一种注射用人体皮肤填充剂及其制备方法.pdf

一种注射用人体皮肤填充剂，主要由细胞成分与富含血小板血浆、凝血因子和钙离子组成，每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000－5000万个，血小板的含量为100－700×106个，凝血因子含量为1－10单位，钙离子含量为10－40mmol/ml；所述细胞成分是指采用治疗者自体的皮肤经过体外低血清或无血清培养和扩增，收集得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。血小板也是从治疗者的自体血液中提取，凝血因子是治疗者自体或外来(包括动物血液中提取和基因重组获得)。本发明还提供了所述注射用人体软组织填充剂的制备方法。本发明的优点是：注射后可立即出现明显的填充和修复效果，且疗效持久，自然安全，治疗程序简便。

权利要求书
1.  一种注射用人体皮肤填充剂，该填充剂主要由细胞成分与富含血小板血浆、凝血因子和钙离子组成，每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个，凝血因子含量为1-10单位；所述细胞成分是指治疗者自体的皮肤经体外低血清或无血清培养和扩增后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。

2.  根据权利要求1所述的注射用人体软组织填充剂，其特征在于：所述富含血小板的血浆是从治疗者血液中提取，且所述血小板的含量范围为100-700×106个/ml注射用填充剂。

3.  根据权利要求1所述的注射用人体软组织填充剂，其特征在于：所述凝血因子的含量为1-10单位/ml注射用填充剂，可以从自体血液中提取，也可以使用动物来源的凝血因子。

4.  根据权利要求1所述的注射用人体软组织填充剂，其特征在于：所述的钙离子为Cacl2或柠檬酸钙，其含量为10-40mmol/ml。

5.  根据权利要求1或3所述的注射用人体软组织填充剂，其特征在于：所述的经培养和扩增后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞的数量之比为10-20∶50-70∶20-30。

6.  一种制备权利要求1至4中任意一项所述的注射用人体软组织填充剂的方法，包括以下步骤：
(1)采用治疗者自体的皮肤进行体外低血清或无血清培养和扩增，收集所得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞；
(2)从治疗者臂部抽全血5-30毫升，在体外分离所得富含血小板的血浆。
(3)将收集到的细胞成分与富含血小板的血浆构成成注射用人体软组织填充剂；每毫升该填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个。

7.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述低血清或无血清体外培养和扩增采用组织块培养法。

8.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述体外低血清或无血清培养和扩增中加入了生长因子和活性材料；所述生长因子选自上皮生长因子、成纤维生长因子中的一种或多种，所述活性材料选自氢化可的松、肝素中的一种或多种。

9.  根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述上皮生长因子在培养液中的含量为1至5纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量为2至20纳克/毫升；所述氢化可的松在培养液中的含量为0.2至2微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量为2至20微克/毫升。

10.  根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述上皮生长因子在培养液中为3纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量为10纳克/毫升；所述氢化可的松在培养液中的含量为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量为为10微克/毫升。

11.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：从治疗者抽取5-30毫升全血，进行500-2000转/分，15分钟离心得到富含血小板的治疗者自体的血浆，其含量为100-700×106个/ml。

12.  根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：从受术者自体血浆中用热冷交换法获得凝血因子或者是从市场购得的动物源性凝血因子，浓度为1-10单位/ml。

13.  用富含自体血小板的血浆与自体细胞制备成注射液。注射过程分为2步：先将培养好的治疗者自体的细胞和富含血小板的血浆制备的注射液注射到需要填充的部位后，用第二支注射器在同样部位注射凝血因子和钙离子的混合溶液，使之在注射部位混合。

说明书一种注射用人体皮肤填充剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种组织填充剂及其制备方法，更具体地说，是一种注射用人体皮肤填充剂及其制备方法。
背景技术
人体软组织填充是作为修复软组织在损伤后的主要治疗方法。十九世纪就已经开始使用石蜡、硅氧烷进行填充。上个世纪八十年代之后又出现了明胶粉末材料，但其均有疗效不确定，毒副作用大等问题。
1997年之后，Isolagen采用自体成纤维细胞作为团组织填充材料，有了一定的疗效，但存在显效慢，疗效不显著等问题。
中国专利03155833.X中公开了一种除皱祛疤的注射剂，应用了自体皮肤，经体外分离、培养和扩增，制成于葡萄糖液中的一种注射剂，治疗疤痕和祛除皱纹。由于该技术使用的生物材料取自患者自体，无排斥反应，效果持久，但该技术的不足之处是，注射剂中能立即发挥人体软组织的填充和修复功能的胶原蛋白含量较低，导致注射到疤痕和皱纹处后见效较慢，一般要4-6个月；另外，使用动物血清作为培养液的成分也可能存在安全性方面的问题。
我们在2006年发明了采用自体的成纤维前体细胞和透明质酸构成的新的填充材料，有效的改善了单纯成纤维细胞治疗出现效果慢的缺陷，但是透明质酸最主要的作用是保水，对细胞的扩增和存活作用较弱。
本专利应用治疗者自体富含血小板的血浆作为注射材料的一部分，自体血浆中的血小板能有效的提高自体细胞的成活率，注射后其产生的细胞因子能促进自体细胞的扩增和产生较多的胶原蛋白，同时自体血浆中的血小板成分与凝血因子构成一种网状结构，能使自体细胞更大量的扩增并扩大了细胞分泌胶原蛋白的空间。因而，自体富含血小板的血浆优于透明质酸。
发明内容
为了克服上述注射用人体软组织填充剂的不足，本发明的目的在于提供一种立即见效、疗效持久、受术者满意度更高的注射用人体软组织填充剂。
本发明的另一个目的是提供这种注射用填充剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种注射用人体皮肤填充剂，该填充剂主要由细胞成分与富含血小板血浆、凝血因子和钙离子组成，每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个/，凝血因子含量为1-10单位，钙离子含量为10-40mmol；所述细胞成分是指采用治疗者自体的皮肤经过体外低血清或无血清培养和扩增，收集得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。
优选地，在本发明所述填充剂中，所述的经培养和扩增后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞的数量之比为10-20∶50-70∶20-30。
用于本发明的血浆是自体的，凝血因子可以是自体血液中提取也可以是从动物材料中提取，为医药级产品。
优选地，在本发明所述填充剂中，血浆中的血小板含量为100-700×106个/ml注射用填充剂，进一步优选200-300×106个/ml注射用填充剂。
本发明所述的填充剂除了细胞成分和富含血小板血浆、凝血因子、钙离子之外，还可以含有一些辅助成分，所述辅助成分可以是本领域常见的能够加入到填充剂中的任何一种或多种成分，如自体胶原蛋白、维生素、葡萄糖、等渗生理盐水等等。
本发明使用的低血清培养基仅需添加3％～5％胎牛血清，而传统培养基通常须加入约10％的新生牛血清，低血清培养基对于细胞生长、增殖、形态、活性和功能没有不良影响，甚至有所改善。
此外，本发明还提供了一种所述注射用人体软组织填充剂的制备方法，该方法包括下列步骤：
(1)采用治疗者自体的皮肤进行体外低血清或无血清培养和扩增，对所得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞进行收集；
(2)将收集到的细胞成分与自体富含血小板的血浆配成注射用人体软组织填充剂。
(3)配置凝血因子和钙离子溶液作为辅助成分。
本发明所采集的皮肤组织可以是从耳后、切眼袋、切眉或者其它部位所得到的皮肤，同时包括表皮和真皮。
在本发明所提供的填充剂制备方法中，将来源于治疗者自体的少量皮肤，例如，1-30平方毫米的皮肤，在加入了生长因子和活性材料的低血清或无血清培养液中进行体外培养和扩增，得到真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞。
所述体外低血清或无血清培养和扩增中，所述培养液的组成可以是本领域常用的基础培养液，例如，可以参见《细胞实验指南》中的有关介绍(2001年，科学出版社出版，主编：D.L.斯佩克特，黄培唐翻译)。优选地，在体外全程无血清培养和扩增过程中，使用的培养液中还包括生长因子和活性材料。所述生长因子为选自：上皮生长因子、成纤维生长因子中的一种或多种；所述活性材料选自：氢化可的松、肝素中的一种或多种。所述上皮生长因子在培养液中的含量可以为1至5纳克/毫升，优选为3纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量可以为2至20纳克/毫升，优选为10纳克/毫升；所述氢化可的松在培养液中的含量可以为0.2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量可以为2至20微克/毫升，优选为10微克/毫升。上述的培养液和生长因子及活性材料可以是选自一个公司或者多个公司(如美国的Cascade公司、Sigma公司、Hyclne公司等)的市售产品。
在本发明所提供的填充剂制备方法中，所述体外培养和扩增可采用本领域常见的任何用于为获得自体细胞的体外培养和扩增方法，如组织消化培养法、组织块培养法等，优选采用组织块培养法。
下面进一步详细说明本发明所提供的填充剂制备方法，但本发明并不因此而受到任何限制。
1、自体皮肤取材
用酒精消毒取材部位，进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将1-30平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中。将创伤部位做一到三针缝合，创可贴覆盖。也可以采用面部整形手术时切除的多余皮肤组织块，如手术切除眼袋或切眉所得到的皮肤。
2、皮肤组织培养前处理
将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮部位，然后去除皮下组织和脂肪，将皮肤组织剪碎为0.1-0.5平方毫米的皮肤碎片，最后将皮肤碎片平铺于培养皿的底面。另外，对于通过做切眼袋、切眉手术或者其它部位获得的大于4平方毫米的皮肤组织，可首先将皮肤组织块用胰酶液消化一段时间，再将消化后的组织块剪碎平铺于培养皿的底面。
3、细胞体外培养
包括原代细胞培养和传代细胞培养两个步骤。
原代培养：在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM和低血清培养液进行培养，使细胞扩增到50％-90％的培养皿底面即可进行传代培养。
传代培养：在原代培养的基础上加入生长因子(如上皮生长因子、成纤维生长因子等)和活性材料(如氢化可的松、肝素等)，培养2-8周，大约培养扩增至1500万-2亿个细胞。
上皮生长因子在培养液中的含量可以为1至5纳克/毫升，优选为3纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量可以为2至20纳克/毫升，优选为10纳克/毫升；所述氢化可的松在培养液中的含量可以为0.2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量可以为2至20微克/毫升，优选为10微克/毫升。
采用本领域常用的细胞培养条件即可，如可将从组织块培养出的真皮细胞(含成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞)用上述的低血清或无血清培养液在温度为37℃，5％的CO2细胞培养箱中培养，每3-4天换上述培养液一次，直至得到所需的细胞成分的含量。
在医院或诊所由医护人员抽取治疗者5-30毫升血液。在洁净的实验室或化验室条件下将此血液置入装有细胞分离液的离心管中，以500-2500转/分的转速离心25分钟，优选转速1500转/分钟，优选离心时间为15分钟，提取上部的富含血小板的血浆作为自体注射用的血浆。
4、填充剂配制
将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，在使用无外源性蛋白的DMEM清洗数次，去除外源性生长因子和活性物质。再将收集到的细胞与少量胶原蛋白直接加入富含血小板的血浆中，混匀，配成注射填充剂，每毫升注射用填充剂中细胞成分的总个数为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个。
凝血因子是从治疗者自己的血液中经过热冷交换处理得到的凝血因子，或者是医疗试剂公司购得的人源性或动物源性的医用的凝血因子，将其配制成浓度为1-10单位/ml的溶液。氯化钙或柠檬酸钙配制成浓度为10-40mmo/ml的溶液。
治疗步骤：先将含有细胞和血浆的溶液注射到治疗部位，使填充部位出现发白和轻微的隆起为止，再将凝血因子与钙离子溶液的混合溶液从同一针孔进入注射，注射到稍感硬度，发白度更加明显，注射过程完成。
与现有技术相比，本发明的注射用人体软组织填充剂包含了大量的血浆和凝血因子构成支架结构，在注射部位能快速产生填充除皱和修复效果；随后，在大量的血小板中产生的自体生长因子的作用下，注射填充剂中含有的细胞成分能不断地分泌出胶原蛋白，保持填充和修复的效果。该注射用人体软组织填充剂在注射后可快速出现明显的填充和修复效果，且疗效持久。此外，本发明的注射用人体软组织填充剂在制备过程中使用了低血清或无血清培养，基本不含有外源性免疫原性物质，大大降低了注射后感染动物源性疾病和发生过敏的危险。且由于血小板和自体血浆对细胞起到促进作用，可诱导细胞生成胶原蛋白纤维并使组织再生，使除皱和修复效果更加自然。
因此，本发明的注射用人体软组织填充剂可广泛用于美容、改善皮肤弹性和光泽以及其它部位和类型的填充和修复中，包括处理由于真皮缺损而导致的各种症状，例如面部皱纹、凹陷性疤痕、妊娠纹、手背皱纹等，还可用于丰唇、增强真皮厚度和改善皮肤基质等。
附图说明
图1是培养成功的真皮细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；
图2是本发明的一个具体实施例的注射用人体软组织填充剂在包装瓶中照片。其中左瓶为细胞与富含血小板血浆注射填充剂，右瓶为凝血因子和钙离子注射填充剂；
图3和图4是本发明的一个具体实施例治疗纹前后的对比照片，其中图3为受术者颈纹治疗前照片，图4为受术者颈纹治疗后照片；
具体实施方式
下面进一步详细说明本发明所提供的注射用人体软组织填充剂及其制备方法，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例：人体软组织填充剂的制备
一.自体健康皮肤样品的提取
用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将接受治疗者耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM细胞保存液，购自美国Hyclone公司)中，将创伤部位做一针缝合，创可贴覆盖。
二.细胞悬液的制备
1.皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮部位，然后去除皮下组织和脂肪，将皮肤组织剪碎为0.1-0.5平方毫米的皮肤碎片，最后将皮肤碎片平铺于培养皿的底面。
2.原代细胞培养：在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM和3％的胎牛血清，放入Forma CO23131型培养箱中，在37℃，5％CO2的条件下进行培养，每隔2～3天换上述培养液一次，当原代细胞达到80％汇集后传代。
3.传代细胞培养：在原代培养的基础上加入上皮生长因子为3纳克/毫升、成纤维生长因子10纳克/毫升、氢化可的松1微克/毫升、肝素10微克/毫升，每3-4天换上述培养液一次，培养4周，大约培养扩增至1500万个细胞。
4.配制注射剂：将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3次。将收集到的细胞与少量胶原蛋白直接加入富含血小板的血浆中，混匀，配成注射填充剂，每毫升注射用填充剂中细胞成分的总个数为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个。
凝血因子是从治疗者自己的血液中经过热冷交换处理得到的凝血因子，或者是医疗试剂公司购得的人源性或动物源性的医用的凝血因子，将其配制成浓度为1-10单位/ml的溶液。氯化钙配制成浓度为10-40mmmol/ml的溶液。
病毒检测：皮肤组织培养4周后，取1ml含有细胞的培养液进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。
免疫反应测试：第4周将0.1ml细胞与血小板注射液对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，无免疫反应。
成品检测：
1)外观：细胞与血小板注射液为黄色混悬液，凝血因子和氯化钙溶液为白色半透明液体。
2)本品中细胞分类检定：
成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定(黄晖，赖西南，王正国，王丽丽，“创伤愈合中物质对表皮干细胞迁移及受体表达的作用”；《中华创伤杂志》2004年；20(3)142-145。利用核标记物)，产品中有10％的成纤维干细胞。
成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察，其标准形态为细小长索状)，产品中有70％的成纤维前体细胞。
成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察，其标准形态为呈多触突的长索形细胞)，产品中有20％的成纤维细胞。
3)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
三.治疗
用于额头皱纹，眼角鱼尾纹，脖颈皱纹，妊娠纹等所有面部及其它身体部位的皱纹和细小皱纹；治疗5例。
1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括：血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。
2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.将1ml填充剂吸入1ml的注射器中备用。
4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20°～45°)，在注射部位注射时，将注射部位表皮拉紧注射细胞，使其发白，注射时使注射部位留有弥散空间。先将含有细胞和血浆的溶液注射到治疗部位，使填充部位出现发白和轻微的隆起为止，再将凝血因子和氯化钙的溶液从同一针孔进入注射，注射到稍感硬度，发白度更加明显，注射过程完成。
疗程：注射部位共注射1次。
四、术后观察、调护：
1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。
2.观察局部及全身的情况：一切正常。
3.每天二次口服维生素C(每次2.00mg，每天共400mg)，服用6个月。
4.术后3天内防曝晒及慎用刺激性化妆品。
五、效果描述
皱纹在注射后基本消失或明显变浅，效果良好。注射前后的效果对比见图3至图4。