仙人掌多糖及其提取纯化方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种化学方法，具体涉及仙人掌多糖及其提取纯化方法和应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种慢性、多发性常见病，多伴有并发症。它与肿瘤、心血管疾病同样被视为世界性三大疾病。随着我国人民生活水平的提高，糖尿病患者的人数在逐年增加。据WHO统计，目前全球糖尿病患者已经超过1.5亿，预计到2025年将突破3亿，并预测二十一世纪糖尿病将在发展中国家流行。
糖尿病患者如果血糖控制不理想，日久则可能发生急、慢性并发症。常见的慢性并发症有糖尿病合并高血压、糖尿病性心脏病、糖尿病脑血管病变、糖尿病眼病、糖尿病足、糖尿病感染等。急性并发症有糖尿病酮症酸中毒昏迷，糖尿病非酮症高渗性昏迷，糖尿病乳酸性酸性酸中毒等。高血糖作为糖尿病主要代谢紊乱之一，在糖尿病并发症的发生发展中发挥重要作用。高血糖主要通过以下四条通路引发病症：(1)蛋白激酶C(PKC)的激活；(2)氧化应激(ROS)；(3)高级糖化终产物(AGEs)形成；(4)多元醇通路(PP)的增加。
国内外学者根据糖尿病发病机制的四条通路，研制出多种特异性针对四大通路中某一通路的药物，对糖尿病慢性并发症的防治有潜在作用，但大多数尚处于动物试验、观察和试用阶段，主要包括以下几类：醛糖还原酶抑制剂(ARI)；高级糖化终产物(AGEs)抑制剂；蛋白激酶C(PKC)抑制剂；抗氧化剂。
其中，抗氧化剂多为一些非特异性抗氧化剂，如VitC，VitE等。近年来有关VitB6、硫胺素、硫辛酸等抗氧化剂在动物实验中报道较多。
研究显示许多植物多糖都具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，从而保护生物膜的作用。因此，研究多糖的抗氧化性时，通常以其清除自由基的能力及抗脂质过氧化的活性来作为评价的主要指标。
野生的仙人掌生长很快，资源广泛，即使是人工种植，扦插繁殖时只要切下一段肉质茎，种在排水良好的菜园土壤中即可。一半土壤，一半沙子，一些碎瓦砾、叶土和骨粉的混合物将会产生良好的发芽生根效果，同时它具有具有清热解毒，散瘀消肿，健胃止痛，镇咳等作用，已应用于治疗胃、十二指肠溃疡，急性痢疾，咳嗽，外用治流行性腮腺炎，乳腺炎，痈疖肿毒，蛇咬伤等，但关于仙人掌多糖对糖尿病并发症中的氧化应激的抑制作用的研究以及在糖尿病并发症中的治疗和保健作用的应用还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种仙人掌多糖的提取纯化方法。以野生仙人掌为原料，对多糖物质进行提取、纯化，得到具有抗氧化性的仙人掌多糖半纯品。
本发明的另一个目的是提供所述方法制备的仙人掌多糖。
本发明的另一个目的是提供所述方法制备的仙人掌多糖的应用。
本发明的一种仙人掌多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)用水浸提经除杂、破碎的仙人掌鲜茎，离心取上清液；
(2)过滤后，采用超滤膜对步骤(1)得到的上清液纯化和浓缩；
(3)将步骤(2)超滤浓缩后的溶液在不同乙醇浓度下分段沉降多糖；
(4)经Sevag法脱蛋白、活性炭脱色初步纯化。
优选方案如下：步骤(1)所述水浸提条件：水料比为6∶1，浸提温度为70～80℃，浸提时间为2.2～3h。
步骤(2)所述过滤采用400目尼龙滤布。
步骤(2)所述纯化和浓缩选用截留分子质量为10000ku的超滤膜，超滤压力为0.20MPa，超滤温度为25℃，料液体积流量控制在0.04～0.05L/min。
步骤(2)所述浓缩的倍数控制5～7倍。
步骤(3)所述分段沉降先用浓度为55％～65％的乙醇，4℃下沉降8h，离心后得到粗多糖OP1，上清液再超滤浓缩到粗多糖浓度1.5～2.0％重量后，加入体积浓度为95％乙醇调节体系乙醇浓度到80％，得沉降粗多糖OP2。
步骤(4)所述Sevag法脱蛋白重复操作6次；所述活性炭脱色是将多糖分别配成1％的水溶液，调pH4.0～6.0后，每100mL多糖水溶液使用活性炭0.15～0.2g脱色。
本发明所述方法提得到的仙人掌多糖可以用于制备糖尿病抗氧化剂药物。
本发明与现有技术相比具有如下：
(1)将超滤技术应用于仙人掌多糖浸提液的纯化和浓缩，具有条件温和、多糖类物质损失少、超滤速度快、工艺路径短、节约能源等优点。
(2)提供了一种制备有抗氧化作用的仙人掌多糖的方法，用于对糖尿病并发症中的氧化应激的抑制作用，为开发和有效利用野生仙人掌植物资源提供新途径。
(3)利于研究防治糖尿病的新的药物，将祖国的中医药学发扬光大。
【具体实施方式】
实施例1
(1)以500克仙人掌鲜茎为原料，除杂、破碎，水溶液浸提多糖，水料比6∶1，浸提温度70℃，浸提时间2.2h；浸提1次，4000转/分条件下离心20min分离得上清液3050mL。
(2)用400目的尼龙滤布过滤作为预处理，之后，用截留分子质量为10000ku的超滤膜过滤，超滤压力为0.20MPa，超滤温度为25℃，料液体积流量控制在0.05L/min、控制浓缩5倍，得浓缩浸提液600mL。
(3)上述浓缩浸提液在乙醇体积浓度为55％，4℃下沉降8h，离心、干燥后得到粗多糖OP1，2.42克，上清液再超滤浓缩到粗多糖浓度1.5％重量后，加入体积浓度为95％的乙醇调节体系乙醇浓度到80％，得沉降粗多糖OP2，2.18克。测定二种粗多糖OP1、OP2中多糖含量分别为64.35％、83.42％。选OP2进入下一步骤。
(4)粗多糖OP2经Sevag法脱蛋白、重复操作6次；之后，将多糖分别配成1％重量的水溶液，用醋酸调pH4.0。添加水溶液体积量0.15％g/100mL的活性炭脱色，得到初步纯化的仙人掌多糖OPM2，1.93克，测定OPM2中多糖含量为86.78％重量。
实施例2
(1)以500克仙人掌鲜茎为原料，除杂、破碎，水溶液浸提多糖，水料比6∶1，浸提温度75℃，浸提时间2.5h；浸提1次，同实施例1离心分离得上清液3050mL。
(2)用400目的尼龙滤布过滤作为预处理，之后，用截留分子质量为10000ku的超滤膜过滤，超滤压力为0.20MPa，超滤温度为25℃，料液体积流量控制在0.04L/min、控制浓缩6倍，得浓缩浸提液500mL。
(3)上述浓缩浸提液在乙醇浓度为60％体积，4℃下沉降8h，离心、干燥后得到粗多糖OP1，2.48克，上清液再超滤浓缩到粗多糖浓度2.0％重量后，加入浓度为95％体积的乙醇调节体系乙醇浓度到80％，得沉降粗多糖OP2，2.10克。测定二种粗多糖OP1、OP2中多糖含量分别为64.75％、83.62％重量。选OP2进入下一步骤。
(4)粗多糖OP2经Sevag法脱蛋白、重复操作6次；之后，将多糖分别配成1％重量的水溶液，用醋酸调pH6.0。添加水溶液体积量0.2％g/100mL的活性炭脱色，得到初步纯化的仙人掌多糖OPM2，1.97克，OPM2中多糖含量为86.90％重量。
实施例3
(1)以500克仙人掌鲜茎为原料，除杂、破碎，水溶液浸提多糖，水料比6∶1，浸提温度80℃，浸提时间3h；浸提1次，离心分离得上清液3050mL。
(2)用400目的尼龙滤布过滤作为预处理，之后，用截留分子质量为10000ku的超滤膜过滤，超滤压力为0.20MPa，超滤温度为25℃，料液体积流量控制在0.045L/min、控制浓缩7倍，得浓缩浸提液450mL。
(3)上述浓缩浸提液在乙醇浓度为65％体积，4℃下沉降8h，离心分离、干燥后得到粗多糖OP1，2.69克，上清液再超滤浓缩到粗多糖浓度2.0％重量后，加入95％体积乙醇调节体系乙醇浓度到80％，得沉降粗多糖OP2，1.95克。二种粗多糖OP1、OP2中多糖含量分别为64.15％、83.72％重量。选OP2进入下一步骤。
(4)粗多糖OP2经Sevag法脱蛋白、重复操作6次；之后，将多糖分别配成1％重量的水溶液，调pH5.0。添加水溶液体积量0.18％g/100mL的活性炭脱色，得到初步纯化的仙人掌多糖OPM2，1.87克，OPM2中多糖含量为88.75％重量。
实施例4
测定仙人掌多糖体外抗氧化性，测定方法如下：
1)清除O-2·实验采用核黄素-蛋氨酸体系 向干燥比色皿内依次加入，0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8、0.13mol/L蛋氨酸、2×10-5mol/L核黄素、7×10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝NBT各0.4mL，依据试验的不同样品浓度，加不同体积的本发明多糖溶液或抗坏血酸溶液、以双蒸水稀释至4.0mL，混匀。空白样管不加蛋氨酸和清除剂，对照样管不加清除剂。混合液在35℃恒温，4000lx下光照20min进行还原，以黑暗中止反应。用分光光度计在560nm处测量各管溶液的光吸收值。
O-2·清除率为＝[(A对照-A样品)/A对照]×100％
2)清除·OH实验采用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系取5×10-3mol/L邻二氮菲溶液1.5mL，加0.05mol/L的磷酸缓冲液pH7.42.0mL充分混匀后，加7.5×10-3mol/LFeSO4溶液1.0mL，每加一管立即混匀，加0.1％H2O21.0mL，最后以双蒸水补充至总体积为10mL。反应液37℃保温1h，在波长536nm处测吸光度A损伤。多糖溶液及抗坏血酸溶液清除·OH作用，依上法试验，在加入7.5×10-3mol/L的FeSO4溶液混匀后，分别加入不同浓度本发明多糖溶液、抗坏血酸溶液后再加H2O2，37℃保温1h，测A加样。未损伤管不加H2O2及多糖溶液或抗坏血酸溶液。
·OH清除率为＝[(A加样-A损伤)/(A未损伤-A损伤)]×100％
3)对丙二醛(MDA)含量的影响
与本发明多糖和Vc的作用：本发明多糖液或Vc液各30ul与Fenton试剂作用后的大鼠脑组织匀浆120ul加入到EP管中，充分混匀，放入37℃震荡温育箱(110次/分)中温育1h，控制多糖或Vc液的终浓度均为1mg/mL。
加样：按照试剂盒说明加样，将样品用漩涡混匀器混匀，试管口用保险膜扎紧，95℃水浴80分钟，取出后用流动水冷却，然后，在3500-4000转/分下，离心10分钟，取上清液1mL，用1cm光径比色皿，蒸馏水调零，532nm处，测定各管吸光度值。
MDA含量(nmol/mgProt)由下式进行计算：
注：标准品浓度单位：10nM/mL，蛋白含量的测定单位mgProt/mL
通过O-2·清除率，·OH清除率MDA含量的测定，对仙人掌多糖的抗氧化性能进行测定，并与天然抗氧化剂维生素C(Vc)进行比较。结果见表1～3，其中，表1是实施例1得到的仙人掌多糖清除O-2·的活性；表2是实施例2得到的仙人掌多糖清除·OH的活性；表3是实施例3得到的仙人掌多糖对大鼠脑组织匀浆中MDA含量的影响，多糖或Vc浓度：1mg/mL。
结果显示：多糖OPM2清除O-2·的能力不及Vc，是Vc的1/2～1/3；多糖OPM2清除·OH的能力是Vc的1～2倍；多糖OPM2有明显抑制大鼠脑组织匀浆中MDA形成的作用，与模型对照组比较，具有极显著性差异，与Vc比，有显著性差异。
表1
样品名称样品浓度(ug/mL) 清除率(％) EC50(ug/mL) 多糖OPM2 Vc 200 400 600 800 1000 31.3 44.1 52.2 63.4 72.9 545 210
表2
样品名称 样品浓度(ug/mL) 清除率(％) EC50(ug/mL) 多糖OPM2 Vc 200 300 400 500 600 31.3 44.1 58.2 67.4 79.8 341 419
表3
有效成分 MDA含量(nmol/mgProt) 模型对照组 Vc OPM2 0.35±0.06 0.15±0.02 0.10±0.02*#
*p＜0.01&模型对照组；#p＜0.05& Vc