用于治疗癌症的具有改善的药物保留的脂质体.pdf

本发明涉及铜离子用于达到增加治疗剂保留在脂质体内的用途。可应用本发明更有效地递送脂质体包封的治疗剂至体外和体内靶点，用于抗癌或其它治疗。所述脂质体可包含含有治疗剂的内部缓冲溶液，该溶液具有的pH小于6.5，最优选为约pH3.5。至少一些铜离子保留在内部溶液中。在特定的实施方案中，该治疗剂可以是化疗药物，例如依立替康。本发明还可包含能促进将药物负载入脂质体的离子载体。在一个特定的实施方案中，离子载体A23187和包封的二价铜(Cu2+)的组合形成依立替康制剂，其出人意外地显示出改善的药物保留特性。

权利要求书
1.  包含包封治疗剂的脂质体的组合物，其中在脂质体内存在铜离子的情况下，将所述治疗剂负载入所述脂质体内，并且所述铜离子增加了所述治疗剂在所述脂质体内的保留。

2.  如在权利要求1中限定的组合物，其中所述治疗剂为抗癌药。

3.  如在权利要求2中限定的组合物，其中所述药物为拓扑异构酶抑制剂。

4.  如在权利要求3中限定的组合物，其中所述药物为喜树碱或其类似物。

5.  如在权利要求4中限定的组合物，其中所述药物为依立替康。

6.  如在权利要求5中限定的组合物，其中所述依立替康主要为内酯形式。

7.  如在权利要求2中限定的组合物，其中所述药物与微管蛋白结合。

8.  如在权利要求7中限定的组合物，其中所述药物为长春花生物碱或其衍生物。

9.  如在权利要求8中限定的组合物，其中所述药物选自长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

10.  如在权利要求1中限定的组合物，其中所述脂质体包含含有所述治疗剂的内部缓冲溶液，其中所述溶液具有的pH小于6.5。

11.  如在权利要求10中限定的组合物，其中所述pH保持在约2至5。

12.  如在权利要求11中限定的组合物，其中所述pH为约pH 3.5。

13.  如在权利要求10中限定的组合物，其中所述溶液包含至少一些所述铜离子。

14.  如在权利要求13中限定的组合物，其中所述脂质体在所述脂质体的脂质双层内包含二价质子阳离子交换离子载体。

15.  如在权利要求14中限定的组合物，其中所述离子载体选自A23187、离子霉素和X-537A。

16.  如在权利要求1中限定的组合物，其中所述脂质体包含选自磷酸甘油酯类和神经鞘脂类的脂质。

17.  如在权利要求16中限定的组合物，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。

18.  如在权利要求17中限定的组合物，其中所述脂质体包含1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)/胆固醇。

19.  如在权利要求1-18的任一项中限定的组合物用于癌症治疗的用途。

20.  增加治疗剂在脂质体内的保留的方法，包含：
(a)在所述脂质体内部提供包含铜离子的脂质体内溶液；
(b)保持所述脂质体内溶液的pH低于6.5；
(b)在所述外部溶液中提供治疗剂，其中所述治疗剂扩散进入所述脂质体内部，并且包封在所述脂质体内，其中所述铜离子的存在增加了所述治疗剂在其中的保留。

21.  如在权利要求20中限定的方法，其中保持所述脂质体内溶液pH低于6.5包括在所述脂质体内溶液中提供缓冲剂。

22.  如在权利要求20中限定的方法，其中保持所述脂质体内溶液pH低于6.5包括在所述内部溶液和所述外部溶液之间提供用于促进离子交换的离子载体。

23.  如在权利要求22中限定的方法，其中所述离子载体使所述内部溶液中二价形式的所述铜离子与所述外部溶液中的质子进行交换。

24.  如在权利要求23中限定的方法，其中所述离子载体为选自A23187、离子霉素和X-537A的二价质子阳离子交换离子载体。

25.  如在权利要求20中限定的方法，其中在所述外部溶液中提供所述治疗剂之前，将所述离子载体加入到所述外部溶液中。

26.  如在权利要求20-25的任一项中限定的方法，其中所述pH保持在约2至5。

27.  如在权利要求26中限定的方法，其中所述pH为约pH 3.5。

28.  如在权利要求1-27的任一项中限定的方法，其中所述治疗剂为抗癌药。

29.  如在权利要求28中限定的方法，其中所述药物为拓扑异构酶抑制剂。

30.  如在权利要求29中限定的方法，其中所述药物为喜树碱或其类似物。

31.  如在权利要求30中限定的方法，其中所述药物为依立替康。

32.  如在权利要求28中限定的方法，其中所述药物与微管蛋白结合。

33.  如在权利要求32中限定的方法，其中所述药物为长春花生物碱或其衍生物。

34.  如在权利要求33中限定的方法，其中所述药物选自长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

35.  通过权利要求20-34的任一项的方法制备的脂质体制剂。

36.  如根据权利要求20-34中任一项的方法配制的脂质体包封的治疗剂用于治疗体内癌症的用途。

37.  如在权利要求36中限定的用途，其中与在不存在铜离子的情况下所述治疗剂的脂质体包封的制剂相比，在体内所述治疗剂在所述脂质体内的保留显著增加。

说明书用于治疗癌症的具有改善的药物保留的脂质体
相关申请参考
本申请要求2004年10月6日申请的序列号为No.60/615,943的美国临时专利申请的利益，本文将其引入作为参考。
发明领域
本发明涉及提供较多的药物保留、能增加治疗化合物体内递送的脂质体药物负载方法和组合物。
发明背景
脂质体为由包封内部隔室的一个或多个脂质双层组成的微观粒子。脂质体可分类成多层脂质体、多囊脂质体、单层脂质体和巨型脂质体(giantliposome)。脂质体已经广泛地用作各种药剂例如药物、化妆品、诊断剂和遗传物质的载体。因为脂质体由无毒的脂质组成，它们通常具有低毒性，因此在各种药物应用中有用。特别地，脂质体可用于增加在血流中具有短半衰期的药剂的循环寿命。脂质体包封(encapsulated)的药物通常具有与那些游离药物极不同的生物分布和毒性。对于特定的体内递送而言，这些载体的粒径、电荷和表面性质可通过改变制备方法和通过处理载体的脂质组成来改变。例如，可通过减少组成载体的脂质的酰基链长来使脂质体更快地释放药物。
在脂质体中包封高药物负荷量的最有效的方法为通过主动负载(activeloading)的方法。该方法是通过创造脂质膜之间的pH梯度(ΔpH)或金属离子梯度(ΔM2+)来介导的。例如，通过在柠檬酸盐缓冲剂pH 4.0中制备脂质体，然后用缓冲的生理盐水pH 7.5替换外部缓冲液而产生的ΔpH可促进弱碱性药物的脂质累积。中性形式的药物被动地扩散穿过脂质双层，并且在脂质体内部的低pH环境中开始进行质子化。该方法可获得＞98％的药物包封和高的药物与脂质比率(例如，长春瑞滨)。经由ΔM2+负载药物按照相似的方法进行，其药物累积是通过金属离子络合推动的(例如多柔比星-Mn2+)。通过金属离子络合推动的负载药物的效率与用于描述ΔpH的那些相当。
进一步主动负载的方法使用离子载体例如A23187和二价金属离子(M2+)的组合。将A23187混入脂质双层中，将来自内部脂质体缓冲剂的1M2+替换为来自外部缓冲剂的2H+，从而产生并保持ΔpH。之前，A23187和内部的Mn2+缓冲剂已经被用于有效地包封长春新碱、环丙沙星、托泊替康和依立替康。在该系统中Mn2+的作用被认为是用于创造ΔpH的‘内部’促进器。实际上，在抗癌药物负载动力学中，用基于Cu2+的缓冲剂替换内部Mn2+基缓冲剂不会引起任何不同。
本发明涉及二价铜离子(Cu2+)用于显著增加脂质内药物保留属性并从而增加体内治疗效果的用途。例如，当与Mn2+/A23187等价物相比时，本文描述的Cu2+/A23187脂质依立替康制剂证实显著改善了抗鼠科异种移植物模型的结肠直肠癌的有效性。申请人的负载方法结合了高包封效率(＞98％)、高药物-脂质比率和提高的药物保留。值得注意的是，本发明描述了跨膜pH梯度的用途，其定义离子载体产生跨膜pH梯度的效用，或公开了在存在中性环境和不存在跨膜pH梯度的情况下，过渡金属例如Mn2+或Cu2+的用途(Fenske等，美国专利  No.5,837,282；Tardi等，US20030091621)。现有技术没有教导在低pH环境中依赖二价铜离子(Cu2+)的方法和组合物，其没有预期到这些组合物将引起改善的药物保留特性。
以前，包含包封在囊泡内的金属离子的脂质体用于诊断应用。例如，脂质体已经被用于递送造影剂，目的在于将造影剂累积在患者身体内想要的部位。在后者应用中，分别在γ和磁共振成像中，脂质体主要被用于递送诊断放射性核苷酸和顺磁性(paramagnetic)金属离子。然而，在这些应用中，脂质体包封的金属离子没有用于药物保留的目的。
喜树碱为一类能抑制核酶、拓扑异构酶I(topo I)的抗癌药。Topo I通过诱导DNA双螺旋的瞬时单链断裂来促进细胞周期S期期间的DNA复制。DNA和topo I形成的复合物被称为‘易解离复合物’。喜树碱通过稳定该易解离的复合物来诱导胱冬酶(caspase)介导的细胞凋亡。喜树碱，例如依立替康，具有内酯环。该内酯环对细胞毒素的活性起决定性作用。以在有利于活性闭合环内酯形成的环境中，这些载体系统保持药物的潜能为基础，喜树碱的脂质体制剂是有吸引力的选择。在由喜树碱形成的闭合内酯环形式和非活性的开放环羧酸形式之间存在平衡(图1)。该平衡受到pH的影响。在酸性pH下，平衡朝着闭合内酯环推动。在中性或碱性pH(例如生理条件)下，平衡有利于非活性的开放环形式。
已经出现了具有如下性质的改善的脂质体制剂的需要：其能增加包封药物的保留，以及优选地保持药物以活性形式存在，以便改善向靶点的递送和有效性。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及包含包封治疗剂的脂质体的组合物，其中在脂质体内存在铜离子的情况下，将所述治疗剂负载入所述脂质体内，并且所述铜离子增加了所述治疗剂在所述脂质体内的保留。脂质体可包含含有治疗剂的内部缓冲溶液，该溶液具有的pH小于6.5，最优选为约pH 3.5。至少某些铜离子保留在内部溶液中。在特定的实施方案中，治疗剂可以是抗癌药，例如依立替康或长春瑞滨。
本发明也涉及增加治疗剂保留在脂质体内的方法，包含步骤：(a)给脂质体内提供包含铜离子的脂质体内溶液；(b)保持所述脂质体内溶液的pH低于6.5；(c)在外部溶液中提供治疗剂，其中治疗剂扩散进入内部，并包封在脂质体内，其中铜离子的存在增加了治疗剂在其中的保留。

附图简述
附图描述了本发明的实施方案，但其不应当被看作是以任何方式限制本发明的精神和范围。
图1为显示受到pH影响的动态平衡的化学图解，其存在于依立替康的活性闭合的内酯环形式和非活性开放环羧基形式之间。
图2为显示使用具有包封的未缓冲CuSO4或ZnSO4溶液的脂质体，依立替康负载效率(药物/脂质比率)＞90％的图。
图3为显示使用包封的缓冲CuSO4 pH 7.5或未缓冲CuSO4+A23187离子载体(其保持低pH环境)的脂质体，依立替康负载效率(药物/脂质比率)＞90％的图。
图4(A)-(C)为显示负载药物依立替康后脂质体内部pH的激发扫描图。pH敏感的荧光探针，HPTS，表明含有包封的无缓冲CuSO4的脂质体的内部pH，在主动负载依立替康后增加。
图5为证实依立替康主要以其内酯形式存在而与包封的CuSO4溶液为未缓冲的或缓冲至pH 7.5无关的HPLC曲线图。
图6显示证实依立替康主要以其内酯形式存在而与包封的CuSO4溶液为未缓冲的或缓冲至pH 7.5无关的TLC分析结果。
图7为显示在血浆中各种脂质体制剂随时间释放的图。
图8为显示在血浆中各种脂质体制剂随时间释放脂质的百分数图。
图9为显示随时间相对药物：脂质比率的图。
图10为显示在血浆中随时间释放药物的百分数图。
图11为显示在单剂量给药游离的或包封的CPT-11后s.c.LS180肿瘤体积的百分数图。
图12为显示在单剂量给药50mg/kg游离的或包封的CPT-11后肿瘤体积的增长百分数图。
图13为显示在单剂量给药100mg/kg游离的或包封的CPT-11后肿瘤体积的增长百分数图。
图14为显示在单剂量给药游离的CPT-11后肿瘤体积的增长百分数图。
图15为显示在单剂量给药pH7.5的包封的CPT-11后肿瘤体积的增长百分数图。
图16为显示在单剂量给药pH3.5的包封的CPT-11后肿瘤体积的增长百分数图。
图17为显示在单剂量给药pH3.5+离子载体的包封的CPT-11后肿瘤体积的增长百分数图。
图18为源自使用单剂量CPT-11(游离的或DSPC/Chol包封的(55∶45mol％)处理具有来源于s.c.注射LS180人腺癌细胞后建立的肿瘤的SCID/Rag2M小鼠的分析总结数据表。
图19为显示单剂量静脉快速注射(i.v.bolus injection)(73.8μmol/kg；50mg/kg)给药Rag-2M小鼠后，血浆中相对依立替康与脂质比率的图。所述制剂由具有如在图例中显示的不同内部溶液的相同脂质体组合物(DSPC/Chol 55∶45mol％)组成。通过Cu2+/A23187药物负载技术制备的制剂显示了显著较好的血浆药物保留，如通过在24小时后较高的相对依立替康与脂质比率证实的。
图20为显示单剂量静脉快速注射(18.5μmol/kg；20mg/kg)给药Rag-2M小鼠后，血浆中相对长春瑞滨与脂质比率的图。所述制剂由具有如在图例中显示的不同内部溶液的相同脂质体组合物(DSPC/Chol 55∶45mol％)组成。通过Cu2+/A23187药物负载技术制备的制剂显示了显著较好的血浆药物保留，如通过在8小时后较高的相对长春瑞滨与脂质比率证实的。
图21为源自单剂量(73.8μmol/kg；50mg/kg)给药Rag-2M小鼠未包封的依立替康或依立替康脂质体(DPSC/Chol 55∶45mol％；通过不同的技术介导的依立替康负载)分析的总结数据表。测定不同依立替康处理的药代动力学参数，并涉及依立替康抗建立的s.c.LS180肿瘤(人结肠直肠癌异种移植物)疗效。
发明详述
整个下述说明书中进行详细阐述是为了提供对本发明更彻底的理解。然而，本发明可以在没有这些具体描述下实施。在其它的情况下，没有显示或详细描述熟知的部分是为了避免不必要地使本发明不清楚。因此，在某种意义上说，说明书和附图将作为说明性的，而不是限制性的。
本申请人的发明提供了改善药物脂质体递送效果的新方法和组合物。本发明是基于发现为了药物负载目的而使用二价金属阳离子的脂质体的药物保留性质出人意外地取决于使用的金属。通过选择最适宜的金属，即二价铜，可调节保留性质以达到从脂质体中理想地释放选择的药剂。
如上所述，用于主动(actively)将药物负载入脂质体的各种方法是已知的。本发明依靠在脂质膜间建立的pH梯度，其用于将治疗剂从外部溶液移入脂质体的内部。pH梯度可以按如本领域技术人员所理解的各种方法建立和维持。在本发明的一个实施方案中，脂质体内溶液保持pH低于约6.5。在特定的实施方案中，脂质体内(intra-liposomal)pH保持在约2至5的范围内，最优选约pH 3.5。例如，这可通过给脂质体内溶液(intra-liposomal solution)中提供缓冲剂或通过给内部溶液和外部溶液间提供用于促进离子交换的离子载体来获得。离子载体可以是能够使外部质子替换内部金属离子的任意化学品类。在一个优选的实施方案中，其由A23187组成。在另一个实施方案中，离子载体可以由离子霉素(ionomycin)或X-537A组成。
不论治疗剂如何主动地负载入脂质体(即如何建立pH梯度)，本发明涉及脂质体内溶液内的二价铜离子增加包封的治疗剂保留的用途。还没有阐明铜离子功能的准确机理。例如，铜可以结合治疗剂和/或其可改善脂质体膜的穿透性。即使在其中离子载体促进二价形式的铜离子从脂质体内部交换至外部溶液的情况下，至少一些铜离子剩余保留在脂质体内。如下面进一步描述的，在脂质内溶液中铜的存在可显著地增加体内药物的保留和疗效。如对本领域技术人员显而易见的是，与不含有铜的类似脂质体制剂相比，治疗剂的保留是“增加的”。如在下文详细描述的，增加的药物保留可通过体内试验测定，例如血浆药物保留(图19和20)。
治疗剂可以是任意的类型，其在存在脂质内铜的情况下负载入脂质体时具有改善的脂质体内保留。在一个优选的实施方案中，化合物可以是任意弱碱性化合物。在另一个优选的实施方案中，治疗化合物可以是拓扑异构酶抑制剂，优选喜树碱或其类似物，最优选依立替康(CPT-11)。在另一个实施方案中，治疗化合物可以是与微管蛋白结合的化合物，优选长春花生物碱类。长春花碱和长春新碱是在马达加斯加长春花属(Madagascar periwinkle)、长春花属(Catharanthus roseus)(以前分类为长春花，其使得这些化合物被称为长春花生物碱)中发现的生物碱。它们和长春地辛和长春瑞滨，长春花碱半合成的衍生物，都通过抑制分裂中期的有丝分裂(细胞分裂)起作用。用于本发明的优选的长春花生物碱为长春瑞滨。
在另一个实施方案中，本发明提供小分子(化合物)、蛋白质、抗体或肽或物质或其可药用盐的任意新的或已知的组合物，其与二价铜离子一起包封入脂质体中获得较多的保留性质的用途。
脂质体组合物由脂质1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(phosophocholine)(DSPC)/胆固醇(55∶45mol％)组成，脂质的比率可根据脂质体制剂领域的技术人员设想的实施方案进行改变。在另一个实施方案中，脂质体可由包括磷酸甘油酯和神经鞘脂类的脂质组成，其中代表性的实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine)、溶血磷脂胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱(dilinoleoylphosphatidylcholine)。也涉及其它不含磷的化合物，例如神经鞘脂类和鞘糖酯(glycosphingolipid)族。另外，可将如上所述的两亲性脂质与包括甘油三酯和甾醇的其它的脂质混合。
在本发明范围内涉及的进一步改进为在脂质体表面上包含靶向抗体，其能特异性地将脂质体定位于疾病区域；例如，转移性癌细胞，其已扩散至身体其它部位。
可涉及许多将得益于脂质体的疾病和病症，脂质体增加了药物保留，使介入的治疗药物能够具有优良的ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)性质。这样的疾病可包括但不限于癌症的治疗。
优选地，药物脂质组合物以肠胃外给药，即关节内、静脉内、皮下地或肌内给药。在其它的实施方案中，药物制剂可以局部给药。
在本发明的一个特定实施方案中，与在不存在A23187离子载体的情况下用铜介导的负载依立替康相比，在存在A23187的情况下，含有铜的包封的依立替康出乎意料地显示出体内依立替康在脂质体中的较多保留，另外还显示出增加的效应。另外，包封的依立替康主要以临床活性内酯形式存在。
下述实例将进一步更详细地阐述本发明，虽然应当理解本发明不限于特定的实例。
实施例1.0
1.1材料和方法
1.1.1脂质体形成
通过挤压法制备DSPC/Chol(55∶45mol％)大单层脂质体(large unilamellarvesicles)(LUVs)。简而言之，将脂质以需要的摩尔比率溶于氯仿中，用不可交换的、不可代谢的脂质标记物3H-CHE标记，在氮气气流下干燥成薄膜。随后，将该脂质置于高真空下3小时除去任何剩余溶剂。然后，在65℃，通过与适宜的缓冲剂(300mM CuSO4、300mM CoSO4、300mM ZnSO4和300mMMnSO4)混合来水合该脂质薄膜。将该混合物进行冻-融(分别5分钟，在液氮中冷冻，在65℃融化)五个循环。在65℃，将形成的多层脂质体(MLV′s)通过0.1μm孔径的层叠聚碳酸酯过滤器(Extruder，Northemlipids)挤压10次。得到的LUVs典型地具有平均囊泡直径为110nm±30nm。使用sephadex G-50大小的排阻色谱法(exclusion chromatography)，用SHE pH 7.5(300mM蔗糖，20mM HEPES，15mM EDTA)替换LUVs’外部缓冲剂。
1.1.2金属离子梯度的形成
在铜、锌、锰或钴的无缓冲硫酸盐溶液中制备挤压的(extruded)DSPC/Chol脂质体。用蔗糖/HEPES/EDTA(SHE)缓冲剂pH7.5替换外部缓冲剂，得到金属离子梯度。在50℃，于60分钟内测定依立替康负载(药物与脂质比率为0.2mol∶mol)的效率。使用包含(CuSO4/HEPES/TEA pH7.5)的内部缓冲剂或无缓冲的CuSO4+A23187离子载体评价脂质体内部pH对药物负载效率的作用。当使用A23187时，来自脂质体内部的Cu2+离子与来自外部缓冲剂的两个质子交换，从而保持低的内部pH。不可透膜(membrane-impermeant)的pH敏感性的荧光探针HPTS用于研究在铜-介导的依立替康包封(encapsulation)后内部pH的任何改变(最初内部pH为7.5或3.5-没有离子载体)。使用HPLC和TLC方法来评价脂质体依立替康的羧基和内酯含量。
1.1.3负载依立替康
在50℃，用脂质培养药物，药物∶脂质比率＝0.2∶1(mol∶mol)。在各个时间点，通过取样等分试样和使用1ml用适宜缓冲剂(680g×3分钟)平衡的sephadex G-50自旋柱(spin columns)分离包封的药物与未包封的药物来测定药物的摄取。将排出的(excluded)部分，包含脂质体，进行分析以测定药物：脂质比率。使用液体闪烁计数测定脂质浓度。在370nm通过检测吸光率来测定依立替康浓度。
1.2结果
1.2.1依立替康负载效率
在铜、锌、锰或钴的无缓冲硫酸盐溶液中制备挤压的DSPC/Chol脂质体。用蔗糖/HEPES/EDTA(SHE)缓冲剂pH 7.5替换外部缓冲剂，得到金属离子梯度。在50℃，于60分钟内测定依立替康负载(药物与脂质比率为0.2mol∶mol)效率。使用包含(CuSO4/HEPES/TEA pH 7.5)的内部缓冲剂或无缓冲的CuSO4+A23187离子载体评价脂质体内部pH对药物负载效率的作用。当使用A23187时，来自脂质体内部的Cu2+离子与来自外部缓冲剂的两个质子交换，从而保持低的内部pH。不可透膜的pH敏感性的荧光探针HPTS用于研究在铜-介导的依立替康包封后内部pH的任何改变(最初内部pH为7.5或3.5-没有离子载体)。使用HPLC和TLC方法来评价脂质依立替康的羧基和内酯含量。
使用具有包封的无缓冲CuSO4和ZnSO4溶液的脂质体，依立替康负载效率为＞90％。为保持低的内部pH包含的A23187离子载体不会影响铜介导的负载特性。当将内部和外部缓冲剂调节至pH 7.5(内部缓冲剂-CuSO4/HEPES/TEA pH 7.5)时，再次发现依立替康负载＞90％。HPTS测定结果表明，用无缓冲的CuSO4负载后，内部pH增加了。HPLC和TLC显示出包封的依立替康主要以内酯形式存在(图5和图6)，与过渡金属溶液的最初内部的pH无关。
1.2.2含有依立替康的DSPC/Chol脂质体的活性药物负载
在50℃，以药物∶脂质比率＝0.2∶1(mol∶mol)用脂质培养药物。在各个时间点，通过取样等分试样和使用1ml用适宜缓冲剂(680g×3分钟)平衡的sephadex G-50自旋柱分离包封的药物与未包封的药物来测定药物的摄取。将排出的(excluded)部分，包含脂质体，进行分析以测定药物∶脂质比率。使用液体闪烁计数测定脂质浓度。在370nm通过检测吸光率来测定依立替康浓度(图2)。
1.2.3脂质体和离子载体制备
如上所述制备DSPC/Chol(55∶45mol％)大单层脂质体(LUVs)。在这一情况下，包封的缓冲剂包含300mM CuSO4(无缓冲的)、300mM CuSO4/20mMHEPES/220mM TEA pH 7.5或300mM CuSO4+A23187离子载体。在依立替康负载之前，直接通过在50℃培养10分钟将离子载体加入到脂质体膜中。A23187的存在促进了1×Cu2+从脂质体内部向外运动，代替了2×H+从外部缓冲剂向内运动。结果是，脂质体的内部保持低pH。
1.2.4含有依立替康的DSPC/Chol脂质体的活性药物负载
如上所述用依立替康负载脂质体。如在图3中显示的，使用含有包封的缓冲CuSO4 pH 7.5或无缓冲CuSO4+A23187离子载体(其保持低pH环境)的脂质体，依立替康负载效率仍然＞90％。
1.2.5药物负载后脂质体内部pH的测定
如上所述制备DSPC/Chol(55∶45mol％)脂质体。在存在或不存在荧光染料下，用下述内部缓冲剂配制脂质体：HPTS(12.5mM)：300mM CuSO4无缓冲的，300mM CuSO4/20mM HEPES/220mM TEA pH 7.5，300mM柠檬酸盐pH 3.5和20mM HEPES pH 7.5。挤压后，如前所述，使用柱色谱法用SHE pH7.5替换外部缓冲剂。
将依立替康主动地负载入DSPC/Chol脂质体，其是用内部缓冲剂300mMCuSO4 pH 3.5 HPTS和300mM CuSO4/20mM HEPES/TEA pH 7.5 HPTS配制的。负载条件为如前述的，HPTS的存在不会降低负载依立替康的效率。
使用LS-50B发光光谱仪(Luminescence Spectrometer)(Perkin-Elmer)进行HPTS检测。为了消除脂质诱导的干扰，将脂质体溶液稀释在HBS pH 7.5中至最终脂质浓度为0.5mM。阴离子荧光团HPTS是水溶性的和不可透膜的，因此，其可以被俘获在脂质体的内部隔室中。HPTS的激发性质取决于pH，因此在酸性条件下，染料在405nm具有的激发最大值，而增加pH会引起在405nm的荧光强度降低和在450nm的强度增加。这可通过在图4A中显示的扫描图来例证，其表示在350-490nm，用对照DSPC/Chol脂质体制剂激发两次后，在510nm的HPTS荧光发射。当内部缓冲剂为pH 3.5的柠檬酸盐时，在405nm HPTS激发有最大值。相反，pH 7.5的HEPES的内部缓冲剂引起在405nm的信号减少，并在450nm出现显著的激发。Cu的存在明显地淬灭了HPTS信号，使其为在可比较的不存在铜的情况下所能看到的约20％(图4B)。
该实验的一个目的是阐明在将依立替康负载入DSPC/Chol脂质体后任何内部pH的改变。除了在前述情况下已经将依立替康有效地载入外，图4C表示与在图4B中描述的相同的含铜脂质体的激发扫描。在＜400nm观察到的增加的激发强度为依立替康负载的假象。依立替康为荧光活性化合物，激发波长为368nm，发射波长为423nm。来自该激发扫描图感兴趣的重点为在450nm周围出现了包含无缓冲的CuSO4(pH～3.5)的脂质体制剂的显著信号。如我们从前述扫描图所观察到的，在pH 3.5，对于我们的对照脂质体制剂而言，在该波长不存在显著信号(图4A，图4B)。
根据在图4C中显示的激发扫描图上依立替康的效果，当与不含药物的相应物相比，在pH 7.5，将这些药物负载入含铜脂质体中不会引起扫描图中明显的改变。
1.2.6依立替康内酯环的检测
在使用包含78％三乙醇胺溶液(3％v/v)和22％乙腈作流动相的C18柱(3.9×150mm)上解析依立替康。通过荧光(激发(lexcit)＝363nm；发射(lemiss)＝425nm)定量药物。峰面积分析表明对于包含无缓冲的CuSO4的脂质体，以内酯形式存在的96％依立替康，以羧酸盐(carboxylate)形式存在的4％依立替康(图5)。对于含有CuSO4 pH 7.5的内部缓冲剂的脂质体，当量值为83％的内酯和17％的羧酸盐。
将依立替康对照品和脂质体样品溶于CHCl3∶MeOH(1∶1v/v)中，在TLC板上点样。通过将TLC板最初暴露于流动相CHCl3∶MeOH∶丙酮(9∶3∶1v/v/v)，随后暴露于流动相丁醇∶乙酸∶水∶丙酮(4∶2∶1∶1v/v/v/v)，来分离内酯和羧基形式的药物。在紫外光下药物是可见的，证实依立替康主要以内酯形式存在(图6)。
1.2.7体内脂质体的稳定性研究
通过在特定时间点，测定血浆中游离脂质和游离药物水平进行脂质体稳定性的分析(图7-10)。这些结果显示出在脂质体中，与使用Mg2+或不存在离子载体或在pH 7.5相比，在pH 3.5下，Cu2+和离子载体A23187提供较多的药物保留(参见图9和图10)。
1.2.8有效性研究
包封的药物依立替康(CPT-11)对肿瘤体积的效果显示在图11-17中。对两个剂量的依立替康(CPT-11)，在存在Cu2+的情况下，在pH 7.5下的包封的效果与pH 3.5下的包封的效果与在离子载体存在下pH 3.5下的包封的效果，进行比较。在pH 3.5或在pH 3.5在离子载体存在下包封可提供更有效的治疗方案。更详细的分析(图18)显示，在pH 3.5与存在Cu2+与存在离子载体的情况下的包封在最低剂量(50μmol/kg)提供了最长的肿瘤生长延迟、最高的对数细胞杀死和较多的细胞(superior cell)杀死。在图18中，T-C是治疗的肿瘤体积增加至400％的天数与对照肿瘤相应天数的差；％生长延迟＝(T-C)/C×100，其中C为当对照肿瘤体积达到400％时的试验天数；对数细胞杀死(Log Cell Kill)＝(T-C)/(3.32×Td)，其中Td为对照肿瘤的肿瘤翻倍时间；和％细胞杀死＝(1-(1/10x))×100，其中x为对数细胞杀死。
综合而言，这些有效性的结果表明由Cu2+与离子载体和依立替康组成的组合物提供了最有效的组合物。这与观察结果一致：该组合物提供了最好的血浆稳定性。
使用含有CuSO4的脂质体，依立替康负载效率为＞90％。A23187离子载体的包含可保持低的内部pH，而不会影响铜介导的负载特性，但强有力地增加了在血浆中测定时的脂质体中药物保留。而且，HPLC和TLC显示出包封的依立替康主要以临床活性的内酯形式存在，其与过渡金属溶液的最初内部的pH无关。在小鼠异种移植物肿瘤模型中，对于较低剂量的依立替康，该组合物提供了血浆中增加的药物保留，获得了体内增加的药物暴露，产生增加的有效性。
总之，在组合物使用过渡金属Cu2+和离子载体可将依立替康包封入DSPC/脂质体中，所述组合物提供了优良的体内药物保留和优良的有效性。
实施例2.0
2.1血浆药物保留
图19和20说明了体内给药至Rag-2M小鼠后血浆中药物与脂质的比率。在每种情况下，给药的制剂由具有不同内部溶液的相同脂质体组合物组成，如在附图图例中表明。在药物依立替康(图19)和长春瑞滨(图20)两种情况下，通过Cu2+/A23187药物负载技术制备的制剂均显示了由高相对药物-脂质比率表示的显著优良的血浆药物保留。
2.2不同依立替康处理的药代动力学参数
图21为类似于概述不同的依立替康处理的药代动力学参数的图18的表。通过Cu2+/A23187药物负载技术制备的制剂的情况下，肿瘤生长的延迟是最有效的。在图21中，根据单剂量静脉快速注射(bolus dose)给药至Rag-2M小鼠(n＝3/时间点)，使用WinNonLin药代动力学参数软件(非隔室模型(noncompartmental))计算依立替康曲线下血浆面积(AUC)。依立替康血浆平均保留时间(MRT)使用WinNonLin药代动力学参数软件(非隔室模型)根据单剂量静脉快速注射给药至Rag-2M小鼠(n＝3/时间点)计算。生长延迟％根据给药至具有建立的s.c LS180肿瘤(人类结肠直肠癌异种移植物)Rag-2M小鼠单剂量的依立替康治疗计算。生长延迟％＝(T-C)/C×100，其中C为当对照肿瘤达到400％时试验的天数，T-C为治疗的肿瘤体积增加至400％的天数与对照肿瘤相应天数的差。对于脂质体依立替康(未缓冲的300mMMnSO4+A23187)，没有标明有效性值，因为没有进行头-头(head-to-head)研究。我们之前公开了与该鼠模型相关的有效性数据和该脂质体制剂(Messerer等，Clin.Cancer Res.10：6638-49，2004)。如对本领域那些技术人员显而易见地是，根据上述公开的内容，在没有背离本发明的精神或范围下，实施本发明中许多改变和改进都是可能的。因此，本发明的范围将根据通过下述权利要求限定的内容来解释。