一种新型多肽在系统性红斑狼疮诊断中的应用 技术领域 ：
本发明涉及免疫学诊断领域， 具体而言， 本发明涉及一种新型多肽 (SLEP) 的制备 方法和及其在系统性红斑狼疮诊断中的应用。 背景技术 ：
系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus， SLE) 是一种以自身抗体产生 和免疫复合物形成为特征的自身免疫性疾病， 临床表现为全身症状及多系统多器官受累的 症状。我国 SLE 的发病率为 70.1/10 万， 并且有逐年上升的趋势。SLE 的早期诊断、 早期治 疗是改善预后的关键。然而我国自身免疫性疾病诊断水平较低， 并且诊断试剂主要依赖进 口， 造成诊断费用昂贵， 增加了国家和患者的医疗成本， 也不利于向基层医院普及。 因此， 建 立稳定、 快捷、 适合推广的检测方法， 是目前亟待解决的问题。
SLE 临床诊断标准中包括自身抗体如抗核抗体 (ANA)、 抗双链 DNA 抗体 (ds-DNA 抗 体 ) 和抗 Sm 抗体检测， 但由于特异性和灵敏度的不高， 还不是理想的血清学检测指标。如 果能够建立 SLE 特异的 “自身抗体谱” 检测方法， 同时检测多种特异性抗体， 提高检出率及 准确性， 将为 SLE 的诊断、 分类、 疗效观察和预后判断提供了可靠的依据， 具有重要的临床 意义。因此， 寻找一种敏感性强、 特异性高而又简便易行的血清学检测方法， 对系统性红斑 狼疮的早期诊断及治疗具有重要意义。
大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一， 但由于其发病机制尚不 明确， 难以直接利用自身抗原检测抗体。抗原表位 (epitope) 是抗原分子中识别、 结合抗体 的基础， 因此是检测抗体的实际有效组分。以抗原表位肽或其模拟肽 (mimotope) 作为诊 断工具有以下几个优势 ： 1) 可以提高 诊断的灵敏度和特异性， 避免了生物大分子易产生 的非特异性结合 [Deroo Set al(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4 ： 75-115] ； 2) 扩大疾病诊断的范围， 对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、 多糖抗原、 脂类抗原， 以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断， 也可以获得与天然抗原表位一致的 结果 [Bruce G(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94 ： 1955 1960 ； Jinaping Q et al(1999) Hyridoma 18(1) ： 103-109] ； 3) 多肽制备、 应用的成本低、 易于质控。 因此， 自身抗原表位肽 或其模拟肽 [Meloen RH et al(2000)J Mol Recognit 13 ： 352-359] 的获得是制备自身抗 体的多肽检测试剂的基础。基于噬菌体肽库技术的抗原表位确定技术， 仅需要以患者血清 样本为靶标， 而无需天然的自身抗原信息， 可以实现快速和简便筛选， 并且成本低、 结果可 信度高。噬菌体肽库技术的另一个突出特点是， 通过筛选可以同时获得某一疾病特异性的 多个抗原表位肽， 它们可能代表了天然抗原的主要免疫显性基团。天然生物大分子抗原通 常由多个抗原表位组成， 其中有一些在免疫反应中起着主要作用， 被称为 “免疫显性基团” ， 针对完整抗原的抗体主要是针对这些表位的多种 “单克隆抗体” 组成。以 SLE 患者血清样 品为靶标， 通过噬菌体肽库筛选， 获得 SLE 特异性的抗原表位肽， 是获得新型诊断试剂的基 础。
基于以上研究及目前的现状， 申请人进行了多方面的研究及探索， 通过下述实验策略获得了 SLE 特异性的抗原表位肽。具体而言， 申请人从 10 例 SLE 患者血清中制备和 纯化得到 IgG， 然后以线性十二肽库与抗体孵育， 经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克 隆。之后通过 ELISA 确定阳性噬菌体克隆， 测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。化学合成其 中的一个表位肽， 命名为 SLEP， 通过 ELISA 检测与患者血清的反应情况， 表明其能特异的与 患者血清中的 IgG 结合， 而不与健康人血清反应。
至此， 申请人能够特异性与 SLE 患者血清中 IgG 结合的抗原表位肽， 由此完成了本 发明。 发明内容 具体地， 本发明提供了 ：
1. 一种系统性红斑狼疮特异性的抗原表位， 其具有下述的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1) ： KSPGTPSPVSQW。
2. 一种核苷酸序列， 其特征在于编码权利要求 1 所述的氨基酸序列。
3. 权利要求 1 所述的氨基酸序列， 其特征在于， 其可作为组合物的一种组分。
4. 权利要求 3 的组合物， 其特征在于， 还可以包含药学上可接受的载体。
5. 权利要求 1 所述的核苷酸序列， 其特征在于， 其可作为组合物的一种组分。
6. 权利要求 5 的组合物， 其特征在于， 还可以包含药学上可接受的载体。
7. 权利要求 1 所述的抗原表位在系统性红斑狼疮诊断的用途。
8. 权利要求 2 所述的核苷酸序列在系统性红斑狼疮诊断的用途。
附图说明
图1： 表示阳性噬菌体克隆的竞争 ELISA 结果。 图2： 表示合成肽 SLEP 与 SLE 患者血清样品、 健康人血清样品的结合。具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明， 具体提供了下述阐述性的实施方案， 本领域的技术人 员应该理解， 本发明并不仅仅限定于下述实施例， 任何与本发明的实施例等同的变体也包 括在本发明中。
实施例
1、 噬菌体展示肽库筛选 SLE 特异性的抗体结合肽
Ph.D.-12 肽库试剂盒购自 NEB 公司， 库容量为 2.7×109， 滴度为 1.5×1013/μl.。 Escherichia coli ER2537 为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示 肽库使用说明书。 每轮筛选以 SLE 患者血清中的总 IgG 包被 ( 每孔 10μg)， 每孔投入 1×1011 噬菌体。噬菌 体富集程度通过 “投入 / 产出比” 计算。经过三轮筛选， 挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克 隆与总 IgG 抗体的特异性结合通过 ELISA 测定。总 IgG 抗体 ( 每孔 10μg) 包被 96 孔板 (Nunc 公司 )4℃过夜。倾去不结合的抗体， 3％ BSA 37℃封闭 1 小时。每孔投入 1×109 噬 菌体 37℃孵育 2 小时。洗涤液 (PBS-0.05％ Tween 20) 洗板 5 次， 共 3 分钟。HRP 标记的 抗 M13 单抗 (1 ∶ 1000 稀释， Amersham Biosciences 公司 )37℃孵育 1 小时。洗涤方法同 上， 以 TMB(Sigma) 为底物检测结合的抗 M13 单抗， 450nm 检测光吸收， 结果见图 1。由图 1可知， 这 12 个克隆均为阳性克隆。
2、 rEfb 抗原表位的获得及其活性验证
对挑取的 20 个噬菌体克隆进行测序， 获得了 7 条阳性克隆的展示肽序列 ( 见表 1)。通过比对这些结合肽序列， 申请人发现 ( 见图 2)。申请人据此合成了该肽段， 其具体的 氨基酸序列为 ： KSPGTPSPVSQW(SEQ ID NO ： 1)， 命名为 SLEP。
3、 SLEP 与 SLE 患者血清 IgG 结合检测
合成肽 SLEP( 每孔 0.5μg) 包被 96 孔板 (Nunc 公司 )4℃过夜。倾去不结合的肽， 3％ BSA 37℃封闭 1 小时。 SLE 患者或健康人血清样品 1 ∶ 400 稀释， 加入不同孔中， 37℃孵 育 1 小时。洗涤液 (PBS-0.05％ Tween 20) 洗板 5 次， 共 3 分钟。1 ∶ 1000 稀释的 HRP 标 记的羊抗人 IgG 37℃孵育 1 小时。洗涤方法同上， 以 TMB(Sigma) 为底物检测结合的抗 M13 单抗， 450nm 检测光吸收， 结果见图 2。
表 1 噬菌体展示肽序列测定结果
综上可知， 本申请的系统性红斑狼疮特异性的抗原表位肽， 能够特异的与患者血 清中的 IgG 结合， 本申请提供了如式 (I) 所示的抗原表位。
本发明涉及免疫学诊断领域， 具体而言， 本发明涉及一种新型多肽 (SLEP) 的制备 方法和及其在系统性红斑狼疮诊断中的应用。 背景技术 ：
系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus， SLE) 是一种以自身抗体产生 和免疫复合物形成为特征的自身免疫性疾病， 临床表现为全身症状及多系统多器官受累的 症状。我国 SLE 的发病率为 70.1/10 万， 并且有逐年上升的趋势。SLE 的早期诊断、 早期治 疗是改善预后的关键。然而我国自身免疫性疾病诊断水平较低， 并且诊断试剂主要依赖进 口， 造成诊断费用昂贵， 增加了国家和患者的医疗成本， 也不利于向基层医院普及。 因此， 建 立稳定、 快捷、 适合推广的检测方法， 是目前亟待解决的问题。
SLE 临床诊断标准中包括自身抗体如抗核抗体 (ANA)、 抗双链 DNA 抗体 (ds-DNA 抗 体 ) 和抗 Sm 抗体检测， 但由于特异性和灵敏度的不高， 还不是理想的血清学检测指标。如 果能够建立 SLE 特异的 “自身抗体谱” 检测方法， 同时检测多种特异性抗体， 提高检出率及 准确性， 将为 SLE 的诊断、 分类、 疗效观察和预后判断提供了可靠的依据， 具有重要的临床 意义。因此， 寻找一种敏感性强、 特异性高而又简便易行的血清学检测方法， 对系统性红斑 狼疮的早期诊断及治疗具有重要意义。
大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一， 但由于其发病机制尚不 明确， 难以直接利用自身抗原检测抗体。抗原表位 (epitope) 是抗原分子中识别、 结合抗体 的基础， 因此是检测抗体的实际有效组分。以抗原表位肽或其模拟肽 (mimotope) 作为诊 断工具有以下几个优势 ： 1) 可以提高 诊断的灵敏度和特异性， 避免了生物大分子易产生 的非特异性结合 [Deroo Set al(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4 ： 75-115] ； 2) 扩大疾病诊断的范围， 对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、 多糖抗原、 脂类抗原， 以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断， 也可以获得与天然抗原表位一致的 结果 [Bruce G(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94 ： 1955 1960 ； Jinaping Q et al(1999) Hyridoma 18(1) ： 103-109] ； 3) 多肽制备、 应用的成本低、 易于质控。 因此， 自身抗原表位肽 或其模拟肽 [Meloen RH et al(2000)J Mol Recognit 13 ： 352-359] 的获得是制备自身抗 体的多肽检测试剂的基础。基于噬菌体肽库技术的抗原表位确定技术， 仅需要以患者血清 样本为靶标， 而无需天然的自身抗原信息， 可以实现快速和简便筛选， 并且成本低、 结果可 信度高。噬菌体肽库技术的另一个突出特点是， 通过筛选可以同时获得某一疾病特异性的 多个抗原表位肽， 它们可能代表了天然抗原的主要免疫显性基团。天然生物大分子抗原通 常由多个抗原表位组成， 其中有一些在免疫反应中起着主要作用， 被称为 “免疫显性基团” ， 针对完整抗原的抗体主要是针对这些表位的多种 “单克隆抗体” 组成。以 SLE 患者血清样 品为靶标， 通过噬菌体肽库筛选， 获得 SLE 特异性的抗原表位肽， 是获得新型诊断试剂的基 础。
基于以上研究及目前的现状， 申请人进行了多方面的研究及探索， 通过下述实验策略获得了 SLE 特异性的抗原表位肽。具体而言， 申请人从 10 例 SLE 患者血清中制备和 纯化得到 IgG， 然后以线性十二肽库与抗体孵育， 经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克 隆。之后通过 ELISA 确定阳性噬菌体克隆， 测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。化学合成其 中的一个表位肽， 命名为 SLEP， 通过 ELISA 检测与患者血清的反应情况， 表明其能特异的与 患者血清中的 IgG 结合， 而不与健康人血清反应。
至此， 申请人能够特异性与 SLE 患者血清中 IgG 结合的抗原表位肽， 由此完成了本 发明。 发明内容 具体地， 本发明提供了 ：
1. 一种系统性红斑狼疮特异性的抗原表位， 其具有下述的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1) ： KSPGTPSPVSQW。
2. 一种核苷酸序列， 其特征在于编码权利要求 1 所述的氨基酸序列。
3. 权利要求 1 所述的氨基酸序列， 其特征在于， 其可作为组合物的一种组分。
4. 权利要求 3 的组合物， 其特征在于， 还可以包含药学上可接受的载体。
5. 权利要求 1 所述的核苷酸序列， 其特征在于， 其可作为组合物的一种组分。
6. 权利要求 5 的组合物， 其特征在于， 还可以包含药学上可接受的载体。
7. 权利要求 1 所述的抗原表位在系统性红斑狼疮诊断的用途。
8. 权利要求 2 所述的核苷酸序列在系统性红斑狼疮诊断的用途。
【附图说明】
图1： 表示阳性噬菌体克隆的竞争 ELISA 结果。 图2： 表示合成肽 SLEP 与 SLE 患者血清样品、 健康人血清样品的结合。具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明， 具体提供了下述阐述性的实施方案， 本领域的技术人 员应该理解， 本发明并不仅仅限定于下述实施例， 任何与本发明的实施例等同的变体也包 括在本发明中。
实施例
1、 噬菌体展示肽库筛选 SLE 特异性的抗体结合肽
Ph.D.-12 肽库试剂盒购自 NEB 公司， 库容量为 2.7×109， 滴度为 1.5×1013/μl.。 Escherichia coli ER2537 为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示 肽库使用说明书。 每轮筛选以 SLE 患者血清中的总 IgG 包被 ( 每孔 10μg)， 每孔投入 1×1011 噬菌体。噬菌 体富集程度通过 “投入 / 产出比” 计算。经过三轮筛选， 挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克 隆与总 IgG 抗体的特异性结合通过 ELISA 测定。总 IgG 抗体 ( 每孔 10μg) 包被 96 孔板 (Nunc 公司 )4℃过夜。倾去不结合的抗体， 3％ BSA 37℃封闭 1 小时。每孔投入 1×109 噬 菌体 37℃孵育 2 小时。洗涤液 (PBS-0.05％ Tween 20) 洗板 5 次， 共 3 分钟。HRP 标记的 抗 M13 单抗 (1 ∶ 1000 稀释， Amersham Biosciences 公司 )37℃孵育 1 小时。洗涤方法同 上， 以 TMB(Sigma) 为底物检测结合的抗 M13 单抗， 450nm 检测光吸收， 结果见图 1。由图 1可知， 这 12 个克隆均为阳性克隆。
2、 rEfb 抗原表位的获得及其活性验证
对挑取的 20 个噬菌体克隆进行测序， 获得了 7 条阳性克隆的展示肽序列 ( 见表 1)。通过比对这些结合肽序列， 申请人发现 ( 见图 2)。申请人据此合成了该肽段， 其具体的 氨基酸序列为 ： KSPGTPSPVSQW(SEQ ID NO ： 1)， 命名为 SLEP。
3、 SLEP 与 SLE 患者血清 IgG 结合检测
合成肽 SLEP( 每孔 0.5μg) 包被 96 孔板 (Nunc 公司 )4℃过夜。倾去不结合的肽， 3％ BSA 37℃封闭 1 小时。 SLE 患者或健康人血清样品 1 ∶ 400 稀释， 加入不同孔中， 37℃孵 育 1 小时。洗涤液 (PBS-0.05％ Tween 20) 洗板 5 次， 共 3 分钟。1 ∶ 1000 稀释的 HRP 标 记的羊抗人 IgG 37℃孵育 1 小时。洗涤方法同上， 以 TMB(Sigma) 为底物检测结合的抗 M13 单抗， 450nm 检测光吸收， 结果见图 2。
表 1 噬菌体展示肽序列测定结果
综上可知， 本申请的系统性红斑狼疮特异性的抗原表位肽， 能够特异的与患者血 清中的 IgG 结合， 本申请提供了如式 (I) 所示的抗原表位。
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