一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法.pdf

本发明公开了一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，它是以海参、海参内脏器官、海鞘、海鞘内脏器官，经清洗，打浆，均质、发酵，酶解，超滤、浓缩、干燥、添加牛磺酸混合制造营养补充剂和食品配方原料，可用于人体补充钒元素和牛磺酸及其药品开发，其产品生物钒含量高，食用安全，吸收率高，生物效价高。

权利要求书
1、  一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于选用海参、海参内脏器官、海鞘、海鞘内脏器官、牛磺酸为原材料，按以下工艺步骤进行加工：
步骤一：原料、处理

1.  1鲜海参，去除内脏，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  2鲜海参内脏器官，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  3干海参，去除内脏，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  4干海参内脏器官，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  5海参粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  6海参内脏器官粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  7鲜海鞘，去除内脏，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  8鲜海鞘内脏器官，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  9干海鞘，去除内脏，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  10干海鞘内脏器官，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  11海鞘粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  12海鞘内脏器官粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；

1.  13将上述1.1-1.12种原料中至少两种进行混合得到的混合物；

1.  14牛磺酸，备用；
在进入步骤二之前，产生下列中间产品：

2.  1将1.1-1.13种原料中的一种或至少两种混合的混合物蒸熟，干燥，粉碎，得粒径≤30微米的粉末，用1份该粉末与1份牛磺酸添加适量调味剂，混合均匀，得钒含量≥40mg/kg，牛磺酸含量≥500g/kg的混合粉，可制片、胶囊；

2.  2将上述混合粉1粉，加水4份，磨浆，均质，得钒含量≥40mg/L，牛磺酸含量≥100g/L的混悬液；
步骤二：磨浆、均质
以步骤一1.1-1.13原料的其中一种1份，加3-20份水混合，磨浆，均质，得粒径≤30微米的浆液；
步骤三：超滤、除盐
浆液用超滤膜超滤，除去大部分盐分，得低盐浆液；
步骤四：灭菌、中间产品
将低盐浆液灭菌，浓缩到钒含量≥20mg/L时，冷却，得浓缩液；
在进入步骤五之前，产生下列中间产品：

4.  1将浓缩液添加牛磺酸、调味剂，得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的口服液；

4.  2将浓缩液干燥，与牛磺酸混合，得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制片、胶囊；

4.  3将浓缩液干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制颗粒；
步骤五：发酵、灭菌、过滤
将步骤四所得浓缩液的液温在15-45℃之间调整，保持恒温，利用发酵方法，按1-10％加入发酵促进剂大豆肽，搅拌均匀，按0.5-8％接种量接种发酵菌种发酵8-32小时，停止发酵，灭菌，过滤，得总蛋白≥45％，多肽≥20％，钒含量≥20mg/L的发酵液；
步骤六：浓缩、干燥、配制产品

6.  1将发酵液添加牛磺酸、调味剂，配制得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的口服液；

6.  2将发酵液浓缩，干燥，与牛磺酸混合，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，制成片、胶囊；

6.  3将发酵液浓缩，干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，制成颗粒；

6.  4将发酵液用超滤膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，添加牛磺酸、调味剂，配制得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的精制口服液；

6.  5将发酵液用超滤膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，浓缩，干燥，与牛磺酸混合，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的精制粉末，制成片、胶囊；

6.  6将发酵液用超滤膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，浓缩，干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的精制粉末，制成颗粒。

2、  根据权利要求1所述的一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于：所述的发酵步骤所使用的发酵菌种是任何适宜人体食用同时又适用于蛋白水解的发酵菌种，优选按下述方法诱变培养的高活力发酵菌种：
(1)菌种选择：芽胞杆菌CAU208；
(2)培养基配制：分别配制激活培养基、种子培养基、分离培养基、发酵培养基等四种培养基在不同的生产环节使用；
①激活培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、大豆肽和水配制，用于激活被培养微生物；
②种子培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、豆粕粉、大豆肽和水配制，用于驯化被培养微生物；
③分离培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、脱脂奶粉、琼脂、大豆肽和水配制，用于从被培养微生物中分离有应用价值的菌株；
④发酵培养基：以豆粕粉、糖蜜、大豆肽和水配制，用于测定有应用价值菌株的蛋白水解力；
(3)发酵菌种：
发酵菌种为分别经过紫外线诱变或亚硝基胍诱变，或经过紫外线与亚硝基胍复合诱变的高活力菌种；
(4)筛选菌种
初筛：紫外线诱变经初筛后得到的正变菌株，亚硝基胍诱变后初筛得到正变菌株；
复筛：将初筛得到的正变菌株，接入100ml/250ml的三角瓶发酵培养基中，进行复筛，测定豆粕水解液的水解度，得较稳定的正变菌株，置分离培养基里培养后，测定分离培养基里的透明圈直径与菌落直径的比值，筛选出比值大的菌株，经种子培养基菌培养，接种于发酵培养基内，一定发酵周期后测定发酵液水解度，得较稳定的正变菌株，分成两组2次复筛，一组进行紫外线处理，一组进行亚硝基胍处理，得性能良好且稳定的菌株，再将此菌株进行紫外线与亚硝基胍复合诱变，得稳定性优良的高产菌株，将高产菌株接种到激活培养基上作为第1代，以后每隔5天传代1次，共传10代，将每一代摇瓶发酵，250ml三角瓶装液100ml，测定发酵液的水解度，选定稳定性好、高产性好、不发生突变回复的菌株为保留菌株，即为高活力发酵菌株。

3、  根据权利要求2所述的一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于：所述的紫外线诱变步骤包括：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节单细胞菌悬液活菌数至106-108个/ml，液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，照射时间2-4min，距离30cm；或紫外线灯功率30W，照射时间2-4min，距离20cm。

4、  根据权利要求2所述的一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于：所述的亚硝基胍诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节活菌数为105-108个/ml，亚硝基胍终质量浓度为0.8-1.2mg/ml，30℃水浴处理30min。

5、  根据权利要求2所述的一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于：所述的紫外线与亚硝基胍复合诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节活菌数为107-109个/ml，亚硝基胍终质量浓度为1.0mg/ml，30℃水浴处理30min，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，照射时间2-4min，距离30cm；或紫外线灯功率30W，照射时间2-4min，距离20cm。

6、  根据权利要求1所述的一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于，步骤五所说的发酵菌也可以是：
(1)任何适宜人体食用的经诱变培育的且适用于蛋白水解的微生物；
(2)任何适宜人体食用的未经诱变培育的且适用于蛋白水解的微生物。

7、  根据权利要求1所述的一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法，其特征在于，步骤五所说的发酵方法过程为酶解法。

说明书一种用富钒食物和牛磺酸制造营养品的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及可供营养品和药品加工用的含有钒、肽、牛磺酸等营养成分的原料的制备方法；本发明涉及按该方法制备的产品以及其用途。
(二)背景技术
钒是人类必需微量元素之一，同时是一类不依靠胰岛素、可替代胰岛素降糖并避开胰岛素抵抗的糖尿病营养治疗剂。无论是无机钒、有机钒，生物转化钒，在安全限量下，只要能吸收，就能产生医疗保健作用。在完全吸收的前提下，微量补充钒就能产生良好的医疗保健作用。但是，目前已知的无机钒毒副作用大，合成有机钒安全性不明确，尚不能供人体食用。
海参、海鞘是同类海生软体动物，能将海水中以钒酸根形式存在的钒元素在其体内浓缩10万-1000万倍，其体内钒元素以钒蛋白-血钒形式存在，是生物界极为罕见的富钒食物，其干重含钒量高达40mg/kg，血液含钒量高达14500mg/L，灰分含钒量高达15％。海参内脏和海鞘内脏是海参、海鞘加工的副产品，也是韩国、日本、西方国家高档食品原料，含钒量更比肌肉高3-5倍，用之制备营养品是一种人体安全有效的钒营养源。
长期以来，氨基酸一直被认为是蛋白质分解后的主要吸收形式。有关肽的转运机制研究表明，与氨基酸运输体系相比，肽吸收具有吸收快、能耗低、不易饱和，且各种肽之间转运无竞争性和抑制性。因此，肽吸收具有效率高、更迅速、氨基酸组成更趋于平衡等优点。所以，将海参内脏和海鞘内脏所含的蛋白质发酵水解为肽，是作为钒营养补充剂的优选形式。
人体合成牛磺酸的能力很弱，主要依靠从膳食中摄取。肾脏可以依据机体的需要和膳食中牛磺酸的含量，调节牛黄酸的排出量，以维持体内牛磺酸的平衡。牛磺酸在机体消化、生殖、免疫、神经、内分泌等多个生理功能的调节、维持机体组织细胞的自稳态中起重要作用。近来国内外大量研究发现，牛磺酸对糖尿病及其并发症具有良好的营养治疗和药物治疗作用：
1.对胰岛B细胞的保护作用：预防性应用牛磺酸可明显抑制链脲佐菌素(STZ)诱导的IDDM动物模型血糖水平升高；IL-1B可抑制B细胞分泌功能，牛磺酸则能对抗IL-1B对胰岛素分泌的抑制，且其反转效应具有量效和时效关系。
2.治疗糖尿病心肌病：研究显示，心肌组织肾素-血管紧张素(RAS)功能亢进参与糖尿病性心肌病的发展过程，牛磺酸可通过抑制糖尿病大鼠心肌组织RAS系统的功能，从而起到减轻糖尿病心肌损害的作用。
3.治疗糖尿病肾病：生理状态下，肾脏可根据进食量的多少，通过调节近端肾小管对牛磺酸的重吸收，使体内的牛磺酸水平保持平衡。补充牛磺酸可使糖尿病肾病SD大鼠的蛋白尿降低50％，减轻肾小球肥大、肾小球间质纤维增生、肾小球硬化。牛磺酸对糖尿病大鼠肾脏结构和功能的改善作用，与牛磺酸降低肾脏皮质丙二醛含量、降低血清游离Fe++含量、减少糖基化终末产物的形成有关。牛磺酸尚可通过降低大鼠肾皮质糖基化终末产物(AGEs)形成和TGF-B基因表达而起到抑制糖尿病大鼠肾小球细胞外基质(ECM)的合成。
4.治疗糖尿病性白内障：糖尿病性白内障的发病机制包括多元醇通路、渗透压学说和氧化学说。牛磺酸具有调节晶体渗透压和抗氧化等重要作用。在糖尿病白内障发生发展的过程中，山梨醇含量增加、晶体渗透压增加，作为调节渗透压重要物质的牛磺酸含量明显降低，抗氧化作用减弱，晶体中的蛋白发生过度氧化，从而引起或加重白内障的发生发展；补充牛磺酸可以抑制糖尿病性白内障的发生发展的机制，可能与其抗氧化功能和抑制高血糖有关。
5.治疗糖尿病神经病变：糖尿病神经病变动物模型体内牛磺酸含量下降，神经传导速度跟着下降。牛磺酸作为抗氧化剂、钙调节剂和血管扩张剂，其减少可能与糖尿病神经代谢和血管功能的减退有着病理遗传学的关系。
因此，将海参、海参内脏、海鞘、海鞘内脏中与蛋白质融合的钒蛋白-血钒水解为氨基酸钒和肽钒，加上牛磺酸的抗糖尿病作用，能配制成有效控制糖尿病及其并发症的营养补充剂和营养治疗药物。
用海参、海参内脏、海鞘、海鞘内脏、牛磺酸的复合物作为人体补钒营养源并用于预防控制糖尿病及其并发症，国内外未见有报道和记载。
(三)发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为需要补充钒元素的人群，提供一种可供人体安全食用富钒和牛磺酸制造营养品的方法，其产品生物钒含量高，食用安全，吸收率高，生物效价高。
实现本发明目的的技术方案如下：选用海参、海参内脏器官、海鞘、海鞘内脏器官、牛磺酸为原材料，按以下工艺步骤进行加工：
步骤一：原料、处理
1.鲜海参，去除内脏，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
2.鲜海参内脏器官，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
3.干海参，去除内脏，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
4.干海参内脏器官，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
5.海参粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
6.海参内脏器官粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
7.鲜海鞘，去除内脏，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
8.鲜海鞘内脏器官，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
9.干海鞘，去除内脏，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
10.干海鞘内脏器官，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
11.海鞘粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
12.海鞘内脏器官粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；
13.将上述1-12种原料中至少两种进行混合得到的混合物；
14.牛磺酸，备用；
在进入步骤二之前，产生下列中间产品：
1.将1-13种原料中的一种或至少两种混合的混合物蒸熟，干燥，粉碎，得粒径≤30微米的粉末，用1份该粉末与1份牛磺酸添加适量调味剂，混合均匀，得钒含量≥40mg/kg，牛磺酸含量≥500g/kg的混合粉，可制片、胶囊；
2.将上述混合粉1份，加水4份，磨浆，均质，得钒含量≥40mg/L，牛磺酸含量≥100g/L的混悬液；
步骤二：磨浆、均质
以步骤一1-13原料的其中一种1份，加3-20份水混合，磨浆，均质，得粒径≤30微米的浆液；
步骤三：超滤、除盐
浆液用超滤膜超滤，除去大部分盐分，得低盐浆液；
步骤四：灭菌、中间产品
将低盐浆液灭菌，浓缩到钒含量≥20mg/L时，冷却，得浓缩液；
在进入步骤五之前，产生下列中间产品：
1.将浓缩液添加牛磺酸、调味剂，得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的口服液；
2.将浓缩液干燥，与牛磺酸混合，得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制片、胶囊；
3.将浓缩液干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制颗粒；
步骤五：发酵、灭菌、过滤
将步骤四所得浓缩液的液温在15-45℃之间调整，保持恒温，按1-10％加入发酵促进剂大豆肽，搅拌均匀，按0.5-8％接种量接种发酵菌种发酵8-32小时，停止发酵，灭菌，过滤，得总蛋白≥45％，多肽≥20％，钒含量≥20mg/L的发酵液；
步骤六：浓缩、干燥、配制产品
1.将发酵液添加牛磺酸、调味剂，配制得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的口服液；
2.将发酵液浓缩，干燥，与牛磺酸混合，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，制成片、胶囊；
3.将发酵液浓缩，干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，制成颗粒；
4.将发酵液用超滤膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，添加牛磺酸、调味剂，配制得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的精制口服液；
5.将发酵液用超滤膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，浓缩，干燥，与牛磺酸混合，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的精制粉末，制成片、胶囊；
6.将发酵液用超滤膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，浓缩，干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的精制粉末，制成颗粒。
本发明还有这样一些技术特征：
1、所述的发酵步骤所使用的发酵菌种是任何适宜人体食用同时又适用于蛋白水解的发酵菌种，优选按下述方法诱变培养的高活力发酵菌种：
(1)菌种选择：芽胞杆菌CAU208；
(2)培养基配制：分别配制激活培养基、种子培养基、分离培养基、发酵培养基等四种培养基在不同的生产环节使用；
①激活培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、大豆肽和水配制，用于激活被培养微生物；
②种子培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、豆粕粉、大豆肽和水配制，用于驯化被培养微生物；
③分离培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、脱脂奶粉、琼脂、大豆肽和水配制，用于从被培养微生物中分离有应用价值的菌株；
④发酵培养基：以豆粕粉、糖蜜、大豆肽和水配制，用于测定有应用价值菌株的蛋白水解力；
(3)发酵菌种：
发酵菌种为分别经过紫外线诱变或亚硝基胍诱变，或经过紫外线与亚硝基胍复合诱变的高活力菌种；
(4)筛选菌种
初筛：紫外线诱变经初筛后得到的正变菌株，亚硝基胍诱变后初筛得到正变菌株；
复筛：将初筛得到的正变菌株，接入100ml/250ml的三角瓶发酵培养基中，进行复筛，测定豆粕水解液的水解度，得较稳定的正变菌株，置分离培养基里培养后，测定分离培养基里的透明圈直径与菌落直径的比值，筛选出比值大的菌株，经种子培养基菌培养，接种于发酵培养基内，一定发酵周期后测定发酵液水解度，得较稳定的正变菌株，分成两组2次复筛，一组进行紫外线处理，一组进行亚硝基胍处理，得性能良好且稳定的菌株，再将此菌株进行紫外线与亚硝基胍复合诱变，得稳定性优良的高产菌株，将高产菌株接种到激活培养基上作为第1代，以后每隔5天传代1次，共传10代，将每一代摇瓶发酵，250ml三角瓶装液100ml，测定发酵液的水解度，选定稳定性好、高产性好、不发生突变回复的菌株为保留菌株，即为高活力发酵菌株；
2、所述的紫外线诱变步骤包括：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节单细胞菌悬液活菌数至106-108个/ml，液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，照射时间2-4min，距离30cm；或紫外线灯功率30W，照射时间2-4min，距离20cm；
3、所述的亚硝基胍诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节活菌数为105-108个/ml，亚硝基胍终质量浓度为0.8-1.2mg/ml，30℃水浴处理约30min；
4、所述的紫外线与亚硝基胍复合诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节活菌数为107-109个/ml，亚硝基胍终质量浓度为1.0mg/ml，30℃水浴处理约30min，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，照射时间2-4min，距离30cm；或紫外线灯功率30W，照射时间2-4min，距离20cm。
按本发明上述方法制备的中间产品，以干重计算，其中总蛋白≥20％，蛋白中的肽含量≥20％，钒元素含量≥80mg/kg。可用于制作成营养食品、食品配方成分、营养补充剂、药品等。
作为上述发酵步骤的优化方法，在发酵前或发酵后的物料中适量添加其他食品原料，可调节最终产品的风味。
作为上述发酵步骤的优化方法，发酵菌种为经过紫外线诱变或亚硝基胍诱变，或经过紫外线与亚硝基胍复合诱变的高活力菌种。诱变过程中将发酵菌进行含有发酵促进剂的培养基培养，制得高活力发酵菌种，提高产品含肽量，缩短发酵周期，降低生产成本。其诱变培养方法如下：
(1)菌种选择：任何适用于人体食用且适宜于蛋白质水解的发酵菌种均可应用，优选芽胞杆菌CAU208；
(2)培养基配制：分别配制激活培养基、种子培养基、分离培养基、发酵培养基等四种培养基，在不同的生产环节使用。
①激活培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、大豆肽和水配制，用于激活被培养微生物。
②种子培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、豆粕粉、大豆肽和水配制，用于驯化被培养微生物。
③分离培养基：以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、脱脂奶粉、琼脂、大豆肽和水配制，用于从被培养微生物中分离有应用价值的菌株。
④发酵培养基：以豆粕粉、糖蜜、大豆肽和水配制，用于测定菌株的蛋白水解力。
作为上述培养基的优化方法，培养基的配方成分和用量比例，根据应用不同的发酵菌种予以调整。
(3)发酵菌种诱变方法：
紫外线诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节单细胞菌悬液活菌数至106-108个/ml，液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，照射时间2-4min，距离30cm；或紫外线灯功率30W，照射时间2-4min，距离20cm；
亚硝基胍诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节活菌数为105-108个/ml，亚硝基胍终质量浓度为0.8-1.2mg/ml，30℃水浴处理约30min。
紫外线与亚硝基胍复合诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36小时，调节活菌数为107-109个/ml，亚硝基胍终质量浓度为0.8-1.2mg/ml，30℃水浴处理约30min，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，距离30cm，照射时间2-4min；或紫外线灯功率30W，距离20cm，照射时间2-4min。
(4)筛选菌种
初筛：将紫外线诱变后的菌株初筛，得到的正变菌株；将亚硝基胍诱变后的菌株初筛，得到的正变菌株。
复筛：将初筛得到的正变菌株，接入100ml/250ml的三角瓶发酵培养基中培养36-60h，测定豆粕水解液的水解度，复筛，得较稳定的正变菌株，在分离培养基里培养后，测定分离培养基里的透明圈直径与菌落直径的比值，筛选出比值大的菌株，经种子培养基菌培养，接种于发酵培养基内，一定发酵周期(36-60h)后测定发酵液水解度，得较稳定的正变菌株，分成两组2次复筛，一组进行紫外线处理，一组进行亚硝基胍处理，得性能良好且稳定的菌株，再将此菌株同时进行紫外线与亚硝基胍诱变，得稳定性优良的高产菌株，将高产菌株接种到激活培养基上作为第1代，以后每隔5天传代1次，共传10代，将每一代摇瓶发酵(250ml三角瓶装液100ml)，测定发酵液的水解度，选定稳定性好、高产性好、不发生突变回复的菌株为保留菌株，即高活力发酵菌株。
按上述方法制备的高活力发酵菌株遗传性能稳定，比母本菌株水解度提高5-8％，水解力提高35-45％，缩短发酵周期10-12小时，生产成本降低15-25％。
作为上述诱变方法的优化方法，紫外线作用强度，化学诱变剂的选择和作用浓度，根据应用不同的发酵菌种予以调整。
上述发酵菌诱变培育法也可替换为原生质体融合法或基因工程法，也可用诱变法、原生质体融合法、基因工程法三种方法的任意组合培育应用。
本发明采用微生物法发酵产肽，与目前以化学法和酶解法产肽技术相比，易于工业化生产，节省能源和用水，减少环境污染，降低成本。其中每一种中间产品都能形成产业化生产和直接利用或食用。特别是采用紫外线和亚硝基胍复合诱变等技术培育高活力微生物发酵产肽，提高了蛋白质的水解率，增加肽产量，所得多肽可用超滤膜超滤纯化，精制得高纯度的小肽，再用牛磺酸混合，所得到肽、钒、牛磺酸复合物，为高纯度、高质量、高功效、质量可控、吸收完全、生物效价高的营养制剂，可同时产生钒、肽、牛磺酸的综合营养补充和营养治疗作用，也可用于开发药物。
(五)具体实施方式
以下对本发明所提供的生产工艺作进一步叙述：
一、原材料选用海参、海参内脏器官、海鞘、海鞘内脏器官、牛磺酸。
二、诱变法培养高活力发酵菌种。
1.菌种选择
发酵微生物菌种为芽胞杆菌CAU208；也可以是华根霉菌、雅致放射毛霉菌、红曲霉菌、黑曲霉菌、，雅致放射毛霉菌、枯草杆菌、纳豆菌、放线菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、宇佐美曲霉菌、肉桂色曲霉菌、米曲霉菌、双歧杆菌、乳酸杆菌。
2.培养基配制
分别配制激活培养基、种子培养基、分离培养基、发酵培养基等四种培养基在不同的生产环节使用。
①激活培养基：用于激活被培养微生物，其用料和配比为，蛋白胨0.25-0.75％，葡萄糖0.25-0.75％，酵母膏0.25-0.75％，磷酸二氢钾0.25-0.75％，琼脂1-1.5％，大豆肽1-6％，加水至1000ml。
②种子培养基：用于驯化被培养微生物，其用料和配比为，蛋白胨0.25-0.75％，葡萄糖0.25-0.75％，酵母膏0.25-0.75％，磷酸二氢钾0.25-0.75％，豆粕粉0.1-0.2％，大豆肽1-6％，加水至1000ml。
③分离培养基：用于从被培养微生物中分离有应用价值的菌株，其用料和配比为，蛋白胨0.25-0.75％，葡萄糖0.25-0.75％，酵母膏0.25-0.75％，磷酸二氢钾0.25-0.75％，脱脂奶粉0.3-1.0％，大豆肽1-6％，加水至1000ml。
④发酵培养基：用于测定有应用价值菌株的发酵活力，其用料和配比为，豆粕粉10％，糖蜜0.77％，大豆肽1-6％，加水至1000ml。
3.诱变方法
可以使用紫外线诱变法，也可以使用亚硝基胍诱变法，而优选紫外线与亚硝基胍复合诱变法。
(1)紫外线诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36h，调节单细胞菌悬液活菌数至106-108个/ml，液层厚度0.2-0.4cm，紫外线灯功率15W，距离30cm；或紫外线灯功率30W，距离20cm，照射时间为2-4min。
(2)亚硝基胍诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养36h，调节菌悬液活菌数为105-108个/ml，亚硝基胍终质量浓度为0.8-1.2mg/ml，30℃水浴处理约30min。
(3)紫外线与亚硝基胍复合诱变：菌种经激活培养基和种子培养基培养约36h，调节菌悬液活菌数为107-109个/ml，亚硝基胍终质量浓度为0.8-1.2mg/ml，30℃水浴处理约30min，亚硝基胍处理后的液层厚度为0.2-0.4cm，进行紫外线诱变，紫外灯功率15W，距离30cm，照射时间2-4min；或紫外线灯功率30W，距离20cm，照射时间2-4min。
(4)筛选菌种
初筛：紫外线诱变后，初筛得到正变菌株；亚硝基胍诱变后，初筛得到正变菌株。
复筛：将初筛得到的正变菌株，接入100ml/250ml的三角瓶发酵培养基中培养36-60h，测定豆粕水解液的水解度，复筛，得到较稳定的正变菌株，置分离培养基里培养36-60h后，测定分离培养基里的透明圈直径与菌落直径的比值，筛选出比值大的菌株，经种子培养基菌培养后，接种于发酵培养基内，一定发酵周期后(36-60h)测定发酵液水解度，得较稳定的正变菌株，分成两组2次复筛，一组进行紫外线诱变，一组进行亚硝基胍诱变，得性能良好且稳定的菌株，再将此菌株同时进行紫外线与亚硝基胍诱变，得稳定性优良的高产菌株，将高产菌株接种到激活培养基上作为第1代，以后每隔5天传代1次，共传10代，将每一代摇瓶发酵(250ml三角瓶装液100ml)，测定发酵液的水解度，选定稳定性好、高产性好、不发生突变回复的菌株为保留菌株，即为高活力发酵菌株。
三、对原料的加工和配制步骤
步骤一原料处理
1.鲜海参，去除内脏，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
2.鲜海参内脏器官，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
3.干海参，去除内脏，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
4.干海参内脏器官，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
5.海参粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
6.海参内脏器官粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
7.鲜海鞘，去除内脏，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
8.鲜海鞘内脏器官，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
9.干海鞘，去除内脏，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
10.干海鞘内脏器官，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
11.海鞘粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
12.海参鞘内脏器官粉，浸泡，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干。
13.以上述1-12种原料中的两种或至少两种以上以任意比例组合的混合物。
14.牛磺酸，备用。
在进入步骤二之前，产生下列中间产品：
1.将1-13种原料中的一种或至少两种以任意比例组合的混合物蒸熟，干燥，粉碎，得粒径≤30微米的粉末，用1份该粉末与1份牛磺酸添加适量调味剂，混合均匀，得钒含量≥40mg/kg，牛磺酸含量≥500g/kg的混合粉，可制片、胶囊。
2.将上述混合粉1粉，加水4份，磨浆，均质，得钒含量≥40mg/L，牛磺酸含量≥100g/L的混悬液。
步骤二磨浆 均质
以步骤一1-13原料的其中一种1份，加3-15份水混合，磨浆，均质，得粒径≤30微米的浆液。
步骤三超滤 除盐
浆液用超滤膜、纳米滤膜超滤，除去大部分盐分，得低盐浆液。
步骤四灭菌 中间产品
将低盐浆液灭菌，浓缩到钒含量≥10mg/L时，冷却，得浓缩液。
在进入步骤五之前，产生下列中间产品：
1.将浓缩液添加牛磺酸、调味剂，得钒含量≥10mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的口服液。
2.将浓缩液干燥，与牛磺酸混合，得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制片、胶囊。
3.将浓缩液干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制颗粒。
步骤五发酵 灭菌 过滤
将浓缩液液温调整到15-45℃，保持恒温，按1-10％加入发酵促进剂大豆肽，搅拌均匀，接种菌种发酵8-32小时，停止发酵，灭菌，过滤，得总蛋白≥20％，蛋白中的多肽≥20％，钒含量≥20mg/L的发酵液。
步骤六浓缩 干燥 配制产品
1.将发酵液添加牛磺酸、调味剂，配制得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的口服液。
2.将发酵液浓缩，干燥，与牛磺酸混合，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制片、胶囊。
3.将发酵液浓缩，干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的粉末，可制颗粒。
4.将发酵液用纳米膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，添加牛磺酸、调味剂，配制得钒含量≥20mg/L、牛磺酸含量≥80g/L的精制口服液。
5.将发酵液纳米膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，浓缩，干燥，与牛磺酸混合，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的精制粉末，可制片、胶囊。
6.将发酵液纳米膜超滤，去除未水解蛋白和大分子肽，浓缩，干燥，与牛磺酸混合，添加调味剂，配制得钒含量≥40mg/kg、牛磺酸含量≥500g/kg的精制粉末，可制颗粒。
实施例1：
鲜海参，清洗，除去砂泥杂质，沥干；以1份海参加6分水混合，磨浆，得粒径≤30微米的浆液；经20-30kg压力的均质机高压均质；用膜孔径为1um、截留分子量≤1000纳米膜、0.3-0.5Mpa压力下进行超滤浓缩；当浓缩液浓缩至相当于原液量的40-50％时，停止浓缩，得1次浓缩液；将1次浓缩液加水至原液量，搅拌均匀，继续用膜孔径为1um、截留分子量为≤1000纳米膜、0.3-0.5Mpa压力下进行超滤浓缩，浓缩至钒元素≥20mg/L时，停止浓缩，得2次浓缩液，加牛磺酸、调味剂，得营养液。
实施例2：
将实施例1所得营养液，真空浓缩干燥，得钒元素≥80mg/kg，其中总蛋白≥10/％的营养粉。并用该营养粉进行胰岛素抵抗大鼠模型动物试验。
试验目的：服用营养粉对胰岛素抵抗大鼠模型血脂、血糖、胰岛素、胰岛素敏感性及血压的影响。
试验方法：实验分为四组，分别为对照组(普通饲料)、模型组(高脂饲料)、二甲双胍组(高脂饲料+二甲双胍)及加营养粉饲料组(高脂饲料+营养粉+牛磺酸，钒剂量为5mg/kg·d，牛磺酸剂量为3g/kg·d)。
试验结果：喂养四周后，模型组空腹血糖、胰岛素、血脂、血压均高于对照组，胰岛素敏感性(葡萄糖-胰岛素耐量实验)则下降(K值分别为5.16±1.12，8.67±0.98，P＜0.01)；加营养粉饲料组血糖、血脂、胰岛素均显著低于模型组，胰岛素敏感性(K值为6.24±1.07)，较模型组有显著改善(P＜0.01)，加营养粉饲料组的上述作用与二甲双胍相似；加营养粉饲料组血压不仅显著低于模型组，也显著低于二甲双胍组。
实施例3：
干海参1份干海参内脏器官1份，混合，浸泡，清洗，除去砂泥杂质，沥干；以1份原材料加5-8分水混合，磨浆，得粒径≤10微米的浆液；经20-30kg压力的均质机高压均质；用膜孔径为1um、截留分子量为1000超滤膜、0.3-0.5Mpa压力下进行超滤浓缩；当浓缩液浓缩至相当于原液量的40-50％时，停止浓缩，得1次浓缩液；将1次浓缩液加水至原液量，搅拌均匀，继续用膜孔径为1um、截留分子量为1000超滤膜、0.3-0.5Mpa压力下进行超滤浓缩，浓缩至相当于原液量的40-50％时，停止浓缩，得2次浓缩液；120-140℃高温快速灭菌，冷却至35-39℃；按3-8％接种量接种经由诱变选育的高活力芽胞杆菌CAU208，35-39℃发酵12-24小时，停止发酵，灭菌，过滤，真空浓缩至钒元素≥80mg/L时，停止浓缩，每升加牛磺酸100g和适量调味剂，搅拌，溶解，过滤，得钒元素含量≥80mg/L，牛磺酸含量≥100g/L，其中总蛋白35％，蛋白成分中的肽含量≥15％的营养液。
将上述营养液分子分装成10ml/瓶，每瓶钒元素含量≥80ug，牛磺酸含量≥1.2g，其中总蛋白≥3.5ml，蛋白成分中的肽≥1.5ml，用于糖尿病人营养治疗。选择2型糖尿病人60例，临床观察为8周。在临床试验中，要求糖尿病患者每日3次服用，每次1瓶，相当于每日补充元素钒240ug，牛磺酸3.6g，主食、副食按照正常饮食习惯不改变。患者所服用的药物或用的胰岛素等也不作任何改变，观察糖尿病患者在服用营养液后血糖、血脂等控制的情况。表1是8周临床观察结果：
                         表1  临床观察结果(均值)
  例数  试验前  1周  2周  3周  4周  5周  7周  8周  血糖  空腹  60  10.86  9.35  9.12  8.76  8.12  7.53  7.12  6.62  餐后  60  16.46  11.35  10.66  10.07  9.13  8.76  8.36  8.20  血脂  TC  60  5.95  5.02  TG  60  2.57  1.76  HDL  60  1. 46  1.83  LDL  60  3.37  2.82  HbA1c  60  8.12  7.53
临床观察结果表明，糖尿病患者的空腹血糖和餐后2小时血糖都均显示，服用营养液后比试验前降低，降低趋势比较明显，而且是在8周内都保持平稳。糖尿病患者的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)比试验前降低，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)比试验前升高，糖化血红蛋白(HbA1c)比试验前降低。。
在临床治疗中，脂代谢紊乱的治疗难于血糖控制的治疗。能对改善脂代谢紊乱有明显改善，说明营养液具有肯定的预防控制糖尿病大小血管并发症作用。
糖化血红蛋白(HbA1c)比试验前降低，尽管降低的幅度不大，但要知道，这只是而时间仅8周的营养治疗。英国的实验研究(UKPDS)是全世界里程碑式研究，对接受试验的糖尿病人进行20年的药物治疗，糖化血红蛋白才降低1％，但糖尿病相关死亡降低21％，心肌梗死降低14％。糖尿病人的HbA1c每升高1个百分点，微血管或小血管并发症的危险性升高(37％)，任一糖尿病相关事件的终点上升21％，糖尿病所致的死亡率增加21％。服用营养液不但能抑制糖化血红蛋白(HbA1c)不升高，而且能使糖化血红蛋白(HbA1c)有所降低，说明对糖尿病及其并发症具有良好的营养治疗价值。
实施例4：
将实施例3所得营养液喷雾干燥，得钒元素含量≥40mg/kg，牛磺酸含量≥500mg/kg，其中总蛋白35％，蛋白组分中的肽≥15％的营养粉。
实施例5：
海鞘粉，泡发，用水清洗，除去砂泥杂质，沥干；以1份海鞘内脏粉加8-15份水混合，磨浆，得粒径≤10微米的浆液；用盐酸溶液和氢氧化钾溶液保持pH为6.5-7.5，保持液温43-46℃，加入酶活力为105单位的枯草杆菌中性蛋白酶，使水解液的浓度为4-6U/ml，水解时间为2.5-3.5小时，得1次水解液；将1次水解液用盐酸溶液和氢氧化钾溶液调pH为2.5-3.5，保持液温43-46℃，加入酶活力为3000单位的胃蛋白酶，浓度为7-9U/ml，水解时间为3-4小时，停止水解，100-105℃灭酶20-30s，过滤，除去杂质，真空浓缩至相当于原液量的20-30％，得水解液2；将水解液2用膜孔径为1um、截留分子量为1000超滤膜、0.3-0.5Mpa压力下进行超滤浓缩；当浓缩液浓缩至钒元素≥20mg/L时，停止浓缩，每升加入牛磺酸500g适量加调味剂，得钒元素≥20mg/L、牛磺酸≥100g/L、其中水解蛋白≥25％，蛋白成分中的肽≥15％的营养液。
实施例6：
将实施例5所得营养液喷雾干燥，得含钒元素≥40mg/kg、牛磺酸≥500g/kg、其中水解蛋白≥25％，蛋白成分中的肽≥15％的营养粉。
将上述营养粉装胶囊，0.5g/粒，钒元素含量≥40ug/粒，牛磺酸含量≥500mg/粒，用于糖尿病人的营养补充治疗。
随机选择100例2型糖尿病人进行临床观察，其中，50例为治疗组，50为对照组。两组病例在性别、年龄、病程、空腹血糖、餐后2小时血糖、血脂、服用的药物的种类及用量、症状积分等方面无显著性差异(P＞0.05)。
试验方法：采用双盲对照法进行临床观察。治疗组口服营养粉胶囊，3粒/次，3次/日，相当于每日补充元素钒360ug，牛磺酸4.5g。对照组口服安慰剂，胶囊内容物为食用熟黄豆粉，3粒/次，3次/日。营养粉胶囊和安慰剂的包装、剂型、外观相同，2组病例在观察期间所服用的药物种类及剂量不变，并坚持原来的饮食控制方法。临床观察时间为30天。
试验结果见表2-表7：
                        表2  两组治疗效果对比

注：与对照组比较有非常显著差异，P＜0.01
               表3  两组观察前后血糖比较(mmol/L，X±S)

注：与观察前比较，P＜0.01，P＜0.05
                  表4  两组观察前后尿糖积分比较(X±S)

注：与观察前比较，，P＜0.01，P＜0.05
                  表5  两组观察前后症状积分比较(X±S)

注：与观察前比较，P＜0.01
              表6  两组观察前后血脂比较(mmol/L，X±S)

注：与观察前比较，P＜0.01，P＜0.05
            表7  两组观察前后安全性检查比较(mmol/L，X±S)

注：t检验，P均＞0.05
临床观察过程中，服用营养粉胶囊的治疗组与服用安慰剂的对照组，均未见明显不良反应。
临床观察显示，服用营养粉胶囊的治疗组的有效率与服用安慰剂的对照组相比有非常显著性差异(P＜0.01)；
服用营养粉胶囊的治疗组空腹血糖及餐后2小时血糖的改善较服用前有非常显著性差异(P＜0.01)，同时与服用安慰剂的对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；
服用营养粉胶囊的治疗组的血脂改善与服用安慰剂的对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；
服用营养粉胶囊的治疗组尿糖改善与服用安慰剂的对照组相比有非常显著性差异(P＜0.01)；
服用营养粉胶囊的治疗组症状改善与服用安慰剂的对照组相比有非常显著性差异(P＜0.01)；
经各种生化项目检测，服用营养粉胶囊的与服用安慰剂的对照组生化指标无明显差异(P＞0.05)，说明糖尿病人服用营养粉胶囊补充钒元素和牛磺酸安全有效，达到了良好的营养治疗目的。