乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法.pdf

本发明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干扰核糖核酸(siRNA)序列及制备方法，SEQ ID NO.1－4为本发明提供的转录siRNA的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列，用体外转录方法合成针对HBV(ayw亚型)基因的特异siRNA，经转染细胞后，达到抑制HBV基因表达的目的。该方法可快速、经济、较大量地获得抗HBV的siRNA，为抗HBV的实验研究和临床应用提供技术和大量siRNA。

权利要求书
1.  乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列，其特征是：该小干扰核糖核酸序列的体外转录的反义DNA模板序列和正义DNA模板序列分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2：
SEQ ID NO.1  5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’
SEQ ID NO.2  5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’。

2.  根据权利要求1所述的乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)选取针对HBVS基因的siRNA的靶DNA序列：
5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’；
(2)设计并合成两段29-mer的DNA作为模板，包括8个与T7启动子引物3′端匹配的碱基和21个设计的siRNA序列，分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；
(3)将这两个模板和对应的T7启动子引物分别混合，引物末端和DNA模板退火结合；
(4)用DNA聚合酶Klenow大片断补平成为双链DNA模板；
(5)分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA包含5′端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3′端两个重复的U(UU)；
(6)通过DNA酶降解模板，同时用单链专一的核酸酶消化5′的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer的双链siRNAs——有19个碱基互补，3′端各有2个U突出；
(7)通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到siRNA。

3.  根据权利要求1所述的乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列在制备抑制乙肝病毒基因表达药物中的应用。

说明书乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术，涉及基因工程技术领域，具体地说涉及针对乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法。
背景技术
(1)乙肝病毒(HBV)的治疗现状
慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一，是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗乙型肝炎的药物主要是以α干扰素为主的免疫调节剂和以拉米呋啶、阿德福韦为主的核苷类似物，但治疗效果仍不满意。HBV DNA的持续复制是导致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA复制，是治疗慢性乙型肝炎和控制HBV持续感染的关键。
(2)RNA干扰的现状
最近，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现，给抗病毒疾病的治疗注入了新的活力。几十年来，RNA被认为仅仅是从DNA获取遗传信息，并将信息传递给蛋白质。但最近研究发现，小片段RNA(small RNA)发挥着基因调控的作用，它能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平[1]。现实验研究已经证实在哺乳动物细胞中，21-23个核苷酸长度的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解特定的RNA，从而阻断蛋白质的表达[2，3]，这些特定长度的dsRNA被称为siRNA(small interfering RNAs)。进一步的机理研究发现，siRNA不仅能够在转录后水平沉默(transcriptionalgene silencing PTGS)特定基因的功能，还能在DNA和转录水平调节基因(transcriptional gene silencing，TGS)的表达[4]。现研究主要集中在转录后水平，siRNAs在细胞浆中形成后首先进入RISC复合体(RNA induced silencingcomplex)，在ATP和解旋酶等的作用下解旋成单链，反义链通过碱基互补方式结合到特定序列的RNA上，在RISC复合体的协助下切割特定RNA序列，从而降解RNA，使之无法翻译成蛋白质，造成该特定基因沉默(gene silencing)，失去功能[4]。同时，RNAi具有高度特异性，19对核苷酸的双链RNA(其3’端外挂2个脲嘧啶序列[5])几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这对siRNA的应用是非常重要的，可以避免siRNA降解与靶mRNA同家族的其他的mRNA[5]。此外，已有研究发现，RNAi除了在转录后水平调节基因表达，而且能使同源DNA序列甲基化结构，因而在转录水平具有重要的调控作用，Mette等证实与NOSPro基因启动子区同源的23nt的dsRNA可直接引起目的基因的DNA序列的甲基化，导致转录失活[6]。
RNAi作为一种RNA基础上的细胞“免疫”系统，近来被应用于抗病毒感染和复制的研究中，并在HIV的体外实验中取得了较理想的结果，作用强度远远超过了反义核酸和核酶技术[7]。Rossi等将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制；同时将siRNA的抑制效应与反义RNA，核酶等进行了比较，发现只有siRNA组抑制了HIVrev-EGFP的表达，其抑制率达到90％，而反义RNA，核酶组与对照组无显著差异[7]，这一结果同样被Sharp等学者所证实[8]。在针对肝炎病毒基因的RNAi研究中，已有研究表明：针对HCV基因靶序列的siRNA能有效抑制HCV RNA的复制及病毒蛋白的表达[10]。由于RNA干扰采用的是双链RNA，它比较稳定，不易被降解，因此RNA干扰不仅在体外，而且在动物体内亦具有较好的效果。因此，RNAi现象的发现，被《SCIENCE》杂志和美国科学促进会评为2002年十大科学成就之一，具有广阔的应用前景。现今一致认为针对病毒基因的siRNA是最佳的治疗策略[9]。
(3)RNA干扰的5种方法
目前，用于RNA干扰的方法主要有5种：(1)化学合成法：直接通过化学方法合成dsRNA，其优点是快速、合成量较大，但是价格昂贵；(2)体外转录法：以Oligo DNA为模板，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成而言比较低，而且能够比化学合成法更快得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等的效果。但技术难度较大；(3)RNaseIII降解dsRNA法：将200～1000个碱基的靶mRNA用体外转录的方法制备后，然后用RNase III在体外消化，得到有多种siRNA的混合物，其优点是可以快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型，但是不适合长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗；(4)siRNA表达载体法：构建表达特异性siRNA的载体，导入真核细胞内表达siRNA，具有可以大量扩增的优点，但是存在基因整合的潜在危险；(5)siRNA表达框架(siRNA expressioncassettes)法：直接通过PCR方法得到表达siRNA的DNA模板，导入真核细胞后在体内转录成siRNA，其优点是方法简单、速度快，可用于筛选有效siRNA序列，但是也存在基因整合的潜在危险。
纵观上述5种方法的优缺点，和RNA干扰应用在慢性HBV感染的实验研究和临床应用中的前景，本发明选择体外转录法合成特定靶序列的dsRNA。
发明内容
本发明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干扰核糖核酸(siRNA)序列及制备方法，SEQ ID NO.1-4为本发明提供的转录siRNA的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列，用体外转录方法合成针对HBV(ayw亚型)基因的特异siRNA，经转染细胞后，达到抑制HBV基因表达的目的。该方法可快速、经济、较大量地获得抗HBV的siRNA，为抗HBV的实验研究和临床应用提供技术和大量siRNA。
本发明提供转录siRNA的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列：
SEQ ID NO.1(Antisense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template)
       5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’
SEQ ID NO.2(Sense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template)
       5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’
SEQ ID NO.3(Antisense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template)
       5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’
SEQ ID NO.4(Sense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template)
       5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’
本发明的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列通过以下步骤实现：
(1)siRNA的设计
(2)特异性siRNA的转录模板的设计和合成
(3)退火
(4)补平
(5)转录
(6)模板降解
(7)过柱纯化
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例一  体外转录合成干扰RNA体外抑制HBV表面抗原融合基因的表达
siRNA的制备
(1)siRNA的设计  根据siRNA的设计原理并利用直接合成siRNA的实验结果，选取针对HBV(ayw亚型)S基因的2条siRNA的目标cDNA靶序列。序列如下：
(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’
(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’
(2)特异性siRNA的转录模板的设计和合成根据上述的cDNA靶序列，设计并合成两段29-mer的DNA作为模板，包括8个与T7启动子引物3’端匹配的碱基(称为引导序列，leader aequence)和21个设计的siRNA序列。
①特异性anti-s siRNA1的反义链和正义链如下：
Antisense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template
5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’
Sense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template
5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’
②特异性anti-s siRNA2的反义链和正义链如下：
Antisense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template
5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’
Sense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template
5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’
(3)退火 将这两个模板和对应的T7启动子引物分别混合，引物末端和DNA模板退火结合。
             2μl T7 promoter primer
             6μl DNA Hyb buffer
             2μl 正义或反义的模板
         70℃，5min→room temp，5min
(4)补平  用DNA聚合酶Klenow大片断补平成为双链DNA模板。
在上述反应管中加入：
             2μl 10×Klenow Reaction buffer
             2μl 10×dNTP Mix
             4μl Nuclease-free water
    2μl Exo-klenow
轻柔混匀，37℃，30min；
(5)转录分别用T7RNA聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA包含5’端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3’端两个重复的U(UU)。
每个转录反应管中加入：
            2μl正义或反义siRNA模板
            4μl Nuclease-free water
            10μl 2×NTP Mix
            2μl 10×T7Reaction buffer
            2μl T7Enzyme Mix
轻柔混匀，37℃，2hr；
正义和反义转录产物混合，置于37℃过夜
(6)模板降解通过DNA酶降解模板，同时用单链专一的核酸酶消化5′的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer的双链siRNAs——有19个碱基互补，3′端各有2个U突出。
上述反应物中加入：
            6μl Digestion buffer
            48.5μl Nuclease-free water
            3μl RNase
            2.5μl DNase
混匀后，37℃，2hr；
(7)过柱纯化  通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以立即转化用的siRNAs，按说明书进行。
实施例2  anti-s siRNA抑制报告质粒pGFP-S和siRNA共转染HepG2细胞的绿荧光蛋白表达和HBV S基因表达的实验
(1)报告质粒pGFP-S和siRNA共转染HepG2细胞  报告质粒pGFP-S是表达报告基因绿荧光蛋白和HBsAg融合蛋白的质粒。HepG2细胞按照1×105/孔接种24孔板，培养24小时后达到80％-90％融合率，共转染pGFP-S和siRNA，具体步骤参照Invitrogen公司Lipofectamine2000说明书。6小时后换10％FCS DMEM，同时设置只转染pGFP-S载体的阴性组，每组重复3孔。
(2)荧光显微镜观察细胞绿荧光蛋白表达  转染48小时后，在倒置荧光显微镜(DM IRB，Leica)下观察绿荧光蛋白在HepG2细胞中的表达情况。结果显示，与pGFP-S载体的阴性组相比，转染pGFP-S和anti-S siRNA的HepG2细胞的荧光强度减弱，荧光细胞数减少。
(3)流式细胞仪观察细胞绿荧光蛋白表达  转染48小时后，常规消化HepG2细胞，离心悬液，重悬于PBS，流式细胞仪检测表达荧光蛋白的阳性细胞数比例和平均荧光强度。结果显示，与pGFP-S载体的阴性组相比，转染pGFP-S和siRNA的HepG2的阳性细胞数比例降低，平均荧光强度降低。
(4)逆转录-实时荧光定量PCR法检测HBV S基因RNA的表达RNA准备：转染72小时后，收获HepG2细胞，Trizol法抽提RNA，方法参照Invitrogen公司说明书。逆转录，过程参照MBI操作说明书。荧光染料法定量PCR，上游引物：5′-CTCACAATACCGCAGAGTC -3′；下游引物：5′-TAAACTGAGCCAGGAGAAA-3′；内参照GAPDH，上游引物：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3′.PCR条件为：95℃ 3min，再94℃30s，56℃ 30s，72℃ 45s，25个循环，荧光检测点选择72℃。同时做阳性对照(直接以pGFP-S质粒DNA为模板组)和阴性对照(不加模板组)。实时定量PCR在25循环定点检测显示，与阴性对照相比，anti-S siRNA1和anti-SsiRNA2对S基因的抑制率均达到50％以上。
实施例3anti-s siRNA抑制对siRNA转染HepG2.2.15细胞的HBsAg和HbeAg表达的实验
(1)siRNA转染HepG2.2.15细胞  HepG2.2.15细胞按照1×104接种24孔板，培养24小时后达到30％-40％融合率，转染siRNA各0.84μg，具体步骤参见Invitrogen公司OLIGOFECTAMINE试剂说明书。设置无关对照siGFP组(FEBS Letters 543(2003)51-54)：sense RNA 5-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3，anti-sense RNA 5-UGCGCUCCUGGACGUAGCCTT-3。6小时后换10％FCS DMEM。每组设3个复孔。
(2)放射免疫法检测HBsAg和HBeAg浓度变化  转染HepG2.2.15细胞后第48h，分别收集细胞培养液，离心去除细胞碎片，上清进行放射免疫法检测，检测方法参见试剂盒说明。转染anti-S siRNA1和anti-S siRNA2后，HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg的浓度较HepG2.2.15细胞低，anti-SsiRNA1和anti-S siRNA2对HBsAg和HBeAg的抑制率均达到60％以上。