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一种液相合成法合成卡贝缩宫素的方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种多肽药物的合成方法， 尤其涉及卡贝缩宫素的合成方法。背景技术 产后出血是全球孕妇患病和死亡的最主要原因， 每年导致 125,000 名孕妇死亡及 2,000 万名妇女患病， 也是目前中国孕产妇死亡的首位原因， 其发病率占分娩总数的 2％～ 3％ ( 徐玲等， 《实用医学杂志》 ， 2007 年第 23 卷第 18 期， 2940 ～ 2941)。近年来随着剖宫产 率上升， 手术并发症越来越被重视， 剖宫产术产后出血率高达 19.8％ ( 高素云等， 《世界中 西医结合杂志》 ， 2009 年第 4 卷第 9 期， 665 ～ 666)。
     引起产后出血的主要原因为宫缩乏力， 占 70％～ 80％ ( 徐玲等， 《实用医学杂志》 ， 2007 年第 23 卷第 18 期， 2940 ～ 2941)。降低发病率及病死率的关键在于及早预防产后子 宫收缩乏力性出血。 剖宫产手术中由于宫缩乏力、 子宫切口撕裂损伤宫旁血管丛、 胎盘粘连 或植入、 凝血功能异常等导致大出血， 是剖宫产手术最危险的并发症， 如何有效控制术中出 血量是产科医生面临的问题 ( 于爱芳， 《实用临床医药杂志》 ， 2009 年第 13 卷第 9 期， 82 ～ 83)。
     目前产后出血的治疗方法有 ： 按摩子宫， 子宫收缩药物的应用， 如缩宫素、 麦角新 碱、 米索、 卡孕栓， 以及宫腔纱条填塞法， 但有时效果不佳， 需给予结扎或栓塞子宫动脉或髂 内动脉， 甚至子宫次全切或子宫切除术 ( 徐玲等， 《实用医学杂志》 ， 2007 年第 23 卷第 18 期， 2940 ～ 2941)。缩宫素又名催产素， 是最古老、 临床使用最广泛的促宫缩剂， 但其半衰期仅 4 ～ 10min， 体内作用时间短， 需持续静滴或多次重复给药。当体内缩宫素受体位点饱和后， 增加药量不再产生促宫缩作用， 收缩子宫下段作用不明显， 大量使用可致水中毒 ( 于爱芳， 《实用临床医药杂志》 ， 2009 年第 13 卷第 9 期， 82 ～ 83)， 部分患者对缩宫素不敏感， 效果较 差。
     子宫肌瘤是女性生殖器官肿瘤中最常见的良性肿瘤， 全子宫切除是传统的手术方 式。腹腔镜技术是近年发展的微创治疗手段， 可为女性保留子宫， 但由于子宫的血流丰富， 出血多仍是限制其应用的关键， 甚至导致中转开腹。常用的促进子宫平滑肌收缩的方法是 在子宫肌层注射催产素， 有时术中需补充静脉滴注催产素， 但收效甚微 ( 沈怡等， 《中国妇幼 保健》 ， 2010 年第 25 卷， 414 ～ 416)。
     卡贝缩宫素 (Carbetocin)， 即 [1- 脱氨基 -1- 单羟基 (2- 氧 - 甲基酪氨酸 )] 催产 素， 是近年来新兴的长效催产素受体激动剂， 是一种人工合成的缩宫素类似物， 具有起效迅 速、 作用强效持久、 使用便捷等特点， 适合抢救用药。临床通常静脉给药， 静脉注射后 2 分钟 即产生促宫缩作用， 对子宫体及子宫下段均有强烈收缩作用， 半衰期 40 ～ 50 分钟， 是缩宫 素的 10 倍。静推后作用可持续 60 ～ 120 分钟 ( 于爱芳， 《实用临床医药杂志》 ， 2009 年第 13 卷第 9 期， 82 ～ 83)。 卡贝缩宫素可以在体内引起与天然激素相似的生理活性， 使子宫收 缩同步化、 规律化和收缩增强并且延长收缩时间。在预防产后出血方面得到了一定范围的 应用并收到了良好的效果 ( 沈怡等， 《中国妇幼保健》 ， 2010 年第 25 卷， 414 ～ 416)。在高危
     病例预防性用药效果更好， 明显降低产后出血， 减少术后发病率， 是更好的用药模式。产后 静脉滴注缩宫素的同时静脉注射或子宫肌层、 臀部肌内注射卡贝缩宫素可更有效预防产后 出血， 且无明显不良反应， 值得基层医院推广 ( 黄淑华等， 《临床合理用药》 ， 2010 年 5 月第 3 卷第 9 期， 83 ～ 84)。
     无论是腹腔镜下子宫肌瘤剔除术还是开腹子宫肌瘤剔除术术中应用卡贝缩宫素 均可有效促进子宫收缩， 减少术中出血量 ( 沈怡等， 《中国妇幼保健》 ， 2010 年第 25 卷， 414 ～ 416)。
     徐玲等的研究表明卡贝缩宫素用于预防及治疗产后出血具有显著疗效， 产后出血 的发生率及产后 2、 24 小时平均出血量均明显少于对照组， 治疗性用药组 93％有效 ( 徐玲 等， 《实用医学杂志》 ， 2007 年第 23 卷第 18 期， 2940 ～ 2941)。高素云等进行了一项比较缩 宫素和卡贝缩宫素治疗效果的临床研究， 对照组 16 例有效， 无效 7 例 ； 治疗组 20 例有效， 无效 2 例。观察组产后出血发生率、 术中及产后 24 小时出血量均明显优于对照组。卡贝缩 宫素用于预防及治疗产后出血有显著疗效 ( 高素云等， 《世界中西医结合杂志》 ， 2009 年第 4 卷第 9 期， 665 ～ 666)。郑涛等进行了一项卡贝缩宫素预防妊娠合并子宫肌瘤剖宫产后出 血的随机对照临床研究， 结果显示卡贝缩宫素能加强和保持合并子宫肌瘤的妊娠子宫的收 缩， 减少产后出血， 可选择做为预防产后出血的一种新的药物治疗措施 ( 郑涛等， 《中国新药 与临床杂志》 ， 2009 年 12 月， 第 28 卷第 12 期， 925 ～ 928)。王静芳比较了卡贝缩宫素和缩 宫素预防妇女剖宫产术后出血的效果， 卡贝缩宫素组产妇术中、 产后 2 小时、 产后 24 小时出 血量均显著小于缩宫素组 ； 缩宫素组产后出血发生率为 12％， 卡贝缩宫素组产后出血发生 率为 4％， 卡贝缩宫素组产后出血的发生率低于缩宫素组 ( 王静芳， 《实用医技杂志》 ， 2010 年 1 月第 17 卷第 1 期， 52 ～ 53)。然而由于价格贵， 卡贝缩宫素目前还没有常规用药 ( 于 爱芳， 《实用临床医药杂志》 ， 2009 年第 13 卷第 9 期， 82 ～ 83)。
     临床试验中静脉注射卡贝缩宫素后常发生 (10-40 ％ ) 的是恶心、 腹疼、 瘙痒、 面 红、 呕吐、 热感、 低血压、 头痛和震颤， 不常发生 (1-5 ％ ) 的不良事件包括背疼、 头晕、 金属 味、 贫血、 出汗、 胸痛、 呼吸困难、 寒战、 心动过速和焦虑。 这些不良事件发生的形式和频率都 与硬膜外或腰麻下进行剖腹产术后给予催产素时观察到的相同。
     另外卡贝缩宫素和催产素一样也可用于动、 植物养殖， 提高动物的受胎率和繁殖 率， 也可以作为促乳剂， 提高动物的产奶量， 用于果树起到催熟作用。
     能够人工大量合成卡贝缩宫素， 满足临床预防和治疗产后出血的需要具有重大意 义， 也利于拓展其在其他领域的用途。
     专利 ES2115543A1 公开了一种卡贝缩宫素的制备方法 (Process for obtaining carbetocinand its pharmaceutically acceptable addition salts or complexes)， 包 括： 1) 合成主肽链结构， N 末端氨基与 4- 氯丁酸连接， 2) 半胱氨酸巯基脱保护基团， 同时断 开多肽链与树脂的连接， 3) 碱性条件下通过巯基的亲核进攻反应形成成硫醚键进行分子内 的环化。利用多肽固相合成法的 HOBt/DIC 体系获得 4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-A sn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA， 然后裂解得到线性肽， 4-chlorobutyl-Tyr(OM e)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2， 再采用 NaOH、 LiOH、 NaHCO3、 DIEA、 DMAP 等碱 性试剂环化得到卡贝缩宫素。
     专利 CS8605461 公开了一种卡贝缩宫素的合成方法， 利用多肽固相合成法合成 Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 线 性 肽， 氢 化 得 到 Ile-Gln-Asn-Cys(Bz l)-Pro-Leu-Gly-NH2， 再和 BrCH2CH2CH2COOH 反应使半胱氨酸的巯基形成硫醚键， 最后与 X-Tyr(OMe)-OH 反应、 脱保护得到卡贝缩宫素。
     中国专利 ( 申请号 ： 200910106889.0) 公开了一种固相合成卡贝缩宫素的方法， 包括以下步骤 ： 由 Fmoc-Gly-OH 和替代度为 0.2mmol/g ～ 0.9mmol/g 的氨基树脂反应得到 Fmoc-Gly- 氨基树脂 ； 通过固相合成法依次连接具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 得到卡贝缩 宫素前体肽 I- 氨基树脂， 脱掉半胱氨酸侧链保护基， 得到卡贝缩宫素前体肽 II- 氨基树脂 ； 在溶剂中， 加入有机碱， 氯化锂， 环化， 得到卡贝缩宫素 - 氨基树脂 ； 裂解， 得到卡贝缩宫素 粗肽 ； 纯化、 冻干得到卡贝缩宫素。
     以上专利公开的方法都使用多肽的固相合成技术， 即将氨基酸逐一连接到树脂 上。 虽然多肽固相合成法经过不断改进和完善， 已经能够合成很多具有生物活性的多肽， 但 是其本身还是存在着很多问题 ：
     1、 合成所需时间较长 ： 多肽固相合成的速率虽有了很大的提高， 但是相对其它合 成方式 ( 如生物合成法 ) 来说， 链的合成速率仍然很慢， 每结合上一个氨基酸需要 20 ～ 120 分钟， 平均一个九肽的合成需要 5h 以上。
     2、 合成的效率和纯度低、 成本高 ： 即使是 30 个氨基酸以内的小肽固相合成， 富含 二硫键和碱性氨基酸残基的多肽合成仍比较困难， 相当一部分多肽还不能成功合成。随着 氨基酸数量的增加， 合成效率逐步下降， 非目的肽含量逐步增长， 目的肽的纯度逐步降低， 后续的纯化愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵， 致使多肽合成的成本很 高， 还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。
     3、 合成试剂的毒性大 ： 进行多肽合成的试剂， 其毒性很大， 如 DCM、 DMF、 哌啶等这 些有机化学试剂， 在成为废液后都需要报环保局进行处理。虽然有些仪器能提供合成过程 全封闭进行， 但其排出的废气废液等， 还是对环境有污染， 不能保证百分百安全。而那些不 是全封闭进行的合成反应， 有毒试剂对环境的危害则更大。
     V.Sanz-Nebot 等采用液质联用技术分析了固相合成法合成的卡贝缩宫素粗 品 中 杂 质 的 情 况 (V.Sanz-Nebot， I.Toro， A.Garce ′ s and J.Barbosa， Separation and Identification of PeptideMixtures in a Synthesis Crude of Carbetocin by Liquid Chromatography/Electrospray IonizationMass Spectrometry， Rapid Commun. Mass Spectrom.1999， 13 ： 2341-2347)， 分 析 使 用 KromasilC8 柱 (BC Aplicaciones Anali′ ticas， S.A.， Barcelona， Spain)， 乙腈浓度 24％～ 30％， 结果见表一， 卡贝缩宫素 含量 4.64％～ 21.57％， 其中 24％乙腈浓度分析结果见附图一， 目标产物卡贝缩宫素的纯 度低。
     表一、 LC/ES-MS 鉴别合成卡贝缩宫素中的杂质肽
     可见固相合成法合成的卡贝缩宫素纯度低， 时间长， 后续纯化工艺难度大， 收率 低， 成本高， 本领域迫切需要开发一种简单易行， 收率高， 时间短的卡贝缩宫素合成方法。 发明内容 本发明的目的是提供一种简单易行， 收率高， 时间短、 易于大量合成的卡贝缩宫素 的液相合成方法。
     为了实现上述目的， 本发明采用了以下技术方案 ：
     一种卡贝缩宫素的合成方法， 包括以下步骤 ：
     (1)、 合成中间体 I ： 4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH ；
     (2)、 合成中间体 II ： H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome ；
     (3)、 合成中间体 III ： H-Pro-Leu-Gly-NH2 ；
     (4)、 中间体 I、 中间体 II 和中间体 III 在溶剂中， 缩合剂存在下缩合， 合成中间体 IV ： Butyryl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 ；
     (5)、 中间体 IV 在碱性条件下加入催化剂环化， 得到卡贝缩宫素。
     采用以下方法合成中间体 I ： Boc-Tyr(me)-OH 与 H-Ile.ome.Hcl 按 0.5 ∶ 1 ～ 1 ∶ 0.5 的比例混合于溶剂中， 调节 pH， 加入偶联剂和缩合剂缩合， 产物提纯后脱保护， 再提 纯后加入 0.5 ～ 2 倍摩尔量的 4- 溴丁酸， 缩合， 产物进一步在碱性条件下脱保护得到中间 体 I。
     其中溶剂为 DMF、 THF 或二氧六环， pH 调节剂为 NMM、 DIEA 或 TMP， 偶联剂为 PyBOP/ HOBT、 HOBT/TBTU、 HOAT/TATU 或 HATU/HOAT， 活化剂为 DIC、 DCC、 EDCI 或 CDI， 脱保护剂为 50％ (V/V)TFA/DCM 或 HCl/MeOH ； 氢氧化锂或氢氧化钠。
     采用以下方法合成中间体 II ： 溶剂中 Fmoc-Asn(trt)-OH 脱保护剂脱保护， 按 0.5 ∶ 1 ～ 1 ∶ 0.5 的摩尔比与 Fmoc-Gln(trt)-OH 混合， 加入偶联剂， pH 调节剂， 在 pH 7 ～ 8 缩合剂存在下缩合， 产物提纯后加入 H-Cys(trt).ome.Hcl 在溶剂中加入偶联剂， pH 调节 剂， 缩合剂缩合， 产物进一步提纯后脱保护得到中间体 II。
     其中溶剂为 DMF、 THF 或二氧六环， pH 调节剂为 NMM、 DIEA 或 TMP， 偶联剂为 PyBOP/ HOBT、 HOBT/TBTU、 HOAT/TATU 或 HATU/HOAT， 活化剂为 DIC、 DCC、 EDCI 或 CDI， 脱保护剂为二 乙胺、 三乙胺、 吡啶或六氢吡啶。
     采 用 以 下 方 法 合 成 中 间 体 III ： Boc-Pro-OH 和 H-Leu.ome.Hcl 按 0.5 ∶ 1 ～ 1 ∶ 0.5 的比例混合于溶剂中， 调节 pH， 加入偶联剂和缩合剂缩合， 产物提纯后脱保护， 再提 纯后加入 0.5 ～ 2 倍摩尔量的入 H-Gly-NH2.Hcl， 缩合， 产物进一步在碱性条件下脱保护得 到中间体 III。
     其中溶剂为 DMF、 THF 或二氧六环， pH 调节剂为 NMM、 DIEA 或 TMP， 偶联剂为 PyBOP/ HOBT、 HOBT/TBTU、 HOAT/TATU 或 HATU/HOAT， 活化剂为 DIC、 DCC、 EDCI 或 CDI， 脱保护剂为 50％ (V/V)TFA/DCM 或 HCl/MeOH ； 二乙胺或三乙胺或吡啶或六氢吡啶。
     采用以下方法合成中间体 IV ： 中间体 I 和中间体 II 按 0.5 ∶ 1 ～ 1 ∶ 0.5 的 比例混合于溶剂中， 调节 pH， 加入偶联剂和缩合剂缩合， 产物提纯后脱保护， 再提纯后加入 0.5 ～ 2 倍摩尔量的合成中间体 III， 缩合， 产物进一步在切割液中脱保护得到中间体 IV。
     其中溶剂为 DMF、 THF 或二氧六环， pH 调节剂为 NMM、 DIEA 或 TMP， 偶联剂为 PyBOP/
     HOBT、 HOBT/TBTU、 HOAT/TATU 或 HATU/HOAT， 活化剂为 DIC、 DCC、 EDCI 或 CDI， 脱保护剂为氢 氧化锂或氢氧化钠。 切割液为 TFA/ 三异丙基硅烷 /H2O、 TFA/ 三氟甲磺酸 / 苯甲硫醚或 TFA/ 三氟甲磺酸硅烷脂 / 苯甲硫醚。
     步骤 (5) 在溶剂中， 加入有机碱， 在催化剂存在下反应 3-8 小时， 得到卡贝缩宫素， 其中溶剂为 DMF 或 N- 甲基吡咯烷酮， 有机碱为 NMM、 DIPEA 或 TMP， 催化剂为氯化锂或二氮 杂二环， 优选的反应时间为 4 ～ 5 小时。
     本发明液相合成缩宫素的得率 85 ％以上， 产品纯度 80 ％以上， 与固相合成法相 比， 优点主要有 ：
     1、 液相合成的理论和技术都已经很熟 ：
     2、 原料在合成过程中经历的步骤少， 利用率高。固相合成法由于是氨基酸一个接 一个连接到肽链上， 每步反应的得率是有限的， 到后面的氨基酸合成效率已经很低， 对后面 投入的原料的利用率也相应降低 ；
     3、 液相合成法可以在合成过程中检测产物的纯度， 可以用重结晶和层析的方法得 到纯度满足要求的多肤产品， 固相合成法的杂质可能是比产物少 1 个、 2 个、 3 个或多个氨基 酸的产物， 其性质与产物非常接近， 给后续的分离纯化带来很大的不便， 而本法和成的产物 杂质与产物相差氨基酸至少在 3 个以上， 最主要的杂质也是 3 肽， 后续提纯比较容易。
     4、 液相合成是大量多肽合成的优先选择， 尤其是工业化生产所需要的千克级量时的选择。 本发明合成卡贝缩宫素的方法与固相合成法相比， 与产品比较接近的少一个或者 两个氨基酸的杂质少， 产品纯度高。杂质和产品相比氨基酸差异大， 因此后续分离纯化容 易， 适合产业化。
     本发明的中间体是产品的部分片断， 可以分别同时合成， 与固相合成逐一增加氨 基酸合成的产品相比， 时间大大缩短， 而且通过控制中间体保证了产品的收率和纯度。
     附图说明
     1、 图 1 为固相合成法合成的卡贝缩宫素的 RP-HPLC 的分析流动相乙腈浓度 24％。 2、 图 2 为卡贝缩宫素工艺合成流程图。 3、 图 3 为本发明合成的卡贝缩宫素的 RP-HPLC 分析。具体实施方式
     下面通过具体实施例进一步说明本发明， 但实施例不能理解为是对本发明保护范 围的限制， 本领域技术人员根据本发明内容所做的非本质性的改变仍属于本发明的保护范 围。
     为了更好地理解本发明， 申请文件中说使用的缩写的含义在此一并说明 ：
     Boc-Tyr(me)-OH N- 叔丁氧羰基 -4- 甲氧基 -L- 苯丙氨酸
     H-Ile.ome.Hcl L- 异亮氨酸甲酯盐酸盐
     4-Bromobutyric acid 4- 溴丁酸
     Fmoc-Gln(trt)-OH N-(9- 芴甲氧羰基 )-N- 三苯甲基 -L- 谷氨酰胺
     Fmoc-Asn(trt)-OH N-(9- 芴甲氧羰基 )-N- 甲苯磺酰基 -L- 天冬酰胺H-Cys(trt).ome.Hcl L- 半胱氨酸甲酯盐酸盐 Boc-Pro-OH N- 叔丁氧基羰基 -L- 脯氨酸 H-Leu.ome.Hcl L- 亮氨酸甲酯盐酸盐 H-Gly-NH2.Hcl 甘氨酰胺盐酸盐 DMF N， N- 二甲基甲酰胺 HOBT N- 羟基苯骈三氮唑 NMM N- 甲基吗啡啉 DIEA 二异丙基乙胺 TMP 甲氧芐氨嘧啶 PyBOP N， N′ - 羰基二咪唑 TBTU O-(IH- 苯并三唑 -1- 基 )-N， N， N′， N′ - 四甲基异脲四氟 HOAT TATU 1- 羟基 -7- 偶氮苯并三氮唑 2-(7- 偶氮苯并三氮唑 )-N， N， N′， N′ - 四甲基脲六氟磷酸化硼
     酯 HATU 2-(7- 偶氮苯并三氮唑 )-N， N， N′， N′ - 四甲基脲六氟
     DIC N， N′ - 二异丙基碳二酰亚胺
     EDCI 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐
     CDI N， N′ - 羰基二咪唑
     DCC N， N’ -2- 二环己基碳二亚氨
     BOP 苯并三唑 -1- 三 ( 三甲氨基 )- 六氟磷酸酯
     DCM 二氯甲烷
     Boc叔丁氧羰基
     Tos对甲基苯磺酰基
     -Obzl 苄氧基
     THF 四氢呋喃
     TFA 三氟乙酸
     合成工艺流程图见附图二。
     实施例一 4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH 的合成
     向 250ml 圆底烧瓶中依次加入 1.48g Boc-Tyr(me)-OH(5mmol) 和在磁力搅拌下 能使基本溶解的适量 DMF， 另取 0.91g H-Ile.ome.Hcl(5mmol) 和 0.68gHOBT(5mmol) 加入 少量 DMF 中， 再加入 2 倍摩尔数 NMM 后一并加入烧瓶中， 继续调 pH 到 7 至 8， 加入 1.03g DCC(5mmol) 搅拌反应， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， TLC 检测， 反应不完 全加入 BOP 继续反应 2 小时， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用 分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无 水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得 1.88g 固体， 收率 89.0 ％。直接加入 20ml50 ％ (V/V) 三氟乙酸的二氯甲烷溶液， TLC 跟踪检测反应， 室温下， 磁力搅拌 30min， 减压蒸干， 加入适 量乙酸乙酯， 旋摇， 析出胶状白色沉淀。用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次， 浓缩干后得到白 色固体 1.35g， 收率 95.0％。再加入 0.84g4- 溴丁酸 (5mmol)， 0.68g HOBT(5mmol)， 1.03g
     DCC(5mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， TLC 检测， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层 为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压 浓缩至干得固体 1.8g， 收率 91.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃， 滴加饱和的氢氧化锂 水溶液到 pH ＝ 13， 当 pH 恒定在 13 后再反应 2 小时， 反应完全后将反应液倒入分液漏斗内 加石油醚洗涤 2 次， 下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体， 加入的柠檬酸量为加到产 品的 pH 值到 3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物， 乙酸乙酯 用饱和的 NaCl 溶液洗涤 3 次， 上层液体为产品， 将产品倒入干燥的烧杯用 Na2SO4 干燥 2 小 时， 干燥后将液体浓缩得到固体产品中间体 I 1.65g， 收率 95％。
     实施例二 H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome 的合成
     将 3g Fmoc-Asn(trt)-OH(5mmol) 用 10ml 二氯甲烷溶解， 加入 7ml 二乙胺反应 2 小 时， 2 小时后点板， 反应完全后直接浓缩得到固体 1.8g， 收率 98％。在磁力搅拌下能使基本 溶解的适量 DMF， 另取 3g Fmoc-Gln(trt)-OH(5mmol) 和 0.68g HOBT(5mmol) 加入少量 DMF 中再加入 N- 甲基吗啡啉 (NMM) 调 pH 到 7 至 8， 加入 1.03g DCC(5mmol) 搅拌反应， TLC 跟 踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， TLC 检测， 反应不完全加入 BOP 继续反应 2 小时， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下 层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至 干得固体 4.1g， 收率 87.0 ％。加入 0.86g H-Cys.ome.Hcl(5mmol)， 0.68g HOBT(5mmol)， 1.03gDCC(5mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止 搅拌， TLC 检测， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 4.1g， 收率 88.0％。再用 15ml 二氯甲烷溶解， 加入 10ml 二乙胺反应 2 小时， 2 小时后点板， 反应完全后直接浓缩得到固体产品中间体 II 3.1g， 收率 96.0％。
     实施例三 H-Pro-Leu-Gly-NH2 的合成
     向 250ml 圆底烧瓶中依次加入 1.1g Boc-Pro-OH(5mmol) 和在磁力搅拌下能使基 本溶解的适量 DMF， 另取等摩尔 0.91g H-Leu.ome.Hcl(5mmol) 和 0.68g HOBT(5mmol) 加入 少量 DMF 中再加入 2 倍摩尔数 N- 甲基吗啡啉 (NMM) 后一并加入烧瓶中， 继续调 pH 到 7 至 8， 加入 1.03gDCC(5mmol) 搅拌反应， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， TLC 检 测， 反应不完全加入 BOP 继续反应 2 小时， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸 乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸 碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 1.52g， 收率 89.0％。将所得产品用甲醇 溶解加入少量四氢呋喃， 滴加饱和的氢氧化锂水溶液到 pH ＝ 13， 当 pH 恒定在 13 后再反应 2 小时， 反应完全后将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤 2 次， 下层液体为产品。在产品 内加入柠檬酸固体， 加入的柠檬酸量为加到产品的 pH 值到 3-4。再将加过柠檬酸的产品倒 入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物， 乙酸乙酯用饱和的 NaCl 溶液洗涤 3 次， 上层液体为产 品， 将产品倒入干燥的烧杯用 Na2SO4 干燥 2 小时， 干燥后将液体浓缩得到固体 1.39g， 收率 95.0 ％。加入 0.55gH-Gly-NH2.Hcl(5mmol)， 0.68g HOBT(5mmol)， 1.03gDCC(5mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， TLC 检测， 室温静 置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 1.42g， 收率 87.5％。直接加入 10ml50％ (V/V) 三氟乙酸的二氯甲烷溶液， TLC 跟踪检测反 应， 室温下， 磁力搅拌 30min， 减压蒸干， 加入适量乙酸乙酯， 旋摇， 析出胶状白色沉淀。用少 量乙酸乙酯洗涤沉淀两次， 浓缩干后得到白色固体中间体 III1.03g， 收率 98.0％。
     实施例四三个片段缩合及保护基团的切除
     向 250ml 圆底烧瓶中依次加入 1.65g 中间体 I(3.6mmol) 和在磁力搅拌下能使基 本溶解的适量 DMF， 另取 3.1g 中间体 II(3.6mmol) 和 0.49g HOBT(3.6mmol) 加入少量 DMF 中再加入 NMM， 调 pH 到 7 至 8， 加入 0.74g DCC(3.6mmol) 搅拌反应， TLC 跟踪监测反应完成 情况。12h 后停止搅拌， TLC 检测， 反应不完全加入 BOP 继续反应 2 小时， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再 萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 4.07g， 收 率 87.0％。 用甲醇溶解加入少量四氢呋喃， 滴加饱和的氢氧化锂水溶液到 pH ＝ 13， 当 pH 恒 定在 13 后再反应 2 小时， 反应完全后将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤 2 次， 下层液 体为产品。在产品内加入柠檬酸固体， 加入的柠檬酸量为加到产品的 pH 值到 3-4。再将加 过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物， 乙酸乙酯用饱和的 NaCl 溶液洗涤 3 次， 上层液体为产品， 将产品倒入干燥的烧杯用 Na2SO4 干燥 2 小时， 干燥后将液体浓缩得到 固体产品 3.82g， 收率 95.0％。加入 1.08g 中间体 III(3.6mmol)， 0.74g HOBT(3.6mmol)， 0.74g DCC(3.6mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停 止搅拌， TLC 检测， 室温静置。抽滤 ( 滤去不溶物 DCU)， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃 取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 4.05g， 收率 86.0％。 加入适量切割液 ( 比例为 TFA95％， 三异丙基 硅烷 2.5％ 水 2.5％ )， 搅拌溶解， 间断震荡两小时， 氮气鼓吹至少量体积， 乙醚沉淀， 所得 沉淀再用乙醚洗涤数次， 吹干得未成环产品中间体 IV2.2g， 收率 96.0％。
     实施例五成环合成卡贝缩宫素
     将上述未成环产品中间体 IV 用适量 DMF 溶解， NMM 作为有机碱， 加入氯化锂环化， 反应 5 小时， Ellman 反应检测巯基反应完全与否。反应完全后直接减压浓缩得粗肽卡贝缩 宫素 1.94g， 收率 97.0％。
     实施例六 4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH 的合成
     在 250ml 圆底烧瓶中加入 2.95g Boc-Tyr(me)-OH(10mmol)， 适量 DMF 溶解， 另取等 摩尔 1.82gH-Ile.ome.Hcl(10mmol) 和 1.35gHOBt(10mmol) 加入少量 DMF 溶解， 再加入 2 倍 摩尔数 NMM 后一并加入烧瓶中， 继续调 pH 到 7 至 8， 加入 1.92EDCI(10mmol) 搅拌反应， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， 室温静置。抽滤， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏 斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 3.84g， 收率 91.0％。直接加入 30ml50％ (V/V) 三氟乙酸的 二氯甲烷溶液， 室温下磁力搅拌 30min， 减压蒸干， 加入适量乙酸乙酯， 旋摇， 析出胶状白色 沉淀。用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次， 浓缩干后得到白色固体 2.82g， 收率 96.0％。再加入 1.67g 的 4- 溴丁酸 (10mmol)， 1.35g HOBt(10mmol)， 1.92g EDCI(10mmol)， 适量 DMF 完全溶 解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， 室温静置。抽滤， 滤液用乙酸 乙酯和水萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 3.95g， 收率 96.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃， 滴加饱和的氢氧化锂水溶液到 pH ＝ 13， 当 pH 恒定在 13 后再反应 2 小时， 反应完全后将反 应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤 2 次， 下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体， 加入 的柠檬酸量为加到产品的 pH 值到 3-4。 再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯 萃取产物， 乙酸乙酯用饱和的 NaCl 溶液洗涤 3 次， 上层液体为产品， 将产品倒入干燥的烧杯 用 Na2SO4 干燥 5 小时， 干燥后将液体浓缩得到固体产品中间体 I 3.5g， 收率 91.5％。
     实施例七 H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome 的合成
     将 5.9g Fmoc-Asn(trt)-OH(10mmol) 用二氯甲烷溶解， 加入二乙胺反应 2 小时， TLC 跟踪监测， 反应完全后直接浓缩得到固体 3.67g， 收率 98.0 ％。适量 DMF 溶解， 另取 6.1gFmoc-Gln(trt)-OH(10mmol) 和 1.35g HOBt(10mmol) 加入少量 DMF 中再加入 N- 甲基吗 啡啉 (NMM) 调 pH 到 7 至 8， 加入 1.92g EDCI(10mmol) 搅拌反应， TLC 跟踪监测反应完成情 况。12h 后停止搅拌， 室温静置。抽滤， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至 干得固体 8.72g， 收率 92.0％。 加入 1.72g H-Cys.ome.Hcl(10mmol)， 1.35g HOBt(10mmol)， 1.92gEDCI(10mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。 12h 后停止 搅拌， 室温静置。 抽滤， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯 再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 8.92g， 收率 87.5％。再用二氯甲烷溶解， 加入二乙胺反应 2 小时， 2 小时后点板看有无反应完全， 反应完全后直接浓缩得到固体产品中间体 II 6.73g， 收率 94.8％。
     实施例八 H-Pro-Leu-Gly-NH2 的合成
     在 250ml 圆 底 烧 瓶 中 加 入 2.15g Boc-Pro-OH(10mmol)， 适 量 DMF 溶 解， 另取 1.82gH-Leu.ome.Hcl(10mmol) 和 1.35g HOBt(10mmol) 加入少量 DMF 中再加入 2 倍摩尔数 N- 甲基吗啡啉 (NMM) 后一并加入烧瓶中， 继续调 pH 到 7 至 8， 加入 1.92EDCI(10mmol) 搅拌 反应， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， 室温静置。抽滤， 滤液用乙酸乙酯和水 用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无 水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 3.05g， 收率 89.0％， 将所得产品用甲醇溶解加入少 量四氢呋喃， 滴加饱和的氢氧化锂水溶液到 pH ＝ 13， 当 pH 恒定在 13 后再反应 2 小时， TLC 跟踪监测， 反应完全则将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤 2 次， 下层液体为产品。在产 品内加入柠檬酸固体， 加入的柠檬酸量为加到产品的 pH 值到 3-4。再将加过柠檬酸的产品 倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物， 乙酸乙酯层用饱和的 NaCl 溶液洗涤 3 次， 上层液体 为产品， 将产品倒入干燥的烧杯用 Na2SO4 干燥 2 小时， 干燥后将液体浓缩至干得固体 2.76g， 收率， 94.5％。加入 1.1gH-Gly-NH2.Hcl， 1.35g HOBt(10mmol)， 1.92g EDCI(10mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， 室温静置。抽滤， 滤 液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙 酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体 2.94g， 收率 91.0％。直接加入 30ml50％ (V/V) 三氟乙酸的二氯甲烷溶液， TLC 跟踪检测反应， 室温下， 磁力搅拌 30min， 减 压蒸干， 加入适量乙酸乙酯， 旋摇， 析出胶状白色沉淀。 用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次， 浓缩 干后得到白色固体中间体 III2.13g， 收率 98.0％。
     实施例九三个片段缩合及保护基团的切除向 250ml 圆底烧瓶中依次加入 3.43g 中间体 I(7.5mmol) 和适量 DMF， 另取 6.46g 中间体 II(7.5mmol) 和 1.01g HOBT(7.5mmol) 加入少量 DMF 溶解， 再加入 NMM， 调 pH 到 7 至 8， 加入 1.44g EDCI(7.5mmol) 搅拌反应， TLC 跟踪监测反应完成情况。12h 后停止搅拌， 室 温静置。抽滤， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产品， 下层用乙酸乙酯再萃取 两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩至干得固体产品 8.78g， 收 率 90.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃， 滴加饱和的氢氧化锂水溶液到 pH ＝ 13， 当 pH 恒定在 13 后再反应 2 小时， TLC 跟踪检测， 反应完全则将反应液倒入分液漏斗内加石油醚 洗涤 2 次， 下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体， 加入的柠檬酸量为加到产品的 pH 值到 3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物， 乙酸乙酯用饱和 的 NaCl 溶液洗涤 3 次， 上层液体为产品， 将产品倒入干燥的烧杯用 Na2SO4 干燥 2 小时， 干燥 后将液体浓缩得到固体产品 8.51g， 收率 98.0％。加入 2.13g(7.5mmol) 中间体 III， 1.01g HOBT(7.5mmol)， ， 1.44gEDCI(7.5mmol)， 适量 DMF 完全溶解， NMM 调碱， TLC 跟踪监测反应完 成情况。 12h 后停止搅拌， 室温静置。 抽滤， 滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取， 上层为产 品， 下层用乙酸乙酯再萃取两遍， 合并乙酸乙酯层， 酸碱洗涤， 无水 Na2SO4 干燥 5h， 减压浓缩 至干得固体 9.36g， 收率 90.3％。 加入适量 TFMSA/TFA、 苯甲硫醚， 于冰浴中， 搅拌， 间断震荡 两小时， 氮气鼓吹至少量体积， 反应液用预冷乙醚沉淀， 所得沉淀再用乙醚洗涤数次， 吹干 得未成环产品中间体 IV5.16g， 收率 98.1％。 实施例十 . 成环合成卡贝缩宫素
     将上述未成环产品中间体 IV 用适量 N- 甲基吡咯烷酮溶解， DIPEA 作为有机碱， 加 入 LiCl 环化， 反应 5 小时， Ellman 反应检测巯基反应完全与否。反应完全后直接减压浓缩 得粗肽卡贝缩宫素 4.59g， 收率 89.8％。
     产品的 RP-HPLC 分析， 流动相 A 为 pH ＝ 6.8 磷酸盐缓冲液， 流动相 B 为乙腈， C18 柱， 梯度为 B 相起始浓度为 20％， 60min 后提高至 35％， 结果见附图三， 其中卡贝缩宫素粗品 纯度达到 80％以上。
     以上内容是结合具体实施例对本发明技术方案的详细说明， 这些具体实施例不是 对发明技术方案的限定。对于本领域技术人员所做的任何简单的非实质性改变， 都应当视 为属于本发明权利要求书技术方案要求保护的范围。