一种检测活的非可培养状态副溶血性弧菌的方法 技术领域 本发明涉及致病性微生物副溶血性弧菌检测领域， 特别是涉及一种检测活的非可 培养状态副溶血性弧菌的方法。
背景技术 副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus， 简称 V.p) 是广泛分布于近海区域、 盐湖及海产品中的革兰氏阴性短杆嗜盐菌， 能感染海水鱼类、 对虾、 蟹、 甲壳类等多种水产 动物， 人食用了受该菌污染的海产品后， 会出现食物中毒及腹泻等症状， 是一种引起食源性 疾病的重要病原菌。20 世纪 80 年代初期， 研究人员发现并提出了细菌 “活的非可培养状 态” (Viable but Non-Culturablestate， VBNC)， 即细菌处于不良环境条件时， 其细胞缩小 成球形， 用常规方法不能培养， 但具有一定的代谢活性， 用特殊方法可以证明其依然存在。 当细菌处于 VBNC 状态时， 经过一定的条件恢复后即可以复苏， 经研究部分复苏菌株的毒力 基因并未遭到破坏， 故 VBNC 状态细菌对人类公共健康、 食品的微生物检验、 遗传工程细菌 向环境释放等安全性问题仍然有潜在致病性， 研究该状态及其检测方法有着重要的意义。
随着周围环境的改变副溶血性弧菌会转化为 VBNC 状态， 由于在 VBNC 状态下这些 细菌用常规方法 ( 如传统的微生物培养基培养、 普通 PCR 验证等 ) 不可检出但仍保持活力， 故经典活菌直接计数法 (Direct viable count， DVC)、 检测细胞内 CTC 水解情况判断代谢 活性、 检测细胞中 INT 的减少判断代谢活性、 ELISA 等方法已广泛应用于细菌 VBNC 的研究， 但是其准确性、 精密性以及时效性还有待提升。 在确定微生物检测标准时， 之前大多数研究 为通过普通 PCR 验证可培养状态 (Viable Culturable， VC) 致病基因的活性， 然而这对于 VBNC 状态显然是不合适的。
近些年逆转录聚合酶链反应技术 (Reverse transcription-PCR， RT-PCR) 检测 mRNA 是一项很有前途的技术被应用于细菌的 VBNC 状态， 用于评估 VBNC 状态细菌产生的影 响。细菌 mRNA 的半衰期很短， 这是由于核酸酶的存在会使其降解， 所以 mRNA 的存在可以作 为细胞存活最有力的也是最令人信服的判断标准。 但是该方法却并未在副溶血性弧菌中应 用， 究其原因， 及其可能是由于细菌处于 VBNC 状态其特异性管家基因不好确认引起。
由于 RT-PCR 法具有很高的特异性和敏感性， 而且这项技术能够使我们确定细胞 是否存活。虽然说其它方法的检测参数像蛋白质的合成能力， 不可分裂细胞的延长指数等 似乎同样有效， 但比起 RT-PCR 法， 这些方法不如其可靠且不能够很标准化的实际应用。因 此 RT-PCR 技术作为一种分析基因表达的快速灵敏的方法在检测细菌 VBNC 状态已经显示出 其重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、 准确检测样品中是否存在活的非可 培养状态 (VBNC) 副溶血性弧菌以及一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现 ：主要运用 RT-PCR 对副溶血性弧菌 VBNC 状态的 rpoS 基因进行检测。其中， 特异性 管家基因 rpoS 主要编码一种转录因子， 该转录因子命名为 sigmaS(σS)， 主要调控细菌中 的应激反应机制， 被用来检测 VBNC 状态的副溶血性弧菌的活性， 而副溶血性弧菌 tl 特异性 基因则在 VBNC 状态则运用 PCR/RT-PCR 无法检出。
本发明第一方面， 一种检测样品中是否存在活的非可培养状态 (VBNC) 副溶血性 弧菌的方法， 包括步骤 ：
以抽提自所述样品的总 RNA 为模板， 用 rpoS 基因的特异性引物对进行逆转录聚合 酶链反应， 从而扩增出对应于 rpoS 基因的扩增产物 ；
检测所述的对应于 rpoS 基因的扩增产物的存在与否， 如存在所述扩增产物则表 示样品中存在 VBNC 状态的副溶血性弧菌 ( 副溶血性弧菌 VBNC 状态中该特异性管家基因 rpoS 运用 PCR 法检测无活性 ) ； 如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在 VBNC 状态的副 溶血性弧菌。
其中所述的样品是经 tl 基因检测呈阴性的样品。
所述的样品可以是水产品。 所述的水产品包括 ： 海水鱼类、 对虾、 蟹、 甲壳类等多种 水产动物。
所述的特异性管家基因引物 rpoS 对选自下组 ：
上游 5’ -gac aat gcg tca gag acg-3’ SEQ ID NO ： 1；
下游 5’ -tca cca cgc aat gct ctg-3’ SEQ ID NO ： 2。
本发明另一方面， 一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法， 包括步骤 ：
(a) 检测所述样品中是否存在 tl 异性基因 ； 如若有 tl 特异性基因存在则说明副 溶血性弧菌存在， 如若无 tl 特异性基因存在则需继续检测 VBNC 的副溶血性弧菌活性 ； (b) 对于经 tl 基因检测呈阴性的样品， 进一步检测是否存在 rpoS 基因 ： 以抽提自 所述样品的总 RNA 为模板， 用 rpoS 基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应， 从而扩 增出对应于 rpoS 基因的扩增产物 ；
检测所述的对应于 rpoS 基因的扩增产物的存在与否， 如存在所述扩增产物则表 示样品中存在 VBNC 状态的副溶血性弧菌 ； 如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在 VBNC 状态的副溶血性弧菌。
所述的样品可以是水产品。 所述的水产品包括 ： 海水鱼类、 对虾、 蟹、 甲壳类等多种 水产动物。
所述的特异性管家基因引物 rpoS 对选自下组 ：
上游 5’ -gac aat gcg tca gag acg-3’ SEQ ID NO ： 1；
下游 5’ -tca cca cgc aat gct ctg-3’ SEQ ID NO ： 2。
该检测方法的建立将为副溶血性弧菌 VBNC 的研究和食品安全检测与控制提供一 定的依据。
相较于其他方法， 该方法优点很明显 ：
首先， 可以检测普通方法检测不到的 VBNC 状态细菌。
其次， 相对于传统检测 VBNC 状态细菌的方法该方法速度快， 并且从基因水平进行 检测， 其准确性和可信度高。
再次， 本发明将副溶血性弧菌特异性管家基因 rpoS 引入检测方法， 国内尚未应
用， 这对于该方法的建立起了决定性作用， 使该方法具有很高的特异性和敏感性。 附图说明 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
图 1 为 样 品 (a、 b)tl 特 异 性 基 因 检 测 结 果。 各 泳 道 分 别 是 M ： DNAmarker( 从 下 至 上： 100， 200， 300， 400， 500， 600bp) ； 1 ：阳 性 对 照 V.p1.1616(+) ； 2 ：阳 性 对 照 V.p1.1997(+) ； 3： 空白对照 (-) ； 4： 样品 a1 ； 5： 样品 a2 ； 6： 样品 a3 ； 7： 样品 b1 ； 8： 样品 b2 ； 9： 样品 b3。
图 2 为样品 b 特异性管家基因 rpoS 检测结果。各泳道分别是 M ： DNAmarker( 从 下 至 上： 100， 200， 300， 400， 500， 600bp) ； 1 ：阳 性 对 照 V.p1.1616(+) ； 2 ：阳 性 对 照 V.p1.1997(+) ； 3： 空白对照 (-) ； 4： 样品 b1 ； 5： 样品 b2 ； 6： 样品 b3。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结合实 施例， 进一步阐述本发明， 但本发明的实施方式不限于此。
实施例 1 A. 将待测水产品 a， b 分别运用 PCR 方法检测副溶血性弧菌 tl 特异性基因， tl 特异性基因 ： 上游引物 ： 5’ -aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg-3’ SEQ ID NO ：3 下游引物 ： 5’ -gct act ttc tag cat ttt ctc tgc-3’ SEQ ID NO ： 4
实验结果 ( 如图 1) 表明 a 样品中有 tl 特异性基因存在， 说明副溶血性弧菌存在， 产品不合格 ； b 样品中无 tl 特异性基因存在， 需继续检测 VBNC 的副溶血性弧菌活性。
注： 1. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均为标准菌株， 来源于中科学院普通 微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。2. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均含有 tl 特 异性基因， 其片段为 450bp。
B. 运用 Trizol 法提取 b 样品中副溶血性弧菌的总 RNA。 用无菌注射器取 1mL 处理 好的待测液， 加 1mL TRNzol Total RNA Regent， 吹吸混匀， 室温放置 7min。加 200μL 氯仿 异戊醇 (24 ∶ 1)， 盖紧盖子剧烈震荡颠倒混匀片刻。室温下静置 5min， 4℃ 10000r/min 离 心 15min。然后转移上层水相 ( 大约 0.5mL) 于新的 1.5mL 的离心管中 ( 切记不要吸出中间 白色层中的蛋白 )。加入等体积的异丙醇 ( 预冷 ) 室温静止沉淀 10min， 4℃ 12000r/min 离 心 10min。弃上清， 缓慢的沿离心管壁加入 1mL75％的乙醇 (0.1％ DEPC 水配制 ) 洗涤 RNA 沉淀， 4℃ 7500r/min 离心 5min。弃上清， 在生物安全柜中倒置干燥 5min ～ 10min( 不可以 使其完全干燥， 预防其溶解性降低 )。用 20μL0.1％的 DEPC 水溶解， 如果 RNA 较难溶解则 可于 55℃～ 60℃助溶 10min， 于 -80℃冻存备用。
C. 运用副溶血性弧菌特异性管家基因 rpoS， 其基因片段的引物设计为 ：
上游 5’ -gac aat gcg tca gag acg-3’ SEQ ID NO ： 1
下游 5’ -tca cca cgc aat gct ctg-3’ SEQ ID NO ： 2
应用 RT-PCR 技术检测总 RNA 中是否有副溶血性弧菌特异性管家基因 rpoS 存在 ( 两步法 ) ：
(1) 反转录合成 cDNA 第一链 ： 首先在反转录之前 70℃温育 RNA 10min， 然后冰浴 5min， 以消除 RNA 的二级结构。在 20μl 反转录反应体系中按照顺序依次加入 1 ～ 4 步 后 70℃水浴 5min， 迅速冰上冷却 10min， 稍加离心， 然后按 5 ～ 8 步加入试剂后 42℃水浴 60min， -20℃保存备用 ( 如表 1 所示 )。
表 1RNA 反转录体系
(2)RT-PCR 法扩增 ： 引物设计和 PCR 扩增条件如表 2 所示， 运用 PCR 扩增试剂盒将 上述反转录产物进行 PCR 扩增， 反应后取 4μLPCR 产物与 6×LoadingBuffer 混合于 1.7％ 琼脂糖凝胶上进行电泳， 并于 EB 染色观察结果。
表 2RT-PCR 引物设定及其条件
实验结果 ( 如图 2) 表明 b 样品中存在所述扩增产物， 表示样品中存在 VBNC 状态 的副溶血性弧菌。
注： 1. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均为标准菌株， 来源于国家菌种保藏 中心 (CGMCC)。2. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均含有特异性管家基因 rpoS， 其片 段为 203bp。
上 述 实 验 中 所 用 的 UNIQ-10 柱 式 细 菌 基 因 组 DNA 抽 提 试 剂 盒、 PCR 扩 增 试 剂 盒、 TAE、 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 及所用引物等均购于上海生物工程技术服务有限公司 ； TRNzol Total RNA Reagent、 DNA Maker I、 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ； Reverse
Transcriptase M-MLV(RNase H-)、 Ribonuclease Inhibitor 购于 TaKaRa 公司 ； 琼脂糖购 于加拿大 Bio Basic INC 公司 ； EB 购于上海华舜生物工程有限公司 ； 异丙醇 (AR)、 无水乙醇 (AR)、 氯仿 (AR)、 异戊醇 (AR) 等购于国药集团化学试剂有限公司。
背景技术 副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus， 简称 V.p) 是广泛分布于近海区域、 盐湖及海产品中的革兰氏阴性短杆嗜盐菌， 能感染海水鱼类、 对虾、 蟹、 甲壳类等多种水产 动物， 人食用了受该菌污染的海产品后， 会出现食物中毒及腹泻等症状， 是一种引起食源性 疾病的重要病原菌。20 世纪 80 年代初期， 研究人员发现并提出了细菌 “活的非可培养状 态” (Viable but Non-Culturablestate， VBNC)， 即细菌处于不良环境条件时， 其细胞缩小 成球形， 用常规方法不能培养， 但具有一定的代谢活性， 用特殊方法可以证明其依然存在。 当细菌处于 VBNC 状态时， 经过一定的条件恢复后即可以复苏， 经研究部分复苏菌株的毒力 基因并未遭到破坏， 故 VBNC 状态细菌对人类公共健康、 食品的微生物检验、 遗传工程细菌 向环境释放等安全性问题仍然有潜在致病性， 研究该状态及其检测方法有着重要的意义。
随着周围环境的改变副溶血性弧菌会转化为 VBNC 状态， 由于在 VBNC 状态下这些 细菌用常规方法 ( 如传统的微生物培养基培养、 普通 PCR 验证等 ) 不可检出但仍保持活力， 故经典活菌直接计数法 (Direct viable count， DVC)、 检测细胞内 CTC 水解情况判断代谢 活性、 检测细胞中 INT 的减少判断代谢活性、 ELISA 等方法已广泛应用于细菌 VBNC 的研究， 但是其准确性、 精密性以及时效性还有待提升。 在确定微生物检测标准时， 之前大多数研究 为通过普通 PCR 验证可培养状态 (Viable Culturable， VC) 致病基因的活性， 然而这对于 VBNC 状态显然是不合适的。
近些年逆转录聚合酶链反应技术 (Reverse transcription-PCR， RT-PCR) 检测 mRNA 是一项很有前途的技术被应用于细菌的 VBNC 状态， 用于评估 VBNC 状态细菌产生的影 响。细菌 mRNA 的半衰期很短， 这是由于核酸酶的存在会使其降解， 所以 mRNA 的存在可以作 为细胞存活最有力的也是最令人信服的判断标准。 但是该方法却并未在副溶血性弧菌中应 用， 究其原因， 及其可能是由于细菌处于 VBNC 状态其特异性管家基因不好确认引起。
由于 RT-PCR 法具有很高的特异性和敏感性， 而且这项技术能够使我们确定细胞 是否存活。虽然说其它方法的检测参数像蛋白质的合成能力， 不可分裂细胞的延长指数等 似乎同样有效， 但比起 RT-PCR 法， 这些方法不如其可靠且不能够很标准化的实际应用。因 此 RT-PCR 技术作为一种分析基因表达的快速灵敏的方法在检测细菌 VBNC 状态已经显示出 其重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、 准确检测样品中是否存在活的非可 培养状态 (VBNC) 副溶血性弧菌以及一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现 ：主要运用 RT-PCR 对副溶血性弧菌 VBNC 状态的 rpoS 基因进行检测。其中， 特异性 管家基因 rpoS 主要编码一种转录因子， 该转录因子命名为 sigmaS(σS)， 主要调控细菌中 的应激反应机制， 被用来检测 VBNC 状态的副溶血性弧菌的活性， 而副溶血性弧菌 tl 特异性 基因则在 VBNC 状态则运用 PCR/RT-PCR 无法检出。
本发明第一方面， 一种检测样品中是否存在活的非可培养状态 (VBNC) 副溶血性 弧菌的方法， 包括步骤 ：
以抽提自所述样品的总 RNA 为模板， 用 rpoS 基因的特异性引物对进行逆转录聚合 酶链反应， 从而扩增出对应于 rpoS 基因的扩增产物 ；
检测所述的对应于 rpoS 基因的扩增产物的存在与否， 如存在所述扩增产物则表 示样品中存在 VBNC 状态的副溶血性弧菌 ( 副溶血性弧菌 VBNC 状态中该特异性管家基因 rpoS 运用 PCR 法检测无活性 ) ； 如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在 VBNC 状态的副 溶血性弧菌。
其中所述的样品是经 tl 基因检测呈阴性的样品。
所述的样品可以是水产品。 所述的水产品包括 ： 海水鱼类、 对虾、 蟹、 甲壳类等多种 水产动物。
所述的特异性管家基因引物 rpoS 对选自下组 ：
上游 5’ -gac aat gcg tca gag acg-3’ SEQ ID NO ： 1；
下游 5’ -tca cca cgc aat gct ctg-3’ SEQ ID NO ： 2。
本发明另一方面， 一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法， 包括步骤 ：
(a) 检测所述样品中是否存在 tl 异性基因 ； 如若有 tl 特异性基因存在则说明副 溶血性弧菌存在， 如若无 tl 特异性基因存在则需继续检测 VBNC 的副溶血性弧菌活性 ； (b) 对于经 tl 基因检测呈阴性的样品， 进一步检测是否存在 rpoS 基因 ： 以抽提自 所述样品的总 RNA 为模板， 用 rpoS 基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应， 从而扩 增出对应于 rpoS 基因的扩增产物 ；
检测所述的对应于 rpoS 基因的扩增产物的存在与否， 如存在所述扩增产物则表 示样品中存在 VBNC 状态的副溶血性弧菌 ； 如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在 VBNC 状态的副溶血性弧菌。
所述的样品可以是水产品。 所述的水产品包括 ： 海水鱼类、 对虾、 蟹、 甲壳类等多种 水产动物。
所述的特异性管家基因引物 rpoS 对选自下组 ：
上游 5’ -gac aat gcg tca gag acg-3’ SEQ ID NO ： 1；
下游 5’ -tca cca cgc aat gct ctg-3’ SEQ ID NO ： 2。
该检测方法的建立将为副溶血性弧菌 VBNC 的研究和食品安全检测与控制提供一 定的依据。
相较于其他方法， 该方法优点很明显 ：
首先， 可以检测普通方法检测不到的 VBNC 状态细菌。
其次， 相对于传统检测 VBNC 状态细菌的方法该方法速度快， 并且从基因水平进行 检测， 其准确性和可信度高。
再次， 本发明将副溶血性弧菌特异性管家基因 rpoS 引入检测方法， 国内尚未应
用， 这对于该方法的建立起了决定性作用， 使该方法具有很高的特异性和敏感性。 附图说明 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
图 1 为 样 品 (a、 b)tl 特 异 性 基 因 检 测 结 果。 各 泳 道 分 别 是 M ： DNAmarker( 从 下 至 上： 100， 200， 300， 400， 500， 600bp) ； 1 ：阳 性 对 照 V.p1.1616(+) ； 2 ：阳 性 对 照 V.p1.1997(+) ； 3： 空白对照 (-) ； 4： 样品 a1 ； 5： 样品 a2 ； 6： 样品 a3 ； 7： 样品 b1 ； 8： 样品 b2 ； 9： 样品 b3。
图 2 为样品 b 特异性管家基因 rpoS 检测结果。各泳道分别是 M ： DNAmarker( 从 下 至 上： 100， 200， 300， 400， 500， 600bp) ； 1 ：阳 性 对 照 V.p1.1616(+) ； 2 ：阳 性 对 照 V.p1.1997(+) ； 3： 空白对照 (-) ； 4： 样品 b1 ； 5： 样品 b2 ； 6： 样品 b3。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结合实 施例， 进一步阐述本发明， 但本发明的实施方式不限于此。
实施例 1 A. 将待测水产品 a， b 分别运用 PCR 方法检测副溶血性弧菌 tl 特异性基因， tl 特异性基因 ： 上游引物 ： 5’ -aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg-3’ SEQ ID NO ：3 下游引物 ： 5’ -gct act ttc tag cat ttt ctc tgc-3’ SEQ ID NO ： 4
实验结果 ( 如图 1) 表明 a 样品中有 tl 特异性基因存在， 说明副溶血性弧菌存在， 产品不合格 ； b 样品中无 tl 特异性基因存在， 需继续检测 VBNC 的副溶血性弧菌活性。
注： 1. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均为标准菌株， 来源于中科学院普通 微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。2. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均含有 tl 特 异性基因， 其片段为 450bp。
B. 运用 Trizol 法提取 b 样品中副溶血性弧菌的总 RNA。 用无菌注射器取 1mL 处理 好的待测液， 加 1mL TRNzol Total RNA Regent， 吹吸混匀， 室温放置 7min。加 200μL 氯仿 异戊醇 (24 ∶ 1)， 盖紧盖子剧烈震荡颠倒混匀片刻。室温下静置 5min， 4℃ 10000r/min 离 心 15min。然后转移上层水相 ( 大约 0.5mL) 于新的 1.5mL 的离心管中 ( 切记不要吸出中间 白色层中的蛋白 )。加入等体积的异丙醇 ( 预冷 ) 室温静止沉淀 10min， 4℃ 12000r/min 离 心 10min。弃上清， 缓慢的沿离心管壁加入 1mL75％的乙醇 (0.1％ DEPC 水配制 ) 洗涤 RNA 沉淀， 4℃ 7500r/min 离心 5min。弃上清， 在生物安全柜中倒置干燥 5min ～ 10min( 不可以 使其完全干燥， 预防其溶解性降低 )。用 20μL0.1％的 DEPC 水溶解， 如果 RNA 较难溶解则 可于 55℃～ 60℃助溶 10min， 于 -80℃冻存备用。
C. 运用副溶血性弧菌特异性管家基因 rpoS， 其基因片段的引物设计为 ：
上游 5’ -gac aat gcg tca gag acg-3’ SEQ ID NO ： 1
下游 5’ -tca cca cgc aat gct ctg-3’ SEQ ID NO ： 2
应用 RT-PCR 技术检测总 RNA 中是否有副溶血性弧菌特异性管家基因 rpoS 存在 ( 两步法 ) ：
(1) 反转录合成 cDNA 第一链 ： 首先在反转录之前 70℃温育 RNA 10min， 然后冰浴 5min， 以消除 RNA 的二级结构。在 20μl 反转录反应体系中按照顺序依次加入 1 ～ 4 步 后 70℃水浴 5min， 迅速冰上冷却 10min， 稍加离心， 然后按 5 ～ 8 步加入试剂后 42℃水浴 60min， -20℃保存备用 ( 如表 1 所示 )。
表 1RNA 反转录体系
(2)RT-PCR 法扩增 ： 引物设计和 PCR 扩增条件如表 2 所示， 运用 PCR 扩增试剂盒将 上述反转录产物进行 PCR 扩增， 反应后取 4μLPCR 产物与 6×LoadingBuffer 混合于 1.7％ 琼脂糖凝胶上进行电泳， 并于 EB 染色观察结果。
表 2RT-PCR 引物设定及其条件
实验结果 ( 如图 2) 表明 b 样品中存在所述扩增产物， 表示样品中存在 VBNC 状态 的副溶血性弧菌。
注： 1. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均为标准菌株， 来源于国家菌种保藏 中心 (CGMCC)。2. 副溶血性弧菌 V.p1.1616、 V.p1.1997 均含有特异性管家基因 rpoS， 其片 段为 203bp。
上 述 实 验 中 所 用 的 UNIQ-10 柱 式 细 菌 基 因 组 DNA 抽 提 试 剂 盒、 PCR 扩 增 试 剂 盒、 TAE、 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 及所用引物等均购于上海生物工程技术服务有限公司 ； TRNzol Total RNA Reagent、 DNA Maker I、 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ； Reverse
Transcriptase M-MLV(RNase H-)、 Ribonuclease Inhibitor 购于 TaKaRa 公司 ； 琼脂糖购 于加拿大 Bio Basic INC 公司 ； EB 购于上海华舜生物工程有限公司 ； 异丙醇 (AR)、 无水乙醇 (AR)、 氯仿 (AR)、 异戊醇 (AR) 等购于国药集团化学试剂有限公司。
以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。7CN 102477463 A
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