抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种融合蛋白，尤其是涉及一种抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
胸腺素原α(prothymosinα)是一个小的酸性蛋白，相对分子质量13,000，最初由大鼠的胸腺分离得到。虽然胸腺素是由胸腺分泌的，但在体内许多组织都有胸腺素原α的表达，而且是不含内含子的一种保守的DNA序列。胸腺肽的临床应用始于20世纪70年代中期，其最主要的贡献是对胸腺依赖性疾病的治疗，它对于维持原发性免疫缺陷病，自身免疫疾病和癌症患者的免疫反应性，刺激其特异性淋巴细胞的活性起着主要作用，因此广泛应用于治疗系统性红斑狼疮、白塞氏综合征、类风湿性关节炎、重症感染、支气管哮喘、急慢性肝炎和肿瘤等疾病。另外，由于人类的老化明显地反映胸腺组织的萎缩和功能的衰竭，胸腺肽可以推迟一些老年性疾病的出现，因此应用胸腺肽抗衰老也有着极其广阔的前景。
随着研究的深入，人们已经将研究重点转向胸腺素中的单一肽，以期发现更有效的临床治疗药物。文献表明，胸腺素α原(prothymosinα，ProTα)和Tα1是当前胸腺素研究中的热点。
胸腺素原α的前28个肽(Thymosinα1，Tα1)已有许多实验证明它是一种免疫激素，1984年，Haritos(Haritos A A et al.Proc Natl Acad Sci.USA，1984，81：1008)等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，其N端含已发现的所有胸腺素α，原家族成员的序列，因此命名为胸腺素α原，ProTα是一个小分子蛋白，由109~113个氨基酸残基组成。由111个氨基酸残基组成。人ProTα由109个氨基酸残基组成，它对提高机体免疫力，抗机会感染，促进淋巴细胞的成熟与分化；对IL-2和IL-2R的表达有一定的促进作用；甚至于发现它对肿瘤也有一定治疗作用。
1986年Pan和Haritos(Pan et al.Arch Biochem Biophys 1986；Haritos et al.Proc NatlAcad Sci USA 1986)等发现大鼠ProTA能增强小鼠抗白色念珠菌(Cαndidαα1bicαns)感染的能力，后来又发现ProTα能刺激转移抑制因子(MIF)的释放，其作用比Tα1强10～20倍。
I型糖尿病的重要原因与自身免疫疾病密切相关，其中主要是因为胰岛β细胞受到自身免疫细胞的攻击，造成抗原暴露，引起免疫系统进一步的反应，使得胰岛β细胞大量损失，正常胰岛素的分泌受到影响，血糖升高，形成糖尿病症状。STZ在I型糖尿病模型制备中已经得到广泛应用，大鼠在50mg/kg一次性注射情况下并可以造模成功，而小鼠则在相同剂量经过5次连续注射后基本达到造模目的，目前认为STZ的作用机理是通过使机体产生过量的NO，攻击破坏胰岛β细胞，引起胰岛细胞抗原暴露，激活机体免疫机制，大量巨噬细胞进入胰岛细胞从而加剧胰岛细胞的损伤，最后造成胰岛素分泌减少，引起血糖增高，诱发糖尿病。诱导的小鼠胸腺萎缩，肾脏明显肿大，并且血清抗氧化能力显著下降。
近年来，糖尿病的病因和发病机理研究表明氧化应激与糖尿病的发生和发展密切相关(曹文彬等，抗氧化微量营养素防治糖尿病的研究进展，长春中医药大学学报，2006，22(2)：73-74)，为了防止糖尿病的发生发展，人们对一些具有防治糖尿病作用的天然抗氧化物进行了系统的研究，发现它们通过表达不同的机制与作用环节打断氧化侵袭引致胰岛β细胞损害的恶性循环，从而为天然抗氧化治疗糖尿病提供了一个新的策略。
前胸腺素α原具有调节平衡免疫功能的作用，能够使过激的免疫功能下调，避免自身免疫疾病的发生，同时，最近研究(Malicet，C.，Dagorn，J.C.，Neira，j.l.and Iovanna，J.L.P8and prothymosin alpha：unity is strenthe.Cell cycle，2006，5(8)：829-830)还表明，ProTα与细胞凋亡因子P8能够形成复合体，共同起到抑制细胞凋亡，促进细胞分裂的功能。此外，最近研究(Mallo，G.V.，Fiedler，F.，Calvo，E.L.，Ortiz，E.M.，Vasseur，et al.cloningand expression on the rat p8 cDNA，a new gene pancreas during the acute phase ofpancreatitis，pancreas development，and regeneration，and which promostes celluarproduction.J.Biol.Chem.1997，272(51)：32360-32369)还证明，P8能够刺激胰岛素β细胞细胞增殖，因此，推测ProTα不仅能够保护胰岛细胞避免自身免疫细胞的攻击，同时能够促进胰岛细胞的分裂，从而增加胰岛素的分泌功能。早在20世纪80年代Tabata，T(Tabata，T.，Kinoshita，Y.，Fujin，S.，Hato，F.，et al.pretection by thymosin fraction5 from streptozotocin induce diabetes in mice.Cellular and molecular biology1989，35(2)：121-127)采用从猪的胸腺分离到的肽腺因子进行抵抗STZ诱导的糖尿病的发生，有一定的效果，但所用的是含有多种成分的复合物。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法及其应用。
本发明的技术方案是采用基因工程手段，从健康人获得人ProTαcDNA，并经过重组技术在原核细胞中以可溶性形式得到高效表达，表达量占细菌总蛋白的28％。
本发明所述的一种抗氧化融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分别为：
上游引物P1：5’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P2：5’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，
将上游引物P1引入BamHI酶切位点，将下游引物P2引入EcoR I酶切位点。
2)采用RT-PCR方法获得前胸腺素α原全长基因cDNA，将PCR产物纯化后与pMD18-TVector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，将鉴定的阳性菌液测序。
3)采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对。
4)用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，获得转基因BL21菌株，在LB培养基37℃培养，加入IPTG，37℃诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，沸水浴后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，获得融合蛋白。
上游引物P1和下游引物P2由上海生工公司合成。将鉴定的阳性菌液可送至上海博亚生物公司测序。
在步骤4)中，所述的转化大肠杆菌BL21，获得转基因BL21菌株可经过超声破碎后离心，得上清，将上清经过GST亲和层析柱分离纯化获得高纯度的GST-Proα融合蛋白。所述的在LB培养基37℃培养在培养至OD500nm为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达的时间为5h，菌液离心后的沉淀用等体积的上样缓冲液溶解，沸水浴中10min后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。
本发明所述的一种抗氧化融合蛋白可在制备抗氧化药物以及预防糖尿病药物中的应用。
通过动物体内实验证明该融合蛋白具有增加胸腺指数能力，但在增加胸腺指数方面对于老龄老鼠效果更明显。对于脾脏指数没有发现有统计学上的差异。
在抗氧化能力活性检测中，选择4个月龄，体重在40g以上的老龄老鼠进行实验，通过注射重组融合蛋白，不仅可以显著提高老鼠胸腺指数，同时可以显著提高老鼠抗氧化能力。
通过动物体内实验，证明该融合蛋白具有很好的抵抗STZ诱导的糖尿病的发生，并且能够承受再次STZ的攻击，表现出很好的抵抗糖尿病诱发因素的影响。同时，通过实验发现该融合蛋白不仅能够有效平衡机体免疫系统功能，同时能够提高胸腺指数，提高小鼠糖耐量能力，并且能够增强机体抗氧化功能。这些因素对于抑制由STZ诱导的糖尿病的发生都有重要影响。同时证明该蛋白在抵抗糖尿病的发生中具有重要保护作用，为今后开发糖尿病基因工程潜在药物奠定基础。
胸腺是人体免疫中枢，青年时最发达，但随着年龄的增加，胸腺逐渐萎缩，因而人的免疫功能逐渐减弱，临床上有采用注射胸腺因子来提高病人的免疫功能，此外对于包括系统性红斑狼疮，I型糖尿病等自身免疫性疾病方面胸腺素具有稳定系统免疫功能的作用。其中目前常用的是从动物胸腺中提取的胸腺肽，胸腺肽成分复杂，质量不稳定，因此寻找作用稳定，成分单一的有效胸腺因子作为临床应用是目前的重要热点。目前临床上已经应用的单一组份是合成的胸腺素α1(商品名日达仙，1.6mg 800人民币，意大利进口)，价格昂贵，本发明从中国人外周血中所克隆到的胸腺素原α基因及其蛋白原核表达，采用基因工程手段表达前胸腺素α原蛋白，纯度高，成分一致，并且经过实验效果显著，同时适合于大规模产业化生产。由此可见，本发明所述的融合蛋白可以起到稳定机体免疫功能，增强抗氧化能力，防止I型糖尿病的发生的功效，为今后研制和开发新的基因工程抗氧化药物及应用奠定基础。
【附图说明】
图1为中国人外周血淋巴总RNA电泳图。在图1中，5S，18S，28S代表不同沉降系数的RNA。
图2为本发明实施例检测RT-PCR获得的产物。在图2中，2000bp，1000bp，750bp，500bp，300bp，250bp，100bp分别代表DNA大小，M代表标准DNA。
图3为ProTα的PCR扩增结果。在图3中，1为PCR产物，M代表标准DNA。
图4为质粒PUCT-α限制性酶切分析。在图4中，1：PUCT-α/BamHI+EcoRI双酶切结果(2.6Kb，300bp)；M：标准DNA DL2000(bp)；2：pMD18-T-Vector质粒。
图5为质粒pGEX-ProTα的PCR鉴定结果。在图5中，1、2：PCR产物(300bp)，3：阴性对照，M：M代表标准DNA，DL2000(bp)。
图6为质粒pGEX-α限制性酶切分析。在图6中，1、2：pGEX-α/BamHI+EcoRI(4.9kb，300bp)，M代表标准DNA，DL2000(bp)。
图7为表达载体pGEX-α构建流程图。在图7中，将proT基因克隆到质粒pUCT载体中，并用EcoRI和BamHI双酶切，同时用与之相同的两种酶双酶切载体pEGX6p-1，在T4连接酶作用下连接构建成表达载体，连接产物在Amp+抗性板筛选阳性克隆子。EcoRI，BamHI，XhoI，NotI，SmaI，SalI等代表多克隆酶切位点。
图8为融合蛋白表达SDS-PAGE。在图8中，1.沉淀；2.上清；3.全蛋白；4诱导前对照；5.空载体诱导后；6.空载体诱导前；M蛋白标准；116KDa，66.2KDa，45.0KDa，37KDa，35.0KDa，26KDa，25.0KDa，18.8KDa，14.4KDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。
图9为融合蛋白表达纯化的SDS-PAGE分析。在图9中，1和3为纯化的蛋白；2为空载体诱导前；4为重组载体诱导后上清；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小标准蛋白。
图10为Western blot分析(一抗采用兔抗ProTα)。在图10中，M：小分子量蛋白Maker，1：转化菌株诱导后蛋白；2：纯化后蛋白；3，4分别为阳性和阴性血清杂交结果；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小标准蛋白。
图11为纯化蛋白Western-blot分析(一抗采用兔抗Tα1)。在图11中，M.分子量标准；1.纯化蛋白；2纯化蛋白杂交(一抗为兔抗thymosinα1)，175kDa，83kDa，62kDa，47.5kDa，32.5kDa，25.0kDa，16.5kDa，6.5kDa代表不同分子量大小标准蛋白。
图12为用药组和对照组胸腺指数的差异。在图12中，proT10，proT1，proT0.1，proT0.01分别代表不同浓度proT，STZ代表链脲菌素。
图13为用药组与对照组肾脏指数的比较。在图13中，proT10，proT1，proT0.1，proT0.01分别代表不同浓度proT，STZ代表链脲菌素。
图14为用药组与对照组小鼠在糖耐量实验的比较。在图14中，proT10，proT1，proT0.1，proT0.01分别代表不同浓度proT，STZ代表链脲菌素。
图15为用药组和对照组血糖变化差异比较。在图15中，10，1，0.1，0.01分别代表不同浓度proT，citrate代表柠檬酸，STZ代表链脲菌素。
图16为实验期间各组小鼠体重变化比较。在图16中，10，1，0.1，0.01分别代表不同浓度proT，citrate代表柠檬酸，STZ代表链脲菌素。
图17为用药组对STZ再次抵抗的效果。在图17中，10，1，0.1，0.01分别代表不同浓度proT，STZ代表链脲菌素。
【具体实施方式】
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例所采用的材料与方法说明如下。
1.实验取材和主要分子生物试剂
试验动物为昆明种小鼠，(20±2)g，6-7周龄，雌性，厦门大学医学院实验动物中心提供，合格证号0501452；S180肿瘤种鼠由厦门大学医学院实验动物中心提供。
正常成人外周血来自厦门大学医院体检健康大学生，由厦门大学医院提供。淋巴细胞分离液购自厦门泰京技术有限公司，TRIZOL Reagent试剂盒为Invitrogen公司产品，MMLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工公司，pMD18-T Vector试剂盒、T4 DNA连接酶、DNA标准分子量和Taq DNA聚合酶为TakaRa公司产品，pGEX 6P-1表达载体，大肠杆菌DH5α及BL21均为本申请人保存。
本发明实施例的健康中国人cDNA序列如下。
ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG
2.引物的设计与合成
根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1：5’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’引入BamHI酶切位点，下游引物P2：5’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’引入EcoR I酶切位点。引物由上海生工公司合成。
3.中国人外周血中ProTα基因的RT-PCR扩增
按照参考文献(郭葆玉，余建国，张淑英，等.克隆人胸腺素原αcDNA及RNA二级结构分析和带X a因子的融合表达.第二军医大学学报，2000，21(1)：34-37.)的方法及TRIZOLReagent试剂盒上的说明，常规分离中国人正常成人外周血PBMC，提取总RNA，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。以总RNA为模板按照MMLV第一链cDNA合成试剂盒上的说明进行逆转录反应。PCR反应体系100μl∶10μl逆转录产物，引物P1、P2各50pmol，4种dN TP各0.4mmol/L、Taq DNA酶5U。扩增条件：94℃变性5min，94℃45s、60℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸8min(见图1和2)。
4.PCR产物克隆鉴定与测序
按常规方法将PCR产物纯化后与pMD18-T Vector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，挑取7个单克隆37℃，LB培养基分别培养，用设计的引物进行PCR扩增鉴定重组菌。将鉴定的阳性菌液送至上海博亚生物公司测序。
5.表达载体的构建及原核表达
用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将该基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，LB培养基，37℃培养至OD500nm为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h，菌液离心后沉淀用等体积的上样缓冲液溶解，沸水浴中10min，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳(见图3和4)。
6.表达产物纯化
超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，ProTα-GST融合蛋白的纯化：Glutathione Sepharose 4B预处理：根据谷胱甘肽-琼脂糖4B(Glutathione SepharoseTM4B)操作说明书，按下列程序纯化GST融合蛋白：因每升细菌培养物约需谷胱甘肽-琼脂糖4B 0.5ml，故按0.5ml柱床体积进行(图5)。
1)将谷胱甘肽-琼脂糖4B基质转移至一次性的小柱子；
2)轻扣小柱以去除气泡，然后让谷胱甘肽-琼脂糖4B基质着床；
3)移取底盖，让柱子滴干；
4)加入10倍床体积的1×PBS洗涤，让柱子滴干，重复2次；
5)在基质中每次加入100μl GSTreduction elution buffer洗脱GST融合蛋白。共洗脱四次；
6)收集洗脱液，每次各取5μl用于SDS-PAGE分析。SDS-PAGE[参照分子克隆手册]进行，分离胶和浓缩胶浓度分别为12％和5％；
7)将蛋白置于-20℃保存。
7.重组人前胸腺素原对老龄老鼠抗氧化功能的影响的活性实验(参见表1)。
选择4个月龄，体重在40克以上的老龄雄性昆明老鼠进行实验，分为6个组，每组10只，用药剂量组分别为0.5mg/kg；0.05mg/kg；0.005mg/kg；0.0005mg/kg，此4组每天腹腔注射重组人前胸腺素原融合蛋白0.5ml。另设2个对照组，1个为不注射任何试剂，1组注射相同体积的生理盐水，20天后从眼眶静脉取血，分离血清检测小鼠血清SOD，GSH-Px，MDA活性，检测试剂为南京建成生物技术公司产品。
表1重组胸腺素α原融合蛋白对老龄老鼠抗氧化功能的影响
(x±s，n＝10，重复3次实验)
组别 n SOD GSH-Px MDA 空白组 30 540.02±10.18 293.04±2.47 4.201±0.083 生理盐水组 30 550.12±8.86 240.12±7.10 4.187±0.016 0.0005mg/kg 30 607.02±7.15ab 286.45±7.18ab 3.368±0.015ab 0.005mg/kg 30 667.32±5.15ab 320.19±3.88ab 3.016±0.019ab 0.05mg/kg 30 720.92±10.06ab 388.53±4.69ab 2.748±0.010ab 0.5mg/kg 30 754.20±7.65ab 403.56±4.68ab 2.319±0.021ab
a：与空白组相比；p＜0.01；b：与生理盐水组相比，p＜0.01
8.重组人前胸腺素α原融合蛋白抵抗由STZ诱导的糖尿病实验
事先连续注射ProTα7天后再与空白组一起注射STZ，并连续再注射ProTα7天后停止用药。
选择健康昆明雄性鼠100只，随机分为6组，设计6组试验，其中一组为对照组(10只)(注射生理盐水代替STZ组)，一组为溶剂对照组(10只)(注射柠檬酸溶液组)，一组为空白组(只注射STZ)(10只)，另外4组为用药组，分别注射胸腺素α原(按剂量10μg/每只，1μg/每只，0.1μg/每只，0.01μg/每只)连续注射七天，之后与实验空白组一起同时注射STZ，剂量为50mg/kg，连续注射4天，而后每隔5天称小鼠体重，测血糖一次，并且在实验的20天检测各组小鼠耐糖量实验。整个实验持续25天，最后处死小鼠，解剖小鼠测胸腺重，肾脏和脾脏重，并分别计算其指数。
糖耐量实验按以下公式计算：
AUC＝0.25×(BS value at 0 hour+4×BS value at 0.5 hours+3×BS value at 2 hours)。
脏器指数按以下公式计算：
脏器指数＝内脏各器官重量(mg)/总体重(g)。
本实验所有数据通过SPSS(version 11.0，SPSS Inc.)软件进行分析处理，其结果参见图6～17。
本发明成功地采用基因工程的方法从经过体检健康的成人外周血淋巴细胞中获得前胸腺素原cDNA，并经过重组技术在原核细胞中以可溶性形式得到高效表达，表达量占细菌总蛋白的28％。
采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对，该cDNA序列与已报道的AF257099 ProTα序列存在3个碱基的差异，但是与1984年首次从胸腺中克隆到的基因序列只有84％的同源性。
健康中国人cDNA序列
ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG
上游引物P1：5’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P2：5’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’。