要性和用途， 其利用大肠杆菌在利用半纤维 素作为给料的合并的生物过程中产生一类重要的化学品和生物燃料。 高效价将使其能够转 用至生产生物燃料或者化学品的工业过程中。重要的是， 这些脂肪酸衍生的化分子对细胞 无毒， 而毒性对于已经被看作重要的第二代生物燃料但是困扰于效价低的较低能量低级醇 是个难题 (Atsumi 等， 2008 ； Steen 等， 2008)。除了表明产生高水平的生物燃料之外， 还显 示能够由半纤维素生产生物燃料， 这是本领域迫切但仍未实现的目标。解除对脂肪酸生物 合成的抑制、 鉴定生产脂肪酸衍生物生物燃料的关键限速步骤以及在合并的生物加工过程 中由廉价的、 可再生的、 植物来源的生物质生产这些生物燃料的方案开辟了在多种微生物 中由可再生资源生产能量密集型第二代生物燃料的代谢工程领域。
实施例 4- 材料和方法
试剂
所有化学品购自 Sigma-Aldrich(St.Louis， MO)， 其包括脂肪酸甲酯标准试剂、 脂 肪酸乙酯标准试剂、 脂肪醛标准试剂和脂肪醇标准试剂。
菌株和质粒
所有研究中使用大肠杆菌 DH1 野生型菌株。如以前的描述敲除 fadD、 fadE、 pta、 poxB 和 ackA(Datsenko 和 Wanner 2000)。在构建本研究中使用的表达质时时， 用大肠杆菌 DH10B 和 DH5α 进行转化和质粒扩增 ； 用大肠杆菌 fadDKO 过量表达 fadD。大肠杆菌天然基因克隆自 DH1。 合成 mFAR1( 小鼠， GenBank 登录号 BC007178) 并对其进行密码子优化以在大 肠杆菌中表达 (Epoch Biolabs)。 合成 atfA( 不动细菌属菌株 ADP1)(Epoch Biolabs)(Cheng and Russell 2004)。 acr1( 不动杆菌 ) 由 Chris Somerville(University of California， Berkeley) 惠赠。pdc 和 adhB 克隆自运动发酵单胞菌基因组 DNA(ATCC 31821)。FAA2 克隆 自酿酒酵母 (BY4742) 基因组 DNA。利用 “不依赖于基因和连接反应的克隆” (“Sequence and Ligation Independent Cloning” ， SLIC) 方法 (Li 和 Elledge 2007) 构建质粒。所有 基因在 IPTG 可诱导的 LacUV5 或者 trc 启动子控制下 as indicated 过量表达。对于构建 菌株和质粒， 在含有合适抗生素 (50μg/L 氨苄青霉素 (Amp)， 20μg/L 氯霉素 (Cam)， 5μg/ L 四环素 (Tet)) 的 Luria-Bertani 培养基中于 37℃培养菌株。为了对脂肪酸衍生的化分 子的产生水平进行表征， 菌株在含有合适抗生素的 M9 基础培养基中生长， 并在 600nm 波长 下测得光度密为 0.5-1 时用 500μMIPTG 进行诱导。
表2
代谢物分析
通过加入 500μL HCl 和 5mL 乙酸乙酯， 并加入 10mg/L 十九酸甲酯作为内部标准， 从 5mL 培养物中提取总游离脂肪酸。将培养管涡旋振荡 15 秒， 随后以 200rpm 振荡 20 分 钟。分离有机层， 并通过将另外 5mL 乙酸乙酯加入培养管中， 进行第二次提取。接着通过加 入 200μL TMS- 重氮甲烷、 10μL HCl 和 90μL MeOH 将游离脂肪酸转化成甲酯 (Aldai et al.2005)。使反应进行 2 小时， 接着应用于装配 Triplus AS 自动取样器和 TR-WAXMS 柱的 Thermo Trace Ultra 气相色谱 (GC) 仪 (Thermo Scientific) 上。GC 程序如下 ： 初始温度 40℃保持 1.2 分钟， 以 30℃ /min 升高至 220℃并保持 3 分钟。用 Xcalibur 软件进行最后
的定量分析。
通过加入 10％ ( 体积 / 体积 ) 乙酸乙酯并加入 10mg/L 十九酸甲酯， 随后以 200rpm 振荡 20 分钟， 从培养物中提取脂肪酸乙酯 (FAEE)、 脂肪醇和脂肪醛。在装配 DB5 柱且带有 Agilent 5973 Network MSD 的 HP 6890 系列 GC 仪 (Thermo) 对 FAEE 进行分析。GC 程序与 对 FAMES 进行定量的程序相同。用 TR-Wax 柱 (Agilent) 分离脂肪醇和醛。GC 程序如下 ： 初始温度 70℃保持 1 分钟， 以 25℃ /min 升高至 240℃并保持 3 分钟。
通过取出 1mL 培养物样品、 以 14k rpm 离心 5 分钟并将上清液应用于装配 Aminex HPX-87H 离子交换柱的 Agilent 1100 系列 HPLC 仪 (Biorad) 上， 对乙醇进行测定。溶剂 (4mM H2SO4) 流速为 .6mL/min， 并使柱保持于 50℃。用 Agilent 1100 系列 DAD 和 RID 检测 仪对所有代谢物进行检测。
参考文献
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