改善细胞对杂质粒子渗透性的方法.pdf

本发明提供了一种方法，用于允许杂质离子非常有效的渗透细胞的细胞壁、细胞膜、细胞器官膜和/或核膜，并与细胞中的补体靶分子杂交或结合。所述细胞来自培养基或来自病人体内获得的样本。杂质离子可以是探针，所述探针由以下物质单独或两个或两个以上的结合体组成，例如：DNA、RNA、肽核酸(PNA)、糖肽、脂肽、醣脂类或朊病毒。所述靶分子是一种细胞、一种细胞成分或者优选地一种病原体或病原体成分。所述病原体可以是例如细菌、真菌、酵母或者病毒。

权利要求书
1.  一种用于增加细胞壁、细胞膜和核膜渗透性的组合物，包括：GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、甲醇、氯化钠和脱氧胆酸钠。

2.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述硫氰酸胍的浓度大约是2.0到3.3M。

3.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述Tris-HCL的浓度大约是10到100mM。

4.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述Tris-HCL的pH值大约是7.0到9.0。

5.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述乙二胺四乙酸的浓度大约是5到50mM。

6.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述IGEPAL的浓度大约是百分之0.1到百分之2.0。

7.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述乙酸的浓度大约是百分之1.0到百分之10。

8.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述甲醇的浓度大约是百分之20到百分之50。

9.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到百分之2.5。

10.  根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱氧胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到百分之2.5。

11.  一种用于对细胞中靶分子染色的方法，包括：a)使细胞与一种组合物相接触从而产生一种可渗透细胞，所述组合物包括GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、甲醇、氯化钠和脱氧胆酸钠；b)将步骤(a)的可渗透细胞与对结合所述靶分子有特异性的粘合剂相接触，和；c)检测步骤(b)所述的粘合剂。

12.  根据权利要求11所述的方法，其中所述靶分子选自由核酸、肽核酸、肽、糖蛋白、脂质体、脂蛋白、病毒和朊病毒所组成的组中。

13.  根据权利要求11所述的方法，其中所述粘合剂选自由核酸、肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白和脂质体所组成的组中。

14.  根据权利要求11所述的方法，其中所述粘合剂还包括一种检测基团。

15.  根据权利要求14所述的方法，其中检测基团选自由荧光标记物、放射性标记物、染料、胶态金属、生物素/抗生物素蛋白和山葵过氧化物酶所组成的组中。

16.  根据权利要求11所述的方法，其中所述检测作用是通过一种对所述粘合剂有亲合性的标记抗体完成的。

17.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述GuSCN的浓度大约是2.0到3.3M。

18.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述Tris-HCL的浓度大约是10到100mM。

19.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述Tris-HCL的pH值大约是7.0到9.0。

20.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述乙二胺四乙酸的浓度大约是5到50mM。

21.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述IGEPAL的浓度大约是百分之0.1到百分之2.0。

22.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述乙酸的浓度大约是百分之1.0到百分之10。

23.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述甲醇的浓度大约是百分之20到百分之50。

24.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到百分之2.5。

25.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述脱氧胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到百分之2.5。

26.  根据权利要求11所述的方法，其中所述靶分子是一种来自微生物结核分枝杆菌的核酸。

27.  根据权利要求11所述的方法，其中所述粘合剂是一种与来自微生物结核分枝杆菌的核酸互补的寡聚核苷酸。

28.  根据权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括背景染色法。

说明书改善细胞对杂质粒子渗透性的方法
技术领域
[0001]本发明涉及改善细胞对杂质离子渗透性的组合物和方法，所述杂质离子包括本发明的探针。
背景技术
[0002]细胞是活的生物体的基本单位。几乎所有细胞的一个共有的特征是他们都被细胞质膜所环绕(或约束)。细胞膜包裹细胞内含物并调节物质运动进出细胞。只有能够扩散穿过细胞膜或被运输穿过细胞膜的分子肯以移动进出细胞。有些可以穿过脂质中心，有些必须从空中穿过。还有一些其它的分子，必须以一种能量依赖的形式与载体相附着才能穿过细胞膜。同样，细胞核和其它细胞器官也具有膜结构来调节分子流动进入或流出细胞器官。
[0003]固定是一种化学过程，能够在一种位置“放置”细胞分子，从而可以研究细胞或组织。大多数用作固定剂的试剂(例如，醇和醛，其中醇例如乙醇，醛例如多聚甲醛)是通过与细胞分子，尤其是蛋白质相交联而起作用的。这些交联过程防止胞内结构的降解。许多固定剂非常适于通过不同的识别方法来保护不同的胞内分子和结构物。以任意目的被选择的这些固定剂可以通过这些目的的特点所决定。
[0004]不幸的是，目前的固定方法经常会妨碍随后研究员或者医生进行的细胞内成分检测。换句话说，能够预防细胞降解和固定的方法同样可以妨碍许多依赖于大尺寸检测分子的不同类型的研究和诊断。据此，人们进行了很多努力来渗透细胞或在固定后制造渠道。
[0005]目前使用的在固定之后渗透细胞膜的方法并不是对所有样本都是有效的，且十分严格(因此，破坏被研究的结构)和/或需要昂贵的仪器。例如，Hoffman等(美国专利第6,835,393号)公开了聚羧酸聚合物的应用和只用在无固定的样品中的用于破坏细胞膜的pH值。Connelly等人(美国专利第5,597,688和5,422,277号)公开了带有2，4-二硝基苯磺酸，2，4-二硝基安息香酸或2，4-二硝基苯的组合物在细胞膜固定和渗透方面的应用，但是这些组合物限制研究员或医生选择固定剂，且因此，限制必需的实验灵活性。机械性方法，例如超声波降解法、电穿孔等等通常只对未固定的样品起作用且需要昂贵的仪器。
[0006]另外，现有技术中对许多胞内靶分子，例如病原体来讲可利用的研究和诊断方法依赖于显微镜评价、细胞形态学参数、染色性质和确定的法分子的存在和缺失。但是，这些诊断方法中有许多并不完全准确或不足够灵敏。
[0007]目前最需要的是能够改进样品细胞膜对杂质粒子渗透性的组合物和方法，所述杂质粒子例如带标记的检测分子。另外，还需要的是能够改进胞内靶分子和病原体的检测的组合物和方法。
发明内容
[0008]在一个实施方案中，本实验通过体内杂交能够直接将靶分子或靶分子片断从细胞中检测出来，其中所述细胞来自细胞培养基或来自从病人身上获得的样品。在一种优选地实施方案中，所述细胞是病原体。该方法由几个步骤组成，这些步骤优选但不必须地按照所列出的顺序进行。将培养基或样本中的样品沉淀到玻璃板上。将样品在玻璃板上用加热或者用固定剂固定。所述固定剂可以是，例如，甲醇、甲醇乙酸、丙酮、甲醛或福尔马林。用IDF溶液处理固定样品(参见上下文)，并对样品进行染色或用探针检测并观察。作为选择，将样本与IDF溶液相混合、培养，然后涂抹或放置在玻璃板上，风干并固定。IDF溶液可以由以下试剂的任意混和物组成：离液盐(例如，硫代盐酸胍或氢氯化物)、离子型去污剂(例如十二烷基磺酸钠)和/或非离子型去污剂(例如，IPGEL、脱氧胆酸、胆酸或胆汁盐类)或其他具有相似性质的试剂、甲醇和乙酸。各种试剂在IDF溶液中的浓度依赖于例如被检测的病原体的细胞壁。尽管本发明不受任何理论或机制的限制，但是应该相信，IDF溶液能够在病原体的细胞壁和/或膜(细胞膜或核膜)上制造“渠道”。这些渠道允许探针渗透细胞壁和细胞膜并进入病原体原生质和/或细胞核。本发明的探针可以包括DNA、RNA、PNA、肽、糖肽、脂肽或醣脂类，或上述物质的任意混和物。样品中被固定的细胞的靶分子与探针复合物(所述探针复合物包括对靶分子有特异性的结合试剂)相接触，所述探针复合物在适于杂交或结合的情况下对靶分子具有特异性(例如，如Shah和Harris在美国专利第6,165,723中描述的那样，该专利通过引证在此全部并入本文)。然后，从样品中洗掉未杂交的或未结合的探针。在一个实施方案中，对被洗涤的样品用适当的复染色剂(例如，伊文思蓝、DAPI、高锰酸钾等等)染色。通过例如显微镜，视觉检测杂交的活结合的探针复合物，探针复合物的存在是细胞靶分子存在的一种信号。该方法可以在不同的杂交缓冲液中进行，Shah和Harris在美国专利第6,165,723号中公开了本发明的一些非限制性实施例，该专利通过引证在此全部并入本文。使用的杂交缓冲液由使用的探针性质决定。本发明的方法对于检测细胞、细胞要素是有效的，且优选地对检测样本的病原体也是有效的。例如，这里公开了非限制性的特异性探针复合物，所述复合物可有效用于检测分歧杆菌类病原体。
[0009]本发明的方法在例如检测来自多种样本的核酸、肽、醣肽、脂肽和醣脂是有效的。作为例子的样本包括，例如，细胞、细胞型、组织或重要的病原或病原体，包括，或者衍生自例如血清、原生质、唾液、尿、脑脊髓液、组织和乳液。本发明的组合物和方法可以在来自任意生物的任何样本中使用，所述生物包括但不仅限于哺乳动物、爬行动物、鱼、鸟、植物和昆虫。
[0010]在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加细胞壁、细胞膜、细胞器官膜和核膜渗透性的组合物(IDF溶液)，所述组合物在一个实施方案中包括：GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCl、乙二胺二乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙氧基)乙醇)、醋酸、甲醇、胆酸钠和脱氧胆酸钠。本发明进一步预计硫氰酸胍的浓度是大约2.0到3.3M；Tris-HCl的浓度大约是10到100mM；Tris-HCl的pH值大约是7.0-9.0；乙二胺二乙酸的浓度大约是5到50mM；IGEPAL的浓度大约是百分之0.1到2.0；醋酸的浓度大约是百分之0.1到10.0；甲醇的浓度大约是百分之20到50；胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到2.5，脱氧胆酸钠的浓度大约是百分之0.02到2.5。
[0011]在其他实施方案中，硫氰酸胍缓冲液被浓度为大约2M到6M的盐酸胍所取代。在另一个实施方案中，IGEPAL被浓度为0.01％-2.0％的十二烷基磺酸钠所取代。在依旧另一个实施方案中，硫氰酸胍与盐酸胍结合使用和/或IGEPAL与十二烷基磺酸钠结合使用。
[0012]在一个实施方案中，本发明提供了一种用于给细胞中靶分子染色的方法，该方法包括：a)将细胞与包括GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCl、乙二胺二乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙氧基)乙醇)、醋酸、甲醇和脱氧胆酸钠的组合物相接触从而产生一种具有通透性的细胞；b)将步骤a)所得的具有通透性的细胞与一种能够与所述靶分子特异性结合的结合试剂相接触，和c)检测步骤b)所述的结合试剂。
[0013]在其他方面，本申请预期上述方法的靶分子选自由，例如核酸、肽核酸、肽、糖蛋白、脂类、脂蛋白、病毒、朊病毒和支原体所组成的组中。
[0014]在其他实施方案中，本发明预期结合试剂选自由核酸、肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白、抗体或抗体片断和脂类所组成的组中。
[0015]本发明的结合试剂可以另外包括一种检测基团，此检测基团可以选自由例如荧光标记、放射性标记、染料、胶态金属、生物素/抗生素蛋白、山葵、过氧化物酶等等所组成的组中。在一种有选的实施方案中，检测是通过一种标记的抗体，该抗体对靶分子抗原具有亲和性。一种包括检测基团的结合试剂在这里被定义为探针复合物。
[0016]在一个实施方案中，在试管中用IDF溶液处理临床样品，随后煮沸从而在溶液中释放核酸。这一技术对于靶分子，例如分歧杆菌、真菌和酵母是有效的，其中所述酵母需要利用例如机械水解(例如，通过超生作用)或与酶长时间培养的方法来消化细胞壁。重要的靶分子可以进一步被以下步骤纯化：(1)标准DNA纯化技术或(2)使用特异性探针进行三明治杂交技术。然后如果需要的话，在检测之间可以分别通过PCR或RT-PCR技术扩增纯化的靶分子DNA和RNA。
[0017]在一种更为优选的实施方案中，靶分子是来自肺结核分歧杆菌微生物的核酸，且结合试剂是一种与来自肺结核分歧杆菌微生物的核酸互补的寡聚核苷酸(或PNA探针)。
[0018]在另一个方面，该方法还包括背景染色从而更高的加亮或显现检测基团。背景染色和染色技术对于本领域普通技术人员来讲是已知的。
具体实施方式
[0019]本发明基于一种发现，此发现是一种改进的方法，此方法通过体内杂交的方式能够使探针渗透进细胞(例如一种病原体)的细胞壁和/或细胞膜，从而检测来自培养基或个体(例如，血涂片、活组织检查切片、石蜡包裹的组织和)样本的细胞中靶分子核酸、蛋白质、肽、脂肽、醣肽、脂质体等等的存在。本发明的方法尤其适合于检测对病原体有特异性的核苷序列，所述病原体可以在例如，唾液、全血、中枢脊髓液(CSF)、其他体液或受感染的组织中发现。更具体的，这里描述了对于传统的固定/预处理方法的新型改进，这种改进允许探针(例如，寡居核苷探针)渗透进入细胞(例如，病原菌，比如，细菌、病毒、真菌、酵母和原生动物)，这些可以位于被感染的宿主细胞的内侧或外侧。另外，在与荧光标记的探针进行杂交之后进行一种具有复染剂(例如，DAPI、伊文斯蓝、高锰酸钾)的过程，从而允许带有杂交探针的生物体在培养基或临床样品中更加容易观察到。
[0020]这里描述的新颖独特的体内杂交预处理过程、检测技术和本发明组合物允许在细胞、微生物或组织部分中使用重组DNA、RNA、PNA、肽、醣蛋白、脂类和醣脂作为探针，且与细菌学、寄生虫学、组织学和病理学实验中常用的显微镜检查方法相匹配。本发明对样品细胞(或组织)使用了经过预处理的核苷序列的核酸探针，并通过例如显微镜、电子显微镜、流式细胞计数或放射成像(例如，X-射线成像、磷成像)的方法检测样品，从而确定哪些细胞(或组织)含有重要的特异性靶分子(例如核酸序列)。因此，在感染的全血涂片或组织切片中，病原微生物例如细菌、病毒、原生动物或真菌可以在被感染的细胞之内检测出来。这种方法提供了游泳的诊断和科学信息，因为特异性核酸的存在或缺失与一种或一种以上的可观察到的结构和形态学有关，且在这种情况下，提供了临床诊断和预后。
[0021]用于从标本中直接发现靶分子核酸片段的方法有以下步骤组成，优选的，这些步骤按照所列顺序进行。首先将从个体处获得的样品放置在载玻片上。用固定剂(例如，甲醇、甲醇-乙酸固定剂或者福尔马林醋酸固定液)将样品固定在载玻片上。一旦样品被固定，用本发明的组合物和方法渗透样品细胞。做为选择，在试管中将样品与IDF溶液混合，培养然后放置在载玻片上，风干并固定。然后，在适于杂交的条件下用对靶分子有特异性的探针接触细胞。
[0022]在杂交足够时间之后，从样本中洗去所有未杂交的探针。在一种优选的实施方案中，随后将样品与一种复染色剂(例如，伊文思蓝、高锰酸钾等等)相接触。无论样品是否被复染色了，则与样品靶分子杂交探针可以通过例如显微镜检查法进行视觉检测。在样本中探针的存在是靶分子片段存在的一种表现。与本发明原位杂交试验同时或者顺序进行的复染色样品能够清除的确定样品中靶分子的位置，从而提高本发明方法。这种信息有助于更清楚的确定基质杂交作用。
[0023]本方法适用于从个体获得的任何样品。这包括但不仅限于，全血、血清、血浆、痰液、尿、母乳、大脑脊髓液和组织。本方法还适合于探测昆虫质粒、昆虫细胞、植物细胞、真菌和细菌细胞内的病原体或者其他靶分子。
[0024]固定细胞或者组织的目的是将细胞固定并保持细胞或者组织的形态学，使细胞成分，例如，RNA在原位杂交期间被维持在细胞基质之内，并同时交联和/或沉淀在细胞基质中的蛋白质，因此细胞或者组织对探针渗入和随后的杂化作用保持基本上开放的结构。
[0025]在一种优选的实施方案中，本发明的探针包括，例如合成的或者生物学上生产的核酸(DNA、RNA和等价物)；；肽核酸(PNA；和等价物)；包含特异性核酸的肽(和等价物)或者在精确条件下与特异性细胞靶分子杂交的肽序列。在另一实施方案中，本发明的探针包括合成的或者生物学上生产的糖肽、脂肽和朊病毒或者在精确的条件下与细胞内特定的靶分子结合的朊病毒-样分子(或者其等价物)。
[0026]探针复合物的定义是包括一种标记物基团的探针，所述标记物基团适合于检测过程。如果探针是一种核酸，标记物基团附属于5′末端、3′末端、内部或者在其任何一种结合物中。优选的标记物基团是一种识别标记，例如放射性同位素示踪(例如，p32、I125、H3)、生物素标记或者荧光标记。做为选择，所述探针具有一种标记的聚脱氧核苷酸尾部，该聚脱氧核苷酸尾部被用来检测探针复合物。该探针复合物可能还由多种不同的核酸序列、PNA、肽、糖肽、脂肽或者朊病毒或者包括一个或一个以上标记物基团标记的其任何一种结合物组成。如果大于一个一个探针基团被标记，则最好用不同的标记物基团来标记每一探针基团。
[0027]寡聚核苷酸探针的核苷酸序列核苷酸序列基本上与至少至少一部分靶分子靶分子核酸互补。靶分子核酸既是一种在固定细胞或者组织之内正常存在的核酸，又是，做为选择，在与异常或者病理状态有关的细胞或者组织中通常不存在的细胞。每种探针复合分子优选由DNA或者RNA片段组成，DNA或者RNA片段的大小在大约10-50个核苷范围内。
[0028]肽探针包括，例如，抗体及已知能够结合规定的靶分子或靶分子范围的其他分子。非抗体探针的实施例包括，例如，酶和酶底物和其作用部分。另外，已知的药物或者化学试剂可以选择性地结合靶分子蛋白质(例如，抗生素可以结合细菌)。例如，脂肽具有在细胞中检测脂质体基团的用途，所述细胞包括细胞中的特异性细胞器或者细胞器部分和内在化细菌。例如，糖肽妨碍血小板凝聚并因此可以用来靶向在血小板起作用过程中必需的分子，由此帮助凝结异常的研究和诊断。朊病毒或者朊病毒一部分可以被用作，例如，对神经学组织的探针。同样，朊病毒可以是固定样品中的靶分子。
[0029]在一种优选的实施方案中，被添加给样品的探针多于靶分子(例如，10∶1、100∶1或者1000∶1)。这可以使杂交杂交反应有效地进行并促进探针∶靶分子的结合。
[0030]通常通过在样品上添加一种探针溶液，使探针复合物(包括，例如，DNA、RNA和/或PNA)与固定样品的样品靶分子(例如，核酸)相接触。适合于杂交作用的示范性的条件是能够提供适当的缓冲液环境的溶液。适用于杂交作用的溶液的一些实施例是：1)一种包括大约10％到50％的甲酰胺、2X.SSC(pH 7.4)和1％NP40的缓冲液；2)一种包括大约1.5M到4M的GuSCN缓冲液、5M GuSCN原料缓冲液的缓冲液；其中GuSCN原料缓冲液由5M GuSCN、100mM Tris-HCl(pH 7.8)、40mM乙二胺四乙酸、1％NP40所组成。通过加入IxTE pH 7.8来稀释库存缓冲液到指定的GuSCN摩尔浓度，从而产生上面提到的GuSCN缓冲液的摩尔浓度。3)一种包括大约2到6M GuHCl缓冲液的缓冲液。8M GuHCl缓冲液由8M GuHCl、200mM Tris-HCl、(pH 7.8)、40mM乙二胺四乙酸、1％NP40所组成。通过加入IxTE pH 7.8来稀释库存缓冲液到指定的GuHCl摩尔浓度，从而产生上面提到的GuHCl缓冲液的摩尔浓度。4)一种包括甲酰胺(20-50％)和GuSCN缓冲液的混合物的缓冲液，(例如，0.5M到3M)。5)一种包括GuSCN缓冲液、(例如0.5M到3M)和GuHCL缓冲液(例如IM到5M)的混合物的缓冲液。
[0031]具体的组合物和杂交缓冲液的浓度随探针的种类或使用的探针组合物的不同而变化。组合物和使用的缓冲液的浓度还依赖探针的于Tm(熔化温度：双链DNA分离形成两个互补单链的温度)、探针序列、探针长度和杂交温度，本领域技术人员只需进行常规实验方法就可以确定所述组合物和使用的缓冲液浓度。
[0032]本发明不局限于任何一种具体的杂交温度，然而，应该理解，在杂交缓冲液中利用甲酰胺可以使杂交作用在比标准杂交过程低得多的温度下进行。例如，在水相杂交缓冲液，例如氯化钠中，对靶分子有特异性(对宿主细胞没有特异性)的普通探针复合物通常需要的温度大约是60-65摄氏度。在上述杂交液1)中进行的相同杂交作用在大约42摄氏度下进行，且具有相等的特异性。
[0033]同样，GuSCN的使用也能够使杂交作用在比标准杂交过程低得多的温度下进行。例如，在普通步骤中，在水相杂交缓冲液，例如氯化钠中，对靶分子有特异性(对宿主细胞没有特异性)的普通探针复合物通常需要的温度大约是60-65摄氏度。在GuSCN或者GuHCl杂交缓冲液中进行的相同杂交作用在大约37摄氏度下进行，且具有相等的特异性。
[0034]在杂交作用完成之后，通常通过使用一系列洗涤缓冲液洗涤从样品中洗去未杂交的探针。本领域技术人员能够确定适当的洗涤缓冲液和洗涤时间。在一个实施方案中，洗涤缓冲液包括0.3M的氯化钠、0.03M的柠檬酸钠、和0.1％SDS。另一种适当的洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
[0035]在洗清之后，可以对样品进行复染色。在一个实施方案中，背景的复染色能够提高杂交探针的显色。优选的复染色剂是，例如，DAPI、伊文思蓝和高锰酸钾。本领域技术人员已知一些其他适当的复染色剂。当使用荧光标记的探针来检测对靶分子有特异性的核酸、蛋白质、糖蛋白和脂蛋白时，通常会用到染色步骤。尽管有一定帮助，但是本发明的实施方案不需要进行复染色。
[0036]通过使用适合特异性基团的方法来检测探针，其中所述特异性基团被用于标记探针复合物。检测荧光标记探针的优选的方法是使用例如，特殊的绿色、红色和蓝色显微镜过滤器(即，荧光显微镜检查法)。通过例如自动射线照相术和磷光剂成像技术可以检测到杂交的放射性标记探针。生物素标记的探针可以通过酶催化检测系统检测，这种检测系统是可商业购得的。
[0037]通过与探针复合物进行反应，上面描述的方法可以在单一临床样品中同时检测到不同的病原体，所述探针复合物由许多不同的核酸序列组成，每个都用不同的标记物基团标记。为了同时检测不同的寡聚核苷酸探针，它们可以被设计成所有的探针复合序列具有非常相似的Tm(熔化温度)值，其中，所述寡聚核苷酸探针对存在于样品中的不同靶分子的不同核酸具有特异性。然后用不同的可检测基团(例如，不同的荧光基团)标记每一特异性寡聚核苷酸。用含有许多组分的探针复合物进行杂交。杂交的样品按照上边的表述进行处理，并通过适合于检测探针复合物不同标记的寡聚核苷酸的方法观察样品(例如，如果使用不同的荧光基团的话，则使用适当的过滤器观察)，从而检测在样品中存在哪些靶分子。
[0038]本领域普通技术人员和医师可以识别与这里描述的原位杂交过程共同使用的新型预处理过程与所有过去已知的监测方法和这里描述的方法兼容，且并不被使用的检测方法所限制。原位杂交过程已经被革新，因此需要更少的操作，且因此能够在很短的时间内进行。本发明的实施方案还包括试剂盒，所述试剂盒包括本发明的组合物。以试剂盒形式存在的组合物能够允许这里所描述的过程以多种不同的实施方案实施，这里描述的过程包括已经与多种检测方法进行简明性和兼容性优化的方法。可以预料，这里制备的包含特别制备的试剂和探针的试剂盒更适合于在临床/诊断实验室中应用，在临床/诊断实验室中，检测特异性核酸存在或者缺少的能力可以用来阳性地或者阴性地识别以具体靶分子的存在为特征的病理状态。
[0039]现有技术中对于多种细胞病变可用的诊断方法取决于微观评价、细胞形态学参数、表面抗点蚀特性、和某些靶分子的存在或者缺失。然而，许多诊断方法并不完全准确或者不充分敏感。在原位杂交过程忠使用上面描述的规程和病原体特异性探针，能够比较容易且更加准确的识别样品中的靶分子(包括但不限于，病原体)。
[0040]本发明提供了一种用于原位杂交过程的简单的预处理方法，这些方法提高了探针对细胞的渗入性，且因此，与过去所描述的过程相比改进了杂交和检测特性。这种改进包括通过增加特异性″信号″的杂交和探测效率来最大化试验的敏感性。尽管本发明不局限于任何一种具体的机制，人们普遍相信增加的灵敏度是由于改进的杂交过程，杂交过程是通过改进探针对细胞的渗透作用来实现的，同时最大化靶分子(例如核酸序列)在细胞或者组织中的保持力且最大化细胞或者组织样品的另一种生物化学和形态特征的保存。
实施例
[0041]一种上述方法优选的且非限制性使用在于从培养基或从痰液中检测结核分枝杆菌。本领域普通技术人员应该了解并理解，新型的方法同样适合于多种其他系统、细胞、组织培养和组织，用于与重要的特异性核酸杂交(或者检测靶细胞、组织或者病原体其他的细胞组分)，同时保持细胞完整和形态学。
实施例
[0042]将培养物或者病人的痰液涂在玻璃平板上，并风干。洗涤被培养的细胞并通过离心作用浓缩。将洗涤的细胞悬浮在带有BSA的磷酸盐缓冲液中。为了使细胞失活，在100摄氏度下煮沸悬浮的细胞15分钟。
样品制备方法1
[0043]用1)NALC/NaOH或2)NALC/NaOH处理痰液随后在100摄氏度下煮沸经过处理的痰液15分钟，使样品失活，或3)用离液序列高的溶液，例如，盐酸胍或硫代硫酸盐(简单的说，相对于痰液2-3个体积的5M GuSCN或8M的GuHCl相混合)处理痰液。在37摄氏度下培养样品20分钟。离心样品使细胞成球状。用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞。将洗涤后的细胞悬浮在带有1％BSA或4)一种离液序列高的溶液，例如，盐酸胍或硫代硫酸盐的磷酸盐缓冲溶液中，随后煮沸(如上面步骤3所述)，此外，在100摄氏度下煮沸悬浮在带有1％BSA磷酸缓冲液中的细胞15分钟，从而杀死分枝杆菌。随后将所得的培养物或痰液样品涂布到玻璃板上，然后风干。
[0044]用甲醇或乙酸甲酯或乙醇固定样品。用IDF溶液处理固定的涂片(如Supra所公开的)10分钟。10分钟之后，用磷酸缓冲液洗涤涂片3次，并风干。
样品制备方法2
[0045]将1体积的未处理过的病人痰液与两体积的IDF溶液(Supra)在试管中混合并在室温(20-25摄氏度)下混合15分钟。随后将痰液-IDF混合物涂布到玻璃板上，风干并用甲醇固定。省去杂交之前对固定涂片进行的IDF处理过程。在杂交之前用磷酸缓冲液洗涤玻璃板3次。
样品制备方法3
[0046]在20-25摄氏度下(室温条件下)用含有2％的戊二醛的磷酸缓冲液处理玻璃板上甲醇固定的痰液-IDF混合物5分钟，然后用磷酸缓冲液洗涤三次，并风干。省去杂交之前对固定涂片进行的IDF处理过程。
样品制备方法4
[0047]将1体积的未处理过的病人痰液与两体积的IDF溶液(Supra)在试管中混合并在室温(20-25摄氏度)下混合15分钟。将痰液-IDF混合物煮沸15分钟来释放溶液中的核酸并同时使样品无传染性。通过标准技术可以将核酸从煮沸的样品中纯化出来，或者所需要的靶分子核酸可以使用特异性探针和磁珠通过三明治杂交筛选出来，如Shah等人所述(Shah J.S.，King W，Liu J.，Smith J.，Serpe G.and Popoff S.，and.(1997).Assay improvements.美国专利第5,629,156号。该专利通过引证在此全部并入本文)。通过PCR(对于DNA靶分子)或RT-PCR(对于RNA靶分子)过程可以扩增纯化的靶分子。
样品探测
[0048]一种寡聚核苷酸探针由一种DNA序列组成，所述DNA序列能够特异性的与肺结核分歧杆菌的23S核糖体RNA杂交，如Shah，Nietupski和Liu(美国专利第5,521,300号)所述。所述寡聚核苷酸优选的用语检测细胞中肺结核分歧杆菌的存在。合适的探针复合物的例子是：
P1.TB探针
5′-罗丹明绿-AGA-ACA-CGC-CAC-TAT-TCA-CAC-GCG-CGT-ATG-C-3′[SEQ ID NO：1]66.5c
P2-Tb-151-2c
5′-罗丹明绿-TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3′[SEQ ID NO：2]
P3.分歧杆菌探针
5′-荧光淬灭基团-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAGCCG TGA GAT TTC-3′[SEQ ID NO：3]68.7c
P4-分歧杆菌属探针-54.1c 5′-荧光淬灭基团-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3′[SEQ ID NO：4]
P5-伯克霍尔德氏菌探针5′-FAM-CTT-GGC-TCT-AAT-ACA-GTC-GG-S′[SEQ BD NO：5]tm52c
PNA探针.
[0049]在一个实施方案中，在37摄氏度条件下，该探针复合物与经过固定/预处理的样品中的核酸相接触，其中，所述经过固定/预处理的样品位于2.5M GuSCN，50mM Tris(pH 7.8)，20mM乙二胺四乙酸和1％NP40的杂交缓冲液中。在一个可选择的实施方案中，该探针复合物在42摄氏度下与固定样品中的核酸相接触，所述固定样品位于50％甲酰胺，2X SSC(pH 7.4)，20mM乙二胺四乙酸，1％NP40的杂交缓冲液中。
[0050]用于检测分歧杆菌属的交替探针复合物中使用的合适的寡聚核苷酸序列的例子是：
P2-Tb-151-2c
5′-罗丹明绿-TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3′[SEQ ID NO：2]
P3.分歧杆菌属探针
5′-荧光淬灭基团-ATC GCC CGC ACG CTCACAGTTAAGCCGTGAGATTTC-3′
[SEQIDNO：3]68.7c
P4-分歧杆菌属探针-54.1c 5′-荧光淬灭基团-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3′[SEQ ID NO：4]
SEQ ID NOs：3和4及其互补序列适用于检测分歧杆菌属。SEQ ID NOs：1和2及其互补序列适用于检测肺结核分歧杆菌。SEQ ID NO：5适用于检测伯克霍尔德氏菌。
[0051]由于在细菌细胞中存在大量的rRNA(1,000-10,000拷贝)，所以在检测分歧杆菌病原体时选择使用核糖体RNA序列。优选的探针复合物的寡聚核苷酸是一种DNA，该DNA带有与肺结核分歧杆菌rRNA的互补序列。优选用荧光素在3’和5’末端对寡聚核苷酸进行标记。应当理解，RNA寡聚核苷酸探针同样也可以被使用。
[0052]如上所述，探针总量是一种预计的量，该量应该超过样品中可能具有的可利用rRNA的估计量(大约100∶1)，从而使杂交反应更为有效且能够促进高速率的探针∶靶分子退火。在定量术语中，这需要探针由30个核苷长度的寡聚核苷酸组成，且使用的浓度范围为1-10μg/ml，从而在背景上产生可靠的信号。
[0053]应当理解，使用GuSCN还能够使杂交过程在比普通杂交过程低得多的温度下进行。对靶分子有特异性(但对宿主细胞无特异性)的特异性探针在水相杂交溶液，例如氯化钠中进行杂交作用，需要大约60-65摄氏度的温度。但是在上述GuSCN或GuHCl杂交缓冲液中进行的杂交作用在37摄氏度下就可以确保专一性。
[0054]原位杂交方法的一个优势在于相对少量的细胞包括一种样品，大量的一致样品可以在短时间内被处理。这里所描述的独特的原位杂交方法是十分简单的。本发明的方法还可以用于很多样品中，包括，但不仅限于石蜡包裹的组织部分、丙酮固定的样品。
[0055]这些试验的结果显示出在被试验的样品中检测到靶分子(病原体DNA)，在对照样品中没有检测到靶分子。在用本发明IDF溶液处理过的样品中检测到的靶分子通常比较好。在不进行过度试验的情况下，本领域普通技术人员应当可以认识、理解并明白本发明的IDF溶液可以在许多需要探针(或其他小物质)有效进入细胞、病原体(例如，位于细胞中的病原体)或细胞器官的情况下使用。
[0056]从以上叙述可以明白，本发明提供了用于增加细胞、细胞壁、细胞膜、细胞器官和细胞器官膜渗透性的组合物和方法，用于帮助，例如检测细胞内成分和/或病原体。