一种杨梅素的医药新用途.pdf

本发明属于医药技术领域，公开了一种杨梅素的医药新用途。经醋酸扭体法、甲醛致痛法、冰醋酸致毛细血管通透法、二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、蛋清和角叉菜胶致足肿胀法、羧甲基纤维素囊中渗出液白细胞游走法、肉芽肿慢性炎症法及原发性和继发性佐剂性关节炎几个动物模型筛选，发现其抗炎活性高且有镇痛作用，同时能预防和治疗佐剂性关节炎，其抗炎活性与阿司匹林活性相当却无胃肠道毒性，其抗类风湿性关节炎活性与雷公藤活性相当，同时具有保肝作用，是一种预防和治疗急、慢性炎症和类风湿性关节炎的理想药物。杨梅素可以和药学上可接受的载体制备成各种剂型，用于抗炎、镇痛及抗类风湿性关节炎。

权利要求书
1、  一种杨梅素的医药新用途，其特征在于：杨梅素用于制备预防和治疗急、慢性炎症、类风湿性关节炎、肝炎、护肝保健、各种疼痛的药物中。

2、  根据权利要求1所述的一种杨梅素的医药新用途，其特征在于：所述的杨梅素为从杨梅或其它植物中提取分离出来的黄酮类化合物。

3、  一种杨梅素的药物组合物，其特征在于：杨梅素可以和药学上可接受的载体混合制备成药物组合物。

4、  根据权利要求1所述的一种杨梅素的医药新用途，其特征在于：所述的杨梅素可以和药学上可接受的载体或赋形剂制成片剂、胶囊、颗粒剂、软胶囊、滴丸。

说明书一种杨梅素的医药新用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种杨梅素的医药新用途，具体涉及杨梅素在制备用于预防和治疗急、慢性炎症、类风湿性关节炎、治疗肝炎、护肝保健、镇痛的药物中的应用。
背景技术
炎症是多种疾病在临床上的常见症状，是机体对各种炎性物质刺激引起组织损害而产生的一种复杂的病理过程。其主要表现为局部的红、肿、热、痛，病理检查可发现在炎症部位有大量炎性细胞浸润和组织坏死。炎症是机体对炎症因子侵袭的重要保护性反应，但同时炎症反应又对机体具有不同程度的损害，许多疾病与炎症有关，如关节炎及外伤感染等。目前，临床上用于治疗炎症的药物大致可分为甾体抗炎药和非甾体抗炎药(NSAIDs)。
甾体抗炎药如氢化可的松，泼尼松等具有良好的抗炎作用，但长期使用可产生水、钠滞留，蛋白分解以及肾上腺素功能减退等严重的不良反应，因此限制了其在需要长期用药的慢性炎症上的治疗应用。非甾体抗炎药按化学结构可分为四类：水杨酸类(阿司匹林)、苯胺类(对乙酰氨基酚、非那西丁)、吡唑酮类(氨基比林、保泰松)及其他有机酸类(吲哚美辛、布洛芬、吡罗昔康)。尽管本类抗炎药物在化学结构上属于不同类别，但均有共同的作用基础，即抑制体内前列腺素(prostaglandin，PG)的生物合成。细胞膜磷脂中以脂化方式结合的花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在磷脂酶A2的作用下可从磷脂中释放出来。游离的花生四烯酸转化途径有二：一是经细胞微粒体内PG合成酶(环氧酶)的催化生成各种PG(PGI，PGE，PGF)，另一代谢途径是经细胞质中的脂氧酶的催化生成白三烯类(leukotrienes，LTs)，这两条代谢途径的产物有相互调节和制约作用。选择性COX2(环氧酶2)抑制剂、5-LOX(5脂氧酶)抑制剂、COX/5-LOX双重抑制剂和NO释放型非甾体抗炎药是目前临床应用最为广泛的一类药物，主要用于治疗各种急、慢性炎症及中、轻度疼痛。
类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性、多关节表现为主的全身性自身免疫性疾病，为临床常见病。目前认为类风湿性关节炎可能是由于人们尚未知的某种抗原对具有敏感性的某些遗传背景的人产生刺激后，发生免疫反应所引起，通常认为与T细胞免疫反应和B细胞产生自身抗体均有关。随着分子生物学和免疫学的发展研究发现：白细胞介素(Interleukin，IL)IL-1，IL-6，IL-8和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是类风湿性关节炎等严重炎症的主要致炎因子。IL阻断剂的研究已经成为当前抗炎药研究的新领域，其中，IL-1阻断剂的研究已经取得了令人瞩目的进展。IL-1阻断剂与传统的NSAIDs、COX2选择性抑制剂以及COX/5-LOX双重抑制剂不同，这类抗炎剂不影响LOX活性，对COX抑制活性也比较弱。总之：细胞因子、白细胞分化抗原(CD)、黏附分子、Th1/Th2平衡、疾病病因、基因等在类风湿性关节炎的发病过程中均起着重要作用。临床上治疗RA常见的药物主要有非甾体抗炎药以及糖皮质激素等，其临床疗效显著，但对其副作用也频见报道，如胃肠道反应、女性月经的紊乱、肝脏转氨酶的升高等。而传统的NSAIDs普遍都具有导致胃肠道、肾以及肝损伤等毒副作用。NSAIDs的胃肠道不良反应已成为其临床应用的最大障碍。而且抗炎药物临床应用面广，使用时间长，难于进行有效的用药监控。因此，对该类药物毒副作用的限制更为严格，寻找低毒高效的新非甾体抗炎药一直是药物研究的一个重要领域。
在医疗模式由治疗型向预防、保健相结合模式转变的大背景下，人们对化学合成药物毒副作用的认识逐渐增强，追求生命的原生态已成为目前研究的主题。植物药能满足人们的这种心理需求，是人类防病治病的主要天然药物。杨梅素作为一种不可多得的天然活性物质，广泛存在于多种中草药植物中，但其一直以粗提物的形式被开发和销售，致使其不能更广泛的应用到制药、食品添加剂等领域，这也是我国目前植物天然产物开发过程中存在的不足之处。因杨梅素毒副作用极小，无胃肠道不良反应，体外实验表明能降低IL-1水平，由此其有望进一步被开发为特殊人群尤其对妊娠及哺乳期妇女和婴儿更加适合的抗炎药物。目前，杨梅素在治疗心脑血管疾病的药物及治疗脂肪肝、肥胖症的药物和治疗溃疡疾病的药物中都有所应用，分别见中国专利申请号：200710034611.8、03127190.1、20061008296.7。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗炎活性强，毒副作用小的新型抗炎药，用于治疗急、慢性炎症和类风湿性关节炎的药物。
本发明的一个目的是提供一种含有杨梅素和药学可接受载体或赋形剂的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供杨梅素和其药物组合物在制备治疗急、慢性炎症、类风湿性关节炎、肝炎的药物和保健品中的应用。
本发明的原理是通过建立药理筛选类型追踪杨梅素药效活性，找到其药用用途。
本发明人经过代表炎症反应第一时相的醋酸致小鼠毛细血管通透模型、二甲苯致小鼠耳肿胀模型、蛋清和角叉菜胶致足肿胀模型，代表炎症反应第二时相的CMC-Na诱导小鼠皮下气囊白细胞游走模型，代表炎症反应第三时相的棉球肉芽肿模型和醋酸扭体法、甲醛致痛模型考察了杨梅素的抗炎镇痛作用，又经原发性和继发性佐剂性关节炎模型考察了杨梅素的抗类风湿性关节炎作用，同时对杨梅素的保肝作用及无胃粘膜损伤作用进行了实验研究。结果表明，杨梅素能抑制急性炎症反应，能抑制炎症晚期的组织增生和肉芽组织的形成，且能减少醋酸所致小鼠的扭体反应，提示杨梅素既可抑制炎症早期的水肿与渗出，又可抑制炎症晚期的肉芽组织形成，同时能缓解原发性和继发性佐剂性关节炎症状又有镇痛作用。
本发明所应用的杨梅素可以从杨梅叶或根、皮中提取，经分离纯化制得。
本发明人发现杨梅素可以用于制药领域，保健品领域和食品领域。
杨梅素可以直接药用或者与药学上可接受载体或赋形剂组合可以配制成药物组合物，杨梅素还可以作为保健品的有效成分，本发明组合物还可以配制成饮料等。
本发明药物组合物可以通过药学领域常规配制技术和载体，配制成药物组合物。本发明组合物可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、软胶囊、滴丸等剂型。还可以加入到茶或饮料中，制成保健茶或饮料。
片剂的普通配方可以是杨梅素：10-90％重量比，蔗糖0-9％重量比，硬脂酸镁1％重量比，50％的乙醇适量。胶囊剂的普通配方可以是杨梅素：10-100％重量比，淀粉0％-90重量比。颗粒剂的普通配方可以是杨梅素：5-100％重量比，(蔗糖+糊精)0％-95％重量比，蔗糖∶糊精＝2∶1。但是本领域技术人员也可以根据需要用本领域公知的技术和载体配制成其他剂型。
本发明通过动物药理实验，确定杨梅素的使用剂量为100mg/kg-400mg/kg/d。且在有效预防、治疗剂量范围内无毒副作用，且无胃损伤副作用且对肝脏有保护作用，可以长期服用。
具体实施方式
通过下面实施例详细说明本发明。但是应该理解这些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。
实施例1：片剂：
杨梅素10g
糖粉19.5
硬脂酸镁0.5g
50％乙醇 适量
将杨梅素、糖粉粉碎成细粉，过筛(100目)，混匀，以50％乙醇(20目筛)制成湿颗粒，干燥，整粒(16目筛)，加入硬脂酸镁，混匀，压制成100片，包薄膜衣，即得。
实施例2：胶囊剂：
杨梅素100g
淀粉20g
50％乙醇 适量
将杨梅素粉碎，加淀粉，混匀，以50％乙醇(20目筛)制成湿颗粒，干燥，整粒(16目筛)，填入空胶囊中，即得
实施例3：颗粒剂：
杨梅素100g
糖粉300g
糊精150g
乙醇5ml
将杨梅素、糖粉、糊精粉碎成细粉，过筛(100目)，混匀，以乙醇(20目筛)制成湿颗粒，干燥，整粒(16目筛)，得到颗粒剂。
实施例4：软胶囊：
杨梅素50g
大豆油150g
将杨梅素粉碎成细粉，过筛(100目)加入大豆油混合均匀后和软胶囊的胶片压制成软胶囊。
实施例5：滴丸：
杨梅素 50g
PEG6000 25g
PEG4000 25g
将杨梅素加入到加热融化的聚乙二醇辅料中混匀；接着将熔融混合液移入滴丸机进行滴制；药液滴至液体石蜡冷却剂中冷却；用吸布吸干冷却剂，选丸，即得到杨梅素滴丸。
本发明通过动物药理实验，确定杨梅素的使用剂量为100mg/kg-400mg/kg/d。且在有效预防、治疗剂量范围内无毒副作用，且无胃损伤副作用且对肝脏有保护作用，可以长期服用。
以下通过实施例对本发明做进一步说明：
试验动物：昆明种小鼠，体重18-22g，Wistar雄性大鼠，150-180g，购于沈阳药科大学动物中心，受试动物预处理：在饲养室内观察一周，室温21-23℃，相对湿度30-70％，进食沈阳药科大学实验动物室提供机制料块，饮自来水，自然光照。
实施例6：杨梅素对醋酸致痛小鼠扭体反应的影响
雄性小鼠60只，体重18-22g，随机分为5组，每组12只，各组均ig给药，1次/天，连续给药7d。5组分别为空白组：0.5％CMC-Na(0.2ml/kg)，阿司匹林阳性对照组：300mg/kg，杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)，末次给药1h后，每只小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液(醋酸溶液临用前配制)致痛(10mL/kg)，观察注射致痛剂后15min内各小鼠的扭体次数(腹部收缩内凹，伸展后肢，臀部抬高、扭转，蠕行)，计算扭体镇痛百分率，镇痛百分率＝(溶媒组平均扭体次数一给药组平均扭体次数)/溶媒组平均扭体次数×100％，并进行数据统计(各治疗组与对照组的比较采用t检验)，结果见表1。
表1杨梅素对醋酸致痛小鼠扭体反应的影响(X±S，n＝12)

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
由表1可知，与空白对照组比较，杨梅素各剂量组和阿司匹林均能明显减少醋酸所致小鼠扭体反应的次数，镇痛百分率分别为39.29％，44.29％、45.24％，并有剂量依赖性。表明杨梅素对醋酸诱发的小鼠疼痛反应有显著抑制作用，即杨梅素有明显的镇痛作用，提示其对化学致痛有明显缓解作用。
实施例7：杨梅素对甲醛致小鼠疼痛的作用
雄性小鼠50只，体重18-22g，随机分为5组，每组10只。分组为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)，正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(消炎痛15mg/kg)。对照组和杨梅素组均ig给药，1次/天，连续给药7d。末次给药1h后，用微量注射器给小鼠右足背部1％的福尔马林30μl，即刻记录sc后0-10min的小鼠持续抬高后足的次数，进行组间比较。结果见表2。
表2杨梅素对甲醛致痛小鼠疼痛反应的影响(X±S)n＝10

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
由表2可见，在sc甲醛后10min内，消炎痛可明显减少甲醛致痛小鼠抬足次数，杨梅素100mg/kg、100mg/kg和100mg/kg组的小鼠抬足次数与正常对照组比较，抬后足次数也显著减少，表明杨梅素有镇痛作用。实施例8：杨梅素对甲醛致痛小鼠疼痛反应的影响
雄性小鼠56只，体重18-22g，随机分为5组，每组10只。分组为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)，正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(消炎痛15mg/kg)。正常对照组和杨梅素组均ig给药，1次/天，连续给药7d。末次给药1h后立即在小鼠的右前足背皮下注射1％的甲醛0.03ml/只致痛，在致痛后1h，将小鼠放入2000ml的烧杯中，稳定5min，然后观察并用秒表记录小鼠在1min内致痛脚离地的时间，以此作为疼痛指标，同时对疼痛进行4级评分。结果见表3。
表3杨梅素对甲醛致痛小鼠疼痛反应的影响(X±S)


*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
由表3可见，杨梅素各剂量组在注射甲醛后1h内均减少小鼠的致痛足离地时间及痛反应评分值，与对照组比较差异显著。
实施例9：杨梅素对小鼠腹部毛细血管通透性的影响
昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，按体重随机分为5组，每组10只，各组均i g给药，给药体积20mL/kg，1次/天，连续给药7d。5组分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg、400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(阿司匹林300mg/kg)。末次给药1h后，各鼠尾静脉注射0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.1mL/10g体重，并立即ip 0.6％醋酸0.2mL/只。致炎后60min颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹腔，用总量5mL的生理盐水多次冲洗小鼠腹腔，收集冲洗液。用吸管吸出洗涤液4ml加入生理盐水至10ml，3000rpm离心15min，取上清液于波长590nm比色测定OD值，以生理盐水溶液调零读取吸光度A值，以A值表示Evans蓝含量，进行组间比较，结果见表4。
表4杨梅素对小鼠腹部毛细血管通透性的影响(X±S，n＝10)

*p＜0.05 vs CMC-Na
结果所示：杨梅素中、高剂量组的吸光度值与正常对照组比较显著降低，表明杨梅素对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加均有不同程度的抑制作用，具有抗炎作用。
实施例10：杨梅素对二甲苯所致小鼠耳廓炎症的影响
雄性小鼠60只，体重18-22g，随机分为5组，每组12只。5组分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(地塞米松2.5mg/kg)。正常对照组和杨梅素组均ig给药，1次/天，连续给药7d，阳性对照组于实验当日ip一次(按10mL/kg)。末次给药1h后，用0.02ml微量进样器将二甲苯以0.02ml/只涂于小鼠右耳两面，左耳不涂作为空白对照，4h后脱颈椎处死，用8mm打孔器沿耳廓基线两耳相同部位打下两圆耳片，称重，以左右耳片重量之差表示肿胀程度(ΔW，单位是mg)，计算肿胀度和肿胀抑制率。按下式计算每只鼠耳肿胀度(Ic)和给药组的肿胀抑制率(E)：Ic＝WR-WL；E＝(Ic-It)/Ic×100％。其中，WR、WL分别代表每只鼠右、左耳片的平均重量；Ic、It分别代表对照组和给药组耳片的肿胀度并进行组间比较。结果见表5。

**p＜0.01 vs CMC-Na
由表5可知，地塞米松和杨梅素高剂量组均能极显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀(P＜0.01)，其抑制率分别为57.78％和41.11％，且杨梅素低、中、高剂量组肿胀抑制率分别为28.89％、34.44％、41.11％，有随剂量增高的趋势，且地塞米松与杨梅素高剂量无显著性差异(P＞0.05)。
实施例11：杨梅素对蛋清致小鼠足肿胀的影响
雄性小鼠48只，体重18-22g，随机分为5组，各组均ig给药，1次/天，连续给药7d。5组分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(地塞米松2.5mg/kg)。实验当日每鼠右后足踝正面上端用笔作一清晰横线，容积法测定致炎前小鼠右后足容积，并于末次给药1h后，小鼠右后足跖皮下注射10％新鲜蛋清0.05ml致炎，分别于致炎1、2、3、4h测量小鼠右后足跖容积1次，并计算小鼠足跖肿胀率。足跖肿胀百分率＝(致炎后足跖体积-致炎前足跖体积)/致炎前足跖体积×100％，结果见表6、表7。
表6杨梅素对蛋清致小鼠足肿胀足跖肿胀体积的影响

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
表7杨梅素对蛋清致小鼠足肿胀的影响


*p＜0.05，vs CMC-Na
结果显示，与空白对照组比较，在致炎1，2，3h，地塞米松能显著降低蛋清所致小鼠足跖肿胀百分率，杨梅素100mg/kg，200mg/kg及400mg/kg组小鼠在致炎后1h能明显降低蛋清所致小鼠足跖肿胀百分率，足跖肿胀百分率分别为19.6％、16.0％和15.0％，且对蛋清致足肿胀的抑制作用在第1小时间最强，表明杨梅素具有抗炎作用。
实施例12：杨梅素对大鼠蛋清性足肿胀的影响
雄性SD大鼠40只，随机分为5组，每组8只。分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg、400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(阿司匹林300mg/kg)。常规饲养3d后灌胃给药，每天给药1次，连续给药7d。末次给药1h后，于每只大鼠右足跖注射新鲜蛋清0.05mL，在注射前每只大鼠测一次足容积作给药前值。分别于注射后30min、1h、2h和4h测大鼠右足足跖厚度以所测厚度值减给药前值作为肿胀度。蛋清致炎大鼠血清中丙二醛、一氧化氮的测定：将足肿胀实验中蛋清致炎4h后的大鼠血清装于EP管中，4℃保存待测超丙二醛含量。
表8杨梅素对大鼠蛋清性足肿胀足跖肿胀厚度的影响

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
表9杨梅素对大鼠蛋清性足肿胀足跖肿胀率的影响


**p＜0.01 vs CMC-Na()内为抑制率
由表8和表9可以看出，杨梅素可显著抑制蛋清诱发的大鼠足肿胀，3个剂量组在30min-4h时均能显著抑制大鼠足肿胀，且3个剂量组之间表现出明显的量效关系与时效关系。即杨梅素对以渗出性水肿为主的炎症早期反应有较强抑制作用。
表10杨梅素对蛋清致炎大鼠血清中MDA含量的影响

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
由此可见，杨梅素3个剂量组与空白组比较能显著降低致炎大鼠血清中丙二醛的含量。
实施例13：杨梅素对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
雄性小鼠60只，体重18-22g，随机分为5组，每组12只，各组均ig给药，1次/天，连续给药7d。5组分别为空白组：0.5％CMC-Na(0.2ml/kg)，阿司匹林阳性对照组：300mg/kg，杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)，末次给药1h后，以0.75％角叉菜胶生理盐水溶液，注射在名鼠右足跖部皮下致炎，每只0.05ml。注射角叉菜胶前和在致炎后2、4h分别用千分尺测量足跖垫厚度，单位为mm，按以下公式计算肿胀度。
足趾肿胀度＝致炎后右足趾厚度-致炎前右足趾厚度；足趾肿胀率(％)＝(炎后右足趾厚度-致炎前右足趾厚度)/致炎前右足趾厚度。结果见表11。
表11杨梅素对小鼠角叉菜胶足肿胀足趾厚度肿胀度的影响(mm，x±SD)

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
结果表明：杨梅素各剂量组在大鼠致炎2、4h后，能显著降低致炎足足趾肿胀度及足趾肿胀率。
实施例14：杨梅素对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响
雄性大鼠37只，体重(180±20)g，随机分5组，分组及剂量同前2.2.4。连续给药7d后于末次给药1h后，大鼠右后足sc1％角叉菜胶0.1mL，于致炎4h后测左、右后足重量，求出肿胀度、肿胀率及抑制率。结果如表12所示，
表12杨梅素对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

**p＜0.01 vs CMC-Na
与模型组比较，杨梅素中、高剂量给可显著抑制角叉菜所致足重量的增加、降低足跖肿胀率，增加足跖肿胀抑制率。
实施例15：杨梅素对小鼠羧甲基纤维素囊中渗出液白细胞游走的影响
昆明种雄性小鼠50只，体重18-22g，按体重随机分为5组，各组均ig给药，给药体积20ml/kg，1次/天，连续给药7d。5组分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg、400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.2ml/kg)和阳性对照组(布洛芬140mg/kg)。于末次给药前一天，将各组小鼠背部剃毛，无菌操作下向小鼠背部皮下注入空气1ml，形成圆形气囊。次日于末次给药后1h后，用消毒针头及注射器向囊内注入1.5％CMC液1ml。于末次给药后7h吸取囊内CMC，精确吸取0.02ml，稀释到0.4ml的生理盐水中，用微量移液器取0.01ml滴于血细胞计数板上，在镜下计数白细胞数。白细胞计数方法：在低倍镜下计数计数室内四角的四大方格中所有白细胞数，最后把所得总数*50，即为每mm3血液中的白细胞总数。(计算原理：每个大方格的面积为1mm2，计数室深度为1/10mm，血液稀释倍数为20倍，因此每mm3血液中的白细胞总数为4个大方格的白细胞*10*20/4)。另取小鼠31只，体重18-22g，按体重随机分为3组，各组均ig给药，给药体积20ml/kg，1次/天，连续给药7d。3组分别为杨梅苷292mg/kg、杨梅总黄酮600mg/kg和正常对照组0.5％CMC-Na，实验方法同前。结果见表13。
表13杨梅素对小鼠羧甲基纤维素囊中渗出液白细胞游走的影响(X±S)


*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
结果表明，杨梅素100mg/kg、杨梅苷292mg/kg和杨梅总黄酮600mg/kg能明显减少末次给药7h后CMC囊内白细胞数(P＜0.05)，杨梅素200mg/kg和400mg/kg组小鼠CMC囊内白细胞数亦显著下降(P＜0.01)，与生理盐水组比较有显著差异且与剂量有关，布洛芬组的白细胞数也明显减少(P＜0.01)，表明杨梅素有抗炎作用，
实施例16：杨梅素对棉球引起小鼠肉芽肿慢性炎症的影响
雄性小鼠48只，体重18-22g，将小鼠在乙醚浅麻醉状况下背部去毛消毒、正中切口，将精密称定的10mg经高压蒸气和氨苄青霉素灭菌的脱脂棉球植入背部正中皮下，待小鼠苏醒后，术后当天选活动正常的模型鼠随机分为5组，各组均ig给药，1次/天，连续给药7d。5组分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg、400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.2ml/kg)和阳性对照组(地塞米松2.5mg/kg)。第7天将小鼠麻醉处死，取出棉球及肉芽组织(给药期间，伤口被抓破棉球脱出的样本弃去)，于60℃烤箱中烘干6h称重，减去原棉球重量10mg，即为肉芽肿净重，并计算抑制率。抑制率(％)＝(空白肉芽组织干重-给药组肉芽组织干重)/空白肉芽组织干重*100％，结果见表14。
表14杨梅素对棉球引起小鼠肉芽肿慢性炎症的影响(x±s)

*p＜0.05，**p＜0.01 vs CMC-Na
由表14可知，与模型空白组相比较，地塞米松和杨梅素均能显著抑制棉球引起的小鼠炎症肉芽组织增生，抑制率分别为44.44％，33.02％，38.58％和32.10％。
实施例17：杨梅素对棉球引起大鼠肉芽肿慢性炎症的影响
雄性大鼠50只，戊巴比妥钠麻醉下左右腋窝部碘酒消毒，75％乙醇脱碘后各切开1cm长的小口，将2个灭菌棉球(每个棉球重(50±1)mg，高压灭菌，各加入10g/L氨苄青霉素2滴)，50℃烘箱烤干分别植入其中并缝合切口。术后大鼠随机分为5组。分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg、400mg/kg)，另设正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(地塞米松2.5mg/kg)。常规饲养3d后灌胃给药，每天给药1次，连续给药7d。末次给药1h后处死动物，取出棉球，在60℃烘箱放置12h后称重，减去原棉球重量即为肉芽肿净重。抑制率(％)＝(空白肉芽组织干重-给药组肉芽组织干重)/空白肉芽组织干重*100％。
表15杨梅素对棉球肉芽肿大鼠的影响

**p＜0.01 vs CMC-Na
由表15所示：杨梅素3个剂量组与空白组比较均能显著抑制肉芽肿形成，杨梅素400mg/kg组对肉芽肿的抑制作用只比地塞米松略低，说明杨梅素对炎症中晚期产生的增生现象有明显抑制作用。
实施例18：杨梅素对原发性佐剂性关节炎大鼠的影响
雄性SD大鼠50只，各大鼠右后足趾部皮内注射Freund’s完全佐剂0.1mL诱发佐剂性关节炎。造模后随机分为6组，各组分别为杨梅素各剂量组(100mg/kg，200mg/kg、400mg/kg)，正常对照组：0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)、模型组0.5％CMC-Na(0.1ml/kg)和阳性对照组(雷公藤15mg/kg)。
原发性佐剂性关节炎大鼠预防给药：于致炎后每天灌胃给药1次，连续给药7d。于造模前，造模后1天，4天，7天观察记录各组大鼠原发侧足跖关节肿胀程度的变化。
杨梅素对继发性佐剂性关节炎的预防给药：于致炎后第7天至第28天灌胃给药，每天一次。
观察造模第14天，第17天，第22天继发侧足趾关节肿胀程度的变化。肿胀抑制率(％)＝(炎后右足趾厚度-致炎前右足趾厚度)/致炎前右足趾厚度；踝关节周长肿胀度＝致炎后右足踝关节周长-致炎前右踝关节周长；踝关节周长肿胀率(％)＝(致炎后右踝关节周长-致炎前右踝关节周长)/致炎前右踝关节周长。由表16、表17、表18、表19所示：造模后第2天所有大鼠出现造模局部(原发侧)的红肿，伴皮温升高，精神萎靡。造模12天，模型组大鼠在不同程度上出现对侧后肢继发性肿胀，少数大鼠前肢也出现继发性肿胀。造模18天，模型组大鼠的关节肿胀程度较之急性期有所缓解，局部的红肿基本消失，皮温基本正常，但几乎都伴有关节的强直，变形以及活动的受限。AA组大鼠经杨梅素预防及治疗后，原发性和继发性病变均明显好转，杨梅素组AA大鼠造模侧和继发侧的肿胀均明显小于模型组。杨梅素对原发性佐剂性关节炎的影响
表16杨梅素对造模侧原发性佐剂性关节炎大鼠体重的影响(x±SD)

△P＜0.05 vs CMC-Na；**P＜0.01vs AA model group
表17杨梅素对造模侧原发性佐剂性关节炎大鼠足趾厚度的影响(cm，x±SD)

△P＜0.01 vs CMC-Na；*P＜0.05vs AA model group；**P＜0.01 vs AA model group
表18杨梅素对造模侧原发性佐剂性关节炎大鼠足趾肿胀率的影响(％，x±SD)

△△P＜0.01 vs CMC-Na；*P＜0.05 vs AA model group；**P＜0.01 vs AA model group
表19杨梅素对继发性佐剂性关节炎大鼠踝关节周长肿胀的影响(x±SD)


△P＜0.05 vs CMC-Na；△△P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05 vs AA model group；**P＜0.01 vs AA modelgroup
实施例19：杨梅素对小鼠胃粘膜的影响
昆明种小鼠36只，随机分为4组，空白组(等体积生理盐水，20ml/kg)，杨梅素100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg，连续给药30天，给药方式为灌胃。末次灌胃给药前禁食24h，末次灌胃给药4h后，脱颈处死，打开腹腔，结扎贲门和幽门，向胃内注射10％甲醛1mL，取胃，置于10％甲醛固定20min，沿胃大弯剪开，冲洗胃内容物，平展于玻璃板上，测胃黏膜所有溃疡面积(mm2)，将其总和作为溃疡数。溃疡指数的测定采用张守仁法(张守仁，邵金莺，於毓文.呋喃唑酮和一些常用抗溃疡药对四种大鼠胃溃疡模型的影响.药学学报，1984，91：5)，即黏膜完整为0级；点状出血1-5个点为1级，6-10个点为2级，10个点以上为3级，条状出血1-5条为4级，6-10条为5级，10条以上为6级。结果：杨梅素各组胃粘膜完整，无水肿、无充血，与空白组比较无差异，没有胃溃疡副作用。
实施例20：杨梅素对肝脏的保护作用
将受试小白鼠按体重、性别均衡分成七组，每组10只，雌雄各半，分别为溶媒对照组、模型对照组、阳性对照联苯双酯滴丸组(200mg/kg)、杨梅素四个剂量组(100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg、50mg/kg)。灌胃给药，给药容积为0.2ml/10g，溶媒对照组、模型对照组、灌胃相同体积的5‰CMC-Na溶剂，连续给药7天。于末次给药后1小时，腹腔注射0.1％CC14，0.2ml/10g进行急性肝损伤模型的制备。16小时后眼眶静脉丛采血，分离血清。按试剂盒说明测定血清中ALT及AST的含量，结果见表8。结果表明：模型组与空白对照组比较AST及ALT值有显著性提高，提示模型制备成功。与模型组比较，杨梅素400mg/kg、200mg/kg剂量组连续给药7天，ALT及AST值显著降低，说明杨梅素200mg/kg、400mg/kg对CC14致小鼠化学性肝损伤有保护作用。
表22杨梅素对CC14致小鼠肝损伤的影响


与溶剂对照组比较▲▲P＜0.01  与模型对照组比较*P＜0.05**P＜0.01
炎症是具有血管系统的活体组织对局部损伤的防御反应，是由损伤因子引起的组织损伤，炎症损伤以血管反应为中心，局部血流适当的加速和液体渗出，有利于稀释、限制和消除损伤因子，清除坏死组织，有利于组织的再生和修复。但过度的变性、渗出、坏死或异常的肉芽增生反应等对机体会造成不同程度的损伤。在炎症的早期，某些炎症介质刺激血管，使血管扩张，血管内皮间隙扩大，血管壁通透性增强，血浆内的液体、蛋白质和白细胞等渗出到组织间隙，随着渗出的增加，造成组织肿胀。因此，炎性渗出组织肿胀是炎症早期的重要指标。在炎症晚期和慢性炎症期，由于巨嗜细胞和纤维母细胞等增生，形成肉芽组织。我们用醋酸、二甲苯、蛋清、角叉菜胶和棉球作为致炎因子，考察了杨梅素对实验性渗出、肿胀、增生的影响；用羧甲基纤维素纳注入小鼠背部空囊中考察了杨梅素对渗出液中白细胞游走的影响；用醋酸、甲醛作为化学致痛剂观察了杨梅素对疼痛的影响；用弗氏完全佐剂观察了杨梅素对类风湿性关节炎的影响；用长期给小鼠灌服一定剂量的杨梅素考察了其对胃粘膜是否有损伤作用；用CC14致小鼠化学性肝损伤来考察杨梅素对肝的保护作用，结果表明杨梅素对对醋酸所致小鼠毛细血管通透性的增加具有明显的抑制作用，呈现一定的量效关系，高、中剂量组抗炎作用与阿司匹林组接近，无明显差异；杨梅素高剂量对二甲苯诱发的小鼠急性渗出性炎症(耳廓肿胀)组有明显的抗炎消肿作用；杨梅素各剂量组对小鼠、大鼠蛋清性足跖肿胀和角叉菜胶足跖肿胀模型均有显著抑制作用，且作用强度近似于地塞米松。醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进主要在于和H+的局部作用，以毛细血管扩张及通透性亢进为主要病理过程，而蛋清所致主要以组织胺和5-HT为炎性介质。由此可见，杨梅素能抑制急性炎症反应。杨梅素能明显减少末次给药7h后CMC囊内白细胞数，又可抑制炎症晚期的组织增生和肉芽组织的形成，同时能缓解原发性和继发性佐剂性关节炎症状又有镇痛作用。提示杨梅素在100mg/kg-400mg/kg量范围有抗炎、镇痛、抗类风湿性关节炎的作用，最为难能可贵的是，杨梅素无胃损伤副作用且对肝脏有保护作用，其作用机制有待进一步探讨。
总之，本实验表明杨梅素具有良好的抗炎、镇痛、抗类风湿性关节炎的作用，且本发明的实质性特点和显著进步在于杨梅素使用的安全性，在具有抗炎、抗类风湿性关节炎作用的同时具有镇痛、保肝、降糖、保护脑神经元的作用。此项研究对于药效评价和临床应用具有重要意义，为杨梅素的进一步开发提供了理论依据。