黄曲霉H4在降解甲醛中的应用.pdf

本发明提供黄曲霉H4在降解甲醛中的应用。关于降解甲醛菌的研究很早以前就有报道，然而大部分是关于降解甲醛细菌和降解甲醛酵母菌的研究，却无降解甲醛霉菌的研究报道，本发明公开了已有菌株——黄曲霉H4在降解甲醛中的应用，同时提供了黄曲霉H4降解甲醛的应用中的一系列数据，如最适生长pH、碳源和甲醛降解能力等，极大地补充了降解甲醛菌的资料库，填补了国内甲醛降解菌研究资料的空白，此外，黄曲霉H4在自然界中分布范围广，繁殖迅速，生长能力强，本发明提供的黄曲霉H4在降解甲醛中的应用，为甲醛污染的生物处理工程，提供了强有力的帮助。

权利要求书
1、  黄曲霉H4在降解甲醛中的应用。

说明书黄曲霉H4在降解甲醛中的应用
技术领域
本发明涉及甲醛降解菌技术领域，具体涉及一种黄曲霉H4在降解甲醛中的应用。
背景技术
关于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究很早以前就有报道，早期人们着手于低浓度降解甲醛的研究，近年来高浓度降解甲醛时有报道。无论是低浓度还是高浓度，Adroer等(1990)分离的Pseudomonasputida A2能降解甲醛250mg·L-1；Azachil等(1995)分离了的Halomonas sp.MAC仅能耐受甲醛75-100mg·L-1；Doronina等(1997)分离的Pseudomonas.alcaligenes能降解甲醛200mg·L-1，菌株Pseudomonas putida J3能降解甲醛450mg·L-1，Methylobacteriumextorquens能降解甲醛500-1000mg·L-1；一株Pseudomonas alcaligenes培养3天后能降解甲醛2000mg·L-1。Mirdamadi等(2005)报道Methylobacterium extorquens(ESS和PSS)和四株Pseudomonaspseudoalcaligenes(LSW，SSW，NSW，OSS)能降解甲醛1850mg·L-1，其中菌株Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS培养24h3700mg·L-1甲醛被100％消耗，培养72h消耗5920mg·L-1甲醛70％，Methylobacterium extorquens ESS和Methylobacterium extorquens PSS还能完全降解甲醛2960mg·L-1。Bonastre等(1986)报道在C甲醛为2300mg·dm-3的活性污泥做基质的实验里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧条件下被好氧菌降解；当以甲醛为碳源时降解甲醛400mg·dm-3，在活性污泥厂的废水处理中完全降解甲醛2300mg·dm-3和苯酚2400mg·dm-3(Zagornaya et al，1990)。Yamazaki等(2001)从海水里分离了一株甲醛耐受细菌，发现它在3％的氯化钠里能降解甲醛400mg·dm-3，在Eiroa等(2004)设计的模型里，指出硝化作用可以降解甲醛，当以甲醛为碳源、甲醇为伴生碳源时，硝化细菌可以降解甲醛的浓度是30-3890mg·dm-3，而反硝化细菌在有甲醛和甲醇存在时可以降解1360mg·dm-3甲醛(Eiroa et al，2006)。然而大部分是降解甲醛细菌和降解甲醛酵母菌的研究，霉菌的研究报道很少，Kondo等(2002)从土壤中分离了一株甲醛耐受真菌Aspergillus nomius IRI013，它能生长在最高w(甲醛)＝0.45％里并把它完全消耗掉。
有关黄曲霉H4的报道，最早出自Nikkuni，S.，Kosaka，N.，Suzuki，C.and Mori，K.Comparative sequence analysis on the 18S rRNA gene of Aspergillus Oryzae，A.Sojae，A.Flavus，A.Parasiticus，A.Niger，A.Awamori and A.Tamarii.J.Gen.Appl.Microbiol.42，181-187(1996)。但是有关黄曲霉H4能降解甲醛的研究并未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄曲霉H4在降解甲醛中的应用，其可有效、快速地降解甲醛。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
一、甲醛降解菌—黄曲霉H4的分离与鉴定
1、培养基配方
基本培养基配方为：1.0％(w·v-1)葡萄糖，0.2％(w·v-1)NaNO3，0.1％(w·v-1)K2HPO4，0.05％(w·v-1)MgSO4·7H2O，0.05％(w·v-1)KCl，0.001％(w·v-1)FeSO4·7H2O，0.01％(w·v-1)酵母膏，0.1％(w·v-1)甲醛(甲醛用市售甲醛标准溶液)，培养基最终pH为6.0。(如没有特别说明，以下基本培养基均为此配方培养基)
察氏培养基配方：3.0％(w·v-1)蔗糖，0.3％(w·v-1)NaNO3，0.1％(w·v-1)K2HPO4，0.05％(w·v-1)MgSO4·7H2O，0.05％(w·v-1)KCl，0.001％(w·v-1)FeSO4·7H2O，1.5-2.0％(w·v-1)琼脂。
麦芽汁培养基配方：2.0％(w·v-1)麦芽浸膏，0.1％(w·v-1)蛋白胨，2.0％(w·v-1)葡萄糖，1.5-2.0％(w·v-1)琼脂。
PDA培养基配方：20％(w·v-1)土豆(去皮)，2.0％(w·v-1)葡萄糖，1.5-2.0％(w·v-1)琼脂。(土豆切碎，加水煮沸30min，用双层纱布过滤，取其滤液。)
2、分离纯化与结果分析
样品采自未经过处理的家具厂出水口的淤泥，其甲醛气味浓烈，甲醛污染严重，从而保证了甲醛降解目的菌的存在。
将上述样品接种于基本培养基里，摇床上160r·min-130℃培养5d，生长起来的霉菌再多次用PDA培养基平板画线，经多次纯化，分离到一株霉菌，编号H4。然后将菌株H4分别接种于察氏培养基、麦芽汁培养基、PDA培养基上，25℃培养8d，观察其菌落特征。同时，显微镜下观察显微结构，并记录好结构特征，结合提取DNA，检测DNA浓度和纯度，PCR 18S rDNA扩增等一系列的分子鉴定手段得出结论：本发明分离纯化得到的降解甲醛菌的18SrDNA序列与已报道的黄曲霉H4(Aspergillus flavus)同源率达99.8％，其培养特征及显微特征也与黄曲霉H4(Aspergillus flavus)最相似。
有关黄曲霉H4的资料出自：Nikkuni，S.，Kosaka，N.，Suzuki，C.andMori，K.Comparative sequence analysis on the 18S rRNA gene ofAspergillus Oryzae，A.Sojae，A.Flavus，A.Parasiticus，A.Niger，A.Awamori and A.Tamarii.J.Gen.Appl.Microbiol.42，181-187(1996)。
由此可见，本发明筛选到的降解甲醛菌是黄曲霉H4，18SrDNA序列长度为1661bp，上传GenBank申请号码为bankit890511。
二、黄曲霉H4的最佳生长pH值
霉菌一般喜好生长在偏酸的环境里，但其嗜酸性的程度差别很大，因此了解其最佳生长的pH，有利于对其进行快速培养和应用。
1、一级种子的制取
选取产孢良好的黄曲霉H4，接种在基本培养基中，摇床160r·min-1，30℃培养2～3d，当霉菌进入快速生长期时，定时测定OD475值，当OD475值快速上升时，此菌液即可作为一级种子
2、样品制备
选取大口150mL三角瓶，配制pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0的液体基本培养基，瓶口用无菌封口培养膜封口(无菌封口培养膜是环凯公司生产的双层膜，上有直径0.6cm的圆孔两个，中间有直径3cm的、孔径小于0.2μ的无菌滤纸片，多用于组培生产)，培养一级种子(OD475值为0.212)，除空白外接入一级种子5mL，置摇床上30℃160r·min-1培养，在接种的第0，24，48，72，96，120，144h取样，每次取2瓶测量菌丝干重，OD值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。
3、结果分析
黄曲霉H4在5种不同pH培养基中培养144h，菌丝干重分别从0.0035、0.0033、0.0034、0.0035、0.0034mg·L-1上升到0.0832、0.0955、0.1010、0.1120、0.1020mg·L-1，菌丝干重最大的是pH5.5。所以黄曲霉H4的最适生长pH为5.5。
三、黄曲霉H4对甲醛的降解能力
选取大口150mL三角瓶，配制基本培养基，C(甲醛)按约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％(w·v-1)加入，pH分别选取已经测得的最适pH(pH5.5)，瓶口用无菌封口培养膜封口，培养一级种子(OD475值为0.178)，除空白外每瓶接入5mL，置摇床上30℃160r·min-1培养，并在接种的第0，24，48，72，96，120，144h取样，每次取3瓶，其中一瓶为空白，取样后先7000×离心15min、过滤，滤液用AHMT分光光度法检测C(甲醛)，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重，菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。
C(甲醛)的检测用AHMT分光光度法，结果以实际测量数据为准，并取其平均值作图。
黄曲霉H4接种后144h，处理0.1％C(甲醛)从1241mg·L-1下降到4.0mg·L-1，降解率为99.7％，实验空白在1247-1318mg·L-1，挥发损失很少，96h内，C(甲醛)下降迅速，菌丝增长缓慢，96h后，菌丝干重增长迅速，但C (甲醛)下降缓慢；处理0.15％C(甲醛)从1465mg·L-1下降到28mg·L-1，降解率为98.1％，实验空白在1516-1598mg·L-1，挥发损失很少，120h内，C(甲醛)下降迅速，菌丝增长缓慢，120h后，菌丝干重增长迅速，但C(甲醛)下降缓慢；处理0.20％C(甲醛)从2333mg·L-1下降到628mg·L-1，降解率为73.1％，实验空白在2494-2581mg·L-1，挥发损失可忽略，24h内，C(甲醛)下降缓慢，24h后，C(甲醛)下降迅速，菌丝干重增长缓慢；处理0.25％C(甲醛)从2922mg·L-1下降到949mg·L-1，降解率为67.5％，实验空白在3199-3242mg·L-1，挥发很少，48h内，C(甲醛)下降缓慢，48h后，C(甲醛)下降迅速，菌丝干重增长缓慢。在4个不同浓度的处理中，菌丝干重分别从0.0032、0.0033、0.0031、0.0031g·L-1上升为0.1110、0.0844、0.0183、0.0157g·L-1。
黄曲霉H4的降解曲线总的规律是由慢到快，再由快到慢，降解曲线有两个阈值。在高浓度甲醛里曲线从缓慢下降转入到快速下降，这个阈值大约是2300mg·L-1左右；在低浓度甲醛里曲线从快速下降解转入到缓慢下降，这个阈值大约是50mg·L-1左右。
黄曲霉H4的降解过程都有两个拐点，一个是当甲醛浓度为50mg·L-1时，黄曲霉H4从快速降解甲醛转为缓慢降解甲醛；另一个是当甲醛浓度为2800mg·L-1时，黄曲霉H4从缓慢降解甲醛转为快速降解甲醛。
当甲醛与一级种子几乎同时加入分离基本培养基时，0h时取样加有甲醛和5mL一级种子的C(甲醛)都比只加甲醛不加菌的空白要低4％～10％左右，这就说明有少量的甲醛刚和菌丝体接触就被黄曲霉H4吸收或吸附。
四、黄曲霉H4的碳源代谢及最佳碳源
选取4种常用碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉，按培养基体积的10％添加(w·v-1)，设置5种不同处理的碳源，分别为：0.1％甲醛、0.1％甲醛+10％蔗糖、0.1％甲醛+10％麦芽糖、0.1％甲醛+10％淀粉、0.1％甲醛+10％葡萄糖，其余成分同基本培养基，pH值为5.5，选用大口150mL三角瓶分装，瓶口用无菌封口培养膜封口，接入一级种子5mL(OD475值为0.187)，置摇床上30℃160r·min-1培养，并在接种的第0，24，48，72，96，120，144h取样，每次取2瓶，测C(甲醛)和菌丝干重值，H4培养基里有葡萄糖的处理，加测C(葡萄糖)，并带只加葡萄糖不加菌的培养基空白。OD值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，取样后7000×离心15min、过滤，滤液用来测量C(甲醛)和C(葡萄糖)，C(甲醛)用AHMT分光光度法检测，C(葡萄糖)用蒽酮比色法检测，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重。结果以实际测量数据为准，并取其平均值作图。
黄曲霉H4在5种不同的碳源里都能有效的降解甲醛，菌丝干重分别从0.0038、0.0037、0.0039、0.0037、0.0038g·L-1上升到0.0038、0.1210、0.1110、0.1080、0.1250g·L-1，在处理0.1％甲醛+10％蔗糖、0.1％甲醛+10％麦芽糖、0.1％甲醛+10％淀粉、0.1％甲醛+10％葡萄糖中，C(甲醛)分别从1169、1189、1209、1231mg·L-1下降到4.20、7.80、8.20、2.80mg·L-1，降解率分别为99.6、99.3、99.3、99.8％，96h内，C(甲醛)下降迅速，菌丝增长较慢，96h后，菌丝干重增长较快，但C(甲醛)下降缓慢。
在只有甲醛作为碳源的处理中，培养144h时H4的C(甲醛)从1238mg·L-1降到458mg·L-1，降解率为63.0％，降解曲线24h后下降速度渐快，后期没有出现缓慢下降期，菌丝干重增长缓慢，没有出现快速增长期。所以黄曲霉H4能单独利用甲醛为碳源并降解甲醛，但降解效果不如加复合碳源，菌丝干重几乎增长很少。
葡萄糖的加入量为13383mg·L-1，C(葡萄糖)呈直线加速度下降，每隔24h消耗的量为1414、1672、1928、2090、2881mg·L-1，到144h C(葡萄糖)是683mg·L-1。只加葡萄糖没加菌的空白，C(葡萄糖)稳定，计算葡萄糖消耗量时可忽略此空白。
黄曲霉H4以0.1％甲醛和葡萄糖为碳源的的利用规律是：前期，C(甲醛)下降快，C(葡萄糖)下降比后期慢，此时甲醛还能抑制菌体的繁殖，黄曲霉H4先以甲醛和葡萄糖同时为碳源，并优先利用甲醛；当C(甲醛)减少到不足以抑制黄曲霉H4生长时，黄曲霉H4则主要以葡萄糖为碳源，C(甲醛)下降速度比前期慢。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明研究发现已有菌种黄曲霉H4具有降解甲醛的能力，同时提供了黄曲霉H4在降解甲醛的应用中的一系列数据，如最适生长pH、碳源和甲醛降解能力等，极大地补充了降解甲醛菌的资料库，并且填补了国内降解甲醛菌研究的空白；2.本发明提供黄曲霉H4在甲醛降解中的应用，为甲醛污染的生物处理工程，提供了强有力的帮助。
附图说明
图1为黄曲霉H4在察氏培养基(25℃，7d)上的菌落形态；
图2为黄曲霉H4在在麦芽汁培养基(25℃，7d)上的菌落形态；
图3为黄曲霉H4在PDA培养基(加有孟加拉红，25℃，7d)上的菌落形态；
图4为黄曲霉H4的球形分生孢子囊；
图5为黄曲霉H4在不同pH时的生长曲线；
图6为黄曲霉H4在不同C甲醛时的降解曲线；
图7为黄曲霉H4在不同C甲醛时的生长曲线；
图8为黄曲霉H4在不同碳源里的C(甲醛)的降解曲线；
图9为黄曲霉H4在不同复合碳源里的生长曲线；
图10为黄曲霉H4的C(葡萄糖)的下降曲线；
图11为黄曲霉H4C(甲醛)和C(葡萄糖)的下降曲线比较；
其中，1为甲醛，2为甲醛+蔗糖，3为甲醛+麦芽糖，4为甲醛+淀粉，5为甲醛+葡萄糖，6为葡萄糖，ck为空白对照。
通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
具体实施方式
实施例1  甲醛降解菌的分离与鉴定
1、培养基的配制
基本培养基配方：1.0％(w·v-1)葡萄糖，0.2％(w·v-1)NaNO3，0.1％(w·v-1)K2HPO4，0.05％(w·v-1)MgSO4·7H2O，0.05％(w·v-1)KCl，0.001％(w·v-1)FeSO4·7H2O，0.01％(w·v-1)酵母膏，0.1％(w·v-1)的甲醛(甲醛用市售甲醛标准溶液)，培养基最终pH为6.0。
察氏培养基配方：3.0％(w·v-1)蔗糖，0.3％(w·v-1)NaNO3，0.1％(w·v-1)K2HPO4，0.05％(w·v-1)MgSO4·7H2O，0.05％(w·v-1)KCl，0.001％(w·v-1)FeSO4·7H2O，1.5～2.0％(w·v-1)琼脂。
麦芽汁培养基配方：2.0％(w·v-1)麦芽浸膏，0.1％(w·v-1)蛋白胨，2.0％(w·v-1)葡萄糖，1.5～2.0％(w·v-1)琼脂。
PDA培养基配方：20％(w·v-1)土豆，2.0％(w·v-1)葡萄糖，1.5～2.0％(w·v-1)琼脂。(土豆去皮切碎，加水煮沸30，用双层纱布过滤，取其滤液。)
2、分离
样品采自未经过处理的家具厂出水口的淤泥，其甲醛气味浓烈，甲醛污染严重，从而保证了甲醛降解目的菌的存在。
在超净工作台上，取10g上述淤泥样置于90mL无菌水中，振荡15min，放置20秒，取1mL上清液接种于培养液里，在摇床上160r·min-130℃培养5d，生长起来的真菌再多次用PDA培养基平板画线，经过多次纯化，分离到一株霉菌，编号H4。
3、鉴定
(1)平板观察
选取察氏培养基、麦芽汁培养基、PDA培养基，将接种针经火焰灭菌并冷却后，蘸取极少量的孢子，点植于平板的中间位置，将平板置于25℃培养8d，观察菌落的特征并记录。
(2)显微观察
用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少许菌体，置载玻片的水滴中，于显微镜下观察其形态特征并记录。
(3)分子鉴定
DNA的提取参照CTAB法进行，DNA浓度和纯度的检测，采用核酸/蛋白分析仪于Nucleic Acid程序下测定。PCR采用真菌18S rDNA扩增通用引物(上游引物：GATCCTGCCAGTAGTCATATGC；下游引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，反应条件为94℃ 5min，30个循环(94℃ 1min、56℃ 1min、72℃ 1min)，72℃反应7min。用1.0％的琼脂糖凝胶电泳40min，于UVI凝胶成像系统分析结果。
扩增产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成，测序结果在Genbank数据库内进行同源序列搜索，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株。
4、结果与分析
经平板观察和显微观察，菌株H4在察氏培养基上，直径可达52mm，平薄，粗糙或稍呈颗粒状，最外缘为白色，内部为黄色，后期稍呈绿色，干燥无渗出液，表面无辐射状纹，反面蛋壳黄色，基质有不规则的辐射皱折沟纹(图1)；在麦芽汁培养基上菌丝生长旺盛，呈棉絮状，较厚，产孢后稍呈粗棉绒状，接种点附近下沉，呈圆形围湖沟，产孢后呈橄榄绿色，有同心环状，无渗出液，无辐射纹，反面淡黄色，有辐射皱折沟纹(图2)。在加了孟加拉红的PDA培养基上呈环状生长(图3)，菌丝绿色，反面无色，直接镜检孢子着生成葡萄状(图4)；镜检分生孢子囊初为球形，后呈辐射状，200-500μm，或裂成几个疏松的柱状体，分生孢子梗大多自基质伸出，壁厚，粗糙；顶囊近球形，直径23-50μm，大部分表面可育，产孢结构双层，也有单双层者；分生孢子球形，直径2.4-4.1mm，壁稍粗糙(图4)。
经分子鉴定，菌株的18SrDNA序列已报道的黄曲霉H4(Aspergillus flavus)同源率达99.8％，其培养特征及显微特征也与黄曲霉H4(Aspergillus flavus)最相似。
结合上述的平板观察、显微观察和分子鉴定结果，得出如下结论：本发明筛选到的降解甲醛菌H4是黄曲霉，18SrDNA序列长度为1661bp，上传GenBank申请号码为bankit890511。
实施例2  黄曲霉H4的最佳生长pH值
霉菌一般喜好生长在偏酸的环境里，但其嗜酸性的程度差别很大，因此了解其最佳生长的pH，有利于对其进行快速培养和应用。
1、一级种子的制取
选取产孢良好的黄曲霉H4，接种在基本培养基中，摇床160r·min-1，30℃培养2～3d，当霉菌进入快速生长期时，定时测定OD475值，当OD475值快速上升时，此菌液即可作为一级种子
2、样品制备
选取大口150mL三角瓶，配制pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0的液体基本培养基，瓶口用无菌封口培养膜封口(无菌封口培养膜是环凯公司生产的双层膜，上有直径0.6cm的圆孔两个，中间有直径3cm的、孔径小于0.2μ的无菌滤纸片，多用于组培生产)，培养一级种子(OD475值为0.212)，除空白外接入一级种子5mL，置摇床上30℃160r·min-1培养，在接种的第0，24，48，72，96，120，144h取样，每次取2瓶测量菌丝干重，OD值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。
3、菌丝干重的测量
烧杯在105℃烘1h至恒重，记录称量结果，将菌液用滤纸过滤后，连同滤纸一起转入已恒重的烧杯中，于80℃烘至恒重，每次带空白两个以上。
菌丝干重(g·L-1)＝[(烧杯+菌的重量+纸)-(烧杯+纸)]*1000/样品量。
菌丝干重取其平均值作图。
4、结果与分析
黄曲霉H4在5种不同pH培养基中培养144h(见图5)，菌丝干重分别从0.0035、0.0033、0.0034、0.0035、0.0034mg·L-1上升到0.0832、0.0955、0.1010、0.1120、0.1020mg·L-1，菌丝干重最大的是pH5.5。所以黄曲霉H4的最适生长pH为5.5。
实施例3  黄曲霉H4对甲醛的降解能力
1、样品制取
选取大口150mL三角瓶，配制基本培养基，C(甲醛)按约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％(w·v-1)加入，pH分别选取已经测得的最适pH(pH5.5)，瓶口用无菌封口培养膜封口，培养一级种子(OD475值为0.178)，除空白外每瓶接入5mL，置摇床上30℃160r·min-1培养，并在接种的第0，24，48，72，96，120，144h取样，每次取3瓶，其中一瓶为空白，取样后先7000×离心15min、过滤，滤液用AHMT分光光度法检测C(甲醛)，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重，菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。
C(甲醛)的检测用AHMT分光光度法，结果以实际测量数据为准，并取其平均值作图。
2、检测
C(甲醛)的检测用AHMT分光光度法，原理为甲醛与4-氨基-3联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂(简称AHMT)在碱性条件下缩合，然后经高碘酸钾氧化成6-巯基-5-三氮杂茂[4，3-b]-S-四氮杂苯紫红色化合物，其色泽深浅与甲醛含量成正比。
上述样品经7000×离心15min并过滤后，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重，取其平均值作图；滤液用AHMT分光光度法检测C(甲醛)，具体步骤如下：
取100ml容量瓶，吸取1.0ml稀释了100倍的上述滤液，加入5mol·L-1氢氧化钾溶液1.0ml，0.5％AHMT溶液1.0ml，盖上管塞，颠倒混匀三次，放置20min，加入1.5％高碘酸钾0.3ml，充分振摇，放置5min，定容至100ml。用1cm比色皿，波长550nm，随样品带空白，测量吸光值，甲醛标液购自百灵威化学技术有限公司。甲醛标线的操作步骤，跟样品的相同，制作标准曲线，得出标线方程，样品含量由标线方程换算得出。
3、结果与分析
如图6、7所示，黄曲霉H4接种后144h，处理0.1％C(甲醛)从1241mg·L-1下降到4.0mg·L-1，降解率为99.7％，实验空白在1247-1318mg·L-1，挥发损失很少，96h内，C(甲醛)下降迅速，菌丝增长缓慢，96h后，菌丝干重增长迅速，但C(甲醛)下降缓慢；处理0.15％C(甲醛)从1465mg·L-1下降到28mg·L-1，降解率为98.1％，实验空白在1516-1598mg·L-1，挥发损失很少，120h内，C(甲醛)下降迅速，菌丝增长缓慢，120h后，菌丝干重增长迅速，但C(甲醛)下降缓慢；处理0.20％C(甲醛)从2333mg·L-1下降到628mg·L-1，降解率为73.1％，实验空白在2494-2581mg·L-1，挥发损失可忽略，24h内，C(甲醛)下降缓慢，24h后，C(甲醛)下降迅速，菌丝干重增长缓慢；处理0.25％C(甲醛)从2922mg·L-1下降到949mg·L-1，降解率为67.5％，实验空白在3199-3242mg·L-1，挥发很少，48h内，C(甲醛)下降缓慢，48h后，C(甲醛)下降迅速，菌丝干重增长缓慢。
黄曲霉H4的降解曲线总的规律是由慢到快，再由快到慢，降解曲线有两个阈值。在高浓度甲醛里曲线从缓慢下降转入到快速下降，这个阈值大约是2300mg·L-1左右；在低浓度甲醛里曲线从快速下降解转入到缓慢下降，这个阈值大约是50mg·L-1左右。
实施例4  黄曲霉H4的碳源代谢及最佳碳源
选取4种常用碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉，按培养基体积的10％添加(w·v-1)，设置5种不同处理的碳源，分别为：0.1％甲醛、0.1％甲醛+10％蔗糖、0.1％甲醛+10％麦芽糖、0.1％甲醛+10％淀粉、0.1％甲醛+10％葡萄糖，其余成分同基本培养基，pH值为5.5，选用大口150mL三角瓶分装，瓶口用无菌封口培养膜封口，接入一级种子5mL(OD475值为0.187)，置摇床上30℃160r·min-1培养，并在接种的第0，24，48，72，96，120，144h取样，每次取2瓶，测C(甲醛)和菌丝干重值，H4培养基里有葡萄糖的处理，加测C(葡萄糖)，并带只加葡萄糖不加菌的培养基空白。OD值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，取样后7000×离心15min、过滤，滤液用来测量C(甲醛)和C(葡萄糖)，C(甲醛)用AHMT分光光度法检测，C(葡萄糖)用蒽酮比色法检测，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重。结果以实际测量数据为准，并取其平均值作图。
如图8、9所示，黄曲霉H4在5种不同的碳源里都能有效的降解甲醛，在处理0.1％甲醛+10％蔗糖、0.1％甲醛+10％麦芽糖、0.1％甲醛+10％淀粉、0.1％甲醛+10％葡萄糖中，C(甲醛)分别从1169、1189、1209、1231mg·L-1下降到4.20、7.80、8.20、2.80mg·L-1，降解率分别为99.6、99.3、99.3、99.8％，96h内，C(甲醛)下降迅速，菌丝增长较慢，96h后，菌丝干重增长较快，但C(甲醛)下降缓慢。
葡萄糖的加入量为13383mg·L-1，C(葡萄糖)呈直线加速度下降，每隔24h消耗的量为1414、1672、1928、2090、2881mg·L-1，到144h C(葡萄糖)是683mg·L-1(图10)。只加葡萄糖没加菌的空白，C(葡萄糖)稳定，计算葡萄糖消耗量时可忽略此空白。
黄曲霉H4以0.1％甲醛和葡萄糖为碳源的的利用规律是：如图11所示，前期，C(甲醛)下降快，C(葡萄糖)下降比后期慢，此时甲醛还能抑制菌体的繁殖，黄曲霉H4先以甲醛和葡萄糖同时为碳源，并优先利用甲醛；当C(甲醛)减少到不足以抑制黄曲霉H4生长时，黄曲霉H4则主要以葡萄糖为碳源，C(甲醛)下降速度比前期慢。
在只有甲醛作为碳源的处理中，培养144h时H1的C(甲醛)从1238mg·L-1降到458mg·L-1，降解率为63.0％，降解曲线24h后下降速度渐快，后期没有出现缓慢下降期，菌丝干重增长很缓慢，没有出现快速增长期。所以黄曲霉H4能单独利用甲醛为碳源并降解甲醛，但降解效果不如加复合碳源，菌丝干重几乎增长很少。