具有抑制癌细胞效果的三七发酵液及其制备方法.pdf

本发明涉及一种三七发酵液及其制备方法。本发明发酵三七的方法包括：活化乳酸菌；将乳酸菌接种至三七培养液中发酵，以获得发酵液；离心发酵液，取得上清液。经离心取得的上清液即为本发明的三七发酵液，其具有抑制癌细胞的效果。

权利要求书
1.   一种发酵三七的方法，其包括：以一培养基活化乳酸菌；将乳酸菌接种至三七培养液中发酵，以获得发酵液；离心发酵液，取得上清液。

2.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述方法进一步包括添加黑豆萃取液于所述三七培养液中。

3.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述方法进一步包括预先热处理所述三七培养液。

4.   根据权利要求3所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述热处理温度在75℃以上。

5.   根据权利要求3所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述热处理时间在10分钟以上。

6.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述乳酸菌为嗜热唾液链球菌(Streptococcus salivarius subsp.Thermophilus(BCRC12268))、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus(BCRC14092))、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus GG。(BCRC16000))、嗜酸性乳酸菌(Lactobacillus acidophilus(BCRC10695))、菲德氏-隆根菌(Bifidobacterium longum(BCRC14602))、链双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum(BCRC14667))、短比非德氏菌(Bifidobacteriumbreve(BCRC 11846))、双叉乳酸杆菌(Bifidobacterium bifidum(BCRC14615))或其组合。

7.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述培养基为MRS或消化蛋白-酵母萃取液(peptone-yeast extract base)培养基。

8.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述三七培养液包括10-15％(w/w)的三七粉末和85-90％(w/w)的水。

9.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述发酵时间为1至7天。

10.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述发酵的温度在25至40℃。

11.   根据权利要求1所述的发酵三七的方法，其特征在于：所述发酵的pH值在3至5之间。

12.   一种三七乳酸菌发酵液，由权利要求1所述的方法制备，具有抑制癌细胞生长的能力。

13.   根据权利要求12所述的三七乳酸菌发酵液，其特征在于：所述三七乳酸菌发酵液具有抑制B型肝炎表面抗原的能力。

14.   根据权利要求12所述的三七乳酸菌发酵液，其特征在于：所述癌细胞包括乳癌细胞、前列腺癌细胞、血癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、子宫颈癌细胞、睾丸癌细胞、淋巴癌细胞、横纹肌肉瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞、肺癌细胞、脑部肿瘤细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肾脏癌细胞或鼻咽癌细胞。

15.   根据权利要求12所述的三七乳酸菌发酵液，其特征在于：所述癌细胞为肝癌细胞。

16.   根据权利要求12所述的三七乳酸菌发酵液，其特征在于：所述三七乳酸菌发酵液具有60％以上的抗癌效果。

17.   一种预防和/或治疗癌症的医药组合物，其包括：
有效量的三七乳酸菌发酵液，由权利要求1所述的方法制备；以及
一种药学上可接受的载体或赋形剂。

18.   根据权利要求17所述的预防和/或治疗癌症的医药组合物，其特征在于：所述癌症包括乳癌、前列腺癌、血癌、直肠癌、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、淋巴癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、胰脏癌、肺癌、脑部肿瘤、皮肤癌、胃癌、肝癌、肾脏癌或鼻咽癌。

19.   根据权利要求17所述的预防和/或治疗癌症的医药组合物，其特征在于：所述癌症为肝癌。

20.   根据权利要求第17所述的预防和/或治疗癌症的医药组合物，其特征在于：所述医药组合物具有60％以上的抗癌效果。

21.   根据权利要求17所述的预防和/或治疗癌症的医药组合物，其特征在于：所述医药组合物为口服或注射剂型。

说明书具有抑制癌细胞效果的三七发酵液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗癌组合物及其制备方法，尤其涉及一种抗癌三七乳酸菌发酵液及其制备方法。
背景技术
癌症是全世界仅次于心血管疾病的第二大疾病，截至目前为止，除了少数癌症，如直肠癌和乳癌可通过外科手术切除，或血癌可通过化学药物获得一定治疗效果外，大多数的癌症在癌细胞转移时仍束手无策。目前国内的癌症死亡率高达百分之二十六点八，平均每十四分零七秒就有一人死于癌症。目前肝癌的治疗方法主要有外科手术、放射疗法、免疫疗法、化学药物疗法和酒精局部注射等。大多数抗肿瘤药物对于在人体中快速增生的癌细胞(如：白血病、淋巴癌)具有较佳毒杀效果，但对于发展较缓慢的癌症(如：肝癌、肺癌)的治疗效果则不佳；此外，许多抗肿瘤药物对细胞选择性较差，因此常有合并免疫抑制等不良副作用。因此，从传统中草药中寻找具有抗癌活性的天然植物成分，以辅助或取代西药为目前研究的新方向。
肝脏是腹腔内最大的器官，也是人体内体积最大的腺体，其重量约占成人体重的2.5％，具有代谢、储存、解毒及合成血浆蛋白等多重功能。肝脏的功能单位为小叶(lobule)，由肝实质细胞和非实质细胞或间质细胞所组成。肝实质细胞(parenchymal cells)一般是指肝细胞(hepatocytes)，而非实质细胞则包括窦内皮细胞(sinusoids endothelial cells)、星状细胞(stellate cells)和储脂细胞(fat-storingcells)等。其中，肝细胞约占总肝细胞数的60-65％，且肝细胞细胞体积较大，因此肝细胞约占肝脏总体积的70-80％。
肝癌即肝脏的恶性肿瘤，一般可分为二种：一为源自于肝脏，称为原发性肝癌，其中60％是由肝硬化转变而来；二为身体其它部分扩散到肝脏的转移性肝癌。依形态学来分，肝癌可分为三类：块状型、结节型和弥漫型，其中以结节型最多。依组织学来分，肝癌可分为(1)肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)，即惯称的肝癌，占肝癌发生率的80％；(2)胆管癌(Cholanglocarcinoma)，占肝癌发生率的20％，多发于老人；(3)肝细胞胆管癌(Mix hepatocholangiocarcinoma)，较为少见；(4)肝原细胞癌(Hepatoblastoma)，较为少见，多发于幼儿。
临床上治疗肝癌的方法可分为：手术切除(surgical resection)或局部性治疗，如经皮穿刺肿瘤内酒精注射(percutaneous ethanol injection)、射频烧灼治疗(radiofrequency ablation)、冷冻疗法(cryotherapy)，以及微波凝固治疗(percutaneousmicrowave coagulation)(Carr，2004；Labont？et al.，2000)，大部分治疗的方法成效不明显。目前肝癌手术切除的成功率只有10-20％，术后五年的存活率在20-50％之间。即使是小于2公分的肝癌，在手术后五年复发的机率也是百分之百。另外，在抗肝癌药物的使用方面，现有药物多半毒性大、特异性小，并多半具免疫抑制等不良作用。Doxorubicin(Adriamycin)为化学治疗使用药物之一，属于抗生素类，副作用为增加罹患心肌症(cardiomyopathy)或心脏衰竭(congestive heartfailure)的机率(Bristow et al.，1978；Minow，1975)、恶心、呕吐、脱发，若外漏则可能造成周围组织局部坏死现象。因此，除了积极开发较少副作用的新治疗药物外，另一方面则是研究如何由摄取天然饮食成分来达到保护肝脏健康、预防癌症发生的目的。
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)，五加科人参属，性温、味辛，传统用于散瘀止血、消肿定痛等，为中国传统名贵药材之一，目前已被证实具有镇痛、护肝、抗发炎、抗血栓、降血压、保护心肌和抗肿瘤等生理功效。其主要用药部位为干燥根部，又称蔘三七、田七、金不换等。三七具有抗血栓、降血压、保护心肌、镇痛、抗发炎、抗疲劳及保肝等功效，其活性物质包含皂苷(dammarane)、三七三酸甘油酯(trilinolein)、田七胺酸(dencichine)、三七多醣(sanchinan-A)、酵素(xylanase)和黄酮类。
三七具有护肝、治疗肝病的功效，近年来日本和中国有许多保健产品以三七为主要成份。但是，三七中的皂苷会受到消化系统的代谢和吸收影响，而影响其功效。因此，需要提供一种能够提升三七保肝、抗癌能力的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种良好的抗癌化合物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种发酵三七的方法，其包括：以一培养基活化乳酸菌；将乳酸菌接种至三七培养液中发酵，以获得发酵液；离心发酵液，取得上清液。
为实现上述目的，本发明还提供了一种三七乳酸菌发酵液，由上述方法制备，其具有抑制癌细胞生长的能力。
为实现上述目的，本发明另提供了一种预防和/或治疗癌症的医药组合物，其包括：有效量的由上述方法制备的三七乳酸菌发酵液，以及一种药学上可接受的载体或赋形剂。
附图说明
为了让本发明的发明目的、特征和优点明显易懂，现在结合具体实施方式和附图，对本发明进行进一步详细说明，其中：
图1a-1b所示为所有的三七乳酸发酵产物都具有抑制Hep 3B或Hep G2细胞的能力。
图2a-2b所示为混合与单一乳酸菌抗癌效果的对比。
图3a-3b所示为发酵温度为32℃时，发酵产物的抗癌效果。
图3c-3d所示为发酵温度为37℃时，发酵产物的抗癌效果。
图3e-3f所示为发酵温度为42℃时，发酵产物的抗癌效果。
图4a-4b所示为pH值为3.5时，发酵产物的抗癌效果。
图4c-4d所示为pH值为4.5时，发酵产物的抗癌效果。
图4e-4f所示为pH值为5.5时，发酵产物的抗癌效果。
图5显示黑豆粹取液可增加抗氧化效果。
图6a-6b显示预先热处理三七培养液可增强抗癌效果。
图7所示为三七发酵液对正常肝细胞的影响。
图8所示为三七发酵液对B型肝炎表面抗原的影响。
图9所示为动物实验的结果。
具体实施方式
本发明提供一种发酵三七的方法，其包括：活化乳酸菌；将乳酸菌接种至三七培养液中发酵，以获得发酵液；离心发酵液，取得上清液。
本发明发酵方法首先以一培养基活化乳酸菌，培养基可以为一般现有的培养基，如MRS或消化蛋白-酵母萃取液(peptone-yeast extract base)等。乳酸菌可为嗜热唾液链球菌(Streptococcus salivarius subsp.Thermophilus(BCRC12268))、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus(BCRC14092))、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG.(BCRC16000))、嗜酸性乳酸菌(Lactobacillusacidophilus(BCRC10695))、菲德氏-隆根菌(Bifidobacterium longum(BCRC14602))、链双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum(BCRC14667))、短比非德氏菌(Bifidobacterium breve(BCRC11846))、双叉乳酸杆菌(Bifidobacteriumbifidum(BCRC14615))或其组合。
然后，将上述至少一种乳酸菌接种于三七培养液中发酵。在本发明中，可使用单一乳酸菌或混合乳酸菌，最好为混合乳酸菌。三七培养液的成份为10-30％(w/w)的三七粉末和70-90％(w/w)的蒸馏水，最好为10-15％(w/w)的三七粉末和85-90％(w/w)的蒸馏水。三七依其根疣的大小可分为20头、40头或60头，在本发明中，最好可以使用40头以上的三七。发酵时间在1至7天之间，最好为1至3天。发酵温度在25至42℃之间，较佳为30至40℃，最佳为35至37℃。发酵时的pH值在3.0至5.0之间，最好在3.5至4.5之间。应当注意的是，若pH值在5.5以上，则发酵产物就不具有抗癌效果。此外，在发酵的过程中，可适当搅拌培养液，以缩短发酵时间。
发酵完成后，以高温灭菌中止发酵，并离心过滤菌体和碳氮源固形物，取得本发明的发酵产物。
在本发明的一个实施方式中，可添加其它活性物质(如黑豆或柴胡萃取液等)至三七培养液中，以增加发酵产物的生物活性，如抗氧化能力等。
在本发明的一个实施方式中，可预先热处理三七培养液，以增加发酵产物的抗癌效果。热处理温度在75℃以上，最好在100℃以上。热处理时间在10分钟以上，最好为20至180分钟。
本发明还提供了一种三七乳酸菌发酵液，由上述发酵流程制得。本发明的三七乳酸菌发酵液具有抑制癌细胞生长的能力，抑制率达60％以上。其中癌细胞可为：乳癌细胞、前列腺癌细胞、血癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、子宫颈癌细胞、睾丸癌细胞、淋巴癌细胞、横纹肌肉瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞、肺癌细胞、脑部肿瘤细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肾脏癌细胞或鼻咽癌细胞，较佳为肝癌细胞。
本发明的组合物具有高度安全性，本发明的三七乳酸发酵液可抑制癌细胞的生长，且对正常细胞的毒性较小。本发明的三七发酵液对小鼠初代肝细胞的LD50在900μg/ml以上，最好在970μg/ml以上。
除了可抑制癌细胞的生长外，本发明的三七乳酸发酵液还可抑制B型肝炎表面抗原(HBsAg)，其抑制效果随着发酵时间而增加，抑制率可达80％以上。
此外，本发明另提供了一种预防和/或治疗癌症的医药组合物，其包括有效量的三七乳酸菌发酵液和一种药学上可接受的载体或赋形剂。其中，癌症可为乳癌、前列腺癌、血癌、直肠癌、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、淋巴癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、胰脏癌、肺癌、脑部肿瘤、皮肤癌、胃癌、肝癌、肾脏癌或鼻咽癌，较佳为肝癌。本发明的医药组合物具有抑制癌细胞生长的能力，抑制率达60％以上，本发明的医药组合物可为口服或注射剂型。
本发明的医药组合物具有预防和/或治疗癌症的效果，因此可给药至癌症患者、接受化疗或放疗患者、癌症高危险族群等。本发明的组合物具有高度安全性，不会对人体造成影响，可长期作为饮食补充品。
本发明提供了一种三七乳酸发酵液及其制备方法，本发明的三七乳酸菌发酵液具有抑制癌细胞、B型肝炎表面抗原(HBsAg)的能力，且对正常细胞的毒性较小。此外，还可额外添加其它物质，以增加本发明发酵产物的生物活性，如抗氧化能力等。
【实施例】
1、三七培养液的制备
将三七磨碎后，以120筛网取得三七粉未，将10g三七粉末加入90ml水中，以高温灭菌釜灭菌20分钟，获得三七培养液。
2、以乳酸菌发酵三七
将乳酸菌接种至实施例1的三七培养液中，乳酸菌分别为嗜热唾液链球菌(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus(BCRC12268))、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus(BCRC14092))、雷曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosusGG.(BCRC16000))、嗜酸性乳酸菌(Lactobacillus acidophilus(BCRC10695))、菲德氏-隆根菌(Bifidobacterium longum(BCRC14602))、链双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum(BCRC14667))、短比非德氏菌(Bifidobacterium breve(BCRC11846))，初始菌数为104cfu/ml，在37℃下培养24或120小时后，以高温灭菌中止发酵，离心过滤菌体和碳氮源固形物，取得发酵产物，并测试1000μg/ml的发酵产物对Hep 3B和Hep G2细胞的影响。以未经发酵的三七培养液作为对照组。请参照图1a-1b，所有的三七乳酸发酵产物都具有抑制Hep 3B或Hep G2细胞的能力，其中以瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)的效果较佳。
3、单一乳酸菌和混合菌的对比
本实施例的发酵流程与实施例2类似，但增加双叉乳酸杆菌(Bifidobacteriumbifidum(BCRC14615))和8种混合乳酸菌发酵，并测试200μg/ml的发酵产物对Hep 3B和Hep G2细胞的影响。请参照图2a-2b，混合乳酸菌的抑制能力较单一乳酸菌高。
4、发酵温度对抑制癌细胞的影响
本实施例的发酵流程与实施例2类似，仅改变发酵温度。发酵温度分别为32℃、37℃、42℃，并测试不同浓度的发酵产物(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml)对Hep 3B和Hep 2G细胞的影响。请参照图3a-3b，发酵温度为32℃时，发酵2天的发酵物有最佳效果；请参照图3c-3d，发酵温度为37℃时，发酵3天的发酵物有最佳效果；请参照图3e-3f，发酵温度为42℃时，发酵3天的发酵物有最佳效果。
5、酸碱值对抑制癌细胞的影响
本实施例的发酵流程与实施例2相同，仅改变发酵时的酸碱值。发酵酸碱值分别为pH3.5、pH4.5、pH5.5，并测试不同浓度的发酵产物(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml)对Hep 3B和Hep 2G细胞的影响。请参照图4a-4d，当pH值为3.5和4.5时，发酵2天的发酵物有最佳效果。请参照图4e-4f，当pH值为5.5时，发酵物则不具有任何抗癌效果。
6、黑豆粹取液对抗氧化的影响
本实施例的发酵流程和实施例2相同，仅改变三七培养液的组成。组成分别为1/4三七粉+3/4黑豆粉、1/2三七粉+1/2黑豆粉、3/4三七粉+1/4黑豆粉、4/4三七粉，并测试发酵产物对Hep 3B和Hep 2G细胞的影响，且将维生素E的抗氧化能力设定为100。请参照图5所示，发酵物抗氧化的能力随着黑豆粉的增加而增加。
7、热处理三七培养液对抑制癌细胞的影响
本实施例的发酵流程和实施例2相同，仅在发酵前预先对三七培养液加热。分别以121℃加热20、60、120、180分钟，测试发酵产物对Hep 3B和Hep 2G细胞的影响，并以不加热做为对照组。请参照图6a和6b所示，加热可增加发酵物的抗癌效果。
8、三七发酵液对正常肝细胞的影响
本实施例的发酵流程和实施例2相同，发酵天数为1天。以发酵产物处理小鼠的初代肝细胞(primary hepatocyte)，并以MTT分析法测定细胞存活率。请参照图7，若发酵物的浓度为200μg/ml时，初代肝细胞的存活率在80％以上，且LD50为976μg/ml。
9、三七发酵液对B型肝炎表面抗原的影响
本实施例的发酵流程和实施例2相同，分别取发酵1、3、5、7天的三七发酵液处理Hep 3B细胞，并测定发酵产物对Hep 3B的B型肝炎表面抗原的抑制效果。请参照图8，抑制效果随着发酵时间的增加而增加，发酵7天的三七发酵液具有80％以上的抑制率。
10、动物实验
取18-22克的SCID小鼠，分为5组，每组10只。首先，接种Hep 3B/T2癌细胞于小鼠的腋下部位，接着喂食不同剂量的三七发酵物，连续35天，每3-4天测量一次肿瘤大小，并在停止喂食后，分别测量小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肿瘤重量。
此实施例的三七发酵物制备条件为：10％(w/w)的三七粉未和90％(w/w)的蒸馏水，以上述8种混合菌，在37℃下发酵48小时。三七发酵物的剂量分别为1000μg/ml(高剂量组)、400μg/ml(中剂量组)和200μg/ml(低剂量组)，正控制组为腹腔注射5-FU，负控制组为喂食磷酸缓冲液，对照组为不接种Hep 3B/T2细胞。
请参照图9，正对照组(5-FU)的肿瘤最小，其次为高剂量组(1000μg/ml)，表示高剂量的三七发酵物具有延缓肿瘤生成的效果。此外，正对照组(5-FU)的肿瘤最轻，其次为高剂量组(1000μg/ml)，详细结果如表1所示。
表1小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肿瘤的重量(mg)
  对照组  负控制组  低剂量组  中剂量组  高剂量组  正控制组  心脏  149.0±19.7  116.8±17.8  111.8±9.5  107.9±5.5  122.7±11.9  143.2±14.6  肝脏  1355±123.4  1114.5±143.4  1160.5±130.6  1211.5±130.6  1110.6±65.7  1171.3±103.0  脾脏  100.2±12.4  59.1±11.7  60.4±3.3  60.4±11.7  66.3±8.3  118.7±35.6  肺脏  190.6±8.4  178.8±14.2  178.5±31.2  185.3±13.6  191.9±19.5  215.8±23  肾脏  411.4±13.3  277.5±45  321.3±45.5  325.2±45.3  282.2±22.6  328.2±26.2  肿瘤  1316.2±403.3  1169.9±310.9  1084.2±344.3  537.2±391.9  376.1±232.9
虽然本发明已结合具体实施方式和附图揭露如上，但其并非用以限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以对本发明作出修改或变更。因此，本发明的保护范围当以权利要求所界定为准。