海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因及应用.pdf

本发明为一种海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因及应用。本发明的海鞘抗菌肽为海鞘抗菌肽Clavanin H，或其保守性变异多肽，或其活性衍生物，或经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的海鞘抗菌肽Clavanin H衍生的多肽。本发明的海鞘抗菌肽的前体肽具有序列表中SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。本发明的海鞘抗菌肽应用于制备抗病菌类产品，如饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。

权利要求书
1.  一种海鞘抗菌肽，为如下(a)或(b)或(c)或(d)所述的多肽：
(a)具有序列表中SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列；
(b)(a)所述氨基酸序列的保守性变异多肽；
(c)(a)所述氨基酸序列的活性衍生物；
(d)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的由(a)衍生的多肽。

2.  根据权利要求1所述的海鞘抗菌肽，其特征在于：为(a)所述多肽的C末端酰胺化修饰物。

3.  一种海鞘抗菌肽的前体肽，具有序列表中SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列；

4.  一种多核苷酸，为如下(a)或(b)所述的核苷酸序列：
(a)编码权利要求3所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

5.  根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：具有序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

6.  权利要求1或2所述的海鞘抗菌肽在制备抗病菌类产品上的应用，所述抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂和医药产品。

说明书海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因及应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种海鞘抗菌肽、其前体肽、编码基因以及海鞘抗菌肽的应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides)是一类具有抗菌活性的天然小分子蛋白。自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又在昆虫、两栖类、水产动物，以及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少900余种抗菌肽。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成，在机体抵抗病原入侵方面起着重要的作用，是机体非特异性免疫的重要组成部分。
抗菌肽的抗性谱十分广泛。大多数对细菌尤其对耐药性细菌有较强的杀灭作用，有些则对某些真菌、原生动物也有杀灭作用。近年研究还发现，某些抗菌肽还能选择杀伤肿瘤细胞，抑制HBV、HIV的复制，从而引起了人们更大的关注。抗菌肽的作用机理特殊，目前流行的观点是：首先，带正电荷的抗菌肽分子与带负电荷的靶细胞膜相接触，随后通过靶细胞膜所产生的电动势将形成疏水面的抗菌肽二聚体注入细胞膜，最后多个二聚体或多聚体在一起形成跨膜的离子通道，从而扰乱细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量严重下降，最终使靶细胞死亡。抗菌肽的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。这一特殊作用机理使微生物不易对其产生抗性。
海鞘是一种海洋无脊椎动物，属于脊索动物门，作为古老的原索动物又处于无脊椎动物和脊椎动物之间。海鞘类是研究脊椎动物先天性免疫进化的极好的材料，由于海鞘类缺乏在更高级的脊椎动物中存在的免疫球蛋白和T细胞受体而依赖于先天性免疫系统，因此它们的血细胞在宿主防御中有着重要的作用。近年来，从海鞘的血细胞中提取了许多的抗菌肽。
目前，人们已经从海鞘中发现了多种抗菌肽。根据海鞘抗菌肽一级结构的不同可分为三大类型。(1)线形螺旋结构的两性抗菌肽分子，包括Clavanins，styelins，clavaspirin；(2)含有DOPA残基的抗菌肽分子，包括plicatamide，haloxyamine；(3)含有二硫键的抗菌肽分子，包括halocidin和dycynthaurin等。
Lee等从柄海鞘(Styela clava)的血细胞中分离出一组由4个α-螺旋抗菌肽组成的家族Clavanins A，B，C，和D。此后又从柄海鞘咽组织构建的cDNA文库中筛选出一种新的Clavanins家族成员Clavanin E。通过研究表明Clavanins A-E是富含组氨酸，包含23个残基，C末端酰胺化的抗菌肽。
对Clavanins的抗菌活性研究发现它们和其他抗菌肽一样在非常低的浓度下表现出快速的杀菌效率。在5分钟的孵化后，1.6ug/ml的Clavanin A使E.coli ML-35P的数量减少了一半；同时发现ClavaninC/D的杀菌能力比Clavanin A/B大致要高3~5倍。之后研究表明它们对其他几种革兰氏阳性和阴性细菌均有显著的抗菌作用，并对几种真菌如C.albicans有抑制效果。在低pH(pH＝5.5)和高盐(300mmol/LNaCl)条件下对其中的几种微生物仍保持相当的活性。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种海鞘抗菌肽及其前体肽。
本发明的第二个目的在于提供本发明海鞘抗菌肽的编码基因。
本发明的第三个目的在于将本发明的海鞘抗菌肽应用于制备抗病菌类产品。
本发明所选择的海鞘属于中国南海食虫性柄海鞘(Styela clava)，采自中国南海西沙群岛。
本发明用构建cDNA文库的方法，从中国南海柄海鞘咽组织中克隆得到抗菌肽Clavanin家族成员。
中国南海海鞘咽组织cDNA文库的构建：首先分离海鞘咽组织，提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平板上挑取单克隆保种。
本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，得到8条EST序列编码中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin家族成员，申请人将之命名为海鞘抗菌肽Clavanin H，海鞘抗菌肽Clavanin H为成熟肽，由23个氨基酸组成，分子量为2.71千道尔顿，海鞘抗菌肽Clavanin H具有典型的抗菌肽一级结构的特征，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，具体如下：
Val Phe Arg Tyr Leu Gly Lys Ile Ile His His Val Gly Asn Phe
1               5                   10                  15
Val His Gly Phe Ser His Val Phe
            20
该成熟肽可以通过分离纯化得到，HPLC鉴定其纯度达到96.5％，MALDI-TOF鉴定其分子量正确。
本发明的海鞘抗菌肽，为如下(a)或(b)或(c)或(d)所述的多肽：
(a)具有序列表中SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列，即海鞘抗菌肽Clavanin H；
(b)(a)所述氨基酸序列的保守性变异多肽；
(c)(a)所述氨基酸序列的活性衍生物；
(d)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的由(a)衍生的多肽。
上述(c)所述海鞘抗菌肽，优选海鞘抗菌肽Clavanin H的C末端酰胺化修饰物。
本发明的海鞘抗菌肽可以是通过化学合成、基因重组表达获得的产物。
本发明的海鞘抗菌肽Clavanin H的前体肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，具体如下：
Met Lys Thr Thr Ile Leu Ile Leu Leu Ile Leu Gly Leu Gly Ile
1               5                   10                  15
Asn Ala Lys Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ser Glu Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Phe Arg Tyr Leu Gly Lys Ile Ile His His Val Gly Asn Phe Val
                35                  40                  45
His Gly Phe Ser His Val Phe Gly Asp Asp Gln Gln Asp Asn Gly
                50                  55                  60
Lys Phe Tyr Gly His Tyr Ala Glu Asp Asn Gly Lys His Trp Tyr
                65                  70                  75
Asp Thr Gly Asp Gln
                80
编码海鞘抗菌肽Clavanin H的前体肽的多核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，具体如下：
atgaaaacaa caattttgat tcttctcata ctgggacttg gcatcaatgc aaaatctctg 60
gaggaaagaa aatcggagga agagaaagta ttccgctacc ttggcaaaat tattcatcat 120
gttggcaatt ttgtacatgg ttttagccac gtgttcggcg acgaccaaca agataatgga 180
aagttttatg gccactacgc agaagacaat ggcaagcatt ggtatgatac cggggatcaa 240
taa                                                               243
本发明的多核苷酸，为如下(a)或(b)所述的核苷酸序列：
(a)编码海鞘抗菌肽Clavanin H的前体肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
本发明的多核苷酸，优选具有序列表中SEQ ID N0：1所述的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明获得的中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H具有生物活性，具有抗菌作用。分离纯化的Clavanin H在50nM时即能抑制部分致病细菌和真菌。因此，本发明的海鞘抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
附图说明
图1是中国南海海鞘咽组织cDNA文库的EST序列长度分布统计图。
图2是本发明的中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H的分子筛分离图谱；
图3为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H分子筛分离后阴离子交换分离图；
图4为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H阴离子分离后HPLC分离图；
图5为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H纯化后MALDI-TOF鉴定图。
图6为中国南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H抑制奶牛乳房炎致病菌生长实验的实验结果。
具体实施方式
实施例一：中国南海海鞘咽组织cDNA文库的构建及EST序列分析
总RNA的提取和cDNA合成：分离中国南海海鞘咽组织，参照GibcoBRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。文库构建采用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit试剂盒，并利用试剂盒本身附带的引物、载体、限制性内切酶等进行实验。取1μg海鞘咽组织总RNA以SMART III寡聚核苷酸片断(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。
海鞘咽组织cDNA文库的构建和鉴定：取cDNA 1.5μl用于连接反应，反应体系5μl，转化其中1μl，取5ul转化液分别涂板，取300ul转化液用于摇总库菌落。隔日记数平板的单菌落数分别为：805，695和1052个。因此双链cDNA7ul可获得的cDNA文库克隆数为：(805+695+1052)*1050*7*5/3*5*1.5＝4.170*106(个)。随机挑取46个单克隆，利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物PCR扩增，结果显示，重组率超过98％(45/46)，大部分的插入片段大于500bp(41/46)，平均插入片段长度为700bp。从平板上随机挑取六板单克隆摇菌、保种、提取质粒、T7引物单向测序，手工使用BLASTN和BLASTX在线同源比对，SEQTOOL、ClustalX 1.83程序分析测序结果。测序结果显示柄海鞘平均插入片段长度为544bp。
以上结果显示本申请人构建的海鞘咽组织cDNA文库在文库重组子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。从图1中可见在500-600bp，700-800bp和800-900bp处存在高丰度的EST序列，而本发明所克隆的南海柄海鞘抗菌基因Clavanin H的EST序列长度正位于500-600bp之间。
实施例二：海鞘抗菌基因Clavanin H序列的测定和分析
南海柄海鞘抗菌基因Clavanin H的序列来自实施例一中国南海海鞘咽组织cDNA文库中所克隆到的8条高度同源的EST序列，海鞘抗菌基因Clavanin H属于高表达基因，约占所有EST序列的4％，以5号板D12号克隆为例对其进行生物信息学分析，结果显示其cDNA序列长度为523bp。利用工具软件SEQTOOL对其碱基序列进行分析，并获得其最大开放读码框，长度240bp(不包含终止密码子)，编码80个氨基酸残基的前体肽，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所述，80个氨基酸残基的前体肽的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO：2所述。进一步分析显示，该前体肽的第1-29位氨基酸残基为其信号肽区域，其第29位残基为赖氨酸，可认为是标准蛋白质水解信号，将前体肽的前导肽和成熟肽部分分开，故确定Clavanin H成熟肽的氨基酸序列为VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVF，即序列表中SEQ IDNO：3所述的氨基酸序列。由于Clavanin H前体肽中信号肽区和成熟肽区与所有已经报道的抗菌肽Clavanin家族有明显的相似性，故海鞘抗菌肽Clavanin H为新的Clavanin家族成员。
实施例三：海鞘抗菌肽Clavanin H的分离纯化
取海鞘咽组织，剪碎后用50mmol/L Tris-Cl，pH8.6+100mmol/LNaCl萃取，用G25Fine(i.d2.6*100cm)分离，以萃取缓冲液洗脱，280nm检测，可见四个紫外吸收峰如图2所示；收集第2峰上QSepharose fast flow分离，NaCl梯度洗脱，获得5个洗脱峰如图3所示。收集第1峰上C18反相柱分离，乙腈梯度洗脱，收集保留时间为45.7min的峰如图4所示。分离纯化的海鞘抗菌Clavanin H，经飞行时间质谱分析，分子量为2.71千道尔顿如图5所示。这与根据所克隆的基因推测的表达序列VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVF的理论分子量2.71千道尔顿一致。
实施例四：海鞘抗菌肽基因Clavanin H的重组表达
本实验采用组氨酸缺陷型毕赤酵母GS115作为宿主菌，采用分泌性表达载体pPICZαA构建重组表达系统。选择SacI内切酶线性化重组载体pPICZαA，然后将带有相应酶切位点的抗菌肽Clavanin H基因通过T4DNA连接酶与线性化载体连接，再将其转化到大肠杆菌DH5α中，利用Zeocin抗性的低盐LB平板筛选阳性转化子。挑单菌落接种培养，抽提质粒进行酶切验证和测序。
制备毕赤酵母菌株GS115的感受态细胞。取80ml感受态细胞与10ug SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，进行电击转化。30℃温育1h后，将菌液涂在含有100ug/ml Zeocin抗生素的YPD固体培养基平板上。30℃恒温培养2~4天，筛选出阳性菌落。同时，将Sacl线性化的pPICZαA空白质粒转化酵母GS115菌株作为空白对照。
将鉴定得到的阳性重组酵母菌分别加入到10ml YPDA培养基中，在30℃恒温培养，进而利用甲醇作为诱导物，对重组目的蛋白Clavanin H进行诱导表达，并经超滤和阳离子交换层析纯化。
实施例五：海鞘抗菌肽Clavanin H的抑菌活性实验
海鞘抗菌肽Clavanin H抑制奶牛乳房炎致病菌实验。试验中选择乳室发炎肿大、皮肤发红、温热、乳汁排出不畅、稀薄带黄色并混有絮状物和凝乳块等表现明显奶牛乳房炎症状的奶牛乳汁。实验组为5ml上述奶牛乳汁与浓度为0.5mg/ml的海鞘抗菌肽Clavanin H等体积震荡混合30分钟，对照组为5ml上述奶牛乳汁与灭菌生理盐水等体积震荡混合30分钟。将上述混合溶液分别涂布到LB固体培养基上，观察奶牛乳房炎致病菌生长情况。从图6中可以看出，加入有抗菌肽的奶牛乳汁中，乳房炎致病菌没有生长(左侧平板)，而对照组(右侧平板)则有大量乳房炎致病菌生长。说明抗菌肽有杀灭乳房炎致病菌的作用。
本发明的海鞘抗菌肽Clavanin H能抑制部分致病细菌和真菌。因此，本发明的海鞘抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，如：饲料添加剂、兽药、防腐剂、抗菌药物等。
                          序列表