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1、(10)申请公布号 CN 102477063 A (43)申请公布日 2012.05.30 CN 102477063 A *CN102477063A* (21)申请号 201010558562.X (22)申请日 2010.11.24 C07J 63/00(2006.01) (71)申请人 上海医药工业研究院 地址 200040 上海市静安区北京西路 1320 号 (72)发明人 邵燕 陈云艳 孔德云 翁小香 周靖 欧阳丹薇 吕峰 高雯 张静 成亮 (74)专利代理机构 上海金盛协力知识产权代理 有限公司 31242 代理人 解文霞 (54) 发明名称 高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备。
2、方 法 (57) 摘要 本发明涉及羟基积雪草苷与其同分异构体积 雪草苷 B 的提纯方法技术领域。本发明所述的高 纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 是 通过制备型高效液相色谱仪， 流动相内添加环糊 精， 根据色谱峰分别采集得到两种收集液， 然后将 两种收集液分别回收溶剂后萃取去除环糊精。本 发明在制备型高效液相色谱分析方法基础上利用 环糊精流动相添加剂法分离出积雪草苷 B 与羟基 积雪草苷， 不需特殊分析柱就分离提纯出了积雪 草苷 B 与羟基积雪草苷， 该方法价廉易行， 与其他 方法相比具有实质性的进步和优势。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 该方法是通过制备型高效液相色谱 仪， 流动相内添加环糊精， 根据色谱峰分别采集得到两种收集液， 然后将两种收集液分别回 收溶剂后萃取去除环糊精。 2. 如权利要求 1 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 所说的流动相为乙腈 - 环糊精水溶液系统。 3. 如权利要求 2 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 所说的环糊精水溶液浓度为 2-8mmol/L。 4. 如权利要求 3 所。
4、述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 所说的环糊精水溶液浓度为 2mmol/L。 5. 如权利要求 1 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 萃取步骤选用丁醇、 戊醇或乙酸乙酯作为有机相。 6. 如权利要求 3 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 萃取时选用正丁醇作为有机相。 7. 如权利要求 1 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 萃取时有机相与水相的体积比为 1 100 100 1。 8. 如权利要求 7 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其。
5、特征在于 ： 萃取时有机相与水相的体积比为 1 4-4 1。 9. 如权利要求 8 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 萃取时有机相与水相的体积比为 2 1。 10. 如权利要求 1 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在于 ： 萃取次数为 1 10 次。 11.如权利要求10所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷B的制备方法， 其特征在于 ： 萃取次数为 1 次。 12. 如权利要求 1 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在 于 ： 萃取时， 收集液回收溶剂后得到的白色粉末的量 (mg) 与有机相、 水相的总量 。
6、(ml) 比为 1 100 100 1。 13. 如权利要求 12 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在 于 ： 萃取时， 收集液回收溶剂后得到的白色粉末的量 (mg) 与有机相、 水相的总量 (ml) 比为 25 1 25 4。 14. 如权利要求 13 所述的高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 其特征在 于 ： 萃取时， 收集液回收溶剂后得到的白色粉末的量 (mg) 与有机相、 水相的总量 (ml) 比为 10 1。 权 利 要 求 书 CN 102477063 A 2 1/3 页 3 高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法 技术领域 0001 。
7、本发明涉及羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷 B 的提纯方法技术领域。 背景技术 0002 积雪草 Centella asiatica(L.)Urban. 为伞形科积雪草属植物积雪草的干燥全 草， 始载于 神农本草经 ， 味苦、 寒。主大热， 恶疮， 痈疽， 身热， 被列为中品。积雪草为 2010 年版 中国药典 收载的常用中药， 具有清热利湿、 解毒消肿的功效， 临床上多用于治疗跌打 损伤、 皮肤病， 同时用于传染性肝炎、 流行性脑脊髓膜炎、 急性肾小球肾炎等。 我国应用积雪 草外用及内服治疗疾病已有两千年的历史， 南非、 印度、 东南亚等许多国家和地区也将其作 为传统药物应用。积雪草主要的。
8、化学成份包括三萜类、 多炔烯类、 挥发油类以及其他成份。 0003 积雪草总苷为从积雪草的全草中提取分离得到的有效部位， 含有多种三萜类化合 物， 主要包括积雪草苷、 羟基积雪草苷及其同分异构体积雪草苷B。 具有促进创伤愈合作用， 临床上多用于治疗手术创伤、 烧伤、 外伤和疤痕疙瘩等。 0004 对于积雪草总苷中有关成分的 HPLC 含量测定已有的相关报道， 均是在一般 HPLC 条件下进行测定， 一般的甲醇 - 水或乙腈 - 水系统的流动相均无法有效分离羟基积雪草苷 与其同分异构体积雪草苷 B， 羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷 B 均为一个混合物的 峰。 0005 环糊精流动相添加剂法简。
9、介 ： 环糊精流动相添加剂法是将环糊精添加于流动相 中。- 环糊精具有特殊的分子结构， 即呈闭合筒状结构。- 环糊精是由七个 D-(+)- 吡 喃葡萄糖单元通过 -1， 4 糖苷键相结合， 外部是亲水性的表面， 内部则是一个具有一定尺 寸的手性疏水管腔， - 环糊精这种独特的内疏水、 外亲水结构不仅使其在模拟酶、 手性分 离、 主 - 客体化学、 分子识别、 光谱探针等领域显示了重要的理论价值， 更在医药、 食品、 化 妆品、 环境保护等领域显示出重要的实用价值， 特别是用于手性分离领域。 但未见将环糊精 包合物中的环糊精去除而对标准品进行提纯的相关文献报道。 发明内容 0006 本发明的目的。
10、就是解决现有 HPLC 条件下无法分离出羟基积雪草苷与其同分异构 体积雪草苷 B 的上述缺陷， 提供一种简便易行的分离高纯度羟基积雪草苷及其同分异构体 积雪草苷 B 的方法。 0007 本发明通过制备型高效液相色谱仪， 采用流动相环糊精添加剂法分别收集得到羟 基积雪草苷的同分异构体积雪草苷 B 与羟基积雪草苷环糊精包合物的固体样品， 即环糊精 与标准品的包合物 ； 然后通过去除环糊精包合物中的环糊精对标准品进行提纯即得到液相 色谱分析用高纯度羟基积雪草苷及其同分异构体积雪草苷 B。 0008 本发明采取的技术方案如下 ： 0009 高纯度羟基积雪草苷及积雪草苷 B 的制备方法， 该方法是通过制。
11、备型高效液相色 谱仪， 流动相内添加环糊精， 根据色谱峰分别采集得到两种收集液， 将两种收集液分别回收 说 明 书 CN 102477063 A 3 2/3 页 4 溶剂后通过萃取去除环糊精， 即得积雪草苷 B 与羟基积雪草苷的标准品。 0010 上述的流动相优选乙腈 - 环糊精水溶液系统， 环糊精水溶液的浓度范围优选在 2-8mmol/L， 最优选 2mmol/L。 0011 上述的萃取步骤中， 优选丁醇、 戊醇、 乙酸乙酯等作为有机相， 最优选的是正丁醇， 正丁醇作为有机相对样品的溶解性能相对最好 ； 有机相与水相的比例在11001001 范围之间选用， 其中有机相与水相的比例优选范围为 。
12、4 1-1 4， 最优选范围为 2 1 ； 两 种收集液分别回收溶剂后得白色粉末， 白色粉末样品量与有机相、 水相的总量的比例 (mg/ ml) 在 1 100 100 1 范围之间选用， 其中优选范围为 10 1 ； 对样品进行萃取次数为 1 10 次， 优选萃取次数为 1 次， 分层得到有机相， 将有机相回收溶剂后即得积雪草苷 B 与 羟基积雪草苷的标准品。 0012 本发明的有益效果 ： 0013 本发明在制备型高效液相色谱分析方法基础上利用环糊精流动相添加剂法分离 出积雪草苷 B 与羟基积雪草苷的环糊精包合物， 然后通过萃取去除环糊精得到液相色谱分 析用高纯度羟基积雪草苷及其同分异构体。
13、积雪草苷 B。该方法价廉易行， 不需特殊分析柱， 就分离提纯出了积雪草苷 B 与羟基积雪草苷， 相对于现有技术具有很大的进步和优势。 具体实施方式 0014 以下实施例是为了更好的说明本发明而非用来限制本发明。 0015 实施例 1-12 0016 1. 制备 ： ( 送样样品为积雪草总苷原料 ) 0017 通过环糊精添加剂法利用制备型高效液相色谱的方法将羟基积雪草苷与其同分 异构体积雪草苷 B 分离 . 岛津制备型高效液相色谱仪， 包括 Shimadzu Class-VP 工作站， LC-8A 泵， SCL-10Avp 泵的控制器， SPD-M10Avp 检测器， FRC-10A 自动收集器。
14、， 流动相选用乙 腈 2mmol/L 环糊精水溶液 (v/v) 26 74， 色谱柱为 ： SHIMADZU shim-pack PRC-ODS 柱 (20mm250mm)， 流速 ： 6ml/min， 进样量 ： 5ml， 检测波长 ： 204nm， 根据色谱峰分别采集得到 制备液相色谱的收集液， 将收集液分别回收溶剂， 得到白色粉末。 0018 2. 萃取 ： 0019 取上述得到的白色粉末 50mg， 选用正丁醇 ( 水饱和的 )、 戊醇、 乙酸乙酯等作为有 机相， 萃取按照有机相与水相的体积比例在 1 100-100 1 范围之间选用， 白色粉末样品 的总量 (mg) 与有机相、 水相。
15、的总量 (V) 的比例在 1 100-100 1 范围之间选用， 对样品 进行萃取， 萃取1-10次， 分层得到有机相， 将有机相回收溶剂后即得积雪草苷B与羟基积雪 草苷的标准品。 0020 3. 样品纯度检测 ： 0021 采 用 HPLC-ELSD 及 UV 检 测， HW Workstation 工 作 站， Alltech ELSD 2000 检 测 器， Waters 515HPLC Pump， 流 动 相 采 用 乙 腈 水 (v/v) 30 70， 色 谱 柱 为 C18(4.6mm250mm) 柱， 流速 ： 1ml/min， 进样量 ： 20l， 检测波长 ： 204nm， 。
16、根据进样量， 样品 的浓度以及样品峰面积可以得出标准品的纯度。根据所得的标准品计算得到收率。 0022 4. 获得的标准品含量 ： 99。 0023 5. 产品外观 ： 白色粉末。 说 明 书 CN 102477063 A 4 3/3 页 5 0024 各实施例萃取步骤具体条件与结果见下表 1 ： 0025 表 1 0026 0028 试验用样品量为 50mg， 收率是以所得样品的纯度达到标准品的纯度计算而得。单 因素考察实验时均采取萃取次数为 3 次， 根据纯度合并萃取的样品， 计算收率， 上表 1 为单 因素实验数据。 0029 本发明另外进行了正交实验， 采取了萃取次数为 1、 2、 3。
17、 次的实验设计， 根据正交 实验的结果得到萃取 1 次为最优选择。 0030 实验分别采用了丁醇、 戊醇、 乙酸乙酯等作为有机相进行了萃取， 其中水饱和的正 丁醇作为有机相， 对样品的溶解性能相对最好， 标准品收率也最高， 戊醇、 乙酸乙酯的实验 收率较低， 所以最优选采用正丁醇作为有机相。 1 25 1 1 4 3 19.97 2 25 1 3 2 3 49.35 3 25 1 2 1 3 36.99 4 25 1 3 1 3 23.35 5 10 1 3 2 3 31.90 6 10 1 2 1 3 63.11 7 10 1 3 1 3 45.06 8 10 1 4 1 3 19.97 9 25 4 3 2 3 30.40 10 25 4 2 1 3 60.69 11 25 4 3 1 3 39.72 12 25 4 4 1 3 22.17 说 明 书 0027 CN 102477063 A 5 。