丹参酮ⅡA磺酸钾用于制备预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧的药物.pdf

本发明涉及丹参酮IIA新的水溶性衍生物丹参酮IIA磺酸钾(potassium tanshinone IIAsulfonate，PTS)的合成工艺、制剂及新的医药用途。具体涉及丹参酮IIA磺酸钾用于制备预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧、改善微循环、增强记忆及相关疾病(脑血栓、急性脑缺血、冠心病、心绞痛、心肌梗死)药物的用途。

权利要求书
1、  式I表示的是丹参酮IIA磺酸钾：

式I。

2、  制备权利要求I的化合物的方法：
合成路线：

丹参中丹参酮IIA的提取、分离及纯化
干燥丹参1kg，用95％乙醇抽提3次，每次24小时，抽提液减压浓缩至500mL，然后加入500mL水，用1000mL三氯甲烷分四次萃取，萃取液减压浓缩，柱层析分离，硅胶为100～200目，洗脱液为含1％～10％乙酸乙酯的石油醚/乙酸乙酯混合溶液，进行梯度洗脱。可得丹参酮IIA约0.85g。
丹参酮IIA磺酸钾具体合成工艺流程：
丹参酮IIA磺酸钾的合成工艺：取丹参酮IIA(纯度在20％以上)50克，加200毫升醋酐，置于三颈瓶中，在搅拌下于10～15℃滴加100毫升浓硫酸-冰醋酸(1∶1，V/V)的混合液，滴加完毕后，在室温下搅拌一小时，然后将反应液徐徐倾入等体积的蒸馏水，立刻加入1立升的饱和氯化钾(化学纯)水溶液，即有粗丹参酮IIA磺酸钾析出，离心，沉淀物用饱和氯化钾溶液洗两次，再用适量水洗一次，使固体物pH＝5.6，将虑取固体物在水浴上蒸至干涸，固体物先用氯仿回流3小时，除去未磺化的脂溶性杂质，再用无水乙醇回流除去残存的氯化钠，乙醇液浓缩，即有红色丹参酮IIA磺酸钾粗结晶析出，再用甲醇重结晶两次，即得橙红色针状结晶，经充分干燥后，熔点194～196℃，得到纯品约10克。

3、  式I所示的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物中在预防和治疗脑缺血缺氧的药物的应用。

4、  式I所示的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物在预防和治疗心肌缺血缺氧的药物中的应用。

5、  式I所示的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物中在制备用于改善微循环、增强记忆的药物的应用。

6、  式I所示的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物中在制备用于预防、治疗脑血栓及其后遗症、急性脑缺血引起的脑缺血缺氧的药物的应用。

7、  式I所示的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物，用于制备预防、治疗冠心病、心肌梗塞、心绞痛造成的心肌缺血缺氧的药物。

8、  式I所示的丹参酮IIA磺酸钾可制成注射剂、冻干粉针、小输液、片剂、胶囊、颗粒剂等口服制剂。

说明书丹参酮ⅡA磺酸钾用于制备预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧的药物
技术领域
本发明涉及丹参酮IIA新的水溶性衍生物丹参酮IIA磺酸钾(potassium tanshinone IIAsulfonate，PTS)的合成工艺、制剂及新的医药用途。具体设计丹参酮IIA磺酸钾用于制备预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧、改善微循环、增强记忆及相关疾病(脑血栓、急性脑缺血、冠心病、心绞痛、心肌梗死)药物的用途。
技术背景
脑血管病是各种病因引起的脑血管病变的总称。脑血管病与心脏病、恶性肿瘤共同构成许多国家的三大致死性疾病。
脑缺血是由于各种原因所引起脑供血不足或功能停止，使神经元代谢障碍和停止，神经细胞死亡，大脑皮层和生命中枢出现永久性损害，并因此产生各种严重的临床症状。
脑缺血(cerebral ischemia)是严重危害中老年人健康的一类疾病，其发病率高、致残率高、如不及时处理死亡率也高。脑缺血的发生与血栓形成和脑血管阻力增大密切相关，预防血栓形成及增加脑血流量，是当前临床上重要的防治脑缺血的方法。
治疗缺血性脑血管病的药物主要分以下几类：
1、抗凝与溶栓药物
2、抗血小板聚集药
3、血管扩张药与钙通道阻断药
4、血液稀释剂
5、脱水剂
6、脑保护剂
目前临床上应用的抗心肌缺血药物的作用方式主要有以下途径：
1、减少心肌耗氧量：可通过舒张血管、减慢心率和降低左室舒张末期容积而实现；
2、增加心肌氧的供给；舒张冠脉、促进侧枝循环和促进血液重新分布均可增加心肌氧的供应；
3、改善心肌代谢；通过促进脂肪代谢转化为糖而实现。
此外，尚可通过抑制血管紧张素I转化酶、Na+-H+交换和减慢心率等环节而产生抗心肌缺血的作用。
丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，性苦、微寒，归心、肝经。作为传统中药，在临床方药中被广泛应用。主要用于祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等。丹参酮IIA(tanshinone IIA)是丹参主要成分之一[Okumura，Y.，et al.，Bull.Chem.Soc.(Japan)1961，34，895]。丹参酮IIA磺酸钾是本项目经丹参酮IIA衍生化得到的水溶性化合物。到目前为止，还未见有关丹参酮IIA磺酸钾的任何报导，以及用丹参酮IIA磺酸钾用于预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧及相关疾病的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种如式I所示的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物在制造用于预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧及相关疾病的应用。
本发明所说的丹参酮IIA磺酸钾或它的化学组合物可用于以下方面
①用于治疗脑血栓急性期引起的脑缺血缺氧；
②用于急性脑梗塞造成的脑缺血缺氧；
③用于预防脑血栓发生；
④用于急性心肌梗塞造成的心肌缺血缺氧；
⑤用于治疗冠心病、心绞痛造成的心肌缺血缺氧；
⑥用于预防冠心病、心肌梗塞、心绞痛；
⑧用于预防脑急血栓后遗症引起的脑缺血缺氧；
本发明所说的丹参酮IIA磺酸钾的结构式如式I所示。

式I
本发明人经研究发现，本发明丹参酮IIA磺酸钾进入血液中，能有效地抑制细胞膜的脂质过氧化反应，稳定细胞膜，特别是对灰质西结构的神经元作用更加明显，有效的减轻脑缺血时所造成的损伤，达到消除水肿和清除自由基作用。显示丹参酮IIA磺酸钾具有预防和治疗脑缺血，及与脑缺血相关疾病的良好前景
本发明通过动物药理实验，确定丹参酮IIA磺酸钾能显著延长急性脑缺血小鼠及常压乃缺氧小鼠的存活时间，同时能显著延长NaNO2中毒小鼠和颈动脉结扎小鼠的存活时间，提示其可成为用于心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧及相关疾病的有效药物。
小鼠断头后脑供血中断，造成急性脑缺血，由于脑组织内原有的血液和营养物质尚能使脑功能维持短暂时间，小鼠显示出有规律的张口喘气，当能量耗至一定程度，活动终止。以喘气时间为指标可观察药物对脑缺血的保护作用，凡能使脑耗氧降低的药物均能延长小鼠的喘气时间。实验结果表明丹参酮IIA磺酸钾能显著延长断头小鼠喘气时间，提示该药具有抗急性脑缺血、降低脑耗氧耗能的作用。小鼠的颅内脑血管之间有吻合枝，单独结扎双侧颈总动脉不出现脑缺血症状，当将迷走神经和颈总动脉一起结扎，则迷走神经刺激血压下降，可造成脑缺血。丹参酮IIA磺酸钾能显著延长小鼠结扎颈总动脉的存活时间。NaNO2中毒死亡模型属细胞外液缺氧，其可以使外周血液中的亚铁血红蛋白氧化成高价血红蛋白，使血氧含量降低，造成组织缺氧。丹参酮IIA磺酸钾能使NaNO2中毒小鼠生存时间显著延长。上述实验结果表明丹参酮IIA磺酸钾能延长多种原因所致缺氧动物的存活时间，可能与其提高机体对低氧的利用能力和对缺氧的耐受力有关。
此外，该药能拮抗东莨菪碱所致的小鼠记忆障碍，具有增强记忆的作用。该药对学习、记忆的促进作用可能与其扩张脑血管的作用有关。
心肌缺血的病理生理基础是心肌的血氧供应失衡，最根本防治措施是改善血供，降低氧耗，通过清除或对抗有害物质对心肌的不良影响以保护心肌。在我国常把小鼠常压抗缺氧实验用作抗心肌缺血药的一种初筛方法。实验结果表明丹参酮IIA磺酸钾能显著延长常压耐缺氧条件下和异丙肾上腺素诱导急性心肌缺氧模型小鼠的存活时间，提示该药是有提高机体的血氧利用率，降低机体耗氧量，增加心脏对缺氧状态下的耐受性。并能有效的对抗异丙肾上腺素引起心肌耗氧量增加而导致的心肌缺血缺氧，改善心功能。众所周知，垂体后叶素能收缩冠状动脉，造成心肌供血不足，并能收缩全身小血管，导致心脏负荷加重，在心电图上表现为心肌缺血的改变，如T波高耸或低平、心率失常等。实验结果显示，丹参酮IIA磺酸钾有较好的抗心肌缺血作用，可对抗Pit引起的ST段位移和心率减慢，且其效应与剂量有关。然而，其确切作用机制还有待进一步研究。
心肌缺血时，血小板的聚集和释放反应增强，提示存在血小板活化。激活的血小板可释放大量的ADP、TXA2及5-HT等活性因子以进一步诱发血小板聚集。血小板似滚雪球式地不断聚集，并在凝血酶等的共同参与下形成血栓，导致动脉血流急剧减少或完全中断引发脑缺血。由此可见，血小板功能亢进是脑缺血发病的重要原因，因此抗血小板聚集药物在预防脑缺血发生具有重要作用。
由此可见缺血性脑卒中后，血小板被激活，分泌神经毒性物质或通过血小板聚集加重微循环障碍和缺血性脑组织损伤。血小板聚集实验结果表明：丹参酮IIA磺酸钾可显著抑制AA诱导的血小板聚集，从而抑制血小板的活化，因而，丹参酮IIA磺酸钾防治脑缺血的发生应与抑制血小板活性有关。
动脉血栓形成及脑梗塞是导致脑缺血发生的最主要原因。脑血管张力增加，血管壁本身的破坏是脑缺血发生的最重要、最直接的因素。众所周知，一旦血管内皮受损，不仅暴露的内皮下层可使血小板粘附、聚集，血栓形成，而且激活了内源性及外源性凝血过程，加速血栓形成。这些因素综合作用的结果，克服了血管内皮的抗血栓保护机制，于是，一个不断增大的血栓最终将导致血管闭塞的发作，引起缺血性的发生。鉴于此，本专利课题研究了丹参酮IIA磺酸钾对家兔颈总动脉血栓形成的作用，结果显示丹参酮IIA磺酸钾能显著抑制家兔颈总动脉的血栓形成，提示丹参酮IIA磺酸钾对动脉血栓形成引起的脑缺血具有明显的保护作用。
本发明还提供一种用于预防和治疗心肌缺血缺氧、脑缺血缺氧的药物，其中含有式I所示的丹参酮IIA磺酸钾，以及药学上可接受的辅助剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、混悬剂、乳剂的形式。该药物的给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉。
本发明通过动物毒理实验，急性毒性实验表明该药毒性很低，给最大耐受剂量后小鼠全部存活，存活者外观、行动无异常，未能测出LD50。确定丹参酮II A磺酸钾在有效治疗剂量范围内无毒副作用，可以长期服用的药物。
具体实施方式
以下通过实例对本发明做进一步说明。
实施例1：丹参中丹参酮IIA的提取、分离及纯化
干燥丹参1kg，用95％乙醇抽提3次，每次24小时，抽提液减压浓缩至500mL，然后加入500mL水，用1000mL三氯甲烷分四次萃取，萃取液减压浓缩，柱层析分离，硅胶为100～200目，洗脱液为含1％～10％乙酸乙酯的石油醚/乙酸乙酯混合溶液，进行梯度洗脱。可得丹参酮IIA约0.85g。
实施例2丹参酮IIA磺酸钾的合成
丹参酮IIA磺酸钾的合成工艺：取丹参酮IIA(纯度在20％以上)50克，加200毫升醋酐，置于三颈瓶中，在搅拌下于10～15℃滴加100毫升浓硫酸-冰醋酸(1∶1，V/V)的混合液，滴加完毕后，在室温下搅拌一小时，然后将反应液徐徐倾入等体积的蒸馏水，立刻加入1立升的饱和氯化钾(化学纯)水溶液，即有粗丹参酮IIA磺酸钾析出，离心，沉淀物用饱和氯化钾溶液洗两次，再用适量水洗一次，使固体物pH＝5.6，将虑取固体物在水浴上蒸至干涸，固体物先用氯仿回流3小时，除去未磺化的脂溶性杂质，再用无水乙醇回流除去残存的氯化钠，乙醇液浓缩，即有红色丹参酮IIA磺酸钾粗结晶析出，再用甲醇重结晶两次，即得橙红色针状结晶，经充分干燥后，熔点194～196℃，得到纯品约10克。
实施例3：丹参酮IIA磺酸钾毒理试验
小鼠急性毒性试验：试验用动物为健康雄性昆明种小鼠。采用静脉方法试验。给药量全100mg/kg(已达最大量)。实验后于20±1℃自由饮水和进食条件下饲养观察7d，观察小鼠存活情况及外观表现。
结果：给药后小鼠全部存活，存活者外观、行动无异常，未能测出LD50。确定丹参酮IIA磺酸钾在有效治疗剂量范围内无毒副作用，可以长期服用的药物。
小鼠30天毒性试验：试验用动物为健康雄性昆明种小鼠。采用静脉方法试验。给药量为50mg/kg/day，连续30天。试验表明，受试鼠无死亡，生长发育、造血功能、生化指标等均无明显的异常变化或毒性反应，重要器官的解剖检查和组织镜检未发现病理变化。
实施例4：丹参酮IIA磺酸钾在动物(大鼠)体内药物动力学的试验
实验用动物为健康雄性大鼠。采用静脉方法试验。分别给予丹参酮IIA磺酸钾及丹参酮IIA磺酸钠，给药剂量10、20、50mg/kg，给药后定时采取血，用甲醇沉淀蛋白，应用HPLC检测，两者药时曲线基本相似，药物动力学参数无显著差异。
实施例5：丹参酮IIA磺酸钾对急性脑缺血小鼠的影响的试验
试验用动物为健康雄性昆明种小鼠。采用静脉方法试验。将小鼠随机分组，每组11只，分别以生理盐水对照组、阳性药丹参酮IIA磺酸钠(sodium tanshinone IIA sulfonate，STS)对照组(10mg/kg)、丹参酮IIA磺酸钾(PTS)低、中、高三个剂量组(5、10、20mg/kg)，每天1次，连续3天。末次给药10分钟后，自小鼠耳后部快速断头，记录从断头开始到最后一次喘气时间(min)。各组数据用均值±标准差(X±SD)表示，实验结果作组间t检验，判断其显著性。
丹参酮IIA磺酸钾对小鼠急性缺血缺氧的保护作用测定结果见表1。
表1丹参酮IIA磺酸钾对断头小鼠喘气时间的影响(n＝11，Mean±SD)
    Group Persistent time(s)Extended rate(％)    Saline    STS    PTS低剂量组    PTS中剂量组    PTS高剂量组19.09±2.3923.07±2.08*25.85±2.19**26.30±2.81**27.69±3.56***    ---    20.85    27.93    29.29    37.57
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与生理盐水相比
由以上实验结果可以看出，丹参酮IIA磺酸钾低、中、高三个剂量组对小鼠急性缺血缺氧均具有显著的保护作用，且其效应与剂量有关。与相同剂量的丹参酮IIA磺酸钠相比，小鼠急性缺血缺氧作用优于丹参酮IIA磺酸钠。
本试验用小鼠急性脑缺血模型研究该药在抗脑缺血、缺氧方面药理作用。小鼠断头后，脑供血终止，在短时间内，脑中原有的血液和营养物质尚能使脑功能维持短暂时间，小鼠显示出有规律的张口喘气，以喘气时间为指标可观察药物对脑缺血的保护作用。凡能使脑耗氧降低的药物均能延长小鼠的喘气时间。实验结果丹参酮IIA磺酸钾能显著延长断头小鼠喘气时间，提示该药具有抗急性脑缺血、降低脑耗氧耗能的作用。
实施例6：丹参酮II A磺酸钾对常压耐缺氧小鼠影响的实验
试验用动物为健康雄性昆明种小鼠。采用静脉方法试验。小鼠90只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为9组。生理盐水组，丹参酮IIA磺酸钾低、中、高三个剂量组(5、10、20mg/kg)和丹参酮IIA磺酸钠对照组(10mg/kg)。每天1次，连续3天。末次给药10分钟后，分别将小鼠移入底部盛有10g新鲜钠石灰的150ml广口瓶中，加盖密封。观察其存活时间，以呼吸停止为死亡指征。另取4组小鼠同上，分别给予生理盐水和丹参酮IIA磺酸钠对照组(10mg/kg)、丹参酮II A磺酸钾中剂量组(10mg/kg)给药10分钟后，分别腹腔注射盐酸异丙肾上腺素2mg/kg，并立即放入广口瓶内密封。观察方法同前。
并依下式计算存活时间延长率(％)：

实验结果表明，10mg/kg和20mg/kg能显著延长常压耐缺氧小鼠的存活时间；同时20mg/kg剂量组也能明显延长给予异丙肾上腺素小鼠常压耐缺氧存活时间，提示具有降低异丙肾上腺素增加心肌耗氧量的作用。结果见表2。
表2丹参酮IIA磺酸钾对常压耐缺氧小鼠存活时间的影响(Mean±SD，n＝10)
Group Dose(mg/kg)No.animals of Persistent tine (min)ExtendedRate(％) NS PTS STS    -    50    50    10    10    10    13.1±3.3    16.2±2.9*    19.6±3.8***    -    41.6    49.6
实施例6丹参酮IIA磺酸钾对缺氧所致大鼠皮层神经元损伤的作用
将怀孕17-19d的大鼠脱颈处死，无菌条件下取出胎鼠，超净台前取出胎鼠大脑，置于冰浴的DMEM培养液中，仔细剔除软脑膜及血管，分离大脑皮层。将分离的大脑皮层剪碎，用0.25％胰酶在37℃水浴中消化5min，离心(1000r，5min)弃上清液，用IMDM培养液(含10％的胎牛血清)轻轻吹打分散成细胞悬液，细胞悬液过滤，调整细胞浓度为1×106cell·mL-1，将细胞接种于预先用0.01％多聚赖氨酸覆盖过的96孔培养板，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中孵育。18-22h后换新鲜的加有1‰阿糖胞苷的IMDM培养液，再隔24h后换50％含血清IMDM培养液。以后每隔1d换1次新鲜的含血清IMDM培养液，细胞培养至5-6d。
实验分为空白、模型组和STS、KTS不同浓度组。实验时各组均换为无血清的IMDM培养液，给药组加入不同浓度丹参酮IIA磺酸钾、丹参酮IIA磺酸钠置于5％CO2培养箱孵育，24h后空白对照组换为含有葡萄糖的Earle’s液，缺氧模型组换为不含葡萄糖的Earle’s液，然后把培养板置于缺氧罐内，通入95％N2和5％CO2混合气体20min。24h后，每孔加入MTT溶液10μl，37℃5％CO2培养箱孵育4h，吸出原液，每孔再加入DMSO溶液100μl，微微振荡10min，用酶标仪492nm波长测定光密度值。
实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，各组数据用均值±标准误(X±SE)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，用LSD进行组间比较，P＜0.05为有显著性差异。
对正常神经元影响见表3，对缺氧神经元的影响见表4。
表3 PTS对正常神经元的影响(Mean±SD)
    Group  Concentration(μM)    OD    Control    STS    PTS    0    0.1    0.1  100.00±9.37  110.49±7.21  134.43±3.47
表4 PTS对缺氧神经元的影响(Mean±SD)
    Group Concentration(μM)    OD    control    Model    STS    PTS    0    0    0.1    0.1    100.0±9.37    45.25±7.38#    104.92±15.96*    123.93±7.68**
#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，compared with the control group；
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with the model group
实验结果表明，STS、PTS低、中、高剂量组神经元成活率均显著高于模型空白组，PTS在相同剂量下神经元成活率与STS模型空白组相比较有显著性差异，尤其低剂量组，提示：在相同条件下，使用相对低剂量的丹参酮IIA磺酸钾可以达到丹参酮IIA磺酸钠高剂量的疗效，这样，可以相应的减少用量，减少毒副作用，使用更安全。
实施例7小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎实验
依实施例5的方法分组给药，给药后10分钟用0号丝线结扎双侧颈总动脉和迷走神经，观察小鼠的存活时间，以呼吸停止为死亡指标。
实验结果表明，10mg/kg和20mg/kg能显著延长双侧颈总动脉及迷走神经结扎小鼠的存活时间，与生理盐水对照组比较具有显著性差异(分别为P＜0.05和P＜0.01)，丹参酮IIA磺酸钠也能显著延长双侧颈总动脉及迷走神经结扎小鼠的存活时间(P＜0.01)。结果见表5。
表5 PTS对双侧颈总动脉及迷走神经结扎小鼠存活时间的影响(Mean±SD，n＝10)
  Group  Dose(mg/k  g)No.of animals Persistent tine (min)Extended Rate(％)
 NS PTS    -    10    10    10 1.7±0.8 3.3±1.0**    -    94.1
与NS比较  *P＜0.05 **P＜0.01
实施例8小鼠NaNO2中毒实验
依实施例5的方法分组给药，给药后10分钟ip.NaNO2 800mg/kg，观察小鼠的存活时间，以呼吸停止为死亡指标。
实验结果表明，10mg/kg能显著延长NaNO2中毒小鼠的存活时间，与生理盐水对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)，尼莫地平也能显著延长NaNO2中毒小鼠的存活时间(P＜0.01)。结果见表6。
表6 PTS对NaNO2中毒小鼠的影响(Mean±SD，n＝10)
  Group  Dose  (mg/kg)No.of animals Persistent tine (min)  Extended  Rate(％)    NS    PTS    -    10    10    10  6.6±0.8  8.7±1.8**    -    31.8
与NS比较  *P＜0.05，**P＜0.01
实施例9学习记忆实验
将小鼠随机分成3组，每组15只，均为雄性，分别为空白1、空白2、阳性对照组及给药组，尾静脉给药3d后开始训练，每只每天训练10次，连续训练3d。最后一次给药后30min，空白2、阳性对照组和给药组分别腹腔注射东莨菪碱(1ml/kg)，再过30分钟后开始测试，每只测5次，记录小鼠错误次数。用t检验法进行组间差异比较。
空白1对照组、阳性对照组和20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg剂量组小鼠的跳台错误次数均明显减少。结果见表7。
表7 PTS对小鼠学习记忆的影响(Mean±SD)
  Group dose(mg/k g) No.of animals No.oferrors in testing  NS  Model  PTS    -    -    10    10    10    10 0.75±0.46** 3.14±1.77 0.67±0.87**
与NS比较，**P＜0.01
心肌缺血实验
实施例10丹参酮IIA磺酸钾对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的影响
取体重为180～220g的健康SD大鼠40只，雌雄不限，随机分为4组：生理盐水(NS)组，丹参酮IIA磺酸钾低、中、高三个剂量组(5、10、20mg/kg)，用25％的乌拉坦1g/kg ip.麻醉后，仰位固定于鼠台上，以6号针头刺于四肢皮下，并与心电图机肢体导联电极相连。心电图机选择标准电压1mv＝10mm，纸速50mm/s。各组分别尾静脉iv.相应浓度的受试药物5ml/kg，给药10分钟后，舌下iv.垂体后叶素(Pit)0.8U/kg，5s内注完。用心电图机记录注射Pit前及注射后15s、30s、45s、60s、90s和3min、5min、8min的ECG。观察T波高度变化及心率变化。T波高度及心率均为每个时间点连续测5个波形，取其平均值。T波高度无论升高或降低，取变化的绝对值。实验结果作组间t检验，判断其显著性。
结果：对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的影响实验结果
1、T波高度变化
NS对照组大鼠iv.Pit后，心电发生明显改变，第一期(0～30s)出现明显的S-T段抬高和T波高耸(P＜0.01)；第二期(30s以后)，呈现明显的S-T段下移，T波低平或倒置(P＜0.05或P＜0.01)。低剂量和中剂量在某些时间点可显著对抗Pit引起的∑ST升高或降低；而高剂量则可在各时间点显著对抗Pit引起的∑ST升高或降低。结果见表8。
表8丹参酮IIA磺酸钾对垂体后叶素所致心肌缺血大鼠的T波的影响(Mean±SD，n＝10)

与pre-pit比较    *P＜0.05  **P＜0.01
2、心率变化
NS组大鼠iv.Pit后，可使大鼠心率明显减慢，至8分钟仍未恢复。低剂量和中剂量(30mg/kg和60mg/kg)在部分时间点有缓解Pit所致心率减慢的倾向。高剂量(120mg/kg)在各时间点均明显缓解Pit所致的心率减慢。结果见表9。
表9丹参酮IIA磺酸钾对垂体后叶素所致心肌缺血大鼠心律的影响(Mean±SD，n＝10)


与pre-pit比较  *P＜0.05  **P＜0.01
实施例11体外抗血小板聚集实验(比浊法)
家兔随机分5组，每组6只。耳缘静脉采血4.5mL，以3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂体积比为9∶1)，室温下离心(800kg，3min)，取上清液制备富血小板血浆(PRP)。分离出PRP后，再离心(2000kg，10min)取上清液制备贫血小板血浆(PPP)，用PPP调节透光率为100％。取PRP 200μL置于比浊管内，分别加入不同浓度的丹参酮IIA磺酸钾(5，10，20mg/ml)或阿司匹林(ASP，100mg/ml)20μL，对照组加等容积NS。温育5分钟后，以花生四烯酸(AA)为诱导剂，描记10分钟聚集曲线，测定最大聚集强度。
依下式计算血小板聚集抑制百分率：

结果：实验结果表明，PTS在体外对AA诱导的家兔血小板聚集有明显抑制作用。随着剂量增加，作用增强，呈现出量效相关性。各剂量组与NS对照组比较，均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。ASP组对AA诱导的体外家兔血小板聚集也有明显的抑制作用(P＜0.01)。结果见表10。
表10 KTS对花生四烯酸诱导体外血小板聚集的影响(Mean±SD，n＝6)
    Group  Con.(mg/mL)platelet aggregation rat(％)inhibition(％)    NS    PTS    ASP    -    5    10    20    100    43.5±9.1    40.1±11.0*    31.2±8.7**    24.9±6.5***    26.8±7.4** - 7.8 28.3 42.8 38.4
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例12体内抗血小板聚集实验(比浊法)
家兔分别从耳缘静脉iv.丹参酮IIA磺酸钾低、中、高三个剂量组(5、10、20mg/kg)，或ASP 80mg/kg，对照组iv.等容积NS。给药后10min自另一耳缘静脉放血，按体外试验法分别进行PRP和PPP的制备，用AA作诱导剂，考察药物对血小板聚集的影响。
结果：实验结果表明，(iv.)对AA诱导的家兔血小板聚集有明显抑制作用。并随着剂量增加作用增强，剂量与效应相关。各剂量组与对照组比较，均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。ASP组对AA诱导的家兔血小板聚集也有明显的抑制作用(P＜0.01)。结果见表11。
表11 PTS对花生四烯酸诱导家兔体内血小板聚集的影响(Mean±SD，n＝6)
    Group Dose(mg/kg)platelet aggregation rat(％)  inhibition(％)    NS    PTS    ASP    -    5    10    15    80    50.6±7.4    47.1±8.9*    39.6±9.5**    27.2±10.5***    35.8±11.7**  -  6.9  21.7  46.2  29.2
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例13对家兔颈总动脉血栓形成的影响
家兔随机分为5组，每组8只。用3％异戊巴比妥钠按60mg/kg耳缘静脉注射麻醉，背

位固定，分离一侧颈总动脉，在相距约4cm处将两端用动脉夹夹住血管，取12号细缝衣针，连一根一端打结的细线，自近心端穿入颈总动脉，顺血管走行3cm，从远心端穿出，将另端也打结后剪断细线，然后缓慢松开动脉夹。分别从另一侧耳缘静脉iv.生理盐水、丹参酮IIA磺酸钾低、中、高三个剂量组(5、10、20mg/kg)，以及ASP 80mg/kg。恢复血流2h后将各组家兔的该段颈总动脉剪下，纵向切开，取出细线，置滤纸上，吸去余血，并迅速称重，减去细线自身重量，即得血栓湿重。依下式计算血栓形成抑制率：
实验结果表明(iv.)PTS对家兔颈总动脉血栓形成有明显抑制作用，并呈量效相关性。随着剂量加大，血栓湿重减轻，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。ASP组对家兔颈总动脉血栓形成也有明显的抑制作用(P＜0.01)。结果见表12。
表12 PTS对对家兔颈总动脉血栓湿重的影响(Mean±SD，n＝8)
    Group  Dose(mg/kg)No.of animals wet weight of thrombosis(mg)inhibition(％)    NS    PTS    -    15    30    60    8    8    8    8  19.0±2.3  17.2±4.7*  15.6±3.2**  13.1±4.0***  -  4.2  17.9  31.1
    ASP    80    8 14.4±6.3**24.2
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
医药上实用性
本发明的上述实验表明：
(1)丹参酮IIA对小鼠急性脑缺血、常压耐缺氧、大鼠缺氧神经元以及对家兔心肌和血栓的影响的实验显示：丹参酮IIA磺酸钾能够显著延长缺血缺氧小鼠的存活时间，对心肌缺血缺氧有明显的改善，且能提高小鼠记忆力。
(2)提示该化合物及其化学组合物可以用于制备治疗脑血栓急性期引起的脑缺血缺氧、急性脑梗塞造成的脑缺血缺氧、急性心肌梗塞造成的心肌缺血缺氧、冠心病、心绞痛造成的心肌缺血缺氧；预防脑血栓的发生，预防冠心病、心肌梗塞、心绞痛，预防脑急血栓后遗症引起的脑缺血缺氧。
(3)使用本发明的式I所示丹参酮IIA磺酸钾，使用剂量范围是10～200mg/天。
(4)使用本发明的式I所示丹参酮IIA磺酸钾，在正常剂量下，其作为药物应用是安全的。
(5)与现有的临床常用的治疗心脑血管药物相比，本发明的化合物具有治疗效果更好，副作用更小和应用范围更广的特点。