中国南海信号芋螺神经毒素基因LT32及其应用.pdf

本发明涉及一种新的中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因Lt3.2及其编码的多肽序列lt3b，以及该多肽在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明通过构建cDNA文库的方法，从中国南海信号芋螺毒管中克隆得到的新的M-超家族芋螺毒素基因，Lt3.2的cDNA序列如序列表中(400)1序列所示。该基因编码的多肽(芋螺毒素lt3b)，前体肽氨基酸序列如序列表(400)2序列所示，推测的成熟肽氨基酸序列如序列表(400)3序列所示。本发明的神经毒素lt3b能增加钠通道开放电流且具有镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛剂。

权利要求书
1.  一种神经毒素多肽，其包括含有序列表<400>2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。

2.  按照权利要求1所述的神经毒素多肽，其特征在于：该新的神经毒素多肽选自以下组之一：
(a)由序列表<400>2所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或舔加而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。

3.  一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一核苷酸序列：
(a)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.  按权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：该核苷酸是编码序列表<400>2所示的氨基酸序列的多核苷酸。

5.  权利要求2的所述的神经毒素多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表400<3>所示。

6.  权利要求1、2或5所述多肽作为神经生物学工具药物和镇痛药物的应用。

7.  权利要求5所述的神经毒素多肽的成熟肽片段RCCISP ACHEECYCCQ，其中“E”为羧化谷氨酸，用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物的应用。

8.  权利要求1、2或5所述多肽作为增加钠离子通道开放电流的试剂的应用。

9.  权利要求1、2或5所述多肽作为离子通道类型的检测的探针的应用。

说明书中国南海信号芋螺神经毒素基因Lt3.2及其应用
技术领域
本发明涉及一种中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因Lt3.2及其编码的多肽序列lt3b和该多肽的制备技术，以及该毒素在神经生物学研究，离子通道药物和镇痛药物开发中的应用。
背景技术
芋螺属于软体动物门腹足纲芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域，少数在水深几米至200余米的深水区，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)时期与陆地上恐龙同时灭绝的海洋捕食性软体动物菊石的消失客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于中新世(Miocene)，基本上持续到现在。每个芋螺物种的形成都伴随全新的毒液成分和有效的毒液输送装置的进化。
芋螺具有强大的自然进化能力，全球有超过500种芋螺，单一种属中就包括数百种物种，这使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺是食肉动物，靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺(molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右。食鱼性芋螺占芋螺总数最少，但毒性最强，报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的，如织锦芋螺(C.textile)、地纹芋螺(C.geographus)等。
芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特异地作用于神经系统的电压门控和配体门控离子通道的不用亚型和递质受体，因此被广泛用于神经生物学研究。芋螺毒素通常为由7～41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较(40～80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。
二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素以其分子小，结构稳定，对受体作用范围广并且活性强的特点，已经跃居于动物神经毒素研究的首位。由于它们作用靶点广泛，能高度特异地结合细胞膜上神经递质和激肽的受体和各种离子通道，一方面，可以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为神经生物学中发现鉴定新受体，研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要探针，并推动了离子通道的进化研究。
保守估计有50000种以上不同的芋螺毒素存在，至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX M VIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。芋螺毒素药用研究的其他方向还有：具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性，降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。
另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。
芋螺在我国南海海域有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种，主要分布在台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。近年来国内也开展了芋螺毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。中国科学院北京药物化学研究所的陈冀胜研究员等人已自桶形芋螺(C.betulinus)、独特芋螺(C.caracteristileus)、菖蒲芋螺(C.vexillum)、地纹芋螺等类芋螺中分离鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。军事医学科学院生物工程研究所的卢柏松、黄培堂以及戴秋云等从我国的线纹芋螺、织锦芋螺中也发现了一些新的毒素成分和基因序列。热带农业大学彭世清、罗素兰等已从菖蒲芋螺基因组中克隆到两个新芋螺毒素基因(GenBank登记号AY316159，AY316160)；同时还从海南产的大理石芋螺(C.marmoreus)、幻芋螺(C.magus)、信号芋螺(C.littertus)、勇士芋螺(C.miles)、独特芋螺、织锦芋螺、桶形芋螺、疵篙芋螺(C.lividus)等共12个种中分别发现了多种具有药用功能的芋螺毒素及其基因。虽然我国有着丰富的芋螺资源，但由于起步较晚，目前对于芋螺毒素的研究尚处于初期阶段，有着广阔的研究空间和开发前景。
由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建信号芋螺毒管cDNA文库可以系统地研究食虫芋螺的毒素组成、表达谱，发现新的食虫芋螺特有的毒素序列。迄今为止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海信号芋螺是一种食虫性芋螺，世界上尚没有关于它的毒素研究的报道。
因此，开展我国南海信号芋螺毒素的生物化学、药理学尤其是其分子生物学和基因工程技术领域的探索研究将有助于对新毒素分子相应受体及其作用机制的深入研究，而且可为我国芋螺海洋资源的药用开发利用提供重要理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因Lt3.2及其编码的多肽序列lt3b及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供该多肽的分离纯化方法。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供这些多肽的用途。
本发明的第一方面，提供一种新的神经毒素多肽，其包括含有序列表<400>2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。
上述的新的神经毒素多肽优选自以下组之一：
(a)由序列表<400>2所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或舔加而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一核苷酸序列：
(a)编码上述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
较佳的，该多核苷酸编码<400>2所示的氨基酸序列。
本发明的第三方面，提供上述的神经毒素多肽的成熟肽RCCISPACHEECYCCQ(其中“E”为羧化谷氨酸)及其修饰物，以及含有上述成熟肽片段的多肽。
本发明的第四个方面提供上述多肽的用途：本发明获得的中国南海信号芋螺神经毒素多肽的成熟肽是一种神经毒素lt3b(注：由于前体肽和成熟肽毕竟是两种不一样的多肽，为了区分，前体肽在本专利申请中叫做神经毒素多肽，而其成熟肽叫做神经毒素lt3b)，具有生物活性。该神经毒素具有镇痛作用。分离纯化的lt3b能增大钠离子通道的开放电流。因此，本发明的中国南海信号芋螺神经毒素lt3b可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
通过cDNA文库的构建和测序的方法，从中国南海信号芋螺毒管中分离得到具有新的半胱氨酸骨架的芋螺毒素Lt3.2基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明基因所编码的多肽lt3b，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；其成熟肽序列如序列表中<400>3序列所示
本发明所选择的信号芋螺采自中国南海西沙群岛一带。
信号芋螺毒管cDNA文库的构建：取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合成双链cDNA，双链cDNA与pMD18T载体连接后转化E.coli，并保存每个重组克隆。
本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码芋螺毒素的克隆，命名为Lt3.2(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码70个氨基酸残基。
电生理实验结果证实，信号芋螺毒素lt3b能增加大鼠DRG细胞钠离子通道的开放电流，可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者用于工具药的研究开发，用于制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病的药物。
小鼠热板试验结果证实，重组信号芋螺毒素lt3b的中、高剂量组与空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)；由此可初步认为lt3b的中、高剂量组具有一定的镇痛作用，从而为制备镇痛药物提供数据。
附图说明
图1为信号芋螺粗毒经Sephadex G25分离的层析峰图
图2为芋螺粗毒凝胶过滤后洗脱各峰的电泳图，其中
1：G25峰III经过1KD超滤膜超滤后；2：G25峰I；3：G25峰II
图3为凝胶色谱II号峰的离子交换层析图
图4为芋螺毒素lt3b高效液相色谱图
图5为芋螺毒素lt3b的MOLDI-TOF质谱图
图6为芋螺毒素lt3b对大鼠背根神经节细胞电压门控钠离子通道电流的影响
图6A：钳制电压为-80mV，刺激电压从-80mV至+30mV，脉冲间隔为10mV，刺激电压的脉冲宽度为100ms。对照和加100nM lt3b后电流峰形的变化
图6B：I-V曲线表明了对照和加100nM lt3b 20min后峰电流的变化
图7为重组芋螺毒素lt3b生理模型上的镇痛药效
NS：空白对照组，H：lt3b样品高剂量组，M：lt3b样品中剂量组，L：lt3b样品低剂量组
具体实施方式
在本发明申请中，“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另外一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。
本发明中的多核苷酸指RNA序列、DNA序列或cDNA。
本发明用构建cDNA文库的方法，从中国南海信号芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素M-超家族成员Lt3.2，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明基因编码的多肽的氨基酸序列如序列表<400>2所示，该多肽是一前体肽，其成熟肽(神经毒素lt3b)的氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示：该成熟肽由16个氨基酸组成，分子量为1930.30道尔顿。
本发明所选择的信号芋螺属于中国南海食虫性信号芋螺(Conuslitteratus)，采自海南省三亚市。
中国南海信号芋螺毒管cDNA文库的构建：首先分离信号芋螺毒管，提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平板上挑取单克隆保种。
本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，得到EST序列编码中国南海信号芋螺神经毒素M-超家族成员，命名为Lt3.2(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码的前体肽的氨基酸序列如序列表<400>2所示，而该前体肽的成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示由16个氨基酸组成，分子量为1930.30道尔顿，具有典型芋螺毒素一级结构的特征，分子内具有三对二硫键。
本发明通过分离纯化得到了一条多肽lt3b，RCCISPACHEECYCCQ，分子量为1930.30道尔顿，其中“E”为羧化谷氨酸。其分子内第一个和第四个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第五个半胱氨酸成一对二硫键，第三个和第六个半胱氨酸成一对二硫键。
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定：
总RNA的提取和cDNA合成：分离中国南海信号芋螺毒管，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。取1μg信号芋螺毒管总RNA以SMART III olignuclotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。
信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定：取cDNA 1.5μl用于连接反应，转化后涂板。从平板中挑取单克隆保种并随机挑取一定数目的单克隆进行测序和生物信息学分析。
实施例2：信号芋螺粗毒提取：
将新鲜分离的毒液管放置于培养皿，采用三种不同方式获取粗毒。1)挤出法。捏住毒囊一端，将浆液从毒液管挤出。2)匀浆法。将毒管及毒囊解剖出来后，放到冰浴的烧杯里，用匀浆器粉碎。3)液氮碾磨法。在碾钵中加入液氮，使毒管和毒泡磨成粉末。将三种方法获得的毒液分别在1.1％的乙酸缓冲液中萃取，反复离心收集上清液，即时上凝胶层析或者放置于-20℃冷冻保存。
实施例3：凝胶色谱分离纯化
将实施例2萃取的粗毒用Sephadex G-25层析柱(用1.1％的乙酸溶液平衡)进行初步分离，流速为1ml/min。信号芋螺粗毒经Sephadex G25分离的层析峰图如图1所示。收集各个洗脱峰，然后用SDS-PAGE电泳确定每个峰所含组分的大致分子量，结果如图2所示。
将收集的各峰用Tris-HCl调节pH到8.8，然后分别上样到Q sepharose highperformance阴离子交换柱(20×2.6cm，预先用pH8.8的50mM Tris-HCl溶液平衡)进行离子交换层析，同时收集穿透峰；流速1ml/min。用0~1M NaCl溶液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰。其中，G25凝胶色谱II号峰的离子交换层析图分别如图3所示。
实施例4：RP-HPLC分离纯化、质谱与测序
将离子交换层析中收集的各组分用Stirred cell 8200超滤装置(配截留分子量为1KD的滤膜)过滤浓缩。滤缸内液用Hypersil BDS C18 RP-HPLC柱再次纯化，所用的平衡液为BufferA(0.1％TFA)，洗脱液为Buffer B(含0.1％TFA的乙腈)，流速为0.8ml/min。高效液相色谱图如图3所示。图4所示的高效液相色谱图是收集图3的IV号峰来进行的。收集洗脱峰，用MOLDI-TOF质谱分析后，在ABI 492cLC型蛋白质序列测定仪上用Edman降解法测定氨基酸序列，获得的信号芋螺毒素lt3b的氨基酸序列与序列表400<3>一致。
实施例5：信号芋螺毒素lt3b对钠离子通道的作用
选用细胞表面光滑的DRG细胞进行全细胞电流膜片钳实验。利用内液中CsCl与外液中TEA-Cl阻断钾离子电流，内液中NaF和外液中LaCl阻断钙离子电流。细胞钳制电压为-80mV，刺激电压为-80mV到+30mV，步阶为10mV，刺激电压脉冲宽度为100mS。记录的电流为钠内向电流。将用上述方法分离纯化获得的新的芋螺毒素lt3b加到细胞外液中至终浓度为100nM，约20min后，当芋螺毒素均匀扩散到溶液中后，钠通道的开放电流比对照有明显的增大，增大比例15％左右。
实施例6：生理模型上的中枢镇痛药效实验法
基本方案：小鼠热板法
选取NIH系小鼠100只，体重20±2g，全为雌性。实验前先对小鼠进行筛选，将小鼠放于事先加热到55℃的热板测痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间为该鼠的痛阈值，测定2次，挑选出痛阈值不超过20s的小鼠为合格者进行正式实验。将筛选后的小鼠随机分成4组，即空白对照组、lt3b样品低、中、高剂量组，每组10只。实验开始时进行腹腔注射给药，其中lt3b样品低、中、高剂量组给予剂量分别为0.07mg/kg，0.14mg/kg，0.28mg/kg，空白对照组给予等体积的生理盐水。于注射给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h测定一次，如痛阈值超过60s则按60s计算(注意时间不宜太久以免烫伤小鼠足部)。实验结束后，进行统计学处理并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)÷用药前平均痛阈值×100％。
由实验结果可得，空白对照组小鼠给药前后的痛阈值基本稳定，提示经过筛选后的小鼠对热刺激反应的耐受性较好。受试样品lt3b的低、中、高剂量组小鼠给药后的痛阈值均不同程度的提高，其中给药0.5h时，受试样品lt3b的三个剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.001)；给药1h和2h时，受试样品lt3b的中、高剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.001)；给药3h时，受试样品的痛阈值降至最低，其中lt3b的中、高剂量组与空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)；由此可初步认为lt3b的中、高剂量组具有一定的镇痛作用。(见图7)
序列表