获自传染性法氏囊病病毒（IBDV）的嵌合空心病毒样颗粒，其制备方法和应用.pdf

本发明公开了通过组装包括含有IBDV(传染性法氏囊病病毒)pVP2蛋白或所述IBDV pVP2的“1－n”片段的区域A，其中“n”是介于441－501之间的整数，以及包括含有目的多肽，例如可用于预防、治疗或诊断目的多肽的异源多肽的区域B，从而形成了获自所述传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空心病毒样颗粒。

权利要求书
1.   融合蛋白，包括含有传染性法氏囊病病毒(IBDV)的pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的区域A以及含有异源多肽的区域B，其中“n”是介于441-501之间的整数。

2.   权利要求1的融合蛋白，其中所述区域A由IBDV pVP2蛋白组成。

3.   权利要求1的融合蛋白，其中所述区域A由选自如下的所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段组成：
(i)pVP2-441，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基441之间的氨基酸序列组成；
(ii)pVP2-452，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基452之间的氨基酸序列组成；
(iii)pVP2-456，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基456之间的氨基酸序列组成；
(iv)pVP2-466，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基466之间的氨基酸序列组成；
(v)pVP2-476，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基476之间的氨基酸序列组成；
(vi)pVP2-487，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基487之间的氨基酸序列组成；
(vii)pVP2-494，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基494之间的氨基酸序列组成；以及
(viii)pVP2-501，其氨基酸序列由IBDV pVP2蛋白的残基1至残基501之间的氨基酸序列组成。

4.   权利要求1的融合蛋白，其中所述区域B结合于所述IBDVpVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的氨基末端区域。

5.   权利要求1的融合蛋白，其中所述区域B结合于所述IBDVpVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的羧基末端区域。

6.   权利要求1的融合蛋白，其中所述异源多肽包括目的多肽，所述目的多肽是可用于接种疫苗、治疗或诊断的多肽。

7.   权利要求1的融合蛋白，其中所述区域B包括异源多肽，所述异源多肽包括单一目的多肽。

8.   权利要求1的融合蛋白，其中所述区域B包括异源多肽，所述异源多肽包括两个或更多个目的多肽。

9.   权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括区域A和单一区域B。

10.   权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括区域A和两个相同或不同的区域B，其中所述区域B之一结合于存在于区域A中的所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的氨基末端区域，而另一区域B则结合于存在于区域A中的所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的羧基末端区域。

11.   权利要求10的融合蛋白，其中每个区域B都含有异源多肽，所述异源多肽包括一个或者多个相同或不同的多肽。

12.   权利要求1-11任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包括位于所述区域A和区域B之间的连接多肽。

13.   嵌合空心病毒样颗粒，包括权利要求1-12任一项所述的至少一种融合蛋白。

14.   核酸，包括编码权利要求1-12任一项所限定的融合蛋白的核苷酸序列。

15.   表达盒，包括可操作地结合于转录，以及任选的翻译，控制元件的权利要求14的核酸。

16.   重组载体，包括权利要求14的核酸。

17.   权利要求16的载体，其中所述载体选自任选的具有异源复制原点的质粒，杆粒，酵母人工染色体(YACs)，细菌人工染色体(BACs)，基于噬菌体P1的人工染色体(PACs)，粘粒，或病毒。

18.   宿主细胞，含有权利要求14的核酸，或权利要求15的表达盒，或权利要求16或17任一项的重组载体。

19.   由权利要求14的核酸序列转化的宿主细胞。

20.   用权利要求16或17任一项的重组载体转化，转染或感染的宿主细胞。

21.   权利要求18-20任一项的宿主细胞，其中的细胞是哺乳动物细胞，鸟细胞，昆虫细胞或酵母细胞。

22.   制备权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒的方法，包括培养权利要求18-21任一项的宿主细胞，并且，如果需要的话，回收所述嵌合空心病毒样颗粒。

23.   权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞，所述方法包括(i)在允许表达所述融合蛋白及其组装从而形成权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒，IBDC CVLP-pVP2s*的条件下，培养用含有编码权利要求1-12任一项的融合蛋白的核酸的重组杆状病毒感染的昆虫细胞，并且，如果需要的话，(ii)分离且任选纯化所述IBDC CVLP-pVP2s*。

24.   权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是酵母，所述方法包括(i)在允许表达所述融合蛋白及其组装从而形成权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒，IBDC CVLP-pVP2s*的条件下，培养用含有编码权利要求1-12任一项的融合蛋白的核酸的重组载体转化的酵母细胞，并且，如果需要的话，(ii)分离且任选纯化所述IBDC CVLP-pVP2s*。

25.   权利要求16或17任一项的重组载体在制备和获得权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒中的应用。

26.   权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒在制备药物组合物中的应用。

27.   权利要求26的用途，其中所述药物组合物是疫苗，基因治疗载体或活性物质递送系统。

28.   药物组合物，含有治疗有效量的权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒，任选地连同药物可接受佐剂和/或介质。

29.   权利要求28的药物组合物，其中所述药物组合物是疫苗，基因治疗载体或活性物质递送系统。

30.   疫苗，含有治疗有效量的权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒，任选地连同药物可接受的佐剂和/或介质。

31.   权利要求30的疫苗，其中所述疫苗保护动物和人类抵抗由两种或更多种诱导疾病的感染媒介物引起的感染。

32.   基因治疗载体，含有权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒。

33.   活性物质递送系统，包括权利要求13的嵌合空心病毒样颗粒以及活性物质。

说明书获自传染性法氏囊病病毒（IBDV）的嵌合空心病毒样颗粒，其制备方法和应用
发明领域
本发明涉及制备获自传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空心病毒样颗粒及其应用。
发明背景
病毒样颗粒是在核酸和蛋白的包装和运输过程中特化的结构。病毒样颗粒的普遍特征是其能够刺激宿主免疫反应的良好能力。这些性质使得病毒样颗粒成为了在开发细胞内递送系统和生产亚单位疫苗中备受关注的介质。采用不同的基因表达系统能够辅助产生若干病毒，例如轮状病毒(US 2003/0175301)，逆转录病毒(US 6,602,705)，细小病毒(US 6,458,362)等病毒的空心病毒衣壳或病毒样颗粒(VLPs)。对这些表达系统的遗传操作又反过来可允许制备其蛋白不同于那些形成天然病毒衣壳的含有异源氨基酸序列的VLPs。这些VLPs通常称为异型，重组或嵌合VLPs(CVLPs)，且其主要用于两种目的：(i)通过免疫遗传相关的异源肽产生多价疫苗，以及(ii)通过插入参与受体-配基互作的氨基酸序列修饰趋向性。
传染性法氏囊病病毒(IBDV)，隶属于双核糖核酸病毒科，感染若干禽类物种且直接导致传染性法氏囊病，这是一种能够在世界范围家禽业中引起相当规模经济损失的严重免疫抑制疾病。
IBDV颗粒是具有T＝13对称性的二十面体，其缺乏包膜，并且是由单蛋白层形成的。迄今为止，旨在获得IBDV颗粒原子模型的方法均告失败。出于这个原因，对于其结构可获得的信息是基于对纯化病毒和VLPs的冷冻电镜术所得影像而产生的三位模型。基于这些研究，现已观察到所述颗粒的外表面是由260个蛋白VP2(37kDa)三聚体的连续格珊以五种不同构象排列形成的。所述颗粒的内侧含有200个蛋白VP3(29kDa)三聚体，后者之间相互独立，都结合于VP2三聚体的基部区域。一般认为第三种多肽，VP4(28kDa)，也可以是所述颗粒的一部分，位于形成二十面体结构角的五聚体基部。
多肽VP2，VP3和VP4是对大小为109kDa的前体多肽进行蛋白水解处理来制备的。这种前体是自动催化处理的，从而释放出多肽pVP2(48kDa)，VP3和VP4。VP4结构域，位于所述多聚蛋白的中部区域，属于离子蛋白酶家族且负责蛋白水解切割。多肽pVP2和VP3直接负责组装衣壳。在形成所述蛋白的成熟形式，即在纯化颗粒中所发现的形式，VP2之前，所述pVP2产物在其C-末端经历了最后的切割。这种pVP2处理是正确形成所述衣壳所必需的，并需要VP3的存在，尽管所负责的蛋白酶尚未鉴定出来。
形态发生是病毒周期的关键过程，其需要与前体多肽中修饰相关的连续步骤。结果是，病毒发展了策略，允许在其每种成分之间的连续和正确的互作。这些策略之一，通常是为二十面体病毒所采用的，是将单一多聚蛋白的多肽用作其结构成分的基础。在这些情况下，对所述多聚蛋白的正确蛋白水解处理在组装过程中具有至关重要的作用。
IBDV衣壳组装的这一原则已在早期工作中得到证明(Fernández-Arias A等，1998.感染性法氏囊病病毒ORF A1的表达导致了病毒样颗粒的形成“Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virusresults in the formation of virus-like particles”.Journal of GeneralVirology 79：1047-1054)。编码IBDV多聚蛋白的基因在真核细胞中的表达导致了VLP的形成，其与IBDV病毒颗粒在形态学和生物化学上完全不可区别。还观察到衣壳组装仅需要病毒多聚蛋白的合成和正确处理，并独立于病毒基因组的存在或独立于由病毒基因组编码的其他蛋白，诸如VP5和VP1蛋白。
迄今为止，从不同重组系统中表达IBDV基因所得的结果能够允许的情况包括：i)所述组装过程独立于所述病毒遗传材料而存在，ii)只有由多聚蛋白基因编码的那些多肽是组装所必需的，以及iii)组装需要多肽VP2和VP3之间的协同互作。
然而，尚不清楚的是，是否pVP2/VP3互作是建立在所述前体多聚蛋白的VP2和VP3结构域之间的，即使是在其未经修饰的情况下，或者是否，相反地，这一互作发生在所述前体的处理之后。进而言之，现有的信息并未排除这样的可能性，即VP4也可以在衣壳形态发生过程中起到相关的作用。事实上，由IBDV VP2，VP3和VP4蛋白的组装所形成的IBDV VLPs已被公开(US 6,528,063；US 5,788,970和JP5194597)。
由本工作发明人所开发的工作可允许通过使用不同的真核表达载体来建立旨在获得IBDV VLPs的系统。这些载体被用于在缺乏或存在病毒聚合酶RNA VP1的条件下表达所述IBDV多聚蛋白。纯化VLPs的生物化学表征表明当仅有所述多聚蛋白表达时，其含有pVP2，VP2和VP3蛋白，而当所述多聚蛋白和病毒聚合酶RNA同时表达时，其含有pVP2，VP2，VP3和VP1蛋白(Fernández-Arias A等，1998.感染性法氏囊病病毒ORF A1的表达导致了病毒样颗粒的形成“Expression ofORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles”.Journal of General Virology 79：1047-1054；Martínez-Torrecuadrada JL等，2000.在表达于昆虫细胞中的感染性法氏囊病病毒衣壳蛋白的组装体中的不同架构“Different architectures inthe assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed ininsect cells”.Virology 278：322-331；Maraver A et al.2003.VP3的寡聚化结构域，感染性法氏囊病病毒的脚手架蛋白，在衣壳形成中具有重要作用“The oligomerization domain of VP3，the scaffolding protein ofinfectious bursal disease virus，plays a critical role for capsid formation”.Journal of Virology 77：6438-49；Lombardo E et al.1999.VP1，VP1，推测的感染性法氏囊病病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，与衣壳蛋白VP3形成了复合物，导致了进入病毒样颗粒的有效壳体化“the putativeRNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，formscomplexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidationinto virus-like particles”.Journal of Virology 73：6973-6983)。
顺便提及，专利文件WO 02/088339公开了通过组装包括在其末端的羧基末端结合于多肽的IBDV多聚蛋白的嵌合蛋白而形成的IBDV病毒样颗粒。
将仅仅基于IBDV pVP2蛋白，或其片段，融合于目的多肽的CVLPs，或其潜在的作为疫苗或作为感兴趣产物的载体的用途，在此之前尚未进行过描述。
发明概述
本发明面临的问题是提供新的工具来在载体，目的产物，例如具有生物学活性的分子，例如药物，多肽，蛋白，核酸等中进行载体化或整合。
本发明所提供的解决方案是基于发明人观察到，作为表达IBDVpVP2蛋白或者是能够自我组装并形成所述病毒样颗粒的所述蛋白的片段的结果，有可能获得得自IBDV的嵌合空心病毒样颗粒，其可进行遗传修饰从而包括编码含有目的多肽的异源多肽的核苷酸序列，在本说明书中一般称为IBDV CVLP-pVP2S*。事实上，发明人还观察到，全长IBDV pVP2蛋白，或直到501，通常为441-466，在IBDV pVP2蛋白1位氨基酸之后开始连续氨基酸残基的所述蛋白的片段，可融合于异源多肽，且由此所得的所述融合(嵌合)蛋白可组装到一起并形成CVLPs，特别是所述CVLP-pVP2s*，其在特异性和与细胞相互作用方面具有与那些天然病毒衣壳相类似的性质，且可对其进行深入操作从而针对于其他靶细胞。
所述IBDV CVLP-pVP2s*是通过组装包括含有IBDV pVP2蛋白或包括同源于所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段序列的至少一种序列的IBDV pVP2蛋白片段的区域A，其中“n”是介于441和501之间的整数，以及含有异源多肽的区域B，其中所述区域B结合于所述IBDVpVP2*蛋白的氨基或羧基末端，而形成的。在一个实施方案中，所述异源多肽含有目的多肽，例如用于接种(免疫)，治疗，诊断等的多肽。因此，所述CVLP-pVP2s*可用于保健目的，例如治疗，预防或预防，或诊断等目的，例如用于疫苗，基因治疗载体等的制备。
发明人进行的研究令人惊奇地表明有可能获得通过组装含有如下成分的融合蛋白来形成CVLPs(i)IBDV pVP2蛋白片段(例如，具有441-501，优选为441-466，从IBDV pVP2蛋白的1位氨基酸之后开始的连续氨基酸残基)，和(ii)异源氨基酸序列，且所述异源氨基酸序列并非形成所述CVLP的障碍。本发明人还观察到，所述CVLPs可用于有效地免疫鸟类来抵抗由IBDV诱导的感染，或可有效地防护动物免受由其他的偶然制剂所诱导的感染(依赖于存在于所述CVLPs中的异源氨基酸序列以及包含于所述序列中的抗原/免疫原)。
在特定的实施方案中，本发明人获得了由融合蛋白组装物形成的CVLPs，所述组装物含有IBDV pVP2蛋白片段(例如，具有从IBDVpVP2蛋白的氨基酸1之后开始的441-466的pVP2片段)和异源氨基酸序列，例如组氨酸标签(实施例1)。在又一个特定的实施方案中，发明人还观察到通过表达IBDV pVP2蛋白片段，特别是在本说明书中鉴定为融合于含有FMDV B和T细胞表位(实施例3)的称为BT的口蹄疫病毒(FMDV)的嵌合肽的蛋白pVP2-456的片段来形成CVLP(Zhang，Q.等，2002，Acta Virologica 46(1)：1-9)。
与通过组装两个蛋白形成其他CVLPs的制备相比较(例如，IBDVpVP2蛋白和基于IBDV VP3蛋白的融合蛋白)，在操作所使用的表达载体的水平和产量水平上，根据单一蛋白(pVP2*)制备CVLP具有诸多优点。
因此，本发明的一个方面涉及包括含有，或由，IBDV pVP2蛋白或含有与IBDV pVP2蛋白的片段1-n同源的至少一条序列的所述IBDVpVP2蛋白的片段组成的区域A，其中“n”是介于441至501之间整数，和含有，或由，异源多肽组成的区域B的融合蛋白。在一个实施方案中，所述异源多肽含有目的多肽。为获得所述融合蛋白的方法构成了本发明的又一方面。
在另一方面，本发明涉及嵌合空心病毒样颗粒，在本说明书中一般称为IBDV CVLP-pVP2*(单数形式)或CVLP-pVP2s*(复数形式)，其特征在于其是通过组装在上文中所定义的所述融合蛋白而形成的。
本发明的又一方面涉及基于在上文中所定义的所述融合蛋白的基因表达，来制备由本发明所提供的所述IBDV CVLP-pVP2s*的方法。
开发来实施制备所述融合蛋白或所述IBDV CVLP-pVP2s*核酸，表达盒，重组载体和宿主细胞，及其制备所述IBDV CVLP-pVP2s*融合蛋白的用途构成了本发明的其他方面。
所述IBDV CVLP-pVP2s*具有在载体，目的产物，例如具有生物学活性的分子，例如药物，多肽，蛋白，抗体，核酸等中载体化或整合的能力。
因此，本发明的另一方面涉及使用所述IBDV CVLP-pVP2s*来制备药物组合物，例如疫苗、基因治疗载体和活性物质递送系统。所述疫苗、基因治疗载体和活性物质递送系统构成了本发明的其他方面。
附图的简要描述
图1所示为在N-末端具有或不具有His-标签的pVP2的C-末端缺失突变体的表达。通过使用抗-VP2(图1A，1B)和抗-His(图1C)多克隆抗体通过SDS-PAGE和Western杂交来分析不含有(图1A)和含有(图1B，9C)His-标签的pVP2/VP2表达突变体的集合。将每种突变体的相同体积细胞提取物上样，从而对pVP2/VP2突变体表达的相对水平进行比较。IBDV衣壳被用作阳性对照，并示出了对应于pVP2和VP2的位置。分子量标记在左侧以kDa示出。出于简化的目的，根据最后一个氨基酸的位置对pVP2/VP2突变体进行指明。为了确保VP3蛋白不出现并由此丢弃可能的污染情况，使用抗-VP3抗体(未示出)来控制Western杂交。
图2所示为对pVP2C-末端α-螺旋的分析。图2A所示为以单字母编码的，在缺乏(断线)或存在30％三氟乙醇(TFE)(连续线)的情况下，存在于PES缓冲液中FGFKDIIRAIRRI(SEQ ID NO：1)的肽的圆二色(CD)谱。在该图中可观察到在208和220nm的最小值和在195nm升高的椭圆形状。在图2B中，所示为1mTIM 241-250残基的二级结构。参见α螺旋的两性分子的本质。
图3所示为在使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶中对pVP2蛋白和HT-pVP2突变体的分析。图3A所示为pVP2C-末端区域的示意图，并示出了在突变体中被选择缺失的位置和序列。同样还生成了His-标签突变体的版本。具有标签(图3C)和没有标签(图3B)的突变体都在两个步骤中以高水平表达和离心；取12个组分并浓缩20倍，然后将每种组分上样1-10μl(0.1μl/HT-pVP2突变体)。通过SDS-PAGE对其进行分析并通过考马斯染色进行显色。星号指示的是使用抗-VP2抗体(VP2-512)通过Western印迹对凝胶进行分析。因为不能从第一蔗糖梯度中沉淀出来，所以VP2-487和VP2-494突变体并未形成充分稳定的结构来抵抗纯化条件(结果未显示)。在图3D中，示出了感染了IBDV细胞的IBDV蛋白的典型谱。沉淀方向是从左到右，且组分12代表了每种梯度的顶部。
图4所示为组装C-末端区域缺失突变体的pVP2的电子显微照片。图4A和4B所示为VP2-441和VP2-456突变体形成了具有对称性为T＝1的衣壳的颗粒，尽管事实上可通过12个十二面体颗粒(图4A中的箭头)形成一些与不稳定较大结构相关的残基。图4C，4D和4E所示为不同VP2-466组装体的照片：在底部组分中从其傅立叶变换(插入)推测所得的具有六边形排列的管状结构如图4C所示，图4D所示为具有T＝1的衣壳，断裂细管和解离材料作为主要结构的颗粒，以及在中间组分中获得的具有T＝13的衣壳的颗粒，而图4E所示为在顶部组分中具有T＝1的颗粒。
图5所示为对应于在C-末端区域具有缺失的突变体蛋白His-pVP2组装体进行电子显微术所获得的照片。将浓缩组分稀释(1/50)从而对所得组装体进行最适观察。图5A所示为HT-VP2-441的组装体：具有T＝1的衣壳结构和较大的十二面体组装体(箭头所示)。图5B所示为HT-VP2-466的组装体：存在于中间组分中具有T＝13和T＝7的衣壳的颗粒。图5C所示为在中间组分中具有衣壳T＝13和T＝7的HT-VP2-466颗粒的组装体。图5D，5E和5F所示为HT-VP2-476的组装体：在底部组分中有类型I的管状结构(图5D)，在中间组分中有T＝13和T＝7衣壳的颗粒以及具有管状组装体的片段(图5E)，以及在顶部组分中的不规则组装体(图5F)。小棒对应100nm的长度。
图6所示为IBDV衣壳的三维结构。图6A所示为IBDV衣壳的冷冻电子显微照片。小棒长度为50nm。图6B所示为沿二十面体对称的二维轴所见的所述IBDV衣壳外(左侧)和内(右侧)表面的示意图。表面图谱可由假定存在的780个VP2-441分子的和0.73cm3/g的值作为局部特异蛋白的体积来代表。为了清楚地看到包膜小孔，仅示出了所述图谱的正半球。五种类型的三聚体壳粒用字母a到e指出。小棒长度为
图7所示为HT-VP2-466衣壳的三维结构。图7A所示为HT-VP2-466组装体的冷冻电子显微照片(组分7)。小棒长度为50nm。圆圈围起具有对称性为T＝13，T＝7和可能为T＝1的三种可清晰区别的二十面体组装体。小棒长度为50nm。图7B所示为具有T＝13(左侧和中间)和T＝7(右侧)HT-VP2-466衣壳的三维结构。对这些密度图谱扩出轮廓从而包围780个(T＝13)或420个(T＝7)HT-VP2-466分子的体积。示出了HT-VP2-466的三聚体类型。小棒长度为
图8所示为IBDV和HT-VP2-466衣壳的结构比较。图8A所示为在分辨率为的条件下，对IBDV(连续线)和HT-VP2-466(点状线)3DR衣壳进行分析的密度谱图。除了细小的差异(箭头)，所述蛋白包膜()是实际上重叠的。图8B所示为对用于冷冻电镜术的IBDV和HT-VP2-466衣壳蛋白进行考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片。从等量的凝胶中对pVP2/VP2和VP3进行定量。图8C和8D所示为分别从IBDV和HT-VP2-466 3DR取得衣壳的横切面。蛋白和RNA是暗的。图8E所示为通过计算HT-VP2-466和IBDV衣壳之间的差异得到的图谱。所得图谱代表了沿着二维二十面体轴看到的IBDV衣壳的外表面。图8F所示为通过计算IBDV相对于HT-VP2-466衣壳之间的差异得到的差异图谱。去除这些差异，所得的图谱，具有132个主要的凸角，沿着二维二十面体看，示出了HT-VP2-466衣壳的内表面。每一个这些密度小岛，使用0.73cm3/g作为部分蛋白体积，相当于约26kDa。在另一方面，5-6拷贝442-446(2.6kDa)片段和His-标签(3.4kDa)的团块各自为31-37kDa。小棒长度为
图9所示为IBDV和HT-VP2-466衣壳的结构组成。IBDV(左半部分)和HT-VP2.466(右半部分)3DR衣壳的二十面体剖面以的分辨率示出，并在二维轴方向观察。从具有T＝13衣壳中心示出的所述二十面体剖面的垂直距离是(A)，(B)，(C)，(D)，(E)，(F)，(G)和(H)。所述面是由Facets程序产生的(由R.A.Crowther，MRC，Cambridge提供)。小棒长度是
图10所示为pVP2和HT-pVP2突变蛋白组装体。图10A所示为说明根据C-末端序列延伸，单独(VP2)或具有His-标签(HT-VP2)，通过具有不同C末端延伸的VP2而采用的组装体的示意图。所述肽的α-螺旋，以单字母编码描述的，443-GFKLDIIRAIR-453(SEQ ID NO：2)得以示出。必须注意的是，由于结合于VP2(或其His-标签版本)的C-末端序列长度有所增加，在具有T＝1的衣壳和管的结构之间的替换就存在一种平衡，从而有利于形成六面体管状结构。pVP2C-末端区域的全序列和在本发明中所使用的位点也一并示出。图10B所示为适用于在左侧SEQ ID NO：2肽的在上文中所提及α-螺旋的示意图。在图左侧示出的是用于本发明的两性α-螺旋和VP3 C-末端区域最后五个氨基酸(或类似VP3 His-标签(H-标签)区域的比对)之间的预期互补上样。VP3和H-标签序列以相反的方向，从C-末端到N-末端区域示出。
图11所示为含有通过组装IBDV pVP2-456蛋白和含有口蹄疫病毒的嵌合BT肽，或FMDV，表达于酵母中的B和T表位所形成的含有IBDV嵌合衣壳的不同组分(F6-F11)的Western印迹分析结果。上面的印迹所示为使用特异性IBDV抗-VP2抗体所得的结果，而下面的印迹所示则为使用特异性抗-FMDV抗体所得的结果。在形成衣壳时，由于存在产生蛋白质的聚集物，不同的免疫反应条带(多肽)，可以在上部的印迹中观察到；而相同的多肽可以被特异性的抗-FMDV抗体(下部图板)识别。对照(pESCURA/pVP2)以不能够为特异性抗-FMDV抗体识别的更小分子量表现出了针对特异抗-VP2抗体的免疫反应条带。
图12所示为在使用CVLP免疫小鼠之后三周使用针对口蹄疫病毒(FMDV)的抗体由ELISA分析所得的结果。
发明详述
在第一方面，本发明涉及融合蛋白，在下文中称为本发明的融合蛋白，其含有区域A，其包括，或由IBDV的pVP2蛋白或所述IBDVpVP2蛋白的1-n片段组成，其中“n”是介于441-501之间的整数，以及区域B，其含有，或由异源多肽组成。在一个实施方案中，所述异源多肽含有目的多肽。相对于区域A，区域B可位于氨基(N-)或羧基(C-)末端位置。
正如在本发明中所用到的，术语“IBDV”是指传染性法氏囊病病毒并包括属于任意已知血清型(1或2)的不同IBDV株[作为说明，参见van den Berg TP等人的综述，2000.Rev Sci Tech.19：509-43]。
术语“IBDV pVP2蛋白”一般是指这样的蛋白，其氨基酸序列包括，或由IBDV pVP2蛋白的氨基酸序列组成，并包括代表任意所述IBDV株[NCBI蛋白数据库]的任意不同的pVP2蛋白，如Sánchez和Rodríguez(1999)所定义的那样(Sánchez AB & Rodríguez JF.在传染性法氏囊病病毒的蛋白水解处理：通过位点指导的突变发生鉴定多聚蛋白剪切位点“Proteolytic processing in infectious bursal disease virus：identification of the polyprotein cleavage sites by site-directedmutagenesis”Virology.1999 Sep 15；262(1)：190-199)，也指基本上同源于所述IBDV pVP2蛋白的蛋白，即与某些IBDV pVP2蛋白的序列表现出良好比对的蛋白，例如其蛋白的氨基酸序列与所述IBDV pVP2蛋白的同一性程度为至少60％，优选为至少80％，更优选为至少90％，以及甚至更优选为95％。对于IBDV pVP2蛋白序列的序列同源性可由本领域所属技术人员在适合于比较序列的计算机程序，例如BLAST程序(Altschul et al.1997.Nucleic Acids Res.25：3389)帮助之下方便地进行鉴定。在特定的实施方案中，所述IBDV pVP2蛋白是IBDV pVP2蛋白Soroa株，其全长氨基酸序列存放于NCBI，登录号为AAD30136。
术语“所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段，其中“n”是介于441-501之间的整数”，一般是指这样的肽或蛋白，其氨基酸序列由介于所述IBDV pVP2蛋白的残基1和残基“n”之间的连续氨基酸序列组成，其中“n”是介于441-501之间的整数。因此，存在于由本发明所提供CVLP-pVP2s*中的，所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段，视情况而定，所具有的氨基酸序列是由从代表任意IBDV株的任意pVP2蛋白，例如IBDV pVP2蛋白Soroa株[NCBI，登录号AAD30136]的氨基酸1位残基开始，介于441和501连续氨基酸残基组成，主要是由其组成，或含有其。
所述IBDV pVP2蛋白的特定1-n片段是指以下的格式“pVP2-n”，其中“n”是之前所定义的。在特定的实施方案中，IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段选自：
(i)pVP2-441蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基441之间的连续氨基酸序列组成；
(ii)pVP2-452蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基452之间的连续氨基酸序列组成；
(iii)pVP2-456蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基456之间的连续氨基酸序列组成；
(iv)pVP2-466蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基466之间的连续氨基酸序列组成；
(v)pVP2-476蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基476之间的连续氨基酸序列组成；
(vi)pVP2-487蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基487之间的连续氨基酸序列组成；
(vii)pVP2-494蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基494之间的连续氨基酸序列组成；
(viii)pVP2-501蛋白，其氨基酸序列由介于IBDV pVP2蛋白的残基1至残基501之间的连续氨基酸序列组成。
本发明的融合蛋白含有区域A，其包括，或由IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段组成，其中“n”是介于441-501之间的整数，以及区域B，其含有，或由异源多肽组成。在一个实施方案中，本发明所述融合蛋白含有区域A，其包括IBDV pVP2蛋白或所述IBDVpVP2蛋白的1-n片段，其中“n”是介于441-501之间的整数。在另一个实施方案中，本发明所述融合蛋白包括由IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段组成的区域A，其中“n”是介于441-501之间的整数。在又一个实施方案中，本发明所述融合蛋白包括含有异源多肽的区域B。在又一个实施方案中，本发明所述融合蛋白包括由异源多肽组成的区域B。
在一个实施方案中，本发明所述融合蛋白包括结合于含有，或由异源多肽组成区域B的，含有，或由IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段组成的区域A，其中“n”是介于441-501之间的整数。在特定的实施方案中，所述区域B结合于所述IBDV pVP2蛋白的氨基末端区域，而在又一个实施方案中，所述区域B结合于所述IBDV pVP2蛋白的羧基末端区域。
在特定的实施方案中，所述区域A含有，或由IBDV pVP2蛋白组成。在这种情况下，形成本发明所述融合蛋白的区域A的IBDV pVP2蛋白可以是代表任意IBDV株，例如全长IBDV pVP2 Soroa株[NCBI，登录号AAD30136]的任意pVP2蛋白。
在又一个特定的实施方案中，所述区域A由所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段组成。在这种情况下，形成本发明所述融合蛋白区域A的IBDV pVP2蛋白的1-n片段可以是代表任意IBDV株，例如Soroa株的pVP2蛋白的任一1-n片段。在一个特定的实施方案中，形成所述区域A的IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段是选自pVP2-441蛋白，pVP2-452蛋白，pVP2-456蛋白，pVP2-466蛋白，pVP2-476蛋白，pVP2-487蛋白，pVP2-494蛋白，和pVP2-501蛋白，优选选自pVP2-441蛋白，pVP2-452蛋白，pVP2-456蛋白和pVP2-466蛋白的蛋白。
存在于本发明的融合蛋白中的区域B含有，或由异源多肽组成。正如在本发明中所使用的，术语“异源多肽”是指不属于天然IBDV衣壳的多肽。
在一个实施方案中，所述异源多肽含有，或由目的多肽组成。所述目的多肽的大小可在广泛的范围中变化，从几个氨基酸直至上百个氨基酸。所述目的多肽可以实际上是，不在乎其来源(真核，原核，病毒，等等)，能进行重组表达的任意多肽，例如抗原，例如病毒，细菌，或微生物抗原等，针对所述抗原可预期在动物(包括人类)中诱导免疫反应；酶，例如旨在补充在有机体中缺乏其功能的酶；或多肽，其含有能够特异性识别靶DNA或RNA序列的核酸结合肽结构域，所述靶DNA或RNA序列使本发明的融合蛋白结合于含有所述靶序列的核酸序列，及其在含有本发明所述融合蛋白病毒类颗粒中的壳体化(IBDVCVLP-pVP2s*)。在一个特定的实施方案中，所述目的多肽是可用于接种，治疗或诊断的多肽，例如能够在动物和人类中诱导针对由病毒，细菌，寄生虫或其他类型微生物引起的疾病，或针对于肿瘤疾病的免疫反应的表位或抗原决定簇。在特定的实施方案中，所述目的多肽是称为BT的口蹄疫病毒(FMDV)嵌合肽，其含有FMDV B细胞表位(B表位)和T细胞表位(T表位)(Zhang，Q.et al.，2002，Acta Virologica 46(1)：1-9)。在一个特定的实施方案中，B表位位于FMDV VP1蛋白中，例如介于所述西班牙血清型C分离物VP1蛋白的133-159位，或其他分离物的等同位置，而T表位则位于FMDV VP4蛋白中，例如介于所述FMDV血清型亚洲VP4蛋白的20-34位。
在一个特定的实施方案中，所述区域B含有单一目的多肽。然而，在其他特定的实施方案中，所述区域B含有可以形成串联形式的两个或更多个相同或不同的目的多肽。
在一个特定的实施方案中，本发明所述融合蛋白含有结合于单一区域B的区域A。在这种情况下，所述区域B可结合于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的氨基末端区域；或者所述区域B可结合于所述IBDV pVP2蛋白或IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的羧基末端区域。
正如之前所讨论的，区域B可含有一或多个目的多肽。在一个特定的实施方案中，所述区域B含有单一目的多肽，而在另一个特定的实施方案中，所述区域B含有两或更多个目的多肽。
在又一个特定的实施方案中，本发明所述融合蛋白含有结合于两个区域B的区域A，其中一个结合于存在于区域A中所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的氨基末端区域，而另一个则结合于存在于区域A中所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的羧基末端区域。所述区域B可以是相同或不同的，且其中的每一个都可以含有一个或多个目的多肽，其相互之间可以是相同或不同的。
因此，在一个实施方案中，本发明所述融合蛋白包括结合于第一个和第二个区域B的区域A，第一个区域B结合于区域A的氨基末端区域而第二个区域B则结合于区域A的羧基末端区域。如上所述，所述第一个和第二个区域B含有相同或不同的异源多肽。
在一个特定的实施方案中，本发明所述融合蛋白包括结合于含有第一个目的多肽(PI1)的第一个区域B和含有第二个目的多肽(PI2)的第二个区域B的区域A。所述目的多肽(PI1)和(PI2)可以相同或不同。在一个特定的实施方案中，所述目的多肽(PI1)和(PI2)各不相同。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述融合蛋白含有结合于两个区域B的区域A，其中一个结合于存在于区域A中IBDV pVP2蛋白或IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的氨基末端区域，而另一个则结合于存在于区域A中的IBDV pVP2蛋白或IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的羧基末端区域。所述区域B可以相同或不同，且其各自可含有一或多个目的多肽，这些多肽可以是各自相同或不同的。在一个特定的实施方案中，本发明所述融合蛋白包括结合于含有第一个目的多肽(PI1)的第一个区域B和含有第二个目的多肽(PI2)的第二个区域B的区域A。所述目的多肽(PI1)和(PI2)可以相同或不同。在一个特定的实施方案中，所述目的多肽(PI1)和(PI2)是不相的。
本发明所述融合蛋白的区域A可以直接结合于所述区域B。或者，所述区域A并不直接结合于所述区域B，但却通过介于所述区域A和B之间的连接多肽进行结合。因此，如果需要的话，本发明所述融合蛋白还可再含有位于所述区域A和B之间的连接多肽。有益的是，所述连接多肽是具有结构扰性的连接多肽，优选为使得非结构结构域能够或不能诱导免疫反应的多肽。以说明的方式，所述扰性肽可含有重复的氨基酸残基，特别是Gly和Ser残基，或任意其他适合重复的氨基酸残基。
可通过在适当的宿主细胞中对编码所述融合蛋白的核酸序列进行基因表达的方式而获得。所述适合的宿主细胞是含有编码本发明所述融合蛋白的核苷酸序列的细胞，例如含有编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列的核酸序列，或能够被所述核酸转化的细胞，或者是用含有编码本发明所述融合蛋白的核酸序列的重组载体转化，转染或感染的细胞。适合于获得本发明所述融合蛋白的核酸序列，表达盒，重组载体和宿主细胞在下文中将与制备IBDV CVLP-pVP2s*的方法一同进行详细描述。
表达于适合宿主细胞中的本发明所述融合蛋白能够自我组装，并形成在本说明书中一般被称为IBDV CVLP-pVP2*(单数)或IBDVCVLP-pVP2s*(复数)的得自于IBDV的嵌合空心病毒样颗粒。
因此，在又一方面，本发明涉及所述IBDV CVLP-pVP2s*，即，含有至少一种本发明所述融合蛋白的嵌合空心病毒样颗粒。所述IBDVCVLP-pVP2s*是通过组装本发明所述融合蛋白形成的，其具有T＝1的对称性，且其特征在于其仅由包括含有或由IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段组成的区域A，其中“n”是介于441-501之间的整数，以及含有，或由异源多肽组成区域B的本发明所述组装融合蛋白组成。
可通过在允许形成所述IBDV的病毒样颗粒的条件下，在适当的宿主细胞中，通过表达本发明所述融合蛋白的方式，获得本发明的IBDV CVLP-pVP2s*。
因此，在另一方面，本发明涉及含有编码本发明所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸。
在特定的实施方案中，本发明所述核酸序列包括(i)含有，或由对应于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的开放阅读框或编码区组成的核苷酸序列，其中“n”是介于441-501之间的整数；以及(ii)含有，或由含有一个或多个目的多肽的一种多种异源多肽的开放阅读框或编码区组成的核苷酸序列。
在又一个特定的实施方案中，由本发明所提供的核酸序列包括(i)含有，或由对应于IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的开放阅读框或编码区域组成的核苷酸序列，其中“n”是介于441-501之间的整数，(ii)含有，或由含有一或多个目的多肽的一或多个异源多肽的开放阅读框或编码区组成的第一核苷酸序列，以及(ii’)含有，或由含有一或多个目的多肽的一或多个异源多肽的开放阅读框或编码区组成的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列可与所述第一核苷酸序列相同或不同。在这种情况下，所述第一或第二核苷酸序列之一可操作地结合于含有对应于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的开放阅读框或编码区的核苷酸序列的5’末端，而另一个则可操作地结合于含有对应于所述IBDV pVP2蛋白或IBDV pVP2蛋白的所述1-n片段的开放阅读框或编码区的核苷酸序列的3’末端。
正如在本说明书中所使用的，术语“对应于所述IBDV pVP2蛋白的开放阅读框”或“对应于所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的开放阅读框”包括，除所述开放阅读框的核苷酸序列之外，与编码pVP2蛋白及1-n片段相同阅读框类似的其他开放阅读框，其中“n”是介于所述IBDV pVP2蛋白的441-501之间的整数。
类似地，术语“含有一种或多种目的多肽的一种或多种异源多肽的开放阅读框”，包括含有一种或多种目的多肽的所述异源多肽的任意编码核苷酸序列。正如在此所使用的，术语“类似于”旨在包括在所述IBDV pVP2蛋白或1-n片段编码核苷酸序列的基础上能够分离或构建的任意核苷酸序列。，其中“n”是含有介于所述IBDV pVP2蛋白的441-501的整数，例如通过引入保守性或非保守型核苷酸取代，包括插入一个或多个核苷酸，在所述分子的任意末端加入一个或多个核苷酸，或在所述序列的任意末端或内部缺失一个或多个核苷酸。一般地，类似于其他核苷酸序列的核苷酸序列对所述核苷酸序列而言是基本上同源的。
在用于本说明书的意义上，表达“基本上同源”是指目的核苷酸序列具有同一性的程度，在核苷酸水平，为至少60％，优选为至少80％，更优选为至少90％，且甚至更优选为至少95％。
在另一方面，本发明提供了表达盒，其含有由本发明所提供的核酸序列，即含有能够编码可操作结合于转录，和任选的翻译，控制元件的编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列的核酸。
在一个特定实施方案中，由本发明所提供的表达盒包括，可操作地结合于转录，以及任选的翻译，控制元件的，核苷酸序列，其含有(i)含有，或由对应于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白1-n片段的开放阅读框或编码区组成的核苷酸序列，其中“n”是介于441-501之间的整数，和(ii)含有，或由含有一种或多种目的多肽的一种或多种异源多肽的开放阅读框或编码区组成的核苷酸序列。
在又一个特定的实施方案中，由本发明所提供的表达盒包括，可操作地结合于转录，以及任选的翻译，控制元件的核苷酸序列，其含有(i)含有，或由对应于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白1-n片段的开放阅读框或编码区组成的核苷酸序列，其中“n”是介于441-501之间的整数，(ii)含有，或由含有一种或多种目的多肽的一种或多种异源多肽的开放阅读框或编码区组成的第一核苷酸序列，以及(ii’)含有，或由含有一种或多种目的多肽的一种或多种异源多肽的开放阅读框或编码区组成的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列可与第一核苷酸序列相同或不同。在这种情况下，所述第一或第二核苷酸序列之一可操作地结合于含有对应于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的开放阅读框或编码区的核苷酸序列的5’末端，而另一个则可操作地结合于含有对应于所述IBDV pVP2蛋白或所述IBDV pVP2蛋白的1-n片段的开放阅读框或编码区的核苷酸序列的3’末端。
存在于本发明所提供表达盒内的所述转录，和任选的翻译，控制元件包括启动子，其指导可操作连接于其本核苷酸序列(IBDV pVP2或其片段级和异源多肽)的转录，以及其他转录所必需或适合的序列，及其在时间和空间上的适当调控，例如开始和终止信号，剪切位点，聚腺苷酸华信号，复制起点，转录增强子，转录沉默子等。一般地，所述元件，以及用于构建表达盒以及入本发明所述的载体，是根据旨在所使用的宿主细胞而选择的。
在又一方面，本发明提供了重组载体，其含有由本发明所提供的核酸序列或由本发明所提供的表达盒。事实上，任何载体都可用于产生有本发明所提供的重组载体。为了进行说明，可根据每个具体情况的条件和需要，从所述质粒，杆粒，酵母人工染色体(YACs)，细菌人工染色体(BACs)，基于噬菌体P1的人工染色体(PACs)，粘粒，或病毒选择适当的表达系统或载体，其还进一步的含有异源复制起点，例如细菌或酵母起点，从而能够扩增入细菌或酵母，以及可用于选择能够与所述基因或感兴趣基因不同转染细胞的标记。这些重组载体可由本领域所属技术人员通过使用常规遗传工程技术的方式来获得(Sambrooket al.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual“分子克隆：实验手册”.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y)，且其也是本发明的部分。
在特定的实施方案中，所述重组载体是质粒，例如适于转化酵母，或病毒，例如在其复制周期表达本发明所述融合蛋白的重组杆状病毒(rBV)，且其在组装之后，形成IBDV CVLP-pVP2s*。在一个特定的实施方案中，在酵母中获得了CVLPs，特别是相对于pVP2-456蛋白而言在C-末端位置含有FMDV嵌合BT肽的IBDV CVLP-pVP2s*。出于这一目的，制备了用于转化酿酒酵母培养物(实施例3)的表达载体pESCURA/pVP2-456-BT。在又一个特定的实施方案中，可通过使用基于rBV表达系统(实施例1)的方式获得CVLPs。
在另一方面，本发明提供了含有由本发明所提供核酸序列，即含有编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列核酸的宿主细胞。在一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是经过含有编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列的本发明所提供核酸序列转化的细胞。在又一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是由含有编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列的本发明所述核酸序列所提供的重组载体转化，转染或感染的细胞。
事实上，任意易感于由本发明所提供核酸序列转化的宿主细胞，或任意易感于由本发明所提供重组载体转化，转染或感染的宿主细胞都可以使用，例如，哺乳动物细胞，鸟类细胞，昆虫细胞，酵母细胞等等；然而，在一个特定的实施方案中，所述宿主细胞可选自酵母和昆虫细胞。由于其简单性和制备成本，酵母是适合的。当所述表达系统含有rBV时，昆虫细胞是适合的。出于生物安全考虑使用rBV是有益的，涉及杆状病毒宿主范围的杆状病毒，其不能够在非昆虫细胞的细胞类型中进行复制。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了用本发明所提供重组载体，例如含有本发明所述核酸序列的质粒，或含有编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列由本发明提供的表达盒转化的宿主细胞，例如酵母，例如酵母菌属的酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisae)，栗酒裂殖酵母(S.pombe)等，或者是毕赤酵母属的酵母，例如毕赤酵母(P.pastoris)等。
在另一个特定的实施方案中，本发明提供了经由本发明所提供重组载体，例如含有本发明所述核酸序列的rBV或含有编码本发明所述融合蛋白很苷酸序列由本发明提供表达盒感染的宿主细胞，例如昆虫细胞。
在另一方面，本发明提供了制备IBDV CVLP-pVP2s*的方法，其包括在允许表达所述融合蛋白的条件下，培养含有编码本发明所述融合蛋白核酸由本发明提供的宿主细胞，并且，如果需要的话，回收所述IBDV CVLP-pVP2s*。在一个特定的实施方案中，所述方法是通过使用经由含有编码本发明所述融合蛋白核酸的本发明的核酸序列转染细胞组成的由本发明所提供宿主细胞的方式实施的。在另一个特定的实施方案中，所述方法是通过由经过含有编码本发明所述融合蛋白核苷酸序列的本发明所述核酸序列的本发明所提供重组载体转化，转染或感染细胞组成的本发明所提供宿主细胞实施的。
在所述细胞中表达了本发明所述融合蛋白之后，所表达的蛋白进行了组装并形成了IBDV CVLP-pVP2s*，如果确有需要的话，其可从培养基中的分离或转移并进行纯化。所述IBDV CVLP-pVP2s*的分离和纯化可通过常规方法，例如通过蔗糖梯度分离的方式来完成。
在一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞，且本发明所述融合蛋白的基因表达是通过使用允许在昆虫细胞中表达来自本发明所提供核酸的本发明所述融合蛋白的rBV的方式实施的。因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了制备IBDV CVLP-pVP2s*的方法，其包括(i)在允许表达所述重组蛋白及其组装从而形成IBDVCVLP-pVP2s*的条件下，培养经过含有编码本发明所述融合蛋白核酸的rBV感染的昆虫细胞，和(ii)如果确有需要的话，对所述IBDVCVLP-pVP2s*进行分离，以及任选的纯化。所述方法因此包括首先获得由含有本发明所述核酸或含有编码本发明所述融合蛋白核酸的本发明所提供表达盒的rBV组成的重组载体，然后使用所述rBV感染昆虫细胞，表达重组蛋白，并且如果确有需要的话，分离通过组装本发明所述融合蛋白所形成的IBDV CVLP-pVP2s*，并且任选地随后纯化所述IBDV CVLP-pVP2s*。
构建允许表达本发明所述融合蛋白的重组杆状病毒可由本领域所属技术人员根据本发明所述内容以及这一工程的现有技术来实施(Sambrook et al.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual“分子克隆：实验手册”.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；Leusch MS et al.1995.A novel host-vector system fordirect selection of recombinant baculoviruses(bacmids)in Escherichiacoli(在大肠杆菌中直接选择重组杆状病毒(杆粒)的新型宿主-载体系统).Gene 160：91-4；Luckow VA et al.1993.Efficient generation of infectiousrecombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertionof foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichiacoli(通过位点特异性转座子介导的外源基因向在大肠杆菌中扩增的杆状病毒基因组的插入来有效地产生感染性重组杆状病毒).J Virol67：4566-79)。
在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞，且本发明所述融合蛋白的基因表达可通过使用允许在酵母细胞中表达本发明所述融合蛋白重组载体的方法来实施。因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了制备IBDV CVLP-pVP2s*的方法，其包括(i)在允许表达所述重组蛋白及其组装从而形成IBDV CVLP-pVP2s*的条件下，培养经过含有编码本发明所述融合蛋白核酸的重组载体感染的酵母，和(ii)如果确有需要的话，对所述IBDV CVLP-pVP2s*进行分离，以及任选的纯化。所述方法因此包括首先获得由含有本发明所述核酸或含有编码本发明所述融合蛋白核酸的本发明所提供表达盒的质粒组成的重组载体，然后使用所述重组载体感染酵母细胞，表达重组蛋白，并且如果确有需要的话，分离通过组装本发明所述融合蛋白所形成的IBDVCVLP-pVP2s*，并且任意地随后纯化所述IBDV CVLP-pVP2s*。在一个特定的实施方案中，适于转化酵母的适当表达系统基于的是pESC酵母表达系统(Stratagene)。获得经由允许表达本发明所述蛋白的适当重组载体转化的酵母，可由本领域所属技术人员根据本文所述以及本工程的现有技术来实施(pESC epitope tagging vectors Instructions manual“pESC表位标签载体使用手册”.Stratagene www.stratagene.com；Sambrook et al.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual“分子克隆：实验手册”.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)。一般地，在酵母细胞中获得的IBDV CVLP-pVP2s*是T＝1的衣壳；为了进行说明，当在酵母细胞中产生了由pVP2-441蛋白，pVP2-456蛋白或pVP2-466蛋白构成区域A的IBDV CVLP-pVP2s*时，由此所获得的IBDV CVLP-pVP2s*仅有T＝1的衣壳。
在另一方面，本发明涉及使用由本发明所提供的重组载体来制备和获得本发明所述融合蛋白和/或本发明所述IBDV CVLP-pVP2s*。
所述IBDV CVLP-pVP2s*可用作感兴趣产物，例如具有生物学活性分子，例如具有治疗疾病治疗潜力的药物，多肽，蛋白，抗体，激素，酶，核酸等的载体或载体，因此其可用作治疗，诊断或研究目的。在一个特定的实施方案中，所述具有生物学兴趣的分子包括目的多肽，例如递送入动物或人体内的免疫反应抗原或诱导物，所以其可用于制备抵抗由病毒，细菌，寄生虫或任意其他类型微生物所引起人类和动物疾病，或抵抗肿瘤疾病的疫苗，或其包括可用于基因治疗，旨在导入内部适合细胞的核酸序列，因此其可用于制备基因治疗载体，或其可包括适于给药于人体或动物体的保健兴趣化合物(抗体，激素，具有适于治疗疾病治疗潜力的酶，等等)，因此其可用作活性物质递送系统。
因此，在又一方面，本发明涉及使用IBDV CVLP-pVP2s*来制备药物组合物，例如疫苗，基因治疗载体，活性物质递送系统等等。在一个特定的实施方案中，所述药物组合物是旨在提供保护抵抗向由病毒，细菌，寄生虫或任意其他类型微生物所引起的人类或动物疾病，或肿瘤疾病的疫苗。在又一个特定的实施方案中，所述药物组合物是基因治疗载体。在又一个特定的实施方案中，所述药物组合物是活性物质递送系统；所述活性物质的说明性和非限制性示例包括涉及治疗疾病的药物，抗体，激素，酶等等。
此外，在又一方面，本发明涉及含有治疗有效量IBDVCVLP-pVP2s*和药物可接受佐剂和载体的药物组合物。在一个特定的实施方案中，所述药物组合物时疫苗，基因治疗或活性物质递送系统。
在又一方面，本发明涉及含有治疗有效量IBDV CVLP-pVP2s*，任意具有一种或多种药物可接受佐剂和/或载体的疫苗。所述疫苗可用于保护(即，保护)动物和人类抵抗由微生物(病毒，细菌，寄生虫等)引起的疾病，或抵抗肿瘤疾病。在一个特定的实施方案中，所述疫苗特别有用于保护动物和人同时抵抗由两种或更多种疾病诱导感染制剂引起的感染。为了进行说明，由本发明所提供的疫苗可用于保护鸟类，例如，鸡，火鸡，雌鹅，雄鹅，野鸡，鹌鹑和鸵鸟等等抵抗IBDV并且抵抗一种或多种造成禽类疾病(禽类病原体)的感染性制剂。
在本说明书所用的意思中，“治疗有效量”的表述是指为产生所希望效果的IBDV CVLP-pVP2s*的计算量，并且其通常是通过IBDVCVLP-pVP2s*的典型特征和所获得的免疫效果，在其他原因中，得以确定的。
可用于所述疫苗中的药物可接受佐剂和载体是本领域所属技术人员公知的佐剂和载体，且常规可用于制备疫苗。
在一个特定的实施方案中，所述疫苗在药物可接受的稀释剂，例如盐水溶液，磷酸缓冲盐水溶液(PBS)，或任意其他药物可接受的稀释剂中被制备成溶液或水性悬液。
由本发明所提供的疫苗可通过任意适合的给药方法进行给药，从而导致保护抵抗所使用异源序列或表位的免疫反应，出于这一原因，所属疫苗应该被配置成适于所选定给药方法的药物形式。在一个特定的实施方案中，给药本发明所提供的疫苗是在肠胃外，例如腹膜内，皮下等方式实施的。
在又一方面，本发明涉及含有IBDV CVLP-pVP2s*的基因治疗载体。
在又一方面，本发明涉及含有至少一种IBDV CVLP-pVP2s*和一种活性物质的活性物质递送系统。活性物质的说明性的，非限制性示例包括用于治疗疾病具有治疗潜力的药物，抗体，激素，酶等等。
以下实施例旨在说明本发明且不应该被认为以任何意思对本发明进行限制。
实施例1在昆虫细胞中获得IBDV CVLP-pVP2s*以及结构多态性的分析
I.材料与方法
病毒的制备
通过标准程序从鹌鹑肌肉QM7细胞中纯化IBDV Soroa株，即血清型I IBDV株(Lombardo et al.1999.VP1，the putative RNA-dependentRNA polymerase of infectious bursal disease virus，forms complexes withthe capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation into virus-likeparticles.“VP1，推测的感染性法氏囊病病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，形成了具有衣壳蛋白VP3的复合物，导致了有效的壳体化成病毒样颗粒”J Virol 73，6973-6983)并保存于25mM PES缓冲液(哌嗪-N-N’-双(2-乙基磺酸)[PIPES]pH＝6.2，150mM NaCl和20mM CaCl2)中。
重组杆状病毒的构建
所述重组杆状病毒(rBV)FB/VP2-456之前已有报道(Castónet al.，2001.C terminus of infectious bursal disease virus major capsid proteinVP2 is involved in definition of the T number for capsid assembly“感染性法氏囊病病毒主要衣壳蛋白VP2的C末端涉及衣壳组装T数字的确定”.J Virol 75，10815-10828)。
质粒pVOTE.2/POLY(et al，2004.The C-terminal domain of thepVP2 precursor is essential for the interaction between VP2 and VP3，thecapsid polypeptides of infectious bursal disease virus“pVP2前体的C-末端结构域对VP2和VP3，即感染性法氏囊病病毒衣壳多肽之间的相互作用至关重要”.Virology 322，135-142.)被用作DNA模子来进行那些得自pVP2 DNA片段的PCR合成从而产生了被鉴定为FB/VP2-441，FB/VP2-466，FB/VP2-476，FB/VP2-487，FB/VP2-494，FB/VP2-501和FB/VP2-512的rBVs。PCR是使用Vent DNA聚合酶(Biolabs)使用对每种突变体5’末端(5’-pVP2)相同的引物和3’末端特定的引物进行的(表1)。
表1用于产生C-末端突变缺失的寡核苷酸引物序列

将BglII-HindIII消化的PCR片段克隆入蛋白表达质粒FastBac和pHisFastBac-C()的多(多连接物)克隆位点BamHI-HindIII。质粒pHisFastBac-C用于表达所述His-pVP2变异体。所使用的特别标签序列，以单字母编码，是MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMGS(SEQ ID NO：12)。通过Sanger测序方法的方式检查了所得的质粒序列(Sanger et al.，1977.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors“使用链终止抑制剂进行DNA测序”.Proc Natl Acad Sci U S A 74，5463-5467)。
根据制造商(Invitrogen)的程序进行了得自E.coli DH10Bac菌株杆粒的选择以及使用脂质体lipofectamine对其制剂进行转染。
所述构建体表达于H5昆虫细胞中(Maraver et al.，2003.Identification and molecular characterization of the RNApolymerase-binding motif of infectious bursal disease virus inner capsidprotein VP3“感染性法氏囊病病毒内衣壳蛋白VP3 RNA聚合酶结合基序的鉴定和分子表征”.J Virol 11，2459-2468)(图1)。
pVP2缺失突变结构的表征和纯化
以1-5个噬斑形成单位(PFU)/细胞的感染复数(m.o.i.)使用适当的rBV感染H5细胞(2-5×108细胞)。所述细胞在感染后(h.p.i.)48小时收集，并在冰上在含有1％IGEPAL CA-630(Sigma)的PES裂解缓冲液中裂解。所述颗粒材料通过20％蔗糖衬垫和25-50％线形蔗糖梯度进行纯化。含有所述pVP2缺失突变蛋白的颗粒材料通过超速离心浓缩了20倍，并通过SDS-PAGE和Western杂交的方式进行鉴定。选择富含VP2的级份进行结构研究并在纯化之后的头1-2天进行使用。
SDS-PAGE和Western印迹
将感染细胞的细胞提取物(10-15μl)或蔗糖浓度梯度的组分(2-5μl)加入至Laemmli缓冲液中直至达到1x的终浓度，加热(100℃，2分钟)。在11％聚丙烯酰胺凝胶(38.96％(w/v)丙烯酰胺和1.04(w/v)亚甲基双丙烯烯胺)上进行电泳。Western印迹是使用抗-VP2血清进行的(Lombardoet al.，1999.VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase ofinfectious bursal disease virus，forms complexes with the capsid proteinVP3，leading to efficient encapsidation into virus-like particles“VP1，推测的感染性法氏囊病病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，与衣壳蛋白VP3形成了复合物，导致了进入病毒样颗粒的有效壳体化”.J Virol 73，6973-6983)。兔抗-VP3血清被用作阴性对照。抗-His标签抗体得自Sigma。
常规电镜技术
将每种蔗糖梯度组分的2-5μl样本进行排列并使用2％(w/v)水性乙酸双氧铀进行负染。使用JEOL 1200 EXII电子显微镜，在100kV操作，以x40000放大倍数记录显微图
电镜技术
将样本(5μl滴)，或含有病毒颗粒或HT-VP2-466衣壳的组分，在包被有碳的小网上进行排列，用水滴洗两次，通过吸水纸干燥，并根据已建立的方法浸没于液体乙烷浴，主要是根据已公开的Castón等人的方法(Castónet al.2001.C terminus of infectious bursal disease virusmajor capsid protein VP2 is involved in definition of the T number forcapsid assembly“感染性法氏囊病病毒主要衣壳蛋白VP2的C末端涉及衣壳组装T数字的确定”.J Virol 75，10815-10828)。在最低曝光，从而使得所捕获的样本接收6-10e-/nm2的曝光，以名义上x50,000的放大倍数，在以200kV操作和组装了场装置的Tecnai G2电子显微镜的条件下记录显微照片。将噬菌体T4玻璃化，并将其尾鞘的轴向间距用作内部放大倍数标准。
圆二色性(CD)显微术
SEQ ID NO：1的肽是化学合成的，而在25℃使用大小为0.1-1mm细胞的远UV CD谱储存于Jasco二色性谱。所使用的肽浓度范围从10-200μM。如前所述，根据Jimenez，1999对CD谱进行分析(Jimenezet al，1999.Helicity of alpha(404-451)and beta(394-445)tubulinC-terminal recombinant peptides“α(404-451)和β(394-445)微管蛋白C-末端重组肽的螺旋性”.Protein Sci 8，788-799)(图4A)。
影像分析
使用PIC软件系统进行了一般的图片处理操作((Trus et al.1996.Digital image processing of electron micrographs：the PIC system-III“电子显微照片的数码影像处理：PIC系统III”.J Struct Biol 116，61-67))。在其分辨率和由傅里叶分析引起散光的条件下对所述显微照片进行评估。选定电子显微照片的亚聚焦值允许在第一个零电子显微镜对比传递函数(CTF)范围的分辨率范围内重建其结构。对于所述分析选定显微照片的亚聚焦值(IBDV为81，HT-VP2-466衣壳为82)，以Bsoft套件测定的话(Heymann，2001)，范围为0.6-3.7μM(分别在的空间CTF)。所述显微照片是使用Zeiss PhotoScan TD扫描器在7μm/象素且二进制从而产生21μm象素(在所述样本中为)。使用Conway等人的自动方法对所述蛋白颗粒进行提取和前处理(Conway et al.，1993.The effects of radiation damage on the structure of frozen hydrated capsidsHSV-1“辐射损伤在冷冻水合衣壳HSV-1结构的作用”.J Struct Biol111，222-233)。所述颗粒角趋向的第一估计是使用IBDV 3DR作为起始模型，在相当的比例上，在分辨率条件下，通过傅里叶变换(PFT)中的“合用线”测定的(Baker and Cheng，1996.A model-based approachfor determining orientations of biological macromolecules imaged bycryoelectron microscopy“测定通过低温电镜术成像生物学大分子方向的基于模型的方法”.J Struct Biol 116，120-130)。对新的密度图谱进行计算并用于后续相方向和起点的全部改进，使用修饰版本的PFT算法从而可同时使用振幅和相信息。
只有基于模型的方法被用于重建小VP2衣壳，而从较大VP2衣壳提取的其他小VP2衣壳则被用作起始模型。其三维结构被计算为内部对照而无须使用权重反向投射方法来强加二十面体对称，并且通过随机选择涉及通过对称原始材料选择等价视角通过全部方向空间分配整个方向。所得密度图类似于基于二十面体对称但却分辨率较低(数据未显示)的方法所得的情况。通过对所必需CTF小叶相的简单变换，对所述相进行了衬度传递函数(CTF)的更正。使用傅立叶-贝塞尔技术计算了重构体(Crowther，1971.Procedures for three-dimensionalreconstruction of spherical viruses by Fourier synthesis from electronmicrographs“通过傅立叶合成从电子显微照片得到球状病毒3维重组的程序”.Phil Trans R Soc Ser B 261，221-230)。终重构体组合了10,849和1,557幅IBDV和HT-VP2-466衣壳的影像，且分别通过和的包膜傅立叶相关标准(0.5倍阈值)获得了所述分辨率。其他更小HT-VP2-466衣壳的重构体是从相同组别显微照片中计算而来的。最终的重构体分辨率，含有108个颗粒，是根据FSC分析所得的约(Convay et al.，1993.The effects of radiation damage on the structure offrozen hydrated HSV-I capsids“辐射损伤对水合HSV-I衣壳的辐射损伤”.J Struct Biol 111，222-233)。
球状定量放射密度图谱是对T＝13的两个图谱进行计算得到的，并成比例地重叠这两个图谱。通过二者的差异并改变所述两张图谱的次序随后获得了所述图谱。小密度岛被滤光从而翻译出了两张图谱的结果(参见图8E和8F)，仅考虑到在对应于所述蛋白薄膜半径上的较大差异。
II.结果
在其N-末端具有His-标签的pVP2蛋白C-末端缺失突变体
假定当表达于重组杆状病毒时，对pVP2蛋白C-末端(512个氨基酸)处理所产生的VP2蛋白(441个氨基酸)并未出现，则其C-末端长度各异的不同pVP2构建体都可在所述系统中表达。456，466，476，487，494和501位(图3A)都被选中从而可均一地覆盖所述区域。对这些pVP2/VP2变异体的Western印迹分析表明，具有C-末端缺失的全部pVP2突变体都正确表达了，产生了一条主带(图1)。同样还产生了，在其N-末端融合于His-标签(HT-VP2)的相同系列的pVP2/VP2突变体。所述pVP2/VP2变异体的分子量如表2所示。
表2pVP2/VP2变异体的分子量(kDa)

所述pVP2/VP2变异体以高水平进行表达，并通过蔗糖衬垫的方式然后通过蔗糖梯度进行纯化。从所述梯度所得的组分通过SDS-PAGE电泳进行表征。使用考马斯亮蓝染色的凝胶表明含有pVP2变异体的组分具有范围非常广的条带(图3B，3C)。出于比较所述结果的目的，根据本文所述策略可从感染IBDV细胞中获得所述融合蛋白(图3D)。尽管不含有His-标签的pVP2突变体具有异源组织结构(图3B)，含有His-标签的pVP2/VP2融合蛋白却是有组织的，因此其大小随着C-末端结构域长度的增加而增加(图3C)。
pVP2/VP2组装体的电镜分析
根据pVP2 C-末端的长度和His-标签的存在与否，根据电镜术进行负染的，对从蔗糖梯度获得的不同蛋白组分的分析，表现出了不同的形态。
VP2-441(图4A)和VP2-456(图4B)产生了直径为约23nm的环形(donut)状组装结构，相当于对称方式为T＝1的十二面体衣壳。随着VP-466组装类型的形成，所述变异体也通过蔗糖梯度得以就位。底层组分含有直径为约25nm的细管(图4C)，规则的以螺旋状形态排列(图4C，方框)。中间组分表现出了由妨碍其本身的材料所围绕的，具有类似于对称方式为T＝1衣壳的更短细管，说明这种对称可能是不稳定的(图4D)。类似于T＝13的对称也是偶尔观察到的(图4D，方框)。在所述梯度上面部分中的主要结构是较小的等体积颗粒(图4E)。VP2-476以和VP2-466相类似的方式进行活动。绝大多数的VP2-501都迁移到了所述梯度下半部分的组分中去，并组装成直径为约35nm的部分配列的管(图4F)。在所述梯度的上半部分中，VP2-501组装成了具有不规则大小的等体积大小的扭曲的管状结构。最终观察到VP2-512成为弯曲的短管和不规则的颗粒。
在IBDV感染的细胞中，大多数的纯化结构都位于所述梯度的中部并符合直径65-70nm的二十面体颗粒(图4H)。然而，在靠近所述梯度的底部却观察到了具有六边形组织结构成为I型管的管状结构(图4G)。
所有这些结果都表明VP2-466含有足够的信息来形成六聚体(细管)和五聚体(T＝1的衣壳)类型的衣壳，还零星地观察到了具有T＝13组装的衣壳。
(His-)pVP2/VP2组装的电镜分析
类似地，也对HT-pVP2/VP2融合蛋白的组装进行了分析。在富含HT-VP2-441的组分中观察到了直径为23nm颗粒的出现(图5A)。突变体HT-VP2-456产生了具有类似于真实传染性衣壳T＝13结构的组装(比较图5B和4H)，其迁移到了所述梯度的中部。大多数HT-VP2-456，即T＝1的衣壳，都位于所述梯度的上层部分。形成正确衣壳的趋势随着HT-VP2-466蛋白而得以改善(图5C)。具有衣壳类似于T＝13的颗粒以更大的丰度得以出现，且由于其是以较高效率获得的，其也被选作高分辨率的结构研究。中值为约53nm的衣壳可以轻松地T＝13的衣壳区别开来(图5C，箭头)。
HT-VP2-476(图5D-F)和HT-VP2-487融合蛋白保持了能够组装形成具有类似于病毒结构的衣壳的能力，尽管效率较低。主要的结构是具有可变长度的六边形管(图5D)。最后，HT-VP2-494，HT-VP2-501和HT-VP2-512蛋白仅形成了具有明显六边形排列的管状结构。
不同pVP2/VP2蛋白的His-标签N-末端并未影响在常规颗粒中亚单位的组装，在缺乏VP3蛋白的情况下，所述衣壳的其他主要成分，HT-VP2-456，允许具有对称类似于T＝13衣壳的正确的结构组装。
pVP2-C末端结构域的氨基酸443-452的圆二色性分析
SEQ ID NO：2的肽的二级结构，对应于pVP2蛋白C-末端的氨基酸443-452，是通过Agadir计算机程序的方式进行预测的(Munoz andSerrano，1994.Elucidating the folding problem of helical peptides usingempirical parameters“使用经验参数来说明螺旋肽的折叠问题”.NatStruct Biol 1，399-409)。所述程序在肽中检测到了显著的螺旋趋势，其产生了兼性α-螺旋(图10B，左侧)。为了和本预测进行比较，合成了合成肽，即氨基酸442-454，并采用圆二色谱分析平均的二级结构。在水性缓冲液中，所述肽表现出了不明显的螺旋结构，因此采用了随机卷曲的构型。当三氟乙醇(TFE)，即一种螺旋诱导剂，被加入时，其导致了明显螺旋成分的形成(图2)。使用WHATIF在PDB(蛋白数据库)中进行了搜索(http://www.cmbi.kun.nl/gv/wahtif)从而观察是否可以发现多肽具有类似已知的结构，且在墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)磷酸丙糖异构酶(Lm TIM)的氨基酸241-250中发现了所述肽(Williamset al.，1999.Structural and mutagenesis studies of leishmaniatriosephosphate isomerase：a point mutation can convert a mesophilicenzyme into a superstable enzyme without losing catalytic power“利什曼原虫磷酸丙糖异构酶的结构和突变发生研究：点突变可将嗜温酶转变成没有丧失催化能力的超稳定酶”.Protein Eng 12，243-250)。当所述肽序列，以单字母编码为，EFRDIIDATR(SEQ ID NO：13)，与所述十个pVP2氨基酸进行比较时，可以观察到所述兼性本质是基本一致的：即存在保守性的改变(R变成K)，使用R取代D，其通过维持所负载链的一侧改变了极性，并将T改变成I。
IBDV衣壳的结构
IBDV颗粒的低温电镜照片表明了清晰的外围锯齿状区域(图6A)。T＝13的衣壳的最终密度图谱式以的分辨率进行计算。所述衣壳的分子构架基本上类似于等人(et al.，1997.Three-dimensional structure of infectious bursal disease virus determinedby electron cryomicroscopy“由低温电镜确定的感染性法氏囊病病毒的三维结构”.J Virol 71，325-330)已公开的架构，其中的主要特点是存在有从连续包膜投射出的260个VP2三聚体，并以五种不同形成方式进行排列(图6B a-e)。在内侧，有200个内部Y-形的三聚体投射。分辨率的改进允许以更准确和精确的方式鉴定众多结构细节，特别是在内部衣壳的5个轴向上。以这种方式，通过两个环形边缘，替换了60个内部三聚体，每个五聚体对应5个三聚体。尽管最外侧的边缘是通过10个紧密连接的球状密度形成的，内部边缘时通过5个球形成的，正如所预期的那样(图9)。另一个相关的方面涉及衣壳表面多孔的外观。这些孔(总共616个)具有约的直径，并在密度连接下精确地定位，称为连接臂，介于外侧的毗邻三聚体之间。
His-VP2-466衣壳的结构
对富含病毒样颗粒组分的电镜分析表明，VP2-466衣壳是由不同衣壳但却具有类似组装的复杂混合物形成的(图7A)。这些衣壳具有从65nm(类似于T＝13的IBDV衣壳)至53nm的大约尺寸，还具有较小等体积组装的变异。所有这些结构都具有相同的外周锯齿状区域。以的分辨率对HT-VP2-466衣壳3DR进行测定(图7B，左侧和中间)。IBDV和HT-VP2-466衣壳的外侧是基本上重叠的，尽管所述内侧具有明显的不同。较大的结构差异涉及五重和六重轴对称，其中在HT-VP2-466衣壳而不是在IBDV衣壳中观察到了连接Y-形三聚体结构的特别密度。
中间尺寸HT-VP2-466衣壳的密度图谱表现出了T＝7的对称(图7B，右侧)，其是基于等同于类似那些T＝13的具有三聚体的壳粒，除了需要三种不同类型的三角形壳粒(称为a’，b’和c’)。T＝13和T＝7的衣壳在二十面体格珊中具有相同的HT-VP2-466基本三聚体模块。
IBDV和HT-VP2-466衣壳的结构和生化比较
在IBDV和HT-VP2-466衣壳的径向密度图谱(图8A)和中部横切面(图8C和8D)所发现的结构相似性，是基本上重叠的。在蛋白衣壳中发现了两种微小的差异(大约半径)(图8A，箭头)。在IBDV衣壳内侧观察到的特别密度峰，主要位于的半径范围内，以及在起内侧上HT-VP2-466衣壳的另一种(在的半径)。差异图谱是通过在两种结构中对于蛋白鞘的密度值进行算术减法从而更精确的定位所述差异。通过改变两种图谱中的减法次序，所得图谱就近表示出能够归属于每种结构中的那些结构差异(图8E和8F)。在IBDV衣壳外侧的结构差异位置上说明具有更大差异的区域是介于毗邻VP2三聚体的连接臂之间。在内侧的结构差异主要是五重和六重轴的对称，精确地定位于在HT-VP2-466衣壳的内部密度上。
使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶说明作为主要成份的富含pVP2/VP2和VP3病毒颗粒的成分(图8B)，含有几乎90％的总蛋白。用于获得HT-VP2-466衣壳低温电镜数据组分的等价分析表明，所述衣壳由约54kDa的单一多肽组成。因为在蛋白鞘水平的最小差异不能被考虑来检查具有VP3的差异，所得的结果意味着两种衣壳都是由单一蛋白，VP2，或其变异体His-标签，真对于IBDV和HT-VP2-466衣壳分别构建而成的，且VP3并未被整合作为IBDV衣壳的整合部分。
在T＝13的衣壳中的准等价(quasi-equivalence)分析
由于这种衣壳必须考虑到准等价衣壳，所以必须考虑IBDV衣壳的新方案。为了确认这一假设并适当地评定所述IBDV和HT-VP2-466衣壳的等价特征，对所述衣壳二十面体剖面的对比图谱进行比较(图9)。最外层切片(de 328 a)表明所述三聚体单位是基本上相同的(图9A，9B和9C)。此外，连续的衣壳在()是明显的，并观察到了最小的差异(图9D和9E)。在的半径上，相当于两种衣壳T＝13内层开始的切面表明，260内部三聚体单位具有260个其他内部三聚体单位的明显连续，包括五重轴对称左右的情况(图9F)。所述五重辐射的三聚体比六重辐射的三聚体组装的更紧密并在的半径上出现了融合，而在HT-VP2-466衣壳的六重轴对称上可见额外的密度(图9G)。在第6对称轴中的额外的密度(图9H)在半径是很明显的。
III.讨论
在IBDV中丰度最高蛋白，VP2蛋白的构象多态，在本发明中进行了分析。VP2最初是作为512个氨基酸的前体合成的，其在其C-末端进行了若干次处理从而产生了成熟的VP2蛋白(441个氨基酸)。大多数表达于在本发明所开发杆状病毒系统中的突变体都因此符合在所述病毒组装过程中自然发生的中间体。负责控制所述多态的分子机制存在于在临时结合于C末端的71个氨基酸序列中，并在其功能完成之后转移。在缺乏VP3的情况下，在VP2的N-末端存在的His-标签是其正确组装所必须的，说明这种His-标签可在组装的过程中复制VP3蛋白的功能。对IBDV衣壳T＝13复合物进行组装的控制因此需要在本发明所述系统中不连接的两种多态元素的相互作用。
本发明的结果说明所述VP2蛋白改变的分子控制物位于443-GFKDIIRAIR-453(SEQ ID NO：2)片段内，其是以α-螺旋的形状排列的。本发明的所述HT-VP2-456突变体代表了在VP2种介于形成单一构想或多种构象之间的边界。如果组装单位较短的话，就像在HT-VP2-441的情况中，仅产生了五聚体的结构(衣壳T＝1)，其中如果包括了氨基酸443-452，则可形成衣壳T＝13和衣壳T＝1。
实施例2
IBDV CVLP-pVP2s*免疫原性的表征
为了评估在实施例1中所得CVLP-pVP2-456的免疫原性，在1日龄鸡只重进行了免疫检测。简言之，使用含有稀释于PBS的10μgCVLP-pVP2-456/动物的200μl单剂量肌肉免疫一组7只SPF(无特定病原体)动物。使用PBS注射类似的组。每周从两组中的每一只动物提取血清。将来自于每组和时间的血清进行混合从而获得了有等体积所述组中每个个体等量提及的同源血清(混合)所代表。通过ELISA的方式分析所述血清。所以，使用10ng CVLP-pVP2-456包被小孔。根据之前已公开的方法进行所述检测((Current Protocols in Immunology“免疫学现有技术”.Edited by：Bierer，Coligan，Margulies，Shevach，Strober，JohnWiley & Sons http://www.interscience.wiley.com/c_p/index.htm)。所得结果表明，在缺乏佐剂的单次免疫引起了针对pVP2-456蛋白的有效反应。当对实施例1中所得的其他CVLP-pVP2s*进行检测时，也得到了类似的结果。当对已公开的西班牙专利申请P200300751，P200400120和P200400121中含有IBDV VP2的其他嵌合(CVLPs)和非嵌合VLPs进行检测时，也得到了相似的结果。
实施例3
在酵母中获得CVLP-pVP2s*(pVP2*-BT)
出于在酵母(S.cerevisiae)培养物中研究获得IBDV CVLP-pVP2s*可能性的目的，使用结合于pVP2-456N-末端，编码FMVD嵌合肽称为BT(Zhang，Q.et al.，2002，Acta Virologica 46(1)：1-9)的异源基因制备了表达质粒pESCURA/pVP-456-BT。所述嵌合BT肽含有B细胞表位(位于FMDV血清型C西班牙分离物VP1蛋白的133-159位)和T细胞表位(位于FMDV血清型亚洲VP4蛋白的20-34位)。B细胞表位的氨基酸序列，以单字母形式表示，为SIINNYYMQQYQNSM(SEQ ID NO：14)，而所述T细胞表位的氨基酸序列，以单字母形式表示，为MTTTYTASARGDLAHLTTTHARHLP(SEQ ID NO：15)。
表达质粒构建体中的第一步是通过将pVP2-456蛋白的编码区克隆入载体pESCURAinv来实现的。质粒pESCURAinv是通过使用酶PvuII消化载体pRS426(Stratagene)并重新连接消化产物产生的。所得载体，pESCURAinv，含有相对于其亲代载体pRS426而言位置颠倒的多克隆区域。使用质粒pVOTE.2/Poly作为模块，使用对应的寡核苷酸(表1)通过PCR的方式获得了对应于pVP2-456蛋白的DNA片段(Fernandez-Arias，A.，Risco，C，Martinez，S.，Albai，J.P.& Rodriguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus resultsin the formation of virus-like particles“感染性法氏囊病病毒ORF A1的表达导致了病毒样颗粒的形成”.Journal of General Virology 79，1047-1054)。所述片段被纯化，经过酶BglII和HindIII的消化，并克隆入之前用酶BamHI和HindIII消化过的载体pESCURA.inv。所得质粒称为pESCURA/pVP2-456。
将含有对应于所述FMDV嵌合BT肽开放阅读框的DNA片段克隆入之前用适当限制酶消化过的质粒pESCURA/pVP2-456。所得质粒称为pESCURA/pVP2-456-BT并含有IBDV pVP2-456蛋白和FMDV嵌合BT肽的ORFs。
根据之前公开的方法，所述质粒pESCURA/pVP2-456-BT随后被用于转化酿酒酵母(S.cerevisiae)酵母单倍体株499的培养物(Gietz，R.D.and R.A.Woods.(2002)Transformation of yeast by the Liac/SS carrierDNA/PEG method“通过Liac/SS载体DNA/PEG方法转化酵母”.Methods in Enzymology 350：87-96)。使用所述质粒转化的酵母是通过在添加有氨基酸色氨酸，亮氨酸和组氨酸并缺乏尿素(-Ura)的SC培养基(CSM+YNB，2％葡萄糖和bacto琼脂)的培养皿中进行生长的方法进行筛选的。在30℃孵育48小时之后，选定一个菌落用于进行随后的蛋白表达分析和CVLP-pVP2-456-BT的形成。
对pVP2-456和BT蛋白表达以及CVLP形成的分析是根据之前公开的对IBDV VLPs进行表征的方法在其他表达系统中进行的((Fernandez-Arias，A.，Risco，C，Martinez，S.，Albar，J.P.& Rodriguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus resultsin the formation of virus-like particles“感染性法氏囊病病毒ORF A1的表达导致了病毒样颗粒的形成”.Journal of General Virology 79，1047-1054；Lombardo，E.，Maraver，A.，Castón，J.R.，Rivera，J.，Fernandez-Arias，A.，Serrano，A.，Carrascosa，J.L.& Rodriguez，J.F.(1999).VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectiousbursal disease virus，forms complexes with the capsid protein VP3，leadingto efficient encapsidation into virus-like particles“VP1，推测的感染性法氏囊病病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，与衣壳蛋白VP3形成了复合物，导致了进入病毒样颗粒的有效壳体化”.Journal of Virology 73，6973-698)。将选定的菌落培养于添加了2％棉子糖的CSM(-Ura)+YNB液体培养基中。将所述培养物在30℃孵育24小时。将这种培养物，以0.2的光密度(OD)，接种于含有添加有2％半乳糖诱导物CSM(-Ura)+YNB培养基的200ml烧瓶中。所述培养物在30℃保持18小时(直到OD达到1.0-2.0之间)。将酵母在3,000rpm离心，在4℃保持5分钟，用蒸馏水洗涤一次，然后将沉淀重悬于裂解缓冲液(TEN：10mM Tris，pH 8.0；150mM NaCl；1mM EDTA)+蛋白酶抑制剂2X(Compl Roche)中。将大约尺度为425-600微米(Sigma)的一体积玻璃珠加入进行裂解。将这一混合物进行30秒的剧烈旋涡30秒，进行4次，间隔30秒，且全部在4℃进行。然后通过在4℃以13,000rpm离心15分钟回收所述可溶组分。根据之前公开的方法，将这一样本用于在蔗糖梯度中进行分馏(Lombardo，E.，Maraver，A.，Castón，J.R.，Rivera，J.，Fernandez-Arias，A.，Serrano，A.，Carrascosa，J.L.& Rodriguez，J.F.(1999).VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectiousbursal disease virus，forms complexes with the capsid protein VP3，leadingto efficient encapsidation into virus-like particles“VP1，推测的感染性法氏囊病病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，与衣壳蛋白VP3形成了复合物，导致了进入病毒样颗粒的有效壳体化”.Journal of Virology 73，6973-6983)。在分馏之后获得所述样本，且通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[分子生物学现有技术]和使用抗-pVP-456和抗-BT血清[分子生物学现有技术]的方式对起始材料样本进行了分析。所述Western印迹表现出了，具有对应于pVP2(48kDa)和BT蛋白(图11)条带预定分子量的条带的存在。这些结果表明在经过质粒pESCURA/pVP2-456-BT转化的酿酒酵母培养物中两种肽的正确表达。随后通过之前所述的TEM的方式对不同梯度组分进行分析(Lombardo，E.，Maraver，A.，Castón，J.R.，Rivera，J.，Fernandez-Arias，A.，Serrano，A.，Carrascosa，J.L.& Rodriguez，J.F.(1999).VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，formscomplexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidationinto virus-like particles“VP1，推测的感染性法氏囊病病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，与衣壳蛋白VP3形成了复合物，导致了进入病毒样颗粒的有效壳体化”.Journal of Virology 73：6973-6983)。对梯度组分的TEM分析表明了CVLPs-VP2-456-BT的存在(数据未显示)。
实施例4
CVLPs诱导抗-FMDV免疫反应的能力
为了评估CVLP[剂CVLPs-pVP2*(pVP2*-BT)(实施例3)]在小鼠中诱导抗-FMDV免疫反应的能力，对4组14日龄的Balbc小数进行了肌肉免疫(10只动物/组)。治疗组如下所示：
●1组，安慰剂(PBS)；
●2组，50μg CVLPs；
●3组，100μg CVLP；以及
●4组，50μg CVLP加佐剂
将维生素E用作佐剂，且将全部免疫原(CVLPs)剂量重悬于终体积为0.2ml的PBS中。接种后3周，从每个动物采集血清样本，如前所述，口蹄疫病毒(FMDV)特异性抗体的存在是通过对使用兔抗-血清型CFMDV血清(抗C1-Noville)捕获的未纯化FMDV株C-S8c1病毒进行捕获ELISA进行检测的[E.de Oliveira et al.Vaccine 23(2005)2647-2657]。
简言之，使用溶于碳酸缓冲液中的抗-C1-Noville血清包被96孔板，在室温蒸发过夜。使用PBS-Tween 20(0.005％)(洗涤缓冲液)洗涤三次板，并将对应于采用FMDV C-S8c1株感染幼仓鼠肾(BHK)细胞上清的抗原加入小孔中。在孵育(37℃ 1小时)之后，用洗涤缓冲液洗涤小孔三次，并使用溶于PBS的0.5％BSA(封闭缓冲液)封闭1小时。
封闭之后，将所述板与溶于封闭缓冲液加上0.1％Tween 20的来自四组小鼠血清(即，来自安慰剂和CVLPs-免疫小鼠血清)的稀释液孵育2小时。在洗涤(用洗涤缓冲液洗涤三次)之后，将小孔与溶于封闭缓冲液加0.1％Tween 20中轭合于辣根过氧化物酶的羊抗鼠血清孵育2小时。在大量洗涤之后，向小孔中加入底物四甲基联苯胺(TMB)，允许所述反应显色10分钟，然后使用2M H2SO4终止。在292nm在分光光度计中确定抗原-抗体反应。
如图12所示，一些来自于3组和4组的动物具有针对FMDV的特定抗体滴度。这些结果明白地指出使用CVLPs[CVLPs-pVP2*(pVP2*-BT)(实施例3)]免疫能够诱导针对FMDV的特异免疫反应，且这一免疫反应随着佐剂的加入而升高。
序列表
<110>比奥诺斯特拉有限公司
     西班牙高等科研理事会
<120>获自传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空心病毒样颗粒，其制备方法和应用
<130>SCT080216-47
 <160>15
 <150>P200501733
 <151>2005-07-15
 <210>1
 <211>13
 <212>PRT
 <213>Artificial sequence
 <220>
 <223>synthetic peptide
 <400>1
 Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg Arg Ile
                   5                  10
 <210>2
 <211>10
 <212>PRT
 <213>Artificial sequence
 <220>
 <223>peptide
 <400>2
 Gly Phe Lys Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg
                   5                  10
 <210>3
 <211>35
 <212>DNA
 <213>Artificial sequence
 <220>synthetic DNA
 <223>Oligonucleotide Primer 5′-VP2 used to generate C-terminal end
 mutant deletions
 <400>3
 gcgcagatct atgacaaacc  tgtcagatcaaaccc                   35
 <210>4
 <211>34
 <212>DNA
 <213>Artificial sequence
 <220>synthetic DNA
 <223>Oligonucleotide Primer NotI-441 used to generate C-terminal end
 mutant deletions
<400>4
gcgcgcggcc gcttatgctc ctgcaatctt cagg    34
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-456 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>5
gcgcaagctt acacagctat cctccttatg gc      32
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-466 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>6
gcgcaagctt aggcaggtgg gaacaatgtg g       31
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-476 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>7
gcgcaagctt aaccttcccc aattgcatgg ggc     33
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-487 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>8
gcgcaagctt aggcctgggc ctcatcgccc agc     33
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-494 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>9
gcgcaagctt aggctcgagc agttcctgaa gc          32
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-501 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>10
gcgcaagctt aagctcttgc ttttcctgac gc          32
<210>11
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>synthetic DNA
<223>Oligonucleotide Primer HindIII-512 used to generate C-terminal end
mutant deletions
<400>11
gcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc        34
<210>12
<211>28
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>extra tag sequence
<400>12
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
                  5                  10                  15
Thr Glu Asn Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Met Gly Ser
             20                  25
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>peptide
<400>13
Glu Phe Arg Asp Ile Ile Asp Ala Thr Arg
                  5                  10
<210>14
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>B cell epitope of the chimeric BT peptide
<400>14
Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met
                  5                  10                  15
<210>15
<211>25
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>T cell epitope of the chimeric BT peptide
<400>15
Met Thr Thr Thr Tyr Thr Ala Ser Ala Arg Gly Asp Leu Ala His Leu
                  5                  10                  15
Thr Thr Thr His Als Arg His Leu Pro
             20                  25