一种Α葡萄糖苷酶抑剂蕨麻提取物及其提取方法.pdf

本发明公开了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂——蕨麻提取物。经体外实验以拜唐苹为阳性对照，观察蕨麻三种提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响、有效成分鉴定以及其水提取物和流浸膏的动力学类型分析。体内实验以正常小鼠为实验对象，用2.5g(蕨麻生药)+淀粉3g/kg剂量灌胃，鼠尾尖取血，测定血糖值，观察其水提取物对其淀粉耐量的影响。结果表明，蕨麻三种提取物对α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制作用，呈量效关系，其中水提物抑制效果较流浸膏、多糖明显。水提取物和流浸膏的动力学类型均为竞争性抑制。其多糖为淀粉型，其流浸膏可能含有羟基黄酮苷类物质。体内实验证明其水提物在餐后1小时有降低血糖的趋势。

权利要求书
1.  一种α-葡萄糖苷酶抑制剂——蕨麻提取物，其特征在于该提取物为水提物、流浸膏及粗多糖。

2.  一种提取权利要求1所述的蕨麻提取物的方法，其提取方法如下：
(1)蕨麻水提物的提取制备
称取蕨麻干粉10g，加纯净水浸泡于500ml的烧杯中，常温下过夜，置水浴锅上隔水煎煮，重复煎煮3次，将3次所得的煎液合并后抽滤，得到浅黄色的澄清滤液，再置于坩埚内，在水浴中蒸发浓缩相当于生药0.4g/ml；
(2)蕨麻粗多糖的提取制备
将上述步骤(1)制得的蕨麻水提物置于烧杯中，加乙醇，静置过夜后，将析出的沉淀物置于离心管中离心，上清液保留备用，在沉淀物中加入95％的乙醇充分洗涤后离心，弃去上清，再依次分别加入无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤后离心，弃去上清，最后将所得沉淀物置于平皿中，待乙醚挥尽后所得的灰褐色粉末即为蕨麻粗多糖；
(3)蕨麻流浸膏的提取制备
将上述步骤(2)中蕨麻粗多糖提取物的醇沉上清液置于坩埚中，在水浴上挥尽乙醇，蒸发水温75℃至流浸膏。

3.  根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于在步骤(1)中在蕨麻干粉中加12倍纯净水，置于水浴锅上煎煮1.5小时，抽滤后的滤液置于坩埚中75℃水浴上蒸发浓缩。

4.  根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于在步骤(2)中在蕨麻水提物中加5倍量的95％的乙醇，在4℃冰箱静置过夜，然后在3000r/min离心10min。

5.  如权利要求1所述的蕨麻提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

说明书一种α-葡萄糖苷酶抑剂—蕨麻提取物及其提取方法
技术领域
本发明涉及一种中药提取物，具体地说是涉及一种藏药蕨麻提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，及其该提取物的提取方法。
背景技术
根据国际糖尿病联盟报告，目前全球糖尿病人数已逾1亿，预测2025年将突破3亿，主体为2型糖尿病(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group.Type 2 diabetes practical targets and treatments 2005，fourth edition6-7；25)。我国糖尿病患病率逐年增高，从1979年的0.67％上升到1997年的3.6％，估计现已有糖尿病患者2000万以上，居世界第2位(丁学屏主编.《中西医结合糖尿病学》人民卫生出版社.2004.3第1版，1，52)，其中2型糖尿病亦占到90％。因此，预防和治疗糖尿病极为紧迫。
糖尿病前期即葡萄糖调节受损(impaired glucose regulation，IGR)，其包括空腹血糖受损(impaired fasting glucose，IFG)和葡萄糖耐量缺损(impairedglucose tolerance IGT)。而发展成糖尿病，几乎都要经过IGT阶段(Alice Y.Y.Cheng，George Fantus.0ral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetesmellitus CMAJ.2005；172(2)：213-226)。我国有近IGT 3000万人，(卫生部疾病控制司，中华医学会糖尿病学分会.中国慢性病预防与控制2004；12(6)：283.)他们是最重要的2型糖尿病高危人群，每年约有8％～11％进展为2型糖尿病，其转化的危险性居世界前列。
对于IGT和2型糖尿病早期患者，均表现为餐后高血糖，而餐后高血糖对机体的危害远远超过空腹高血糖，(卫生部疾病控制司，中华医学会糖尿病学分会.中国慢性病预防与控制2004；12(6)：283.)餐后高血糖的糖毒作用，不仅极易诱发大血管、微血管、周围神经等多组织的病变，引起各种并发症，(BellDS.Importance of postprandial glucose control.Southern med J2001；94(8)：804-809.)还与冠心病和糖尿病的总死亡率之间相关性大于空腹高血糖，所以降低餐后血糖是预防2型糖尿病的发生，减少其并发症和降低死亡率的重要措施之一。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂，被亚太地区2型糖尿病政策组，制订的2005年第四版《2型糖尿病实用目标与治疗》一书中，仍然推荐为降餐后血糖的一线药物(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group.Type 2diabetes practical targets and treatments 2005，fourth edition 6-7；25)。
α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制小肠上皮细胞表面α-葡萄糖苷酶的活性，延迟和减少单糖在其上部的吸收，明显降低餐后高血糖(Coutinho M，GersteinHC，Wang Y，etal.The relationship between glucose and incidentcardiovascular events.A metaregression analysis of published data from20 studies of 95，783 individuals followed for12.4 years.Diabetes Care1999；22(2)：223-240.)，来治疗葡萄糖耐量降低和2型糖尿病的(DECODE StudtyGroup.The European Diabetes Epidemiology Group.Glucose tolerance andcardiovascular mortal ity：comparison of fastiog and 2-hour diagnosticcriteria.Arch Intem Med.2001，161(3)：397-405.)。上个世纪七十年代先后从微生物发酵产生的三种α-葡萄糖苷酶抑制剂，即阿卡波糖(拜唐苹)、伏格列波糖(倍欣)和米格列醇已被广泛应用于临床。(Van de Laar FA，LucassenPL，etal.Alpha-glucosidase inhibitors for type 2 diabetes mellitus.ACP J Club.2005；143(3)：66.)阿卡波糖明显降低糖化血红蛋白；空腹和负荷后血糖以及负荷后胰岛素水平；并使体重指数降低。但是，上述这类抑制剂市场价格都比较贵，要满足低收入患者长期用其干预IGT、2型糖尿病早期的餐后高血糖，延缓2型糖尿病的发生或减轻胰岛β细胞功能的衰竭，是件不容易坚持的事。
从天然产物、中药中筛选更多、更便宜的α-葡萄糖苷酶抑制剂，近年来有不少报道，有多糖、黄酮类、鞣质、皂甙、生物碱或提取物等种类。但是，根据文献检索，用藏药蕨麻筛选，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂蕨麻提取物及其该提取物的提取方法。
1、蕨麻药用蕨麻是蔷薇科鹅绒委陵菜Potentilla anserina L.膨大的块根，异名人参果，莲菜花，藏语称“戳玛”(江苏新医学院主编.《中药大辞典》上海科学技术出版社，2004，2606.)。其为青藏高原特有药材，资源丰富，藏医药用已有1200年历史，其性味：甘、平；主治：健脾益胃，生津止渴，益气补血，利湿(陈惠清，张瑞贤，黄璐琦，等.藏药蕨麻的文献考察[J]中国中药杂志，2000，25(5)：311-313.)。与《备急千金药方·消渴第一》中的治则滋阴泄热，益气养阴，有一致之处。这一治则为从藏药蕨麻中筛选治疗糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂奠定了理论基础。
2、蕨麻药物成分分析洪霞等报道从蕨麻根茎中分离出蕨麻苷，其结构为2α，3β，19β-三羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸-28-O-D-吡喃半乳糖苷(洪霞，蔡光明，韩晋，等.新化合物蕨麻苷的结构鉴定[J].解放军药学学报，2004，20(6)：411-413.)。杨桦等采用苯酚-硫酸法测定了蕨麻中多糖含量为11.08％。(杨桦，贾旭，易红.藏药蕨麻中多糖的含量测定研究[J].中草药，2001，32(1)：29-31.)。此外，块根中还含蛋自质、脂肪、鞣质、蕨麻素、黄酮类化合物等成分(马春花.藏药蕨麻的化学成分及药理作用研究概况[J].时珍国医国药，2006，17(8)：1584-1585.)。从上述蕨麻药物成分分析，其含多糖、黄酮类、鞣质成分，为从藏药蕨麻中筛选治疗糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂的成分奠定了物质基础。
本发明的目的由以下的技术方案来实现。
一种α-葡萄糖苷酶抑制剂——蕨麻提取物，其特征在于该提取物为水提物、流浸膏及粗多糖。
上述蕨麻提取物的提取方法如下：
(1)蕨麻水提物的提取制备
称取蕨麻干粉10g，加纯净水浸泡于500ml的烧杯中，常温下过夜，置水浴锅上隔水煎煮，重复煎煮3次，将3次所得的煎液合并后抽滤，得到浅黄色的澄清滤液，再置于坩埚内，在水浴中蒸发浓缩相当于生药0.4g/ml；
(2)蕨麻粗多糖的提取制备
将上述步骤(1)制得的蕨麻水提物置于烧杯中，加乙醇，静置过夜后，将析出的沉淀物置于离心管中离心，上清液保留备用，在沉淀物中加入95％的乙醇充分洗涤后离心，弃去上清，再依次分别加入无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤后离心，弃去上清，最后将所得沉淀物置于平皿中，待乙醚挥尽后所得的灰褐色粉末即为蕨麻粗多糖；
(3)蕨麻流浸膏的提取制备
将上述步骤(2)中蕨麻粗多糖提取物的醇沉上清液置于坩埚中，在水浴上挥尽乙醇，蒸发水温75℃至流浸膏。
上述步骤(1)中在蕨麻干粉中加12倍纯净水，置于水浴锅上煎煮1.5小时，抽滤后的滤液置于坩埚中75℃水浴上蒸发浓缩。
上述步骤(2)中，在蕨麻水提物中加5倍量的95％的乙醇，在4℃冰箱静置过夜，然后在3000r/min离心10min。
上述的蕨麻提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
有益效果：
经体外实验以拜唐苹为阳性对照，观察蕨麻三种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，实验结果表明蕨麻三种提取物对α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制作用，而且呈量效关系，其中水提取物100mg、200mg相当于生药/ml时抑制率分别达到80.8％和85.1％，而5mg/ml拜唐苹的抑制率为67.7％；粗多糖125mg/ml、250mg/ml时抑制率分别达到66.4％和80.0％，而5mg/ml拜唐苹的抑制率为61.4％；流浸膏62.5mg/ml、125mg/ml、250mg/ml时抑制率分别达到55.5％、77.6％及73.4％，而5 mg/ml拜唐苹的抑制率为51.3％。体内实验表明蕨麻水提物在餐后1小时有降低血糖的趋势。
附图说明
图1蕨麻水提物的双倒数酶动力学曲线  ◆：200mg/mL蕨麻水提物的O.D值倒数； ■：pNPG浓度的O.D值倒数。
图2蕨麻流浸膏的双倒数酶动力学曲线  ◆：200mg/mL蕨麻流浸膏的O.D值倒数；  ■：pNPG浓度的O.D值倒数。
附图标记：◆1/V轴，■1/V2轴，——线性(1/V轴)，——线性(1/V2轴)。
具体实施方式：
实施例1蕨麻提取物的提取方法：
(1)蕨麻水提物的制备  称取蕨麻干粉10g取12倍纯净水浸泡于500ml的烧杯中，常温下过夜，置水浴锅上煎煮1.5h后重复煎煮3次，将3次所得煎液合并后抽滤，得到浅黄色的澄清滤液，再置于坩埚中75℃水浴上蒸发浓缩至相当于生药0.4g/ml；
(2)蕨麻粗多糖的制备  将上述(1)蕨麻水提物烧杯中，加5倍量95％的乙醇，4℃冰箱静置过夜后，将析出的沉淀物置离心管中离心(3000r/min，10min)，保留上清液(用于制备蕨麻流浸膏)，在沉淀物中加入95％的乙醇充分搅拌后离心(3000r/min，10min)，弃上清，再依次分别加入无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤后离心(3000r/min，10min)，弃上清，最后将所得沉淀物置平皿中，待乙醚挥发完后所得灰褐色粉末即为蕨麻粗多糖；
(3)蕨麻流浸膏的制备  把上述(2)蕨麻粗多糖提取过程中的醇沉上清液置于坩埚中，在75℃水浴上挥尽乙醇，蒸发至流浸膏。
实施例2蕨麻提取物的药效学试验：
一、材料
1.试剂  α-葡萄糖苷酶，购于Sigma公司；对硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，购于德国Merck公司；还原型谷胱甘肽，KHK进口分装，其他试剂均为分析纯试剂。
2.仪器  UV7500可见光分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；FA2004N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂；电热三用水箱，北京医疗设备厂；WH-1微型旋转混合仪，上海沪西分析仪器有限公司；pHs-25雷磁数显pH计，上海精密科学设备公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；松下BCD-251WD冰箱，无锡松下冷机公司；DHG-9140A电热鼓风干燥机，上海精密实验设备有限公司；巨轮牌植物粉碎机，河北黄骅齐家科学仪器厂；3650紫外分析仪，上海科艺光学仪皿厂；SH2-D(III)循环水式真空泵，巩义市英山路予华仪器厂；怡成SENTEST手持式快速全血葡萄糖测试仪，北京怡成生物电子技术有限公司。
3.药物与药材  拜唐苹，拜耳医药保健有限公司(批号：109291，日期：06.11.29)成分：阿卡波糖，每片含50毫克阿卡波糖；蕨麻产地为甘肃省甘南地区，中国宁夏中宁三和枸杞开发有限公司出品，由我校中药学院陈建伟教授鉴定和提供药材。
4.动物  昆明种雄性小鼠，体重21.3±0.88g，15只，由本校动物实验中心提供。
二、方法
1.蕨麻提取物成分鉴定方法(中科院上海药物研究所编.中草药提取技术与分离[M].上海科学技术出版社，1983：10-19.)，(肖崇厚.中药提取鉴定原理[M].上海科学技术出版社，1982：13-54.)。
1.1三氯化铁反应  将提取液滴至瓷反应板上，加数滴1％三氯化铁试剂，观察颜色反应。
1.2氨水反应  将提取物滴至滤纸上，经浓氨水上熏数分钟，立即放到紫外灯下观察是否有黄色荧光反应。
1.3双缩脲反应  取提取物1ml加入数滴双缩脲试剂，混匀观察颜色反应。
1.4α-萘酚反应  取1ml提取液加入1～2滴α-萘酚，再延管壁加入数滴浓硫酸，观察颜色反应。
1.5碘反应  取1ml提取液加入1滴碘液试剂观察颜色反应。
2.体外实验
2.1 α-葡萄糖苷酶活性测定  (寇彤，孟晓敏，常建涛，等.何首乌对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[J].大连轻工业学院学报，2006，25(4)：239-241.)反应系统为67 mmol/L磷酸钾缓冲液(37℃，pH6.8)2.0ml，3mmol/L谷胱甘肽溶液50ul，3.84u/ml α-葡萄糖苷酶溶液50ul，混匀，37℃水浴保温l0min后，加入20mmol/L pNPG溶液30ul，再置原水浴中继续保温10min后，经80℃水浴中灭活，再加入0.01mol/L Na2CO3溶液10ml冷却后，于波长400nm处测定在酶的作用下释放出对硝基酚(pNP)的吸光度(0.D)。其中酶活力单位定义：37℃、pH6.8条件下，反应体系中pNP在400nm处每分钟吸光值变化0.001规定为一个酶活力单位。空白对照管内不加α-葡萄糖苷酶和pNPG，加入等量的蒸馏水补足体积。
2.2蕨麻提取物抑制活性的测定  反应系统为67mmol/L磷酸钾缓冲液(37℃，pH6.8)2.0ml，3mmol/L谷胱甘肽溶液50ul，3.84u/ml α-葡萄糖苷酶溶液50ul，蕨麻提取物200ul(阳性药对照管，拜唐苹5mg/ml)混匀，其他操作同上。蕨麻提取物空白对照管内除不加α-葡萄糖苷酶和pNPG外，加入不同浓度蕨麻提取物200ul，用等量的蒸馏水补足体积。
一个抑制剂活力单位定义：37℃、pH6.8条件下，相同时间内降低1个酶活力单位的吸光值。
抑制百分率＝(抑制剂活力/酶活力)×100％＝[酶活力-酶活力(加入药物)]/酶活力×100％，计算公式简化为：抑制百分率＝[1-(中药提取物0.D-中药提取物空白管0.D)/酶活O.D]×100％。
2.3蕨麻提取物抑制类型确定
在抑制剂量一定的条件下，加入不同浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mmol/L)的底物溶液，测定酶活力。可得出一系列不同底物浓度条件下的酶活力，用Excel软件，进行双倒数作图法确定抑制类型。
3.体内实验——蕨麻水提物对小鼠淀粉耐量实验
(洪霞，蔡光明，韩晋，等.新化合物蕨麻苷的结构鉴定[J].解放军药学学报，2004，20(6)：411-413)，(刘英华，滕俊英，郑子新，等.桑叶提取物对餐后血糖及α-葡萄糖苷酶活性的影响[J].中国临床康复，2004，8(27)：5896-5897)。
3.1实验动物随机分组  即淀粉组、淀粉+拜唐苹组和淀粉+蕨麻水提物组，每组动物5只。实验前动物禁食不禁水，12h后尾尖取血测空腹血糖值，再分组灌胃(淀粉3g/kg；拜唐苹25mg/kg+淀粉3g/kg；蕨麻2.5g/kg+淀粉3g/kg，混合)后，分别在半小时，1h，2h，3h鼠尾尖取血，以葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值绘制淀粉耐量曲线。
3.2统计学方法采用SPSS13.0统计学软件，由统计学教研室董菊讲师，负责对体内血糖值方差分析进行数据处理。
4.结果
4.1体外实验
4.1.1蕨麻提取物抑制率分别用蕨麻水提物、粗多糖、流浸膏三种提取物以其浓度梯度对α-葡萄糖苷酶活力影响。
4.1.1.1蕨麻水提物的抑制率  拜唐苹与不同浓度蕨麻水提物抑制率见表1。结果表明，蕨麻水提物有浓度梯度的量效抑制关系。100mg、200mg相当于生药/ml时抑制率达到80.8％～85.1％。
表1  蕨麻水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制率
抑制物    拜唐苹    蕨麻水提物    5mg/ml    25mg/ml    50mg/ml    100mg/ml    200mg/ml抑制率    67.7％    19.5％    60.8％    80.8％    85.1％
4.1.1.2蕨麻粗多糖的抑制率  拜唐苹及不同浓度蕨麻粗多糖抑制率见表2。结果表明，蕨麻粗多糖有浓度梯度的量效抑制关系。250mg蕨麻粗多糖/ml时抑制率达到80.0％。
表2蕨麻粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率
抑制物  拜唐苹    蕨麻粗多糖  5mg/ml    31.25mg/ml    62.5mg/ml    125mg/ml 250mg/ml抑制率  61.4％    13.2％    25.7％    66.4％ 80.0％
4.1.1.3蕨麻流浸膏的抑制率  拜唐苹及不同浓度蕨麻流浸膏抑制率见表3。结果表明，蕨麻流浸膏有浓度梯度的量效抑制关系。
表3  蕨麻流浸膏对α-葡萄糖苷酶的抑制率
  抑制物    拜唐苹    蕨麻流浸膏    5mg/ml    62.5mg/ml  125mg/ml 250mg/ml  抑制率    51.3％    55.5％  77.6％ 73.4％
4.1.2蕨麻提取物抑制作用类型
4.1.2.1蕨麻水提物抑制作用类型  当蕨麻水提物浓度200mg/ml时，加入不同浓度(S)的底物pNPG，测定酶反应速度(V即0.D)，以1/V为纵坐标，1/S为横坐标作图。由图1显示，Km增大，Vmax不变，说明该抑制剂对α-葡萄糖苷酶的作用属于竞争性抑制。
4.1.2.2蕨麻流浸膏抑制作用类型  当蕨麻流浸膏浓度为200mg/ml时，加入不同浓度(S)的底物pNPG，测定酶反应速度(V即0.D)，以1/V为纵坐标，1/S为横坐标作图。由图2显示，Km增大，Vmax不变，说明该抑制剂对α-葡萄糖苷酶的作用属于竞争性抑制。
4.1.3蕨麻提取物成分初步鉴定  取蕨麻水提物、流浸膏经氨水、三氯化铁反应阳性；流浸膏、多糖α-萘酚反应阳性；多糖、水提物与碘反应阳性。三者双缩脲反应阴性，结果见表4。结果表明，蕨麻水提物中抑制成分可能含多糖和羟基类黄酮苷物质。
表4蕨麻提取物成分鉴定
  药材  名  提取物  氨水反  应  三氯化铁反  应 双缩脲反 应  α-萘酚  反应碘反应  蕨麻  水提物  流浸膏  粗多糖  黄色  黄色  -  褐色  褐色  - - - -  未测定  紫红色  +蓝色-蓝色
4.2体内实验
淀粉组、淀粉+拜唐苹组、淀粉+蕨麻水提物组，淀粉耐量实验中所测血糖值见表5。结果显示，空腹血糖值组间无统计学差异；1小时血糖值经方差分析为P＝0.067，P＞0.05，虽然无统计学差异，但能说明有降低餐后血糖的趋势。
表5蕨麻水提物淀粉耐糖实验血糖值(x±s mg/dl，n＝5)
   组别\时间    空腹  0.5h    1h  2h    3h   淀粉组    120.6±    25.43  195.4±  21.95    173.4±    27.54  127.2±  11.82    138.4±    13.61   淀粉+蕨麻组    117.2±    27.59  178.4±  23.46    166.6±    27.70  126.6±  17.71    126.0±    17.933   淀粉+拜糖苹组    116.0±    17.26  167.6±  45.92    133.4±    22.15  139.2±  30.03    114.8±    15.89
5.9结论
体外实验结果表明，蕨麻三种提取物对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，其中水提物比多糖和流浸膏效果更明显，说明蕨麻水提物对α-葡萄糖苷酶起抑制作用可能与多糖和羟基黄酮苷类两种成分协同作用有关。体内实验结果表明，蕨麻水提物餐后1小时有抑制血糖的趋势。