用于快速确定灭菌或消毒处理效果的装置和方法 【发明领域】
本发明涉及用于快速确定医疗装备灭菌或消毒处理效果的装置和方法。
背景
在医院、医师诊所和其他医疗机构中医疗设备使用前要进行灭菌。蒸汽、加热、环氧乙烷和过氧化氢通常被用作灭菌剂。
标准操作为在将在灭菌器内被灭菌的物品装载物中包括无菌指示剂。所述无菌指示剂提供了衡量在特定装载物中对灭菌物品的灭菌处理是否有效的尺度。如果灭菌处理没有效果，如无菌指示剂所指示的，则该设备的装载物将会被拒绝使用。
生物指示剂通常被认做是可靠的无菌指示剂。所述生物指示剂包括已经用孢子或其他微生物接种的载体。在生物指示剂中，因为孢子对灭菌通常比其它微生物有更高的抵抗力，所以孢子常常被用作指示剂生物。
将生物指示剂与将被灭菌的设备一同放在灭菌器中。在灭菌处理的最后，将生物指示剂从灭菌器中取出，并将载体浸没在无菌培养基中。所述培养基和载体在适当的温度下温育预定时间。在温育时间段的最后，确定在该生长培养基中是否有任何微生物生长。如果在该生长培养基中没有微生物的生长，则可以认为在灭菌器中的设备已经被彻底地灭菌。如果发现有微生物生长，则该灭菌处理是无效的，而且灭菌器内的所述物品将被拒绝使用。
微生物的生长可以通过诸如生长培养基内产生浑浊的迹象或由于培养基中细胞生长的副产品所产生的pH改变而造成pH指示剂颜色改变的迹象来确定。例如，在Bumham等人(U.S.专利No.5,552,320)和Hendricks等人(U.S.专利No.6,436,659)中描述了生物指示剂，在此引入两者的全文作为参考。
虽然生物指示剂对于灭菌周期的效果来说是精确的指示剂，但是从生物指示剂获得结果需要至少24-48小时。受到灭菌处理的装置有时被隔离直到从生物指示剂得到结果为止。医疗装备是昂贵的并且医疗机构的存储空间是有限的。因此一些医院在获得结果前就使用该装备。存储隔离的医疗装备不是对资源的有效利用。因此需求用于确定灭菌处理效果的快速测试。
Foltz等人(U.S.专利No.6,355,448)描述了通过测量酶而非孢子的失活来确定灭菌处理效果的方法。其宣称酶测试过程仅需要几分钟而不像从生物指示剂获得结果那样需要几天。
例如，Burnham等人在U.S.专利No.5,486,459中和Hendricks等人在U.S.专利No.6,528,277中公开了多种酶而非一种酶的使用。人们相信多种酶比一种酶能更好地模仿微生物对灭菌处理的响应。然而，酶与灭菌处理的反应可能与孢子或细菌不同。
Feltner等人(U.S.2003/0064427)描述了通过在灭菌处理期间测量所释放的吡啶二羧酸(DPA)的量来快速确定灭菌处理效果的方法。在灭菌处理中通常用作指示剂生物的孢子包含大约10-15重量％的DPA。DPA通常以吡啶二羧酸钙(calcium dipicolinate)的形式存在于孢子的皮层和外壳中。Feltner等人发现当孢子失活时，DPA从孢子释放出来。
Feltner等人通过在大约545nm波长的光谱分析或借助于导数紫外线光谱分析确定出在包围孢子的溶液中DPA的浓度。通过加入镧系元素盐并通过使用紫外线来激发及使用可见光来发射可以增加分析的灵敏度。
Feltner的分析方法需要昂贵的仪器和复杂的数据分析。没有给出探测的极限。
因此需求一种无需昂贵的仪器和复杂数据分析方法就能快速测量灭菌效果的方法。
发明概述
本发明的一个方面涉及用于确定灭菌或消毒处理效果的方法。该方法包括提供含有初始已知数目的活体孢子的生物指示剂，其中活体孢子包含选自钙、锰、镁、钾和钠的至少一种无机物。该方法还包括将生物指示剂暴露在灭菌或消毒处理中，因此杀死至少一部分活体孢子，从而产生一些死孢子。
该方法进一步包括将死孢子与水接触以产生水溶液，该水溶液含有至少一种选自从死孢子释放的钙、锰、镁、钾和钠的无机物，测量与水溶液中至少一种无机物浓度相关的参数，其中在测量之前进行接触。该方法还包括从所述参数和生物指示剂中活体孢子的初始已知数目来确定灭菌或消毒处理的效果。
有利地，用选自原子吸收、火焰发射、ICP、离子色谱法、EDTA滴定、络合滴定、带有至少一种离子的荧光染料指示剂络合物的光谱分析和导电率的一种方法测量参数。优选地，通过测量水溶液的导电率来测量参数。
在实施方案中，从参数确定灭菌或消毒处理的效果包括通过比较水溶液的导电率与导电率对大量死孢子关系的校准曲线来确定死孢子的数目并从死孢子的数目和活体孢子的初始数目来计算效果。有利地，灭菌或消毒选自加热、蒸汽、过氧化氢、过乙酸、环氧乙烷、臭氧、二氧化氯、紫外线和辐射。
在实施方案中，所述接触发生在所述暴露之前。有利地，将死孢子与水接触包括通过打碎安瓿将水从可打碎的安瓿释放出来，而在另一个实施方案中，所述接触是在所述暴露之后。有利地，活体孢子的初始已知数目是至少大约1.0×106个孢子。有利地，活体孢子的初始已知数目是至少大约1.0×107个孢子。该方法还包括在测量和证实灭菌或消毒效果后在生长培养基中培养孢子并确定在生长培养基中指示剂是否发生改变。
本发明另一方面涉及用于确定灭菌或消毒处理效果的生物指示剂。该生物指示剂包含已知数目的活体孢子、包含已知数目活体孢子的小瓶和可打碎的包含蒸馏水或去离子水的安瓿。打碎安瓿将水与小瓶中的孢子接触。
该小瓶还可在小瓶内包括透气性窗口，此处的透气性窗口允许灭菌剂或消毒剂进入小瓶内部，从而使灭菌剂或消毒剂与活体孢子接触。优选地，生物指示剂还可包括支撑孢子的多孔基质。而在另一个实施方案中，生物指示剂还可包括含有生长培养基的第二安瓿。
本发明的另一方面涉及一种生物指示剂，该生物指示剂包含已知数目的活体孢子、包含孢子的小瓶、包含含有水的溶液的可打碎的安瓿，此处打碎安瓿将水与小瓶内的孢子接触。该生物指示剂还包括从小瓶的外部伸入到小瓶的内部的探针，在此该探针在打碎安瓿后接触到小瓶中的水。
有利地，含有水的溶液选自培养基、去离子水和蒸馏水。优选地，所述探针是电极。在实施方案中，生物指示剂还包括小瓶内的透气性窗口，此处透气性窗口允许灭菌剂或消毒剂进入所述小瓶的内部，从而使灭菌剂或消毒剂与活体孢子接触。优选地，生物指示剂还包括含有生长培养基的第二安瓿。
附图简述
图1是根据本发明实施方案的带有探针的电导生物指示剂的示意图；
图2是根据本发明实施方案的不带有探针的电导生物指示剂的示意图；和
图3是以μS/cm为单位的导电率对大量死孢子的关系的图。
发明详述
当在杀菌处理中对医疗装备进行灭菌或消毒时，重要的是能够快速确定杀菌处理是否有效。如此处所用的，术语杀菌处理包括灭菌和消毒两者。
本发明的实施方案提供了用于快速确定杀菌处理效果的装置和方法。所述装置和方法的一些实施方案可在灭菌装置内实施，从而提供了在进行杀菌处理时用于监控杀菌处理效果的装置和方法。与从传统生物指示剂获得结果需要24-48小时相比，该方法的一些实施方案可以快速进行，例如，大约一分钟。
细菌孢子包含诸如钙、锰、镁、钾和钠的无机物。当孢子失活时，至少所述无机物的一部分可从孢子释放。在实施方案中，通过测量一个参数可确定在杀菌处理期间所杀死的孢子数目，该参数与孢子死亡后释放到包围生物指示剂中孢子的水溶液中的至少一种无机物的浓度相关。该无机物可以是钙、锰、镁、钾、钠或任何其他适合的无机物。
从与包围孢子的溶液中的无机物浓度有关的参数可确定在生物指示剂中死孢子的数目。通过比较死孢子的数目与在生物指示剂中初始引入的活体孢子的数目可确定杀菌处理的效果。在一些实施方案中，杀菌处理的效果可在杀菌处理中的任意时刻来确定。
在已经确定了杀菌处理的效果后，通过在生物指示剂内生长培养基中培养微生物或孢子，并且通过用指示剂，例如pH指示剂或其他合适的指示剂确定生长培养基中参数的改变来确定是否发生生长，由此证实杀菌处理的效果。
在已经确定了灭菌或消毒处理效果后，可将该生长培养基引入生物指示剂中。在可选择的实施方案中，在确定了灭菌或消毒处理效果之前，生长培养基可存在于该生物指示剂中。
在实施方案中，该生长培养基可包含在生物指示剂中的可压碎的安瓿内，并且通过压碎所述可压碎的安瓿将该生长培养基释放到生物指示剂中。第二可压碎的安瓿可包含水或者水溶液。通过压碎第二安瓿，可将所述水或者水溶液释放到生物指示剂中。
第二可压碎的安瓿内的水或者水溶液可溶解死孢子中的无机物。可以确定与水溶液中无机物浓度相关的参数，所述水溶液通过在由压碎第二可压碎的安瓿所释放出来的水或者水溶液中溶解来自死孢子的无机物而获得。从该参数和生物指示剂中初始已知数目的活体孢子司确定灭菌或者消毒处理的效果。
当在通过压碎包含生长培养基的可压碎的安瓿而获得的生长培养基中培养微生物或孢子时，通过确定是否发生微生物或孢子的生长可证实灭菌或消毒处理的效果。
确定在生长培养基中是否发生微生物或孢子的生长可证实由与水溶液中无机物浓度相关的参数所得到的灭菌或消毒效果，该水溶液通过压碎包含水或水溶液的第二可压碎的安瓿而获得。
可用如下面更详细描述的各种方法进行与生物指示剂中水溶液内无机物浓度相关的参数的测量。一些合适的方法包括但不限于原子吸收、火焰发射、ICP、离子色谱法、EDTA滴定、络合滴定、带有无机物离子的荧光染料指示剂络合物的光谱分析和导电率。其他方法也可能是合适的。
测量与生物指示剂中水溶液内无机物浓度相关的参数比光谱法测量DPA浓度具有更多的优势，如Feltner等人所教导的。用Feltner等人的方法进行数据分析是复杂的。分析中所用的装备是昂贵的。而且，很难在灭菌装置内部进行DPA分析，因为光谱装备体积庞大并对化学制剂灵敏。
根据本发明实施方案的方法从确定与生物指示剂中水溶液内所溶解的无机物浓度相关的参数进行数据分析通常是直截了当的。分析所溶解无机物的许多方法使用并不昂贵的装备。一些分析方法可在灭菌装置内进行。许多分析方法可快速的，在几分钟之内进行。许多所述方法的探测极限是非常低的。
虽然在STERRAD处理中用过氧化氢和等离子体的组合进行灭菌的情形中进行了描述，所述STERRAD处理通常可从Advanced Sterilization Products ofIrvine，California商业获得，但是根据本发明实施方案的装置和方法可用于各种杀菌处理。诸如用过氧化氢和等离子体通过STERRAD处理灭菌或消毒的杀菌处理的描述仅是起说明作用的而并不意味着限定。根据本发明实施方案的装置和方法可用于各种杀菌剂，包括但不限于加热、蒸汽、过氧化氢、过乙酸、环氧乙烷、臭氧、二氧化氯、紫外线或辐射，例如，使用或者不使用等离子体的γ辐射。
所述杀菌剂可是物理杀菌剂或化学杀菌剂。物理杀菌剂通过物理方法，例如加热、蒸汽、紫外线或辐射杀死微生物。化学杀菌剂通过将微生物暴露在对微生物来说是致命的化学制剂，例如过氧化氢、过乙酸、环氧乙烷、臭氧或氯中来杀死微生物。等离子体可被认为或者是物理杀菌剂或者是化学杀菌剂。等离子体可直接杀死微生物，或者等离子体可与化学制剂，例如过氧化氢反应以产生能杀死微生物的试剂。如果杀菌剂是化学的，则化学杀菌剂可以是液体、蒸汽或者气体。
STERRAD处理是灭菌或者消毒处理的示例性实施方案。STERRAD处理详细描述在，例如，U.S.专利No.4,756,882、U.S.专利No.6,325,972以及U.S.专利No.6,365,102中，在此引入上述全文作为参考。
STERRAD灭菌处理用以下方式进行。把需要灭菌的物品放在灭菌室内，关闭该室，并抽真空。注射过氧化氢水溶液并在该室内汽化，从而使得其包围需要灭菌的物品。在降低灭菌室内的压力后，通过施加射频能量产生电场来启动低温气体等离子体。过氧化氢蒸汽在等离子体中分离成活性种类，其与微生物碰撞、反应并杀死微生物。在这些活化组分与生物反应或彼此反应之后，它们失去其高能量并再次结合形成氧、水和其他非毒性副产品。维持等离子体足够长的时间以完成灭菌并去除残留物。在处理完成时，关闭RF能量，释放真空并且通过把高效微粒过滤的空气(High Efficiency，Particulate-Filtered Air)(HEPA)引入该室将该室返回到大气压。等离子体还可由低频电源产生，例如，如在U.S.专利No.6,447,719中所述的，在此引入其全文作为参考。
根据本发明实施方案的装置和方法通常不依赖于用在杀菌处理中的杀菌剂的形式。因此该装置和方法的实施方案在广泛范围的杀菌处理中有广泛的应用。
表1显示了三种不同生物中的无机物浓度。表1中的数据来自G.B.Bender和R.E.Marquis的Applied and Environmental Microbiology 50，1414(1985)的文章。
表1
各种生物的无机物含量
(干重μmol/mg)
生物 Ca Mn Mg K Na 巨大芽孢杆菌(B.megaterium) ATCC19213 0.45 0.16 0.15 0.1 0.15 枯草芽孢杆菌黑色亚种(B.subtilis niger) 0.42 0.99 0.3 0.28 0.18 嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus) ATCC7953 0.74 0.08 0.11 0.02 0.05
生物干重的大约10％是吡啶二羧酸。
可用各种方法测量包围生物指示剂中孢子的水溶液内所溶解的无机物离子。所溶解的无机物可以是，例如钙、锰、镁、钾和钠，尽管也可测量含有其他无机物的微生物中的其他无机物。
在下面提供了对于一些用于溶解的无机物离子的分析方法的探测极限。该探测极限被认为是2005年普遍认可的。该探测极限会随着仪器和分析方法的改进而降低。该探测极限并不意味着限定的意思并且仅为便于指导溶解的无机物离子的适当分析方法的初级筛选而提供。
在实施方案中，至少一种生物指示剂内水溶液中的钙、锰、镁、钾和钠可通过原子吸收或火焰反射进行分析。例如在Official Methods of AOACIntemational(2000)17thEd.AOAC INTERNATIONAL，Gaithersburg，MD，OfficialMethods 965.09，968.08，085.35中描述了通过原子吸收进行的分析。通过原子吸收分析钙的EPA方法是方法215.1。对于镁、钾、钠和锰的对应EPA方法分别是方法242.1、258.1、273.1、243.1。在EPA方法中提供的探测极限对于钙是0.01mg/L、对于锰是0.01mg/L、对于钠是0.002mg/L、对于镁是0.001mg/L和对于钾是0.01mg/L。随着时间的流逝该探测极限会发生改变。
在可选择的实施方案中，水溶液中至少一种钙、锰、镁、钾或钠可通过ICP(感应耦合等离子体)分析来进行分析。通过ICP分析对钙、锰、镁或钠的分析可包括各种检测方法。用于此处的术语ICP包括所有的ICP探测方法。
例如，在NIOSH Manual of Analytical Methods(NMAM，Fourth Edition，March 15，2003，Method 7303中描述了一种适当的ICP方法。方法7303(Method7303)中描述的实施方案使用感应耦合氩等离子体，原子发射光谱法(ICP-AES)方法，EPA方法200.7。
ICP-AES有时被称为ICP-OES，或感应耦合氩等离子体，发射光谱学。感应耦合氩等离子体可简写为ICAP。ICP-AES、ICAP-AES、ICP-OES和ICAP-OES是用于相同方法的，感应耦合氩等离子体，原子发射光谱法的不同缩写。
Agnes Cosnier等人在ICP发射光谱学应用注释40(ICP Optical EmissionSpectroscopy Application Note 40)，Jobin Yvon Inc.of Edison，NJ中对各种离子提供了一般的探测极限。Jobin Yvon Inc.是Horiba Group的成员。
根据Cosnier等人，对于钙、镁、锰、钠和钾各自的EPA200.7(ICP-AES)一般探测极限分别是30μg/L、30μg/L、1.4μg/L、29μg/L和700μg/L。
在可选择的实施方案中可应用其他ICP探测方法。例如，质谱分析法可用作ICP探测方法。使用质谱分析法作为探测方法的用于ICP的EPA方法是方法200.8，感应耦合等离子体—质谱分析法或ICP-MS。在用于ICP-MS的方法200.8中列举了锰作为分析物。根据水和废水检测标准方法委员会(StandardMethods Committee for the Examination of Water and Wastewater)，即使镁、钠和钾没有作为分析物被具体地在方法中列出，通过ICP-MS也可分析它们。见，例如，www.standardmethods.org。
根据Research & Productivity Council of Fredericton，NB，加拿大，由ICP-MS分析的钙、镁、锰、钠和钾各自的含水样品报告极限分别是50μg/L、10μg/L、1μg/L、20μg/L和40μg/L。
在其他实施方案中可使用其他ICP探测方法。
在可选择的实施方案中，通过离子色谱法可分离并分析水溶液中的钙、镁、锰、钠或钾。例如，在由Alltech Associates，Inc.，2051 Waukegan Road，Deerfield，Illinois 60015-1899提出的Application Notes#A0009和A0012或在由DionexCorporation，1228 Titan Way，Sunnyvale，California 94088-3603提出的ApplicationNote 120中描述了适当的离子色谱法。
而在另一实施方案中，如上所述，例如在ASTM方法D511-93A中，可用EDTA滴定分析钙，及可通过络合滴定分析方法分析镁。
根据水和废水检测标准方法委员会，当样品含有磷的水平大于50mg/L时，通过EDTA滴定确定钙的指示剂中会有干扰。对这种样品该委员会不推荐使用EDTA滴定方法。
孢子通常不含有高达50mg/L的磷的水平。一些生物指示剂可能包括基于磷酸盐的缓冲剂。包括磷酸盐缓冲剂的生物指示剂含有磷酸盐的水平可高于50mg/L。
在另一实施方案中，可使用荧光染料指示剂作为探针通过光谱分析测量钙或镁的浓度。无机物离子钙、镁、钠和钾离子不会自然地发荧光。可通过形成离子与荧光指示剂分子的络合物来测量无机物离子的浓度。通过光谱分析方法，例如荧光光谱学可确定离子和荧光指示剂分子的络合物的浓度。
在十九世纪八十年代Tsien和同事们制造了各种适当的荧光指示剂。A.Takahashi，P.Camacho，J.D.Lechleiter和B.Herman在Physiological Reviews，79，1089(1999)上的一篇文章提供了对关于荧光染料指示剂，包括Tsien等人的指示剂的综述和文章的参考。
Takahashi等人将荧光指示剂区分为紫外线激发指示剂(UV-excitableindicators)或可见光激发指示剂(visible-excitable indicators)。紫外线激发指示剂的一些例子包括，例如，quin 2、indo 1、fura 2、indo 1FF、fura 2FF、fura PE2、indo PE3、bis-fura 2、C18-fura 2、FFT18和FIP 18。许多荧光染料指示剂对钙有高亲和力。Mag-indo 1、mag-fura 2和mag-fura 5是对镁而非钙具有高亲和力的紫外线激发指示剂的例子。
一些可见光波长激发指示剂(visible-wavelength-excitable indicators)包括，例如，fluo 3、calcium green、Oregon green BAPTA、calcium orange、calciumcrimson、fura red、rhod 2、calcium green C18和fura-indoline-C18。
荧光指示剂也可被分为非比率指示剂(nonratiometic indicators)或比率指示剂(ratiometic indicators)。不论指示剂是否与离子络合，非比率指示剂激发和发射的波长都是相同的。相反，当指示剂与Ca+2或其他离子络合时，比率指示剂激发或发射的光谱的波长会发生偏移。
Fura 2是当结合钙时在激发光谱发生偏移的比率指示剂的例子。当没有钙存在时，fura 2激发的最大值是372nm。当fura 2结合钙时激发的最大值偏移到340nm。
不论是否与离子络合，fura 2的荧光发射都是在510nm处。当fura 2与离子络合时，激发最大值而非荧光发射的最大值发生偏移。
对于一些比率指示剂，当指示剂结合离子时荧光最大值而非发射最大值会偏移。例如，比率指示剂indo 1作为游离染料具有472nm的发射最大值。当indo1与钙络合时，indo 1的发射最大值从472nm偏移到400nm。
使用比率指示剂而非非比率指示剂分析无机物离子会有优势。对于比率指示剂来说结合离子的染料和无离子染料的荧光强度比率不依赖于指示剂的浓度和光程长度。由于暴露给激发源而造成比率指示剂的降解不会影响结合染料和游离染料强度的比率。确定结合比率指示剂的钙离子或其他适当离子的浓度不依赖于染料负载、细胞厚度、染料降解、激发源强度、染料光漂白、探测器效率和其他变量。
在实施方案中，在包围生物指示剂内孢子的水溶液中诸如钙、镁、钾、钠或锰的无机物离子浓度可通过无机物离子与荧光染料指示剂的络合物的光谱测定来确定。在实施方案中，荧光染料指示剂可以是比率指示剂。在实施方案中，使用荧光光谱学可进行络合物的光谱测定。其他光谱方法也是合适的。
在另一实施方案中，无机物离子，例如钙、镁、钾、钠或锰的浓度可用离子灵敏电极来确定。通过将离子络合剂结合到亲脂膜中可制备离子灵敏电极。离子特异性电极中的膜将样品溶液从包含已知离子浓度的参考溶液中分离出来。通过使用Nemst方程式从样品溶液和参考溶液之间的电势差可确定出样品溶液中的离子浓度。
例如，钙选择电极在商业上可从Fluka and Riedel-de Haёn(其是Sigma-Aldrich公司族的一部分)以Calcium Ionophore Selectrophore获得，从ThermoElectron Corporation以Orion ion-plus钙电极获得或从Radiometer Analytical SAS以ISE25Ca获得。其他钙选择电极也适用。
对于其他离子在商业上存在类似的离子特异性电极。
如Takabasbi等人在文章中所提到的，用钙选择电极所测量的钙浓度的范围宽于用荧光染料指示剂所测量的钙浓度的范围。钙选择电极的pCa是pCa 9到pCa 1，与之对比的，例如，indo 1荧光染料的pCa是pCa 7.5到pCa 5。根据Radiometer Analytical SAS目录(存在于www.radiometer-analytical.com)，Radiometer Analytical ISE25Ca电极具有10-6到100M Ca的范围。其他钙特异性电极可能有不同的范围。然而，Takahashi等人声称钙选择电极的响应时间比荧光指示剂的响应时间要慢。
在示例性实施方案中，溶解的无机物，例如钙、镁、钾、钠或锰的浓度可通过测量包围生物指示剂中孢子的水溶液的导电率来确定。诸如钙、镁、钾、钠或锰的离子导电。当所溶解的无机物离子浓度增加时，水溶液的导电率也增加。
在实施方案中，制备包含各种离子浓度的水溶液，测量溶液的导电率，并可制作出离子浓度对导电率关系的校准曲线。接着通过测量溶液的导电率及使用离子浓度对导电率关系的校准曲线将水溶液的导电率与离子浓度进行关联可确定水溶液中的离子浓度。
在另一实施方案中，可产生死孢子数目对导电率关系的校准曲线，如以下实施例1所示。例如，通过测量包围生物指示剂中孢子的水溶液的导电率及通过校准曲线将该导电率与死孢子数目关联可确定生物指示剂内水溶液中死孢子的数目。
例如，可用导电率计测量溶液的导电率。其他用于测量溶液导电率的仪器也是适合的。
生物指示剂
用于确定生物指示剂内水溶液导电率的适当装置或设备的例子显示在图1中。图1的装置或成套工具仅是能用于确定导电率的一种形式的装置。用于确定导电率的其他形式的装置也是适合的。
如图1所示，电导生物指示剂10可包括具有透气性窗口30的小瓶20。在实施方案中，透气性窗口30可包括能透过杀菌剂的材料，例如TYVEK，其为DuPont为纺丝(spun)聚乙烯注册的商标。其他透气性膜也是适合的。在其他实施方案中，在小瓶20内透气性窗口30可包括无遮盖的开口。在另一个实施方案中，透气性窗口30可包括针孔，即一种开口足够小以致液体都不会从生物指示剂10中漏出。当辐射或紫外线被用作灭菌剂或消毒剂时，生物指示剂10不包括透气性窗口30。在实施方案中，小瓶20可包括完全封闭该小瓶的盖子。
探针40从小瓶20的外部伸入小瓶20的内部。小瓶20含有初始数目的孢子50。探针40通常可包括导电金属，例如铂或铜。探针40可包括例如金属丝、平板或条棒。探针40的一部分可用保护性涂层，例如塑料涂覆。保护性涂层可减少杀菌剂与探针40的反应量。探针40可包括电极。
初始数目的孢子50可通过本领域技术人员已知的标准方法进行测定。孢子50可是任何合适的孢子。表1的孢子，巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色亚种和嗜热脂肪芽孢杆菌都是适合的。孢子50可包括，例如选自钙、锰、镁、钾和钠的至少一种无机物。其他孢子可包括其他的无机物。
在实施方案中，孢子50可以干孢子的形式存在。在可选择的实施方案中，孢子50可支撑在多孔基质上，例如多孔玻璃圆盘上。
电导生物指示剂10包括可压碎的安瓿60。可压碎的安瓿60可由易碎的材料，例如玻璃制成。可压碎的安瓿60包含水溶液。可压碎的安瓿60可以是任何当压碎该可压碎的安瓿时允许水溶液从可压碎的安瓿60泄出的可打碎的外壳。该水溶液可包括任何合适的水溶液，例如去离子水、蒸馏水或孢子50的生长培养基。在其他实施方案中，水溶液可包括与无机物离子反应的化学制剂或不含有待测无机物的水溶液。在实施方案中，生物指示剂10可进一步包括含有生长培养基的第二可压碎的安瓿(未示出)。
透气性窗口30显示在图1中小瓶20的顶部。在小瓶20中的其他位置也是适合的。
在实施方案中，小瓶20由可变形的材料，例如聚丙烯制成。
生物指示剂的可选实施方案
图2示出了生物指示剂10的可选实施方案。图2的生物指示剂10的实施方案与图1的电导生物指示剂10的实施方案类似。与图1中所示的实施方案不同，图2的生物指示剂不包括探针40。与无机物浓度相关的参数可用各种方法测定。图2的生物指示剂10的可压碎的安瓿60包含水，例如去离子水或蒸馏水。在另外的实施方案中，该水溶液可包括与无机物离子反应的化学制剂或不含待测无机物的水溶液。图2所示的生物指示剂10的实施方案中可压碎的安瓿60内的水不支持微生物的生长。
图2的生物指示剂可进一步包括含有生长培养基的第二可压碎的安瓿(未示出)。
利用图1的电导生物指示剂确定杀菌处理完全的方法
将图1中所示的电导生物指示剂10放置在灭菌装置中，并运行一个杀菌周期。在上述杀菌周期期间杀菌剂通过透气性窗口30可进入小瓶20中。杀菌剂可接触孢子50，从而杀死封闭在小瓶20内的至少一部分孢子50。
在上述杀菌周期结束后，包含在可压碎的安瓿60内的水溶液通过压碎该可压碎的安瓿60而释放出来。可以任何适当的方式压碎该可压碎的安瓿60。例如，将小瓶20变形。如果将小瓶20变形，小瓶20的壁可接触到可压碎的安瓿60，从而压碎可压碎的安瓿60。
压碎该可压碎的安瓿60释放可压碎的安瓿内所含的水溶液。该水溶液可接触小瓶20内的孢子50。将孢子50与可压碎的安瓿60内所含的水溶液接触可溶解包含在孢子内的无机物，从而形成包含无机物的水溶液。该溶解的无机物的水溶液可接触探针40。
导电率计或其他适合的用于测量导电率的装置可连接到探针40以测量小瓶20内水溶液的导电率。如实施例1中的表2和图2所示，当小瓶20内死孢子的数目增加时，封闭在小瓶20内的水的导电率增加。水溶液增加的导电率与所溶解的无机物，例如钙、镁、钠或钾的增加的浓度相关，所述无机物在孢子被杀菌剂杀死时从孢子中释放出来。
通过将死孢子的数目与电导生物指示剂10内活体孢子的初始数目相比较，可将小瓶20中的水所增加的导电率与杀菌处理的效果相关联，其中所述死孢子的数目由电导生物指示剂10内水溶液的导电率来确定。
金属丝(未示出)可连接到自持生物指示剂10上的电极40以将封闭在小瓶20内的水溶液的导电率传递到导电率计或用于测量水溶液导电率的其他合适的装置上。在实施方案中，金属丝可穿过灭菌装置的壁，从而使得当杀菌处理正在进行时或杀菌处理结束之后可从该灭菌装置的外部测量导电率结果。关于图1的电导生物指示剂的导电率结果可从灭菌或杀菌处理装置的内部或外部来测量。
利用图2的生物指示剂确定杀菌处理完全的方法
用图2的生物指示剂10来确定杀菌处理完全的方法通常类似于图1的电导生物指示剂10的方法。在灭菌装置或杀菌处理装置中可放入图2的生物指示剂10，并运行一个杀菌周期。在上述杀菌周期期间杀菌剂可通过透气性窗口30进入小瓶20。杀菌剂可接触孢子50，从而杀死封闭在小瓶20内的至少一部分孢子50。杀死孢子50可释放孢子50中包含的无机物。
在上述杀菌周期结束后，包含在可压碎的安瓿60内的水通过压碎该可压碎的安瓿60而释放出来。可用任何适当的方式压碎该可压碎的安瓿60。例如，将小瓶20变形。将小瓶20变形可将小瓶20的壁接触可压碎的安瓿60，从而压碎该可压碎的安瓿60。可在灭菌装置或杀菌处理装置内部或者在该装置的外部压碎图2生物指示剂10的实施方案的可压碎的安瓿60。
压碎该可压碎的安瓿60释放可压碎的安瓿内所含的水。该水可接触小瓶20内所含的孢子50。将孢子50与可压碎的安瓿60内所含的水接触溶解孢子内所含的无机物，从而形成水溶液，该水溶液包括当小瓶20内的孢子50被杀死后所释放的无机物。可用任何适当的方法探测水溶液中的无机物。描述了通过导电率进行的确定来阐明该方法。
探针(未示出)可插入包括小瓶20内所溶解无机物的水溶液中。小瓶20内水溶液的导电率可用任何适当的测量装置，例如导电率计进行测定。因为探针从装置的外部插入小瓶内，所以在灭菌装置或杀菌装置外部进行图2的电导生物指示剂10的导电率的确定。
例如，可穿过透气性窗口30插入探针。可选择地，为了将探针插入图2电导生物指示剂10的小瓶20内的水溶液中，可至少是暂时地去除小瓶20的一部分。
以与以前对图1电导生物指示剂10所描述的方法相类似的方式从图2电导生物指示剂10的小瓶20内水溶液的导电率来确定杀菌处理的效果。
导电率计的成本是非常低的。而诸如Felkner等人的导数紫外分光光度计的仪器成本是非常高的。测量溶液的导电率非常快速，少于一分钟，远远快于从生物指示剂获得灭菌结果所需的1-2天。
如实施例1的表2和图2中的数据所示，水溶液的导电率对死孢子的数目非常灵敏。导电率从当存在8.2×106个死孢子时的1.15μS/cm增加到当存在8.2×107个死孢子时的3.36μS/cm。当从8.2×106个死孢子变到8.2×107个死孢子时，2μS/cm的导电率改变是很容易辨别的。随着死孢子的数目增加，生物指示剂内的水溶液的导电率明显改变。
实施例1中所用的去离子水具有0.90μS/cm的导电率。实施例1中所测量的总导电率范围为从对于包含1.6×104个死孢子的样品的0.90μS/cm到对于包含1.6×109个死孢子的样品的50.10μS/cm。包含8.2×104或者更少孢子的样品的导电率与去离子水的导电率是相同的。
通过诸如反渗透的方法可降低水的导电率。降低电导生物指示剂中所用水的导电率能减少导电率确定中的“噪声”，从而增加通过导电率测量确定生物指示剂中死孢子数目的灵敏度。
如以前所述，通过广泛的各种方法可确定与生物指示剂内水溶液中无机物离子浓度相关的参数。确定生物指示剂内所含水溶液的导电率的实施方案是示例性的实施方案。用于确定与水溶液中无机物离子浓度相关的参数的其他方法也是适合的。
以下实施例仅意味着说明作用并不意味着对范围的限定。
实施例
实施例1
导电率对孢子数目关系的确定。
确定包含各种群体的活体嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的水溶液的导电率。不管活体孢子的群体如何，该水溶液的导电率都大约是0.89μS/cm。无菌去离子水也具有0.89μS/cm的导电率。因此活体孢子对水溶液的导电率没有任何显著的影响。在以下表2的所有例子中由活体孢子和去离子水所引起的导电率均被报道为0.90μS/cm。
各种数目的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子被放置在多孔玻璃基质上。所述基质和孢子在Sterrad100S灭菌器中用过氧化氢/等离子体进行处理，Sterrad100S灭菌器商业上可从Advanced Sterilization Systems，Irvine，Califomia处获得。在实验条件下将多孔玻璃基质上的所有孢子杀死。将去离子水加入到玻璃基质中，并测定溶液的导电率。结果显示在下面表2中。图3以图形显示了导电率对死孢子数目关系图的数据。
表2
溶液导电率对死孢子数目的关系
孢子数目 导电率(μS/cm) 活体孢子和DI 暴露后的死孢子 1.6×109 0.90 50.10 8.2×108 0.90 25.50 8.2×107 0.90 3.36 8.2×106 0.90 1.15 8.2×105 0.90 0.92 8.2×104 0.90 0.90 1.6×104 0.90 0.90
包含8.2×106个死孢子的水悬浮液的导电率为1.15μS/cm，而包含1.6×109个死孢子的水悬浮液的导电率为50.10μS/cm。因此包含8.2×106个死孢子的水悬浮液与具有1.6×109个死孢子的悬浮液很容易区分开来。
包含8.2×105个死孢子的水悬浮液具有0.92μS/cm的导电率，与包含8.2×104个死孢子的水悬浮液的0.90μS/cm的导电率不易区分。
如表2中的数据所示，在灭菌后1.15μS/cm的导电率暗示了在灭菌期间至少杀死了8.2×106个孢子。在实施方案中，在生物指示剂中使用至少大约1.0×106个孢子。灭菌后水溶液中大约1.15μS/cm的导电率暗示杀死了至少8.2×106个孢子。
当电导生物指示剂内水溶液的导电率为至少1.15μS/cm时，利用生物指示剂中大量活体孢子可提供已经实现有效灭菌的更高程度的保证。在实施方案中，电导生物指示剂内的活体孢子初始数目是至少大约1.0×107个活体孢子。使用大量的活体孢子提供了杀菌处理已经有效的更高保证。
如果使用具有低导电率的水来制备加入到生物指示剂中的死孢子中的水溶液，则可能测量到比表2中所示的导电率值更低的导电率值。例如，通过使用反渗透可制备具有更低导电率的水。
在不脱离本发明范围和精神下，本发明的各种修改和变更对本领域的技术人员来说是显然的。应该理解的是本发明并不限于公开于此的实施方案，并且应当像现有技术所允许的那样宽泛地来解释权利要求。