一株植物内生真菌及其应用.pdf

本发明公开了一株植物内生真菌及其应用。该植物内生真菌为直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192。该菌株及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性、能够产生具有抑制病原真菌的活性挥发性天然气体化合物，该菌株能够寄生香蕉根结线虫，其代谢产物能够毒杀香蕉根结线虫，该菌株可以在生物防治植物病虫害、臂形草生产以及作为真菌改良及育种材料方面得到广泛应用。

权利要求书
1、  直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192。

2、  直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192在防治植物病害中的应用。

3、  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物病害为芒果炭疽病菌和/或香蕉枯萎病菌和/或香蕉炭疽病菌和/或橡胶炭疽病菌和/或橡胶棒孢霉落叶病菌和/或木瓜棒孢霉病菌和/或竹子枯萎病菌和/或水稻稻瘟病菌和/或水稻胡麻斑病菌和/或甘蔗赤腐病菌和/或臂形草叶斑病菌引起的植物病害。

4、  直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192在防治根结线虫引起的线虫病害中的应用。

5、  根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述根结线虫病害为香蕉根结线虫病。

6、  直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192在生产抑菌性气体物质中的应用。

7、  以直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192为活性成分的生物菌剂。

说明书一株植物内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株植物内生真菌及其应用，特别涉及一株从珊状臂形草叶片中分离获得的植物内生真菌及其在抑制植物病原真菌、寄生线虫以及产生挥发性天然气体化合物中的应用。
背景技术
植物内生真菌是指整个生活周期或生活史的大部分阶段生活在植物体内的一些真菌，它们和宿主植物之间为互利共生关系。内生真菌由宿主植物为其提供生存空间和养分，其生物量较少，但是它对宿主植物的生存起着重要作用，能够促进宿主植物的生长，增强其抗病性、抗虫性、抗旱性以及生长竞争能力等。有些内生真菌能够和宿主根组织一起形成菌根，帮助宿主植物吸收水分和营养，促进植物的生长并提高宿主的抗旱性。有的内生真菌能够产生拮抗性物质或者诱导宿主植物产生系统抗性，帮助宿主植物抵抗病原物的侵染，增强了宿主的抗病抗虫性。有些内生真菌能够产生或促使宿主产生一些毒性碱类化合物、脂肪酸及酚萜类化合物、挥发性天然气体化合物、或者促使宿主的形态及生理发生变化，因而增强宿主植物的抗逆性。利用从锡兰肉桂小枝中分离获得的一种内生真菌Muscodor albus及其有关种类所产生的挥发性天然气体化合物，2002年，美国AgreQuest公司独家推出世界上第一种能够提高植物抗真菌病害能力的真菌熏蒸剂。
Lewis 1924年在禾本科植物叶片内首先发现存在着内生真菌，此后这方面的研究工作一直很少，直到最近20年内生真菌的研究才开始比较活跃。关于禾草类植物内生真菌，目前研究和利用最广泛的当属高羊茅和黑麦草等温带禾本科牧草内生真菌以及近年来国外研究较多的臂形草等热带禾本科牧草内生真菌，这些内生真菌主要属Acremonium、Netyphodium和等，对多种植物病原真菌具有生长抑制活性。它们具有较强的宿主专一性，只对宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用，可通过人工接种导入未感染宿主植物或近缘植物中并可通过宿主种子进行传播。
臂形草(Brachiaria sp.)又名旗草，为多年生热带禾本科牧草，原产非洲。它具有生长快、饲用价值高、耐干旱、耐贫瘠和盐碱等优点，现已成为热带和亚热带地区优良的放牧型和水土保持型牧草。我国曾从哥伦比亚国际热带农业中心(CIAT)引进栽培，正在推广种植，已育成的主要品种多达数十种，推广面积达近百万亩。国外有研究从臂形草叶片或叶鞘中分离出内生真菌，大部分属于Acremonium，如Acremonium implicatum，其中就有在体内体外对病原菌起抑杀作用的，如对臂形草叶斑病(Drechslera sp.)和叶枯病(Rhizoctonia solani)有防治作用的病原菌，但报道其抑菌谱不广。
目前关于内生真菌的研究多集中在分离、鉴定、人工接种及提高植物抗性等方面，而将其有目的地用于生物防治方面并不多，主要是由于大部分只对部分植物病原真菌具有抑制作用，对病原物的抑制谱较窄。有些拮抗性真菌能够产生对病原物有拮抗作用的挥发性天然气体化合物，因而扩大了它的拮抗作用应用范围。禾草类内生真菌在产挥发性天然气体化合物方面的研究在国内外还未见报道，其对真菌生长抑制剂重铬酸钾的耐性研究也很少，同时内生真菌对植物寄生线虫的寄生作用也少有涉猎。
植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，近年来已成为生防菌剂研制开发的热点，而利用拮抗性内生真菌进行生物防治是生态农业可持续发展的一个重要方面。筛选获得具有抑制病原菌活性的内生真菌是利用它进行植物病害防治的基础工作，具有广谱抗病虫害作用的内生菌在生物防治病虫害、促进农业可持续发展中具有极大的应用前景。如果内生菌能够产生具有广谱杀菌作用的挥发性活性天然气体物质，其应用前途将更为广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有广谱抑制病原真菌活性、具有寄生线虫以及能够产生挥发性天然气体化合物的植物内生真菌及其应用。
本发明所提供的植物内生真菌为直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5CGMCC No.2192。
所述直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5是从珊状臂形草叶片中分离获得的臂形草内生菌，已于2007年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.2192。
所述直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192的基本培养形态特征为：在PDA平板上，28℃培养9天后菌落直径为3.3cm。菌丝纤细，具分枝，刚性，成网状，无隔，无色或浅淡绿色，直或弯曲，不平整，直径为1.2～1.81μm；分生孢子梗不分枝或偶尔分支，直立单生或偶尔多生，无隔，顶端成头状，分生孢子头圆形或梭形，大小为1.64～4.1μm×1.75～4.9μm；梗基比梗顶端粗，粗×长：1.46～1.97μm×15.82～25.95μm；分生孢子无隔，单孢，短圆桶状、椭圆状、纺锤状，杆状或球状，大小为1.23～1.62μm×1.93～2.88μm。该菌株的rDNA-ITS序列如序列表中序列1所示，即18S，ITS1，5.8S，ITS2和28S区域部分序列，结果发现其与不同Acremonium属菌株的rDNA-ITS区序列相似性为89～94％。
以上述直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
本发明的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192是一株从珊状臂形草叶片中分离获得的具有广谱抑制病原真菌活性、具有寄生线虫以及能够产生挥发性天然气体化合物的内生真菌，可用作载体应用于臂形草生产以及作为真菌基因改良和育种材料。
实验证明，本发明的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192具有广谱体外抑制病原真菌活性的能力，对芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、橡胶棒孢霉落叶病菌、木瓜棒孢霉病菌、竹子枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、水稻胡麻斑病菌、甘蔗赤腐病菌、臂形草叶斑病菌具有很强的拮抗作用，其菌液和产生的挥发性气体均可以抑制这些病原菌的侵入和生长，可用于这些病原菌引起的植物病害的防治。
直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192具有寄生植物寄生线虫能力，其发酵菌液具有毒杀寄生线虫的作用，可以用于防治植物线虫病害。
本发明的珊状臂形草内生真菌菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5CGMCC No.2192具有产生挥发性天然气体化合物的能力，试验表明该挥发性气体对植物病原真菌具有很好的抑制作用，有利于规模化生产挥发性天然气体化合物，同样可以在防治植物病害方面发挥重要作用。
总之，该菌株可以在生物防治植物病害、臂形草生产以及作为真菌改良及育种材料方面得到广泛应用。
附图说明
图1为在不同培养基平板上HND5菌株的生长状态(附加两种典型平板特征)；图中，A为胡萝卜培养基，B为燕麦培养基，C为NA培养基，D为PDA培养基，E为玉米粉培养基，F为MM培养基，G为典型PDA平板特征I，H为典型PDA平板特征II，I为PDA平板背面特征I，J为PDA平板背面特征II，K为PDA平板背面特征III。
图2为HND5菌株显微形态；图2中A为产孢器形态I；图2中B为产孢器形态II；图2中C为产孢器形态III；图2中D为产孢器形态IV(箭头示)；图2中E为菌环形态I；图2中F为菌环形态II；图2中G为分生孢子形态；图2中H为分生孢子萌发形态I；图2中I为分生孢子萌发形态II；图2中J为分生孢子头扫描电子显微镜图I(单生分生孢子梗，放大3200倍)；图2中K为分生孢子头扫描电子显微镜图II(单生分生孢子梗三瓶梗梗基，放大2000倍)。
图3为在PDA平板上HND5菌株对植物病原真菌的抑制作用；图3中I为HND5与芒果炭疽病菌对峙培养；II为HND5与香蕉炭疽病菌对峙培养；III为HND5与香蕉枯萎病菌对峙培养；IV为HND5与竹子枯萎病菌对峙培养；V为HND5与木瓜棒孢病菌对峙培养；VI为HND5与水稻稻瘟菌对峙培养；VII为HND5与甘蔗赤腐病菌对峙培养；VIII为HND5与橡胶棒孢霉菌对峙培养；IX为HND5与橡胶炭疽菌对峙培养(二者同时接种)X为HND5与橡胶炭疽菌对峙培养(HND5预培养5天再接种病原菌)。
图4为HND5的生长曲线图。
图5为不同培养基培养对HND5的生物量积累的影响的柱形图。
图6为不同温度下HND5的生长速度曲线图。
图7为不同pH值对HND5菌落生长速度影响的柱形图。
图8为不同碳氮源对HND5菌落生长速度的影响的柱形图。
图9为HND5菌株在PDA平板上产生挥发性抑菌活性气体物质抑制病原真菌；图9中A-H中左图分别为受到HND5产生活性挥发性气体物质抑制影响的芒果炭疽病菌(图9中A)、香蕉枯萎病菌(图9中B)、甘蔗赤腐病菌(图9中C)、木瓜棒孢霉病菌(图9中D)、水稻稻瘟菌(图9中E)、橡胶炭疽菌(图9中F)、香蕉炭疽菌(图9中G)和橡胶多主棒孢霉菌(图9中H)菌落生长状况。
图10为HND5菌株寄生香蕉根结线虫图片。
图11为HND5菌株防治香蕉根结线虫的盆栽试验结果照片。图11中A为HND5发酵液(稀释100倍)处理植株；图11中B为5％丁硫克百威(稀释1000倍)处理植株；图11中C为无菌水对照植株。
图12为HND5菌株防治香蕉根结线虫盆栽试验的香蕉根结照片。图12中A为HND5发酵液(稀释100倍)处理6周后的根结情况；图12中B为5％丁硫克百威(稀释1000倍)处理6周后的根结情况；图12中C为对照无菌去离子水处理6周后的根结情况。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、臂形草内生真菌菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCCNo.2192的筛选及其鉴定
1、臂形草内生真菌菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCCNo.2192的筛选
本发明的珊状臂形草内生真菌菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5CGMCC No.2192是利用组织块分离法，采用严格表面消毒程序从珊状臂形草健康的叶片中分离出来。具体方法为：取新鲜完好的健康的珊状臂形草叶片表面消毒后用无菌水清洗4次，再用无菌滤纸吸干叶片上多余水份。用无菌剪刀将叶片剪碎，将其接种到PDA平板(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20，琼脂20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)上，取第4次清洗的无菌水涂布平板以检测表面消毒效果，28℃暗培养2个月，其间定期检查。最后共分离获得了11个真菌菌株，分别按照实施例2所述的方法对芒果炭疽病菌，香蕉枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，橡胶炭疽病菌，橡胶棒孢霉落叶病菌，木瓜棒孢霉病菌，竹子枯萎病菌，水稻稻瘟病菌，水稻胡麻斑病菌，甘蔗赤腐病菌以及臂形草叶斑病菌进行拮抗活性试验，结果表明筛选得到一株具有对多种病原菌具有拮抗作用的臂形草内生真菌菌株，将其命名为HND5。
2、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192的鉴定
将HND5在不同培养基上培养，分别在试验培养基平板中央或相距4cm的两端接种直径为4mm大小的菌块，于28℃黑暗或光照条件培养，观察。该HND5菌株在各种培养基上培养的菌落图片如图1所示。结果表明，HND5菌落的典型形态特征为：在PDA平板上，菌落典型特征为白色棉质状，肉质(见图1中D，PDA培养基，28℃黑暗培养9天)，随着时间的增加或受光照的影响变为粉红色或橘红色(见图1中G(PDA平板28℃黑暗培养1周后的HND5菌落特征，典型PDA平板特征I)和图1中H(PDA平板28℃光照培养1周后的HND5菌落特征，典型PDA平板特征II))，背面为淡黄色、白色、橙黄、红色或淡褐色(图1中I、J、K，即28℃黑暗培养1周后，PDA平板背面三种特征I、II和III)。在玉米粉培养基(成分：玉米粉30g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)上，菌落生长比在PDA平板上快，且气生菌丝旺盛(见图1中E(玉米粉培养基，28℃黑暗培养3周))。在PDA平板上，菌落平整或凹凸不平整，中央隆起或表面产生许多小菌丝束突起(见图1中G，典型PDA平板特征I)，边缘较规则或不规则，菌落表面向培养基平板内凹陷，使平板背面产生明显且较规则的褶皱纹(见图1中的J、K(PDA平板背面特征II和III))。菌落质地紧密，湿润，后期表面能够分泌无色或黄色粘性液珠(见图1中I、J(典型PDA平板特征I和II))。在胡萝卜培养基(配方：胡萝卜200g，葡萄糖20g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)(培养3周，图1中A)、燕麦培养基(配方：燕麦片30g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)(培养3周，图1中B)和MM培养基(配方：KNO3 10g，KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 2.5g，FeCl3 0.02g，葡萄糖10g，琼脂20g，定容至1000mL，121℃，灭菌20min)(培养1周)上菌落白色，质地疏松(图1中F)。在NA培养基(配方：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂20g，定容至1000mL，121℃，灭菌20min)上菌落淡粉红色，菌落质地紧密，表面粉质(培养2周，图1中C)。图1中，A为胡萝卜培养基培养3周的HND5菌落，B为燕麦培养基培养3周的HND5菌落，C为NA培养基培养2周的HND5菌落，D为PDA培养基28℃黑暗培养9天的HND5菌落，E为玉米粉培养基，28℃黑暗培养3周的HND5菌落，F为MM培养基培养1周的HND5菌落，G为典型PDA平板特征I(PDA平板28℃黑暗培养1周)，H为典型PDA平板特征II(PDA平板28℃光照培养1周)，I为PDA平板背面特征I(PDA平板28℃黑暗培养1周)，J为PDA平板背面特征II(PDA平板28℃黑暗培养1周)，K为PDA平板背面特征III(PDA平板28℃黑暗培养1周)。
采用插片法对本发明的珊状臂形草内生真菌菌株HND5 CGMCC No.2192进行光学显微形态观察鉴定。同时也利用扫描电子显微镜SEM(型号为S-3000N，日本Hitachi公司生产)对其进行显微观察。该菌株在PDA平板上培养容易产孢，光学显微形态观察中，在PDA平板中央接种HND5菌块，相距2cm处与琼脂平板成45度斜插入盖玻片。28℃培养1个月，定期取出盖玻片，显微镜下观察具有基内菌丝和气生菌丝，菌丝纤细，具分枝，刚性，成网状，无隔，无色或浅淡绿色，直或弯曲，光滑或不平整，粗度为1.2～1.81μm，且菌丝上可形成菌环结构；分生孢子梗不分枝或偶尔分支，直立单生或偶尔多生，无隔，顶端成头状，分生孢子头为圆形或梭形，大小为1.64～4.1μm×1.75～4.9μm(见图2中J(单分生孢子梗)和K(单分生孢子梗三瓶梗梗基三分生孢子头))；梗基比梗顶端粗，粗×长：1.46～1.97μm×15.82～25.95μm；分生孢子(图2中G)无隔，单孢，短圆桶状、椭圆状、纺锤状，杆状或球状，大小为1.23～1.62μm×1.93～2.88μm。该HND5产生的分生孢子在质量百分含量为1.6％水琼脂上，28℃培养30小时后即行萌发，可以形成两种萌发形态，一种可形成较长萌发管(图2中I)，一种在孢子一端出现酵母芽殖样萌发，顶端有小细胞，小细胞与母孢子由一短或长细管连接(图2中H)。该菌株在PDA上培养时能形成菌环结构(图2中E、F)。HND5在含1000μg/mL重铬酸钾的PDA平板上生长9天后菌落直径可达1.3cm。该菌株的具体显微照片结果如图2所示，图2中A为产孢器形态I，是HND5在繁殖菌丝上稀疏出现的分生孢子产孢器(菌龄为2周，箭头示)；图2中B为产孢器形态II(箭头示)，是HND5在繁殖菌丝上出现的大量紧密排列的分生孢子产孢器(菌龄为2周)；图2中C为产孢器形态III(箭头示)，是HND5后期的分生孢子产孢器形态(菌龄为3周)；图2中D为产孢器形态IV(箭头示)是指单分生孢子梗双瓶梗梗基双分生孢子头(菌龄为2周)；图2中E为菌环形态I，是多个菌环结构状态照片(箭头示)；图2中F为菌环形态II，是单个菌环结构状态照片(箭头示)；图2中G为分生孢子；图2中H为分生孢子萌发形态I(箭头示)；图2中I为分生孢子萌发形态II(箭头示)；图2中J为分生孢子头扫描电子显微镜图I(单生分生孢子梗，放大3200倍)；图2中K为分生孢子头扫描电子显微镜图II(单生分生孢子梗三瓶梗梗基，放大2000倍)。
根据上述形态特征，鉴定该菌株为直立枝顶孢(Acremonium strictum)。
进一步对该菌株的rDNA-ITS序列即18S，ITS1，5.8S，ITS2和28S区域部分序列进行扩增鉴定：提取菌株的基因组DNA作为模板，采用两条通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，获得大小约0.6Kb的扩增产物。扩增片段克隆后送由上海Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd进行测序，测序获得585个碱基的ITS序列，序列如序列表中序列1所示。
将该菌株的上述rDNA-ITS序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，结果显示，其序列与Acremonium strictum genogroup III strain UW940的rDNA-ITS区序列(GenBank accession No.DQ459004)同源性达到94％，与另外其它不同的Acremoniumstrictum菌株的rDNA-ITS区序列同源性为89～93％，与Acremonium implicatum的rDNA-ITS区序列(GenBank accession No.AF368810)同源性为89％，与Acremoniumkiliense的rDNA-ITS区序列(GenBank accession No.AJ853771)同源性为93％，与Nectria mauitiicola(GenBank accession No.AJ557830)和一种来自Dioscoreazingiberensis的内生真菌DF3(GenBank accession No.DQ459004)的rDNA-ITS区序列同源性也达到了94％。
通过上述表型特征和分子特征将其鉴定为Acremonium属真菌，即直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5，直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5，已于2007年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCCNo.2192。
实施例2、内生真菌菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCCNo.2192对病原真菌的拮抗活性鉴定
检测直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192对病原真菌的拮抗活性，包括对芒果炭疽病菌，香蕉枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，橡胶炭疽病菌，橡胶棒孢霉落叶病菌，木瓜棒孢霉病菌，竹子枯萎病菌，水稻稻瘟病菌，水稻胡麻斑病菌，甘蔗赤腐病菌以及臂形草叶斑病菌等的拮抗活性。
供试病原真菌有：芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.31219)，香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporium f.sp.cubense，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCCNo.31272)，香蕉炭疽病菌(Gloeosporium musarum，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.31247)，橡胶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.30012)，橡胶树棒孢霉落叶病菌(Corynespora cassicola，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.3.10072)，木瓜棒孢霉病菌(Corynespora sp.，购买自日本农林水产省农业生物学国家农业生物学研究所菌种保存中心，保藏编号MAFF No.239507)，竹子枯萎病菌(Fusarium oxysporium，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.31353)，水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.30320)，水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzaeShoem，购买自美国农业研究菌种保藏中心，保藏编号NRRL No.5232)，甘蔗赤腐病菌(Colletotrichum falcatum Went，购买于日本国家技术与评价研究所生物资源中心，保藏编号NBRC No.101620)以及臂形草叶斑病菌(Drechslera sp.，购买于美国典型菌种保藏中心，保藏编号ATCC No.38737)。
采用体外平板对峙法进行拮抗病原真菌活性评价，具体方法为：分别在PDA平板中央接种直径为4mm的上述供试病原真菌菌块(灭菌打孔器打取)，于距平板中央3cm的两点或三点处接种直径约4mm的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5CGMCC No.2192圆菌块(灭菌打孔器打取)，以只接种供试病原真菌菌块不接种直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192的该菌株为对照，28℃暗培养7天后观察并测量生长距离，计算抑制率。抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径-原菌饼直径)]×100％。
直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192与上述各病原真菌对峙培养结果如图3(直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192与9种病原真菌的平板对峙结果图)和表1所示，结果表明，内生真菌直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5菌株对所有的这些供试病原真菌均具有较强的抑制活性，抑制距离达到0.4～1.4cm，抑菌率为51.2±0.7％～91.0±3.4％。图3中I-X中左图均为对照，右图均为HND5与病原菌对峙培养的照片。图3中I为HND5与芒果炭疽病菌对峙培养；II为HND5与香蕉炭疽病菌对峙培养；III为HND5与香蕉枯萎病菌对峙培养；IV为HND5与竹子枯萎病菌对峙培养；V为HND5与木瓜棒孢病菌对峙培养；VI为HND5与水稻稻瘟菌对峙培养；VII为HND5与甘蔗赤腐病菌对峙培养；VIII为HND5与橡胶棒孢霉菌对峙培养；IX为HND5与橡胶炭疽菌对峙培养(二者同时接种)；X为HND5与橡胶炭疽菌对峙培养(HND5预培养5天再接种病原菌)。
表1.平板对峙法中HND5对不同病原真菌的抑制率
  病原菌  抑制率(％)  病原菌  抑制率(％)  病原菌  抑制率(％)  芒果炭疽病菌  51.2±0.7  橡胶炭疽病菌  63.5±2.2  水稻稻瘟病菌  79.1±2.1  香蕉枯萎病菌  68.4±1.2  橡胶树棒孢霉落叶病  菌  54.6±1.1  水稻胡麻斑病  菌  91.0±3.4  香蕉炭疽病菌  69.8±2.4  木瓜棒孢霉病菌  63.3±1.4  甘蔗赤腐病菌  75.8±2.2  竹子枯萎病菌  67.7±1.3  臂形草叶斑病菌  65.4±3.3
同时采用直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192菌液进行了该菌株菌液拮抗活性试验，采用PDA培养基进行。先将该菌株在PDB培养液(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min。)中摇菌培养7天(28℃，180rpm)，再按1∶25(体积比)的比例接种新鲜培养基，28℃，180rpm扩大培养14天，再在28℃静置暗培养14天。用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌获取无菌菌液(OD600值0.4～0.5)。在每20mL PDA培养基中加入2mL无菌菌液将其制成带毒平板。在中央接种上述供试病原真菌，以不加菌液为对照28℃暗培养7天后观察并测量生长距离，计算抑菌率。抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径-原菌饼直径)]×100％。其菌液只对臂形草叶斑病、木瓜棒孢和水稻稻瘟病菌具有一定的抑制作用，抑制率低，分别为36.8±2.6％、42.2±1.8％和51.6±3.1％，该菌株菌液对病原菌的抑菌谱不广。
实施例3、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192的基础生物学特性研究
1、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192生长曲线测定
用灭菌打孔器打取1块菌龄为2周(PDA培养基平板上培养)、直径约为4mm的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192菌块到50mL液体PDA中，28℃，180rpm摇菌培养。分别取第1天到第7天，第9天和第15天的菌液，真空泵抽除滤液后，收集菌体，分别称取其湿重和干重重量(60℃烘干至衡重)(g)。发现其干湿重菌体量高峰均出现在第7天，随后其生物量下降；其生长曲线图如图4所示。
2、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192生长最适培养基的确定
1)直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192在如下所述的固体培养基(pH6～7)平板上生长情况的比较：
Minimal agar medium：KNO3 10g，KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 2.5g，FeCl3 0.02g，葡萄糖10g，琼脂20g，定容至1000mL；
PDA(马铃薯葡萄糖)培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；
CMV(玉米粉)培养基：玉米粉30g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；
OA(燕麦)培养基：燕麦片30g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；
CA(胡萝卜)培养基：胡萝卜200g，葡萄糖20g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；
NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂20g，定容至1000mL；
上述培养基均在121℃，灭菌20min。
分别在直径9cm的培养皿中倒入20mL融化的上述六种固体培养基，凝固后即得各种培养基的等厚度固体平板，在平板中央接种直径约4mm大小的菌龄为PDA平板培养基上培养了2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCCNo.2192打孔菌块，每种培养基设三次重复，28℃暗培养，7天后测量菌落大小，计算菌落生长速度。结果如表2所示，在PDA平板上生长速度最快，其次为OA平板，MM平板，CA平板和CMV平板，在NA平板上的生长速度最慢。在CMV，OA，MM和CA培养基上菌落质地疏松，在PDA和NA培养基上菌落质地非常紧密。培养后期，PDA，CMV，OA，CA和NA平板上菌落变为淡橘黄色或橘红色，而MM平板上菌落始终为白色。
表2.在不同培养基上的生长速度(菌落直径/培养时间)
  培养基  MM  PDA  CMV  OA  CA  NA  生长速度(mm/天)  3.51±0.15  3.75±0.11  3.13±0.12  3.68±0.13  3.34±0.09  2.02±0.13
2)直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192在不同的液体培养基(pH6～7)上生长状况的比较，选用如下液体培养基：
PDA：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL。
PDB：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 3g，VB1 10mg，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL。
YEG(酵母提取物葡萄糖培养基)：酵母膏2.0g，KH2PO4 5.0g，MgSO4 0.5g，葡萄糖5.0g，定容至1000mL。
M102培养基：蔗糖30.0g，麦芽提取物20.0g，细菌蛋白胨2.0g，酵母提取物1.0g，KCl 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，定容至1000mL。
SM培养基：山梨糖醇100.0g，葡萄糖40.0g，琥珀酸10.0g，酵母提取物1.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，TE溶液5.0mL，定容至1000mL，pH5.6；[TE溶液成分(g/100mL)：柠檬酸5g，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 100g，ZnSO4·7H2O 5g，MnSO4·H2O 0.05g，Na2MoO4·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.25g。
SM-TE培养基：即不含TE溶液的SM培养基。
上述培养基均为121℃，灭菌20min。
用灭菌打孔器打取一块直径约4mm、菌龄为2周的直立枝顶孢(Acremoniumstrictum)HND5 CGMCC No.2192菌块，接种到75mL各上述液体培养基中，每种培养基三次重复。28℃，180rpm摇菌培养7天，真空泵抽除滤液后，收集菌体，称取其干重重量(60℃烘干至衡重)(g)，比较其对菌体生物量产生的影响。结果如图5所示，结果表明，最适液体培养基为SM-TE，其次为SM和M102，而液体PDA为效果最差。
3、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192菌株生长温度范围研究
PDA平板的制备：在直径9cm的培养皿中倒入20mL溶化的PDA固体培养基，凝固后即得等厚度的PDA固体平板，在平板中央接种打孔得到的直径约4mm大小的菌龄为PDA固体平板培养2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCCNo.2192菌块，分别置于不同的温度(4℃，15℃，22℃，28℃，30℃，37℃和45℃)下暗培养，每个测试温度设三次重复，于培养7天和14天后均测量一下各个处理PDA平板菌落生长直径。结果如图6所示，结果表明，在所采用的8个温度中，28℃为其生长最适温度。
4、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192生长pH值范围检测
制备不同pH值的PDA平板：分别用1M HCl和1M NaOH调节液体PDA培养基PH值到4，5，6，7，8，9，10，11或12，调节好PH后，加入琼脂配制成固体培养基，121℃，20min灭菌得到PH值分别为4，5，6，7，8，9，10，11或12的PDA平板。
在上述制备的PH值分别为4，5，6，7，8，9，10，11或12的PDA平板中央分别接种一个用灭菌打孔器打取直径约4mm大小的菌龄为PDA固体平板培养2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192菌块，分别置28℃暗培养，于培养7天和14天后，分别用十字交叉法测量菌落直径，设三次重复，求取平均数和标准差。结果如图7所示，结果表明，该菌株在供试pH5～11范围内生长直径差异不大，最适生长pH为7。
5、不同碳氮源对直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192生长的影响
配制不同碳源的培养基：以Czapek培养基为基本培养基，分别用D-葡萄糖，乳糖，淀粉，麦芽糖，D-山梨醇，D-果糖，D-木糖，甘露醇，D-甘露糖替换Czapek培养基中的蔗糖，其他成分不变，制备得到以这些物质为唯一碳源的培养基(加入琼脂配制固体培养基)。
配制不同氮源的培养基：以Czapek培养基为基本培养基，分别用硝酸钾，硝酸铵，硫酸铵，酵母提取物，牛肉浸膏，酵母浸膏，蛋白胨替换Czapek培养基中的硝酸钠，其他成分不变，制备得到以这些物质为唯一氮源的培养基(加入琼脂配制固体培养基)。
上述Czapek培养基的配方为：MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，NaNO3 2g，蔗糖20g，定容至1000mL，pH7.0(加入琼脂配制固体培养基)。均经121℃，20min灭菌。
1)采用固体平板法测其菌落平均直径
分别将上述不同碳原和氮原的固体培养基以及Czapek固体培养基溶化融化后，分别倒入直径9cm的培养皿中，20mL/皿，凝固后即得的等厚度上述不同培养基的固体平板。在平板中央接种打孔得到的直径约4mm大小的菌龄为PDA固体平板培养2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192菌块，设三次重复，28℃暗培养7天，用十字交叉法测量菌落直径。结果如表3所示，结果表明，在含唯一碳源为蔗糖的平板上，其生长速度最快，而在含唯一碳源为D-山梨醇的平板上生长最差，在以D-木糖和乳糖为唯一碳源的平板上其生长速度不如在甘露醇、淀粉、麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-葡萄糖平板上的。在含唯一氮源平板上，在以硝酸钠为唯一氮源的平板上生长最快，其次分别为硝酸钾，酵母浸膏，蛋白胨，牛肉浸膏，酵母提取物和硝酸铵，而在硫酸铵平板上生长最慢。
表3.不同唯一碳氮源平板上HND5生长直径(培养7天)
  碳源  蔗糖  D-葡萄糖  麦芽糖  乳糖  D-山梨醇  平均直径(cm)  3.21±0.12  2.74±0.09  2.75±0.11  2.27±0.15  1.53±0.12  碳源  D-木糖  D-果糖  甘露醇  D-甘露糖  淀粉  平均直径(cm)  2.31±0.09  2.52±0.12  2.56±0.07  2.64±0.11  2.91±0.13  氮源  酵母浸膏  牛肉浸膏  蛋白胨  硫酸铵  硝酸铵  平均直径(cm)  2.63±0.11  2.27±0.12  2.34±0.09  1.75±0.13  2.21±0.14  氮源  硝酸钠  硝酸钾  酵母提取物  平均直径(cm)  2.91±0.15  2.87±0.09  2.24±0.12
2)液体摇菌法测其干重
分别接种一块用灭菌打孔器打取、菌龄为2周(PDA固体培养基平板培养)、直径约为4mm大小的HND5菌株菌块到50mL含上述不同氮源或不同碳源的液体培养基中，每种培养基设三次重复，28℃，180rpm摇菌7d。真空泵抽除滤液，收集菌丝体，称取其干重重量(60℃烘干至衡重)。液体摇菌法测定不同碳氮源影响其生物量的结果如图8所示，结果表明，在单一碳源因子条件下，蔗糖为其最适碳源，D-山梨醇为最不适碳源。而硝酸钠为最适氮源，最不适宜氮源为硫酸铵。
上述两种方法结果表明，其最适碳氮源结果一致。但在部分氮源结果上有些差异，平板法中最适为硝酸钠或硝酸钾，酵母提取物、酵母浸膏和牛肉浸膏与硝酸钠具有较大差异。而在液体摇菌法中虽然最适氮源为硝酸钠，但酵母提取物、酵母浸膏和牛肉浸膏与其没有较大差异。
6、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192对不同浓度盐碱的耐受检测
配制含有盐份NaCl(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％、10％或15％)或KCl(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％、10％或15％)的PDA培养基、含有碱份KOH(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基、含有NaOH(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基或含有Na2CO3(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基，用于检测直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192对不同浓度盐碱的耐受。
按照步骤5的方法制备上述培养基的平板，并接种直立枝顶孢(Acremoniumstrictum)HND5 CGMCC No.2192菌块，每个培养基处理三次重复。28℃暗培养14天，用十字交叉法测量菌落直径。
结果如表4所示，结果表明：HND5菌株仅能耐受质量百分比浓度为1％的NaCl，但能够耐受5％KCl。对于三种碱KOH、NaOH或Na2CO3的耐受力仅在质量百分比浓度为1％的浓度上能够生长。
表4.HND5菌株在含不同浓度盐、碱的PDA平板上菌落平均直径(cm)

7、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192对不同浓度重铬酸钾的耐受研究
重铬酸钾是一种重金属盐类，能够抑制真菌的生长，在分离土壤放线菌时，培养基中加入50μg/mL的重铬酸钾即可较好得起到抑制真菌污染的效果。
在培养了直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192 2周的PDA培养基平板上菌落边缘用灭菌打孔器打取直径约4mm的菌块，分别接种一块于含有10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL或1000μg/mL的重铬酸钾的PDA培养基的平板中央(培养基平板的制备方法同步骤5)，每个浓度的重铬酸钾处理进行三次重复，将平板置于28℃暗培养9天后测量菌落直径。
结果如表5所示，结果表明，随着重铬酸钾浓度的升高，菌株HND5的生长速度递减。在含1000μg/mL重铬酸钾的PDA平板上，9天后菌落直径为1.3cm。由于该菌株对重铬酸钾具有较强的耐性，在进一步筛选内生真菌过程中，利用该特性可以很好的抑制杂菌污染，从而可以进一步将其或相关菌从宿主植物中分离出来。
表5.HND5菌株在含不同浓度重铬酸钾的PDA平板上菌落平均直径(cm)
  浓度(μg/mL)  10  50  100  150  200  平均直径(cm)  2.72±0.12  2.51±0.11  2.17±0.15  2.12±0.08  1.84±0.09  浓度(μg/mL)  300  400  500  600  1000  平均直径(cm)  1.57±0.09  1.50±0.07  1.47±0.14  1.33±0.08  1.30±0.1
8、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192不同保存方法的研究
利用PDA培养基作为活化培养基。对于直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5CGMCC No.2192的保存方法，主要采用了四种方法，分别是4℃平板保存法，-20℃滤纸片保存法，常温超纯水保存法和-20℃臂形草种子保存法。4℃平板保存法：PDA平板接种直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5菌块后，28℃暗培养2周后保存于4℃；-20℃滤纸片或臂形草种子保存法：PDA平板接种直立枝顶孢(Acremoniumstrictum)HND5菌块后，28℃暗培养2周后，菌落表面放置无菌滤纸片或无菌臂形草种子，继续培养2周后，将滤纸片或臂形草种子取出，置于保菌袋中，50℃烘箱烘干，2天后置于-20℃保存；常温超纯水保存法：挖取两块大小约5mm菌龄为2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5菌块，放置于装有3mL无菌超纯水的保菌管中，室温保存。4℃平板保存法保存直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5菌株，保存3个月后活化，培养两周后直径为3.5cm。但保存6个月后再活化，其生长速度减慢，两周后直径为2.8cm，而且发现4℃平板保存时间越长，就越存在被污染的可能性。-20℃滤纸片保存法保存直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5菌株，3个月和12个月后分别活化，发现其生长速度和菌落形态与保存前的菌落形态一致。常温超纯水保存法和-20℃臂形草种子保存法保存效果也同-20℃滤纸片保存法。上述保存方法保存的菌株活化后，经进一步的体外拮抗活性评价，发现其活性可以很好的保存。为降低污染，在有条件的情况下，可以采用-20℃滤纸片保存法作长期保存。
实施例4、内生真菌菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCCNo.2192的内生性鉴定
珊状臂形草种子除菌处理：选取健康饱满的珊状臂形草(Brachiaria brizantha)种子(购买自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带牧草研究中心)，经活体苯胺蓝染色检测，其内生真菌带菌率为70％。
取一部分均匀饱满种子经热处理(先经过43℃恒温水浴保温15min，再升温至60℃恒温水浴保温60min)后，再经70％(体积百分含量)酒精消毒90s，再用质量百分浓度为0.1％的升汞溶液消毒20min，无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干后置于MS平板上，26℃暗培养萌发。当种子萌发至三叶期后，进行内生真菌苯胺蓝染色和组织块分离检测，结果表明处理后的幼苗带菌率仅为11.15±0.21％，其除菌率达到了84.37±0.62％。
将上述经检测不带菌的幼苗进行HND5菌株回接：用无菌刀片在幼苗顶端分生组织处划一个小伤口，从新鲜菌落上挑取少许菌丝体接种到幼苗伤口处，然后在伤口处涂上少量无菌凡士林防止真菌掉到培养基平板上。接种后继续在MS平板上培养一周后，转移到含营养液的小盆中培养24h，然后移植到含有无菌土的盆中种植。共接种223株，最终共获得34株成活幼苗，成活率为15.2％。种植接种植株3个月后，取植株叶鞘和叶片进行苯胺蓝染色检测和组织块分离内生真菌，结果从3株植株中分离出HND5菌株，经检测其拮抗活性与最初接种的菌株一致。在另外的18株植株中只能够染色检测到内生真菌的存在，但未能分离到内生真菌，其它13株中未能检测出内生真菌。接种3个月后仍然能从接种的部分幼苗中分离到HND5菌株，表明该菌株能够在珊状臂形草植株稳定存在并正常繁殖。接种34株植株只有3株分离到该菌株，表明接种方法还有待改进，也有可能人工接种条件与自然环境不一致而造成的。
实施例5、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192产生挥发性气体化合物及该气体对病原真菌的抑制作用实验
1、按照实施例3中步骤3的方法用直径为9cm的培养皿制备PDA平板，并在每个平板上的多个不同位置各接种一块打孔得到的直径约4mm大小的菌龄为PDA固体平板培养2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192菌块，28℃培养15天，待其基本长满平板后，即用于活性挥发性气体化合物试验。
2、用上述同样方法制备PDA平板，在平板中央接种大打孔直径约4mm、菌龄为一周的芒果炭疽病菌等11种病原真菌(芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、竹子枯萎病菌、橡胶树炭疽病菌、橡胶树棒孢霉落叶病菌、木瓜棒孢霉病菌、臂形草叶斑病菌、水稻稻瘟病菌、水稻胡麻斑病菌、甘蔗赤腐病菌，菌株来源同实施例2)的菌块到PDA平板(培养皿皿底)中央。
3、取步骤1所述已经培养15天的HND5平板，轻轻将培养皿上方的皿盖与下方具有培养基的长有HND5菌落的皿底移开，再分别将步骤2所述11种接好病原真菌的PDA平皿皿底(中央带有接种好的病原真菌菌块)倒扣在原来培养HND5培养皿的皿底上，用parafilm“M”封口，以倒扣在没有培养过HND5的皿底上的接好病原真菌的PDA平皿皿底作对照，三次重复，28℃暗培养7天后观察，按照实施例2的方法计算抑菌率。
结果如表6所示，结果发现，所有供试病原真菌的生长都受到抑制，其中对水稻稻瘟病菌菌株抑制率最高，表明菌株直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5CGMCC No.2192能够产生活性挥发性气体物质抑制病原真菌的生长，其中的8种病原真菌受抑制情况如图9所示。图9中A-H中左图分别为受到HND5产生活性挥发性气体物质抑制影响的芒果炭疽病菌(图9中A)、香蕉枯萎病菌(图9中B)、甘蔗赤腐病菌(图9中C)、木瓜棒孢霉病菌(图9中D)、水稻稻瘟菌(图9中E)、橡胶炭疽菌(图9中F)、香蕉炭疽菌(图9中G)和橡胶多主棒孢霉菌(图9中H)菌落生长状况，图9中A-H中的左图平皿下方为HND5培养平板，上方为接种病原真菌的平板，两平板倒扣在一起，右图均为没有加盖培养过HND5的皿底(加盖无菌皿底)的对照。
表6.活性气体对病原菌的抑制率
  病原菌  抑制率(％)  病原菌  抑制率(％)  芒果炭疽病  菌  67.1±3.3  橡胶树炭疽病菌  73.2±2.2  香蕉枯萎病  菌  63.1±2.2  橡胶树棒孢霉落叶病  菌  66.1±2.3  香蕉炭疽病  菌  62.8±1.2  木瓜棒孢霉病菌  62.3±1.4  竹子枯萎病  菌  63.6±1.3  臂形草叶斑病菌  65.0±1.3  水稻稻瘟病  菌  86.7±2.2  水稻胡麻斑病菌  81.5±2.3
  甘蔗赤腐病  菌  58.8±1.2
实施例6、直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5 CGMCC No.2192寄生线虫功能鉴定
直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5寄生准备：在载玻片上滴加一滴PDA半固体培养基(含有质量百分浓度为1％的琼脂)，从PDA培养1周菌龄的HND5菌落上挑取少量菌丝体接种在该PDA半固体培养基上，28℃暗培养一周，备用。
HND5寄生线虫实验：剖开患有香蕉根结线虫病的香蕉幼苗根结，置于灭菌水中，8h后挑取线虫。用含有10％次氯酸钠和10μg/mL四环素的灭菌水溶液清洗挑取的活线虫，3min后将其挑到载玻片上的菌株HND5的菌落上，共接种10片载玻片。28℃暗培养24小时后观察，然后每隔12小时观察一次。结果镜检发现，该菌约60小时后可以产生菌丝套住线虫并寄生致其死亡(图10，HND5寄生香蕉根结线虫)。
打取2块直径约为4mm的菌龄为PDA固体平板培养2周的直立枝顶孢(Acremonium strictum)HND5菌块接种到200mL的PDA液体培养基中，28℃，180rpm条件下振荡培养25天，然后常温静置14天，无菌过滤获其菌液，挑取上述处理的活线虫到菌液中，2天后观察其杀线虫作用，对照组是直接将线虫挑取到无菌蒸馏水中。结果发现对照组中线虫存活率为76％，菌液处理组中线虫存活率仅为37％，二者间效果差异极显著。
同时利用上述发酵液进行了室内盆栽防治香蕉根结线虫病害评价。随机选取长势一致的假茎高度约10cm的香蕉盆栽苗(每盆一株)，每盆接种南方根结线虫2000卵，培养两周后进行接种试验。分别用稀释100倍的HND5菌液(用灭菌打孔器打取一块直径约4mm菌龄为2周的菌块，接种到300mL液体PDA培养液中，28℃，180rpm振荡培养25天，然后常温静置14天)，非熏蒸性杀线虫剂5％丁硫克百威(商品名为好年冬，稀释1000倍后使用)(阳性对照)或以无菌去离子水(阴性对照)，对感病苗进行灌根施药，每个处理每株各灌施50mL处理液，每隔7天灌根施药一次，各施药四次。每个处理100株，各处理重复3次。6周后，每个处理随机取香蕉苗20株，将其根挖出，记录根结线虫危害级别和根结指数(表7)，线虫为害分级标准为：0级：根系完整，无根结；1级：有少量根结；2级：大部分根上有根结；3级：在虫瘤上有再次根结；4级：根结互相连结成为根结团块。

结果如表7和图11、图12所示。结果表明，稀释100倍的菌液与稀释1000倍的杀线虫农药好年冬对香蕉根结线虫病均有较好的防治效果，两者之间的防效在1％或5％水平上没有显著性或极显著性差异，但与无菌水对照相比，有显著性或极显著性差异。与无菌水对照相比，香蕉苗叶片浓绿，枯叶少，长势旺(图11)，根部根结数量比对照显著减少(图12)。图11中A为HND5发酵液(稀释100倍)处理植株；图11中B为5％丁硫克百威(稀释1000倍)处理植株；图11中C为无菌水对照植株。图12中A为HND5发酵液(稀释100倍)处理6周后的根结情况；图12中B为5％丁硫克百威(稀释1000倍)处理6周后的根结情况；图12中C为对照无菌水处理6周后的根结情况。
表7.防治盆栽苗香蕉根结线虫病试验
  处理  根结指数  防效(％)  显著性  5％  1％  无菌水  46.57±3.34  -  a  A  5％丁硫克百威(稀释1000倍)  11.89±1.52  74.47±3.54  b  B  发酵液(稀释100倍)  12.71±1.19  72.1±2.18  b  B
注：表7中小写字母代表盆栽防治效果在5％时的显著性水平，倘若不同处理具有不同小写字母，表示处理结果之间具有显著性差异，反之则没有；大写字母代表盆栽防治效果在1％时的显著性水平，倘若不同处理具有不同大写字母，表示处理结果之间具有极显著性差异，反之则没有。
序列表