反向子代作图.pdf

本发明涉及用于对在生物体中，特别是在植物中的性状进行作图的方法。根据本发明的方法包括：a)提供SDR-0生物体特别是植物的群体，所述生物体每一个起源于由第二次分裂重建产生的未减数细胞群体特别是未减数孢子群体中的一个成员；b)产生每个这些SDR-0生物体的SDR-1子代群体；c)对SDR-1子代群体进行表型分析以鉴定每个SDR-1子代群体内的分离性性状；d)如果分离性子代存在于SDR-1子代群体中，则对相应的SDR-0生物体进行基因分型，并将其基因型与其他SDR-0生物体的基因型进行比较以鉴定与在所述SDR-1子代群体中鉴定出的分离性性状的出现相关联的杂合染色体区域。

权利要求书
1.  用于对在生物体中，特别是在植物中的性状进行作图的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供SDR-0生物体特别是植物的群体，所述生物体每一个起源于由第二次分裂重建产生的未减数细胞群体特别是未减数孢子群体中的一个成员；
b)产生每个这些SDR-0生物体的SDR-1子代群体；
c)对SDR-1子代群体进行表型分析以鉴定每个SDR-1子代群体内的分离性性状；
d)如果分离性子代存在于SDR-1子代群体中，则对相应的SDR-0生物体进行基因分型，并将其基因型与其他SDR-0生物体的基因型进行比较以鉴定与在所述SDR-1子代群体中鉴定出的分离性性状的出现相关联的杂合染色体区域。

2.  权利要求1的方法，其中所述未减数细胞群体通过下列方式来获得，所述未减数细胞中的每一个产生SDR-0群体的植物，所述方式为：基于大小、质量或DNA含量来分选细胞特别是孢子的群体，并选择具有增加的大小、质量或DNA含量的细胞特别是孢子作为未减数细胞特别是未减数孢子的群体的成员。

3.  权利要求2的方法，其中所述细胞特别是孢子借助于流式细胞仪、离心机进行分选，或采用显微操作器人工进行分选。

4.  权利要求1-3中任一项的方法，其中所述SDR-1子代群体的表型分析借助于目视观察或通过分析每个SDR-1生物体中的离子、转录物、蛋白质、代谢物或其组合的含量和/或组成来进行。

5.  权利要求4的方法，其中表型分析借助于表型组学、离子组学、转录物组学、蛋白质组学、代谢物组学或其组合来进行。

6.  权利要求1-5中任一项的方法，其中所述SDR-0生物体的基因分型借助于揭示核酸多态性的方法来进行。

7.  权利要求6的方法，其中所述揭示核酸多态性的方法选自AFLP、RFLP、SNP、SFP、SSR、RAPD。

8.  权利要求1-7中任一项的方法，其中所述SDR-1子代群体的产生在变化的条件下，特别是在变化的环境条件下进行。

9.  权利要求8的方法，其中所述变化的环境条件选自实验室条件和野外条件，并且其中这两种类型的条件根据天气条件而发生变化。

10.  权利要求1-9中任一项的方法，其中所述未减数SDR-0细胞群体由经选择而显示出高于平均值的第二次分裂重建的生物体产生。

11.  权利要求1-9中任一项的方法，其中所述SDR-0细胞群体由经遗传修饰而显示出高于平均值的第二次分裂重建的生物体产生。

12.  权利要求11的方法，其中所述遗传修饰是暂时的。

13.  权利要求11的方法，其中所述遗传修饰是通过将增加生物体中第二次分裂重建事件数目的遗传元件稳定整合入基因组中。

14.  权利要求1-9中任一项的方法，其中所述未减数SDR-0细胞群体由受到环境胁迫而显示出高于平均值的第二次分裂重建的生物体产生。

15.  权利要求14中的方法，其中所述环境胁迫选自温度胁迫、NO2、一氧化二氮N2O或它们的组合。

16.  可通过以下步骤获得的作图群体用于对物种中的一个或多个性状进行作图的用途：
a)提供SDR-0生物体特别是植物的群体，所述生物体每一个起源于由第二次分裂重建产生的未减数细胞群体特别是未减数孢子群体中的一个成员；和
b)产生每个这些SDR-0生物体的SDR-1子代群体。

17.  用于富集细胞特别是孢子或配子的群体中的SDR细胞特别是SDR孢子或配子的方法，所述方法包括基于大小、质量或DNA含量来分选细胞特别是孢子或配子的群体，并选择具有增加的大小、质量或DNA含量的细胞特别是孢子或配子作为未减数细胞特别是未减数孢子或配子。

18.  权利要求17的方法，其中分选所述群体借助于荧光激活细胞分选仪来进行。

说明书反向子代作图
本发明涉及用于对在生物体中，特别是在植物中的性状进行作图(mapping)的方法。
复杂的作物性状例如产量、胁迫耐受性、代谢物组成以及相关现象(例如杂种优势和配合力)由于它们的数量遗传性质和强的与环境的相互作用而很难研究。此外，这些性状/由它们引起的现象的遗传学常常也是复杂的，并且大部分是数量性的和多基因的，这意味着所得的表型是由被不同遗传基因座编码的不同等位基因的相互作用而引起的。
当每个单独的基因座对总的效应具有可测量的贡献而与对数量性状有贡献的其他基因座的等位基因的存在或不存在无关时，表征对所述数量性状有贡献的单独的基因座的尝试已获得成功。在这种情形中，单独的QTL正如对它们的称呼一样，具有加和性质(additive nature)并且以简单的孟德尔法则遗传。
已经广泛描述了数种用于QTL作图的方法，然而当表型是由于许多杂合基因座的相互作用而引起时，尤其是当这样的基因座相互依赖时，这些方法中的多数不能成功。这意味着，两个或更多个特定的基因座需同时存在以表达特定性状。在两个基因座中的任何一个上缺少所需的等位基因时，所述表型性状将不会表达。单独地所需的等位基因可以以纯合或杂合的形式出现。取决于所述特定的性状，可能需要基因座的不同的遗传素质(genetic constitution)。例如，可测量效应只在当2个或更多个基因座以杂合状态存在时才能观察到，当任一基因座是纯合的时候观察不到效应。在这样的情形中，可以认为这样的基因座是相互依赖的。
如前面提到的，复杂性状如产量和胁迫耐受性具有很高的工业重要性，并因而，十分期望具有一些工具例如与这些复杂性状相关联的分子标记，其使得能够增加在不同作物中育种这些性状的效率。
当代的植物育种通常使用遗传(分子)标记技术例如AFLP、RAPD’s、SSR’s、SNP’s等，关于综述参见例如Lakshmikumaran，T.等人，Molecular markers in improvement of wheat and Brassica.In：Plant Breeding-Mendelian to Molecular approaches.H.Jain和M.Kharkwal(eds.)Copyright 2004 Narosa Publishing House，NewDelhi，India，第229-255页。
分子标记作为指示特定性状的诊断工具是十分理想的，甚至在所述性状还未表达的发育阶段中。此外，分子标记对环境条件是不敏感的。
例如，可以发现在遗传上与负责辣椒成熟时它们果实颜色的基因相关联的分子标记(例如以SNP(单核苷酸多态性)的形式，或者与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带相关联)。取自幼苗的DNA样品可用于确定该植物果实最终将会具有哪种颜色。因而，在这种情形中，正在被“召唤”的特定DNA序列的存在和特殊性状的存在之间存在直接关联。
大体上，相同的程序对许多多基因性状是确实可行的(参见例如Tanksley S.，Mapping polygenes，Annu.Rev.Genet.1993，27：205-233)。在后一种情况下，所述的性状，不管它是什么，例如抗病性、对胁迫的抗性、维生素的产生等，可能由多于一个的基因座控制。假定可以测量每个单独的基因座的贡献以及其相关联的DNA标记，并且假定不同基因座以及它们各自的DNA标记物之和将在表型上导致特定性状的存在(在某种程度上)。这种观念要追溯到R.A.Fisher的经典工作(The correlations between relatives on thesupposition of Mendelian inheritance，Trans.R.Soc.Edinb.(1918)52，399-433)，该工作将孟德尔遗传学与关于亲属(relatives)之间相关性的先前的统计学方法相联系，以解释数量遗传性状。
通过重组进行的真核生物染色体作图是本领域技术人员所熟知的技术(Griffiths AJF等人，(2005)Eukaryote chromosome mappingby recombination，In：Introduction to Genetic Analysis，第8版，W.H.Freeman and Company，New York，第115-137页)。
分离性性状(segregating trait)的作图，即QTL-作图(QTL＝数量性状基因座)不仅取决于技术问题或重组，而且同样重要的是对表型的精确观察或评分(分别是定性的或定量的)。在这方面，当对复杂性状或效应进行作图时，本领域技术人员优选使用双单倍体系(DH)群体或重组近交系(RIL)群体，它们对目标性状是分离性的，并且源于单株F1植物。
DH-系通过植株再生和染色体加倍而直接来源于单倍体F1-植物配子。RIL是高度近交系，其来源于单粒种子世系(single seeddescent，SSD)，即通过数代近交而得到，其中每一单独的植株提供一颗种子用于下一代，从F2开始。
备选地，使用所谓的近等基因系(NIL)。NIL是一小段DNA片段不同的纯合系。它们通常源于回交，但是也可以从分离性RIL获得(Tuinstra等人，(1997)Theor.App1.Genet.95：1005-1011)。
DH-系、RIL和NIL对当代的遗传学和遗传作图有重大贡献。这些纯系的优势正是依赖于这样一个事实，即与在典型的F2作图群体(mapping population)的个体植株水平上的分离相比较，品系间的表型变异(品系间变异)容易记录。纯系的可用性当然越来越重要，因为环境的影响同样可以通过遗传上相同的纯系植株的重复来解决。这与单个的、无重复的、单独的F2-植株表型相反，所述F2-植株表型为基因和环境相互作用的产物。
复杂效应(例如杂种优势)或品系间的配合力的阐明是当代遗传学和植物育种的最大挑战之一。对于杂种优势，已经形成了几个假说(参见例如，Birchler J等人，(2003)The Plant Cell 15，2236-2239)。关于杂种优势的所谓的历史解释是“超显性”和显性。超显性指这样一个想法，即在杂种中发生等位基因相互作用，从而杂合类型比任一种纯合类型的表现要好。显性指其中一个亲本的亚最佳的隐性等位基因由另一亲本的显性等位基因补充的情况。然而，由显性解释的杂种优势效应在纯合状态中基本上是固定的，显然对于由超显性解释的效应这是不可能的。最近已经清楚，对杂种优势的这两种竞争性的单基因座解释是不够的，并且上位效应，即基因座间相互作用，作为杂种优势的遗传基础也起着主要作用(Yu SB等人，(1997)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 94：9226-9231)。
如前面提到的，传统上使用的具有纯合个体的作图群体(mappingpopulation)结构，例如重组近交系群体(RIL)和双单倍体(DoubledHaploid，DH)群体，不能容易地应用于对某个基因座处的杂合状态的具体效应进行作图。该缺点已经通过将这些群体与测试者(tester)进行杂交并评估后代杂种的表型而克服了。然而，这种方法具有三个缺点。首先，其需要额外的劳力、空间和时间。此外，其将基因座的杂合状态仅与两个可能的纯合状态之一进行比较，除非使用至少一个额外的测试者。最后，其没有全面评估杂合基因座和遗传背景之间的相互作用，即由于杂合性而引起的具有特定效应的基因相互作用。
由Charcosset等人，(1994)和Reba等人，(1994)(都在Biometrics in plant breeding：applications of molecular markers；Eds：Ooijen J.和Jansen J.CPRO-DLO，Wageningen，The Netherlands中)提出的双列交配群体(diallel mating population)的使用，克服了部分的后两种缺点，但需要更多的劳力和空间。
F2群体和回交群体可以应用于评估对于在某一基因座处的杂合状态的具体效应的作图。然而，因为统计模型中可利用的参数空间(其受群体大小的限制)，在基于F2的QTL-分析中仅能评估有限的基因相互作用。回交群体需要更多时间和劳力来产生它们，并且仅对于轮回亲本(recurrent parent)的遗传背景评估了在某一基因座处的杂合状态的效应，没有考虑与其他基因座可能的相互作用。
避免时间、空间和劳力上的大量投入来发展作图群体的另一种方法是连锁不平衡作图(LD-作图；Kraakman ATW等人，(2004)Genetics168，435-446；Kraft T等人，(20O0)Theor.Appl.Genet.101，323-326)。这种方法利用可获得的已有遗传材料，例如品种和基因库参加者(accessions)。如果该材料是足够杂合的，例如杂种品种的一个作图组，评估所述杂合基因座的特定效应是可能的。然而，通常LD-作图方法不考虑上位效应并且需要大量参加者来检测在由上位效应引起的统计学噪音内的加和性地起作用的QTL，所述的上位效应是由于所有参加者中不同遗传背景引起。(Flint-Garcia SA等人，(2003)Annu.Rev.Plant Biol.54，357-374)。
依赖于两个或更多个基因座的等位基因构成(allelicconstitution)的组合的性状的鉴定或作图要难得多。在群体遗传学中，数个基因座之间的这种相互作用称为‘上位性’。在这种情形中，一个基因座的贡献仅在另一个或第三个或第四个等的基因座的某种等位基因构成中是可测量的。
在一个简单的理论情形中，可以想象，如果二聚体稍微不同(在杂合子中有1个基因座但有2个等位基因)，从而例如形成更有效的催化位点，则由一特定基因(1个基因座)编码的该同型二聚体酶在催化中可能会更有效。在该情形中，与AA或A′A′相比较，AA′在催化方面更优。除此之外，十分可能，在生物合成途径中由“A”基因(无论遗传组成是什么)编码的该酶可能依赖于在级联系统中处于所述特定酶的上游或下游的另一种酶的催化。容易理解，如果所述酶“A”变得更有效力，则这种效力的增加仅在如果“喂养”所述由“A”编码的酶的底物没有限制时才可以有效地执行。在A酶所利用的底物由另一种酶(B)提供并由此遵循相同规则(同型二聚体酶通过2个等位基因来改良)的情形中，改良仅通过组合来获得。在那种情形中，AA′/BB′好于AA/BB′或AA′/BB以及其中两种杂合状态都不存在的另一组合。
在另一方面，如果该途径的输出物不再受限于A控制的步骤，而如果在A下游的酶构成了该限制步骤，则A的不同等位基因的作用是不可测量的，并且因此负责在A下游的该酶的基因座对A来说是上位的。
其中杂合子个体优于纯合个体的一个众所周知的实例是镰形状细胞贫血。对于在纯合个体中是如此明显有害的等位基因的存留的调查研究发现，该等位基因在杂合个体中赋予了小但显著的对于致命形式的疟疾的抗性。自然选择已经导致了在纯合情况的有害效果与由杂合情况提供的对疟病抗性之间保持平衡的等位基因群体。
显然，占优的杂合性和上位效应可以同时存在，并且对同型二聚体所描述的效果也可以对异型多聚体有效。
总之，这意味着一个特定基因座本身的贡献不能容易地测量或显现，因为单独基因座的至少一部分贡献是非加和性的并与一个或多个其他基因座的等位基因状态相互作用。因而，上位性状的QTL作图不能通过传统方法容易地进行，所述传统方法通常假定基因座之间的可加性。由于用于该目的的遗传模型的高参数化，因而将基因座间相互作用引入这些方法中通常导致统计学参数估计和低的检测QTL的能力的问题。
试图解决该问题的备选方法是QTL x遗传背景作图，该方法应用于双列交配群体(Charcosset A等人，(1994)第75-84页，和RebaA等人，(1994)第170-177页，两篇都在：Biomctrics in plantbreeding：applications of molecular markers；Eds：Ooijen J和Jansen J.CPRO-DLO，Wageningen，The Netherlands中)，以及QTLx群体作图，其应用于多个相关的近交系杂交(Jannink J-L & JansenR(2001)Genetics 157：445-454)。后者声明，这些方法也可以应用于其他群体结构。
用于检测上位相互作用的一个感兴趣的群体结构是异质近交家族(Heterogeneous Inbred Family，HIF)(Haley S等人，(1994)Theor.Appl.Genet.88，337-342；Tuinstra M等人，(1997)Theor.Appl.Genet.95：1005-1011)，这是因为其的‘多重其他条件均相同(multiple ceteris paribus)’性质，即该家族含有许多可能的亚群，其中在它们的每一个中仅一个QTL在对于其他QTL的特定纯合背景中是分离性的。
HIF-群体的构建十分冗长乏味的。其需要数代的单粒种子世系，这意味着其很慢并且耗费劳力。在完成HIF-群体时，选取的群体亲本可能不再是最新的了。减少传代时间的设备或备选场所需要高的投资。还考虑到仅两个亲本的QTL-等位基因得以分析这样一个事实，从而常常不值得去投资这样的种群用于商业育种目的。
用于在存在上位效应时进行QTL-作图的一种更实用的方法在美国申请2005/0015827中介绍。当其处于正在进行的育种程序中时，QTL在给定背景中的位置和效应受到反复地监控。没有应用特定的群体结构，和连锁不平衡作图一样(见下面)，并且QTL的位置和效应的改变被接受为无法更改的事实。这种方法的主要缺点是不得不分析大量的参加者，并且缺少建立特定上位效应的分析能力。换句话说，不分析遗传背景中哪个特定基因座与改变中的QTL相互作用。
避免QTL-分析中的上位效应的一种更根本的方法是使用回交群体。以这种方法，QTL-效应可以在或多或少恒定的遗传背景，即轮回亲本的遗传背景中进行分析。大部分回交群体类型(例如回交近交系或BIL)可以看作是正规的作图群体类型的类似物，其中包括了一个或多个回交代来产生更一致的遗传背景，并且在几种情况中，排除了基因座的三种等位基因状态中的一种。
鉴于上面所述，本发明的目标是提供用于对在生物体中，特别是在植物中的性状进行作图的方法，该方法没有上面描述的缺点。
本发明是基于下列发现，即通过利用来源于特殊类别的异常减数分裂的配子，并且对从这样的配子再生的生物体的子代进行表型分析，有可能容易地对编码复杂性状的基因座进行作图。
本发明的方法，在此称为“反向子代作图(Reverse ProgenyMapping)”或“RPM”，是基于细胞特别是孢子的使用，所述细胞是由于减数分裂的第二次分裂异常而形成的，所谓的第二次分裂重建(Second Division Restitution)或SDR，并且这些孢子因此与为单倍体的正常孢子相反是二倍体的(当亲本植株也是二倍体时)。这样的孢子称为SDR-0孢子，并且从它再生的植物称为SDR-0植物。
第二次分裂重建仅仅是更广泛的一类所述未减数孢子/配子的一种情形。Veilleux R((1985)Plant Breeding Reviews 3，253-288)描述了未减数配子形成的机制并提供了在作物植物中未减数配子发生的列表。那时，主要公认两种不同类别的未减数配子，即第二次分裂重建(SDR)和第一次分裂重建(FDR)。最近，已经公开了第三类未减数配子，称为不定减数分裂重建(Indeterminate MeioticRestitution，IMR)(Lim K等人，(2001)Theor.Appl.Genet.103：219-230)。对于本发明的目的来说，仅SDR是相关的。说明SDR是天然和普遍现象的另一出版物是Lim K等人，(2004)BreedingScience 54：13-18。
由于第一次减数分裂期间的交换(crossing-over)，SDR-0孢子的染色体可能具有杂合的区段。在本发明的上下文中，杂合性表示杂种起始植物基因的等位基因是多态性的，而纯合性表示基因的等位基因是相同的。
当再生通过SDR产生的孢子时，获得双倍体植物，其平均具有与通过正常减数分裂和自交而获得的植物(F2代)相比较而言水平降低的杂合性。据估计，SDR事件(eyents)平均含有60％的纯合性(源于100％杂合的杂种植物)，而对于FDR事件纯合性为20％。实际的水平取决于在特定SDR事件过程中发生的交换的数目和与着丝粒的相对位置。
只有位于SDR-0植物的杂合区段上的基因座可以分离。分离在下一代(称为SDR-1)中发生。在SDR-1代中将产生特定表型的基因型将不同于在SDR-0代中的基因型。然而，SDR-1代中的分离性表型(segregating phenotype)只在如果SDR-0植物在一定程度上是杂合的时才可以发生。这意味着，足以确定在SDR-0代中哪个基因座是杂合的以便定位负责SDR-1代中的分离性表型的基因座。单独的SDR-0植株中交换断裂点的鉴定和定位预测了负责SDR-1子代中特定表型性状的分离的基因座的位置，并因而对其进行了作图。
因此，本发明涉及用于对在生物体中，特别是在植物中的性状进行作图的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供SDR-0生物体特别是植物的群体，所述生物体每一个起源于由第二次分裂重建产生的未减数细胞群体特别是未减数孢子群体中的一个成员；
b)产生每个这些SDR-0生物体的SDR-1子代群体；
c)对SDR-1子代群体进行表型分析以鉴定每个SDR-1子代群体内的分离性性状；
d)如果分离性子代存在于SDR-1子代群体中，则对相应的SDR-0生物体进行基因分型，并将其基因型与其他SDR-0生物体的基因型进行比较以鉴定与在所述SDR-1子代群体中鉴定出的分离性性状的出现相关联的杂合染色体区域。
在一个具体的实施方案中，所述未减数细胞群体通过下列方式来获得，所述未减数细胞中的每一个产生SDR-0群体的植物，所述方式为：基于大小、质量或DNA含量来分选细胞特别是孢子的群体，并选择具有增加的大小、质量或DNA含量的细胞特别是孢子作为未减数细胞特别是未减数孢子的群体的成员。所述细胞，特别是孢子，可以借助于流式细胞仪、离心机进行分选，采用显微操作器人工进行分选，或通过任何其他分选手段来进行分选。
SDR-1子代群体的表型分析可以以任何本领域技术人员已知的方式进行，并且可以特别是借助于目视观察或通过分析每个SDR-1生物体中的离子、转录物、蛋白质、代谢物或其组合的含量和/或组成来进行。分析离子、转录物、蛋白质、代谢产物的含量和/或组分例如用技术例如离子组学(ionomics)、转录物组学(transcriptomics)、蛋白质组学(proteomics)、代谢物组学(metabolomics)或其组合来进行。
在对SDR-1子代群体进行表型分析后，对产生出现分离的SDR-1子代群体的SDR-0生物体进行基因分型。基因分型可以通过本领域技术人员已知的任何方法来完成。在一个优选的实施方案中，所述SDR-0生物体的基因分型借助于揭示核酸多态性的方法来进行。许多揭示这样的多态性的技术是已知的，例如AFLP、RFLP、SNP、SFP、SSR、RAPD。这一分子标记技术列表仅作为实例给出，而决不是限制本发明。
有利地，所述SDR-1子代群体的产生在变化的条件下，特别是在变化的环境条件下进行。所述变化的环境条件选自实验室条件和野外条件。这两种类型的条件可以进一步根据天气条件而发生变化。采用这种方法，有可能发现仅在某些条件下表型上可见的性状并对其进行作图。
在一个进一步的实施方案中，相同的性状在不同的遗传背景中进行作图。采用这种方法，有可能发现在一种遗传背景中的相互作用基因座，这种相互作用基因座在另一种遗传背景中是不可见的。
本发明实际上提供了新的起始群体和已知的QTL-作图技术的组合。由于在这种群体中的杂合性水平比其他群体低得多，因而需要分析的生物体的数目比现有技术要少得多。此外，在本发明最基本的实施方案中，只有产生关于待进行作图的性状来说发生分离的SDR-1子代群体的SDR-0生物体需要进行基因分型，而其SDR-1子代群体关于那种性状来说不发生分离的SDR-0生物体则不需要。负责该性状的基因座则位于存在于分离性SDR-1子代群体的SDR-0生物体中的杂合染色体片段内。
减数分裂机制已经描述得相当详细了，包括许多异常形式，其中尤其有称为第一次分裂重建或FDR和第二次分裂重建或SDR。由于分别不存在第一次或第二次减数细胞分裂，所以这两种减数分裂形式都导致二倍体配子的形成。SDR导致两个姐妹染色单体都存在于孢子/配子中，所述孢子/配子因而就它们的遗传组成而言，除了由于减数分裂重组而为杂合的那些区域(并且所述区域因而在供体植物中也是杂合的，所述供体植物为提供SDR-0孢子的植物)外，是相同的。
在每个染色体臂发生单次交换的情形中，该染色体的远端，即从交换点朝向端粒，将是杂合的，而交换点近侧的染色体区域(包括着丝粒)将是纯合的。
由于第一次减数分裂期间独立的染色体再分配，所以SDR事件的染色体的纯合区域含有来自父性或母性遗传的染色体的遗传信息，并因而SDR群体是十分异质的。然而，SDR群体可以描述为包含与部分杂合的RIL或HIF和部分杂合的回交近交系(BIL)相似的品系的群体，所述部分杂合的回交近交系在两个亲本背景中都具有渐渗现象(introgression)。
SDR孢子/配子的产生本身是众所周知的，并且对于数种物种进行了描述(参见例如Ki-Byung Lim等人，(2004)Breeding Science 54：13-18；Veilleux R.(1985)Plant Breeding Reviews 3，253-288；Bastiaanssen H.(1997)Marker assisted elucidation of theorigin of 2N-gametes in diploid potato(PhD论文)ISBN90-5485-759-5(该论文还包括对许多作物的参考资料))。
直到现在，复杂基因座还不能或很难通过本领域技术人员已知的方法在遗传上进行定位。本发明教导了一种用于制备作图群体的全新方法，所述作图群体使得能够就出现分离的基因座扫描整个基因组。所述基因座的类型不限于多基因性状，因为该系统学(systematics)也可以应用于单基因性状。
本发明提供了一种新的并且出奇简单的方法，其用于分析可能具有相互依赖和/或上位的相互作用的基因座。此外，本方法不限于仅2个基因座，而是可以应用于相互作用的许多基因座，只要品系内的分离可以测量或观察。
品系间变异众所周知发生在完全纯合的品系(例如双单倍体)之间，而品系内变异是指其中在品系内有限数目的表型特性在个体植株间不同的情况，这是由于品系亲本中残留的杂合性的分离引起的。
根据本发明，令人惊讶地发现，从已经省略了第二次减数分裂的孢子再生的植物(所谓的SDR-0植物)提供了独特的材料以用于对性状进行作图，包括极其复杂的性状，例如依赖于处于各种等位构型(allelic configuration)的多基因座位的存在的那些性状，和用于对效应例如杂种优势进行作图。
SDR类型的未减数孢子的鉴定、富集或诱导，随后这些孢子再生为植物(SDR-0)和所述SDR-0植物的分子表征(残余杂合染色体区段的鉴定)和这些区段与SDR-1代中任何性状或效应的分离的相关性/关联性，以及不同杂合SDR-0品系与它们的分离模式之间的比较，这些步骤的组合使得能够对相互作用或不相互作用的所有基因座进行作图和鉴定，无论是多基因的还是不是多基因的。
对于单独的SDR-0植物中交换断裂点的鉴定和定位预测了负责SDR-1子代中特定表型性状的分离的基因座的位置，并因而对其进行了作图。此外，精确作图取决于再生的SDR-0植物的数目和取决于遗传图谱的大小而自动进行。
图1描述了完全杂合的杂种的4个染色体对的正常减数分裂的发生，以及在发生减数分裂后染色体的自发加倍(称为“相应的双单倍体”)。在所描述的情形中，交换导致了每组中有两个亲本染色体和两个重组染色体产生。由于来自不同染色体组的各自不同的同系物(homolog)的组合，可以产生许多不同的孢子/配子。图1中仅描述了3种可能性。
双单倍体(DH)植物从这些“孢子”产生。双单倍体的产生是一种完全确立了的技术(Doubled haploid production in crop plants，Ed：N.Maluszynski，K.Kasha，B.Forster and I.Szarejko.KluwerAcademic publishers，Dordrecht/Boston/London，(2003)ISBN1-4020-1544-5)。
图2描述了与图1中相同的杂合杂种的减数分裂，但处于第二次分裂不能发生的情况(即第二次分裂重建的情形)。在这种具体的情形中，形成了二倍体孢子，然而与其中发生了自发或诱导的染色体加倍的图1相反，二倍体孢子的产生是由于不存在第二次减数分裂而引起的。在这两幅图中描绘了4个染色体对，并且同系物以浅色或黑色棒状结构显示，其中棒状物上的黑色圆圈表示着丝粒。
双单倍体植物和二倍体SDR植物之间的本质不同通过SDR植物中的染色体上的杂合区段而清楚地看出，而DH植物是完全纯合的。
在这种理论的情形中，分别产生单倍体孢子(从它制备DH)或产生SDR-0孢子的起始植物(供体植物杂种AB)含有完全杂合的同源染色体。这表明，由那些染色体携带的基因的所有等位基因都是不同的。然而，实际上，这是相当不可能的，因而这种情形举例说明了最极端的杂合情形。
从图2中还可以清楚地看出，在SDR情形中决定纯合基因座与杂合基因座的比率的是同源染色体的非姐妹染色单体由于交换而进行互换的程度。每个染色体臂的交换程度的限度是由着丝粒的位置确定。当然，也可以发生来自染色体的另一端的交换，并且在这种情形中也直到着丝粒。从100％杂合的植物开始，这意味着染色体上携带的基因的所有等位基因是多态性的，这是一种极端的情况。实际上，这是相当不可能发生的，因此起始植物的杂合性百分比平均来说将是更低的。
在图2中还注意到，与RIL和BIL相似的SDR-植物的产生。在貌似BIL(BIL-look-alike)的情形中，着丝粒全部来自一个并且相同的原始亲本，即A或B(参见图1)。
从源自正常减数分裂事件(其中染色体数目已经自发地或借助于化学药品加倍)的单倍体孢子再生的植物将进一步被称为DH-0。如果初级再生体源于由缺少第二次减数分裂的减数分裂事件而产生的孢子，则将植物称为SDR-0。
DH-0植物当自花传粉时将产生在遗传上100％相同并且在所有等位基因中完全固定的子代(DH-1)。因而，尽管在DH-0植物上形成的孢子(配子)再次进行减数分裂和重组，但是不能发生基因重排。这意味着，这种所谓的“纯系”是永久的，因为不能发生分离。
然而当生长在不同条件下，例如低或高温，或例如在不同气候带中时，这种纯系可以在表型上显示不同的表现。所述可以观察到的不同是由于环境变化而引起的，并且对于所述品系的所有“成员”都是有效的。换而言之，没有“品系内”变异。来自不同DH-0植物的不同DH1品系的植物之间的不同具有遗传基础，并被称为“品系间”变异。
在SDR情形中，在SDR-1代中观察到不同的图像。图3A和3B描述了在从图2中的SDR-0事件3再生的植物中发生的孢子/配子形成。从图3B中可清楚地看出，通过重组和组合可以发生全套的染色体组合，并且显然地，组合的数目在染色体数目增加时增加。为了发现两个近交亲本之一的(部分杂合的)貌似BIL的情形，概率是(1/2)x-1，其中x是染色体的数目。为了找到特定的(部分杂合的)貌似BIL的情形，概率是(1/2)x。在表型上可观察的最大变异取决于起始材料中的杂合性程度，并且还取决于重组发生的程度。在其中根本不发生重组，或仅在纯合区域发生重组的不可能情况中，SDR-0再生体将在基因型和表型上都等价于双单倍体(DH-0)。
图4显示了仅在重组发生的程度上不同的理论上的个体SDR-0植株(对于一个染色体)。如果性状或效应的分离在SDR-0 C的SDR-1代中发现而在SDR-0 A和SDR-0 B的SDR-1代中没有发现，则由此断定负责所述分离的染色体区域位于B和C的交换位置之间。取决于分子标记的可利用性和可利用的SDR-0植物的数目，负责分离性表型的基因座因而可以得以非常精确地进行作图并且与已知的分子标记相关联。
本发明的该方法在此称为“反向子代作图”。这种方法的独特特点是，它使用来自亲本植物作图群体的植物子代的子代内分离信息来进行QTL-作图。与经常在传统作图中使用的子代手段的使用相反，本方法利用子代变异。其利用对于某一染色体位置来说杂合的个体和对于该位置来说纯合的个体之间的对比，而不管是哪个亲本等位基因的。传统的方法利用染色体位置的全部三种等位基因状态(纯合亲本(AA)、杂合亲本(AB)、纯合亲本(BB))之间的对比，重点强调两种纯合状态之间的对比。
在另一个实施方案中，反向子代作图可以与常规的品系间作图方法相组合以增加QTL-检测的能力。
在一个进一步的实施方案中，个体SDR-1植株表型可用于一般的混合模型方法(mixture model approach)(Jansen RC(1992)Theor.Appl.Genet.85：252-260)，其中对于在被分析的染色体位置上是杂合的每个SDR-0个体模拟三种可能的等位基因状态。
备选地，有可能使用SDR-1品系变异，例如来计算额外的似然比率，所述额外的似然比率可以与常规的似然比率(用于品系间作图)相乘来获得提高的测试统计量(statistic)。
在另一个实施方案中，有可能对于SDR-1品系中分离存在或不存在简单地使用打分。而且在该情况下，可以计算额外的似然比率。
上面的实施例不排除将本发明的品系内和品系间分离的利用与另一种用于QTL-作图的技术相组合的其他可能性。
存在其中反向子代作图方法最佳地起作用的某些条件。在一个优选的实施方案中，对于其来说QTL应当进行作图的性状仅在部分SDR-1品系(优选在50％到80％之间)中分离。这意味着，对于某些多基因性状(对于所述性状来说，更高数量的QTL在群体中分离)，需要较低水平的杂合性。如果必要，这可在HIF的情况中通过进一步杂交或在SDR的情况中通过第二轮SDR来获得，其中将每个SDR-0个体用于产生新的SDR-0植物，产生所谓的SDR2-0群体。应该注意，群体大小足够大以使整个基因组仍然表现为杂合状态。
根据本发明，基于SDR-0的反向子代作图(RPM)结合了双单倍体品系在表型记录中的理想特征和评估杂合基因座单独和与其他杂合或纯合基因座相互作用的效应的可能性。
正如先前已经说明的，SDR品系在其中它们为杂合性的那些染色体区域与DH品系不同，所述杂合性是由于起始材料中的杂合性并且由于在那些杂合区段中的重组而引起的。这意味着，对于所有其他区段，SDR品系与DH-品系相似。这意味着，在表型水平上仅对有限数目的特征观察到品系内分离。然而，可以记录需要特定基因座的杂合性的表型类别。如果，例如，决定一个特定性状的基因座在SDR-0代中是杂合的，取决于第二轮配子形成中的重组位置，其可以在SDR-1代中产生1∶2∶1(AA∶Aa∶aa)的传统的孟德尔分离。如果Aa表型不同于AA和aa，则仍可将其记录。
在某一基因座必须是杂合状态以快速生长的理论情形中，来自具有杂合状态的该基因座的SDR-0植物的SDR-1品系将显示较快生长对正常生长为1∶1的分离，条件是第二轮重组没有改变SDR-0植物的重组位置。与在DH-1品系之间发生的“品系间变异”相反，这是在SDR-0品系中应用“品系内变异”的一个清楚的实例。
此外，理论上的“快速生长”特征的分离可以通过SDR-0代中存在杂合片段来解释。所以，足以在遗传上分析SDR-0代来解释在SDR-1代中在表型上有什么发生并对其进行作图。
本发明方法的能力还通过单独的基因座之间的相互作用可以进行研究这个事实来证明。例如，考虑了这样的植物，即其中一个基因座应该是纯合隐性的(aa)而另两个基因座应该是杂合的以显示目标性状。在该情形中，如果SDR-0代是AA，则对于所述目标性状将不发生分离。但如果SDR-0代是aa，则对于其他基因座所述性状仍将分离。这种所谓的上位效应很难研究，特别是如果该性状也依赖于环境。
DH群体的表型记录的优势由于缺乏品系内分离和缺乏DH-植物的杂合性而被抵消。然而，F2-群体将显示出所期望的所述性状的分离，但倘若每个F2-个体具有不同的遗传背景，则分析受整个基因组是分离性的这个事实阻碍。这形成了大的统计学背景噪音，其降低了检测上位QTL-效应的能力。除此之外，F2-植物仅可以进行表型分析一次，这引入了大的环境误差。在不同环境中复制DH品系并数次记录表型差别的可能性是可靠的QTL-作图的一个巨大优势。
本发明方法同样是这样的。当从SDR-0品系产生足够的种子以使得能够在不同条件下测试相同的SDR-1代时，不仅可以记录以纯和状态作出贡献的基因座，而且还可以记录以杂合状态表现不同的基因座。另外，对于不论是杂合的还是纯和的基因座之间的上位相互作用来说记录是可能的，当然，对于编码定性或数量性状的单基因座位来说也是可能的。这是相对于现有技术来说一个明显的优势。
染色体上的图距以本领域技术人员众所周知的厘摩(cM)表示。在100厘摩的间隔中，平均每个染色单体出现一个交换(Van den BergJ等人，(1997)第334-396页，in：Plant molecular biology-alaboratory manual，Ed.M.Clark，Springer Verlag，Berlin)。这意味着，如果要寻求对位于离着丝粒1cM处的性状进行作图，在50个重组体中有1个具有直到离着丝粒1cM的染色单体互换。当然，这适用于着丝粒的任一侧。
在表1中，概括了使用某些群体类型用于QTL-作图的优点和缺点。它们中的大多数前面已经提过；否则将它们在表中注明。从该表中可清楚地看出，与其他群体相比较，产生基于SDR的群体需要有限的时间和投入，具有产生非常好的结果的前景。以这种方式，SDR-方法将双单倍体群体(DH)的优势(即以有限的花费进行快速的群体发展)与杂合近交家族(HIF)的QTL-作图潜力(即可靠的表型分析，强的QTL检测能力，包括它们的杂合和上位效应，以及用于精细作图的潜力)相结合。
表1.产生和使用数种群体类型以用于QTL-作图所需要的投入以及潜在结果的概述。投入(花费/时间范围)：*：非常有限，**：有限，***：一般，****：大，*****：非常大；结果(除了：杂合子的QTL-效应的估计)：--：非常差，-：差，＝：中等，+＝合理，++＝好，+++＝非常好；结果(仅对于：杂合子的QTL-效应的估计)：-：不可能，＝：可能，+：好。BCx：在x轮回交后的回交群体；RIL：重组近交系；HIF：杂合近交家族：BIL：回交近交系；DH：双单倍体系；SDR：由第二次分裂重建产生的品系。
  群  体  类  型                           投入                            结果    用    于    产    生    群    体劳    的力    用    于    产    生    群    体时    的间所目需(的粗标略记作的图数)所(需粗的略群作体图大)小  每等  个位  基基  因因  座的  Q数  T目  L  -    表    型    的    可    靠    性  Q  T  L  -  检  测  能  力杂应合的子评的估QTL-效精/ 的细或数作残目图留)( 的重杂组合和性  上  位  效  应分  的析  F2    **    **    *    *    2    --/-6，8    -    ＝    -    +  BCx    ***/****3    ***/****3    */**3    **5    2    ＝    +    +    ＝    -  RIL    ****    ****    ***    *    2    ++7    ++    -    +    ++12  HIF    *****    *****    ***    *    2    +8    ++    +    ++    +++  BIL1    *****    *****    **    *    2    ++7    ++    +9    ++9    -  DH    ***    **    *    *    2    ++7    ++    -    -    ++12  SDR    ***    **    *    *    2    +8    ++    +    ++    +++
随机2    *    *    ****4    ***  ＞＝2    ++7＝    +10  -/+11＝
1参见例如：Jeuken MJW，Lindhout P(2004)：The development oflettuce backcross inbred lines(BILs)for exploitation of theLactuca saligna(wild lettuce)germplasm；Theor.Appl.Genet.109(2)：394-401
2用于例如LD-作图的育种系、变种、基因库参加者的群体
3投入随着回交代数(x)而增加
4对多个等位基因进行单倍体型分析所需的高数目的标记
5足够覆盖基因组(特别是在更高的回交代中)所需的更高数目
6F3-品系表型分析比F2-植物表型分析更可靠
7无限的复制是可能的
8无限的复制是可能的，取决于每个品系的种子量
9通过与轮回亲本杂交是可能的
10仅在杂种的情形中
11取决于群体中连锁不平衡的程度
12仅纯和基因座之间的QTL-相互作用
Zhang X等人((2002)Journal of Horticultural Science &Biotechnology 78(1)，84-88)发现，在辣椒中，通过将植物暴露于11℃下48小时可以将SDR 2n配子(花粉)的频率从＜1％增加至高达10.5％(平均值)。最大的SDR发生率据测量为81.3％。根据本发明可将该方法用于增加SDR事件的数目，并因而增加SDR-0配子的数目。
除了SDR的自发发生或通过环境胁迫诱导SDR-0事件数目的增加之外，还提供了不同的遗传方法，所述方法使得能够干扰参与减数分裂的第二次细胞分裂的基因功能。这样的干扰可以通过诱变或基因转移(transgenesis)来进行。转基因方法旨在稳定或暂时引入修饰减数分裂的第二次分裂的DNA片段从而导致SDR类型的二倍体孢子。所述的修饰可以通过干扰参与减数分裂过程的遗传因子，尤其是参与第二次细胞分裂的那些来进行。所述的干扰可以通过基于转录后基因沉默(PTGS)的特异性基因表达下调来建立。PTGS可以通过RNA-干扰(RNAi)或病毒诱导的基因沉默(VIGS)来完成。用于此的技术是现有技术所熟知的。
在另外一个方法中，所述干扰可以通过过表达对于减数分裂的第二次分裂施加显性负影响的蛋白质来建立，从而导致SDR。
因此，在本发明的第一个实施方案中，未减数SDR-0细胞群体由经选择而显示出高于平均值的第二次分裂重建的生物体产生。备选地，SDR-0细胞群体由经遗传修饰而显示出高于平均值的第二次分裂重建的生物体产生。所述遗传修饰是暂时的，或者是通过将增加生物体中第二次分裂重建事件数目的遗传元件稳定整合入基因组中。
在更进一步的实施方案中，未减数SDR-0细胞群体由受到环境胁迫而显示出高于平均值的第二次分裂重建的生物体产生。环境胁迫的实例是温度胁迫、NO2、一氧化二氮N2O或它们的组合。
本发明进一步涉及可通过以下步骤获得的作图群体用于对物种中的一个或多个性状进行作图的用途：
a)提供SDR-0生物体特别是植物的群体，所述生物体每一个起源于由第二次分裂重建产生的未减数细胞群体特别是未减数孢子群体中的一个成员；和
b)产生每个这些SDR-0生物体的SDR-1子代群体。
无论采用什么方法，均需要在分子水平上知道靶标基因。已经描述了导致SDR-类型的减数分裂的马铃薯(pcpc、osos、fcfc)和玉米(elongate)的许多隐性突变体。在这些特定实例中已经突变的基因还没有在分子水平上被鉴定，但是它们是使用分子抑制技术在靶物种中获得SDR的极好候选物，尽管它们仍旧还未克隆。本发明涉及反向子代作图的一般原理，并且不是所有可能的在供体生物体中诱导SDR的实施方案已经得以描述这一事实对于本发明来说是无关的。
备选方案可以在基因如DUET(Venkata Reddy等人，(2003)Development 130，5975-5987)和CYC1；2(Wang等人，(2004)PlantPhysiology 136，4127-4135)中找到，所述基因已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中进行了描述，并且所述基因在突变后导致异常形式的减数分裂。在这些突变体中的二倍体减数分裂产物是SDR样的，并因而DUET和CYC1；2以及它们在其他植物物种中的功能同系物是获得SDR减数分裂的候选靶基因。
另外一个候选靶基因是TETRASPORE/STUD(Yang等人，(2003)Plant J.34，229-240)，其在敲除后导致减数分裂后细胞分裂的缺失。tetraspore/stud突变体的小孢子的二倍体再生体可以是SDR样的。
2n孢子或配子的发生不限于雄配子体，而是还存在证据表明这也在雌配子体的水平上发生。Zagorcheva L报道了在黄瓜中出现大孢子发生和大配子发生的偏离，参见Macrosporgenesis andmacrogametogenesis((1976)Genetics and Plant Breeding 9(5)pp 386-399)。
此外，通过根据EP 0 374 755在黄瓜中产生单倍体和双单倍体，本发明者通过使用AFLP分析(根据EP 0 534 858进行)发现，在所预期的双单倍体中，某一百分比不源于单倍体大孢子而是来源于未减数大孢子(2n)。这在图5、6和7中证明。
图5显示了黄瓜中典型F2系的AFLP模式。每条水平线代表1个单独的植株。每一竖栏表示一连锁群。浅灰色部分表示杂合区域，而黑色和暗色区域表示各自的纯合区域。
图6显示了黄瓜中典型DH系的AFLP分析。每条水平线代表1个个体植物。每一竖栏表示一连锁群。正如在DH中所预期的，仅存在黑色和暗色区域，而不存在浅灰色部分。
图7显示了黄瓜中典型SDR-0植物的AFLP分析。每条水平线代表1个单独的植株。每一竖栏表示一连锁群。浅灰色部分表示杂合区域，而黑色和暗色区域表示各自的纯合区域。从这些附图的比较可得出结论，这些植物中的杂合性比一般F2中的要低很多。
因而，这些附图显示，最初推测的双单倍体(图7)仍然含有杂合部分，这根据定义在真正的双单倍体(图6)中是不可能的。为了比较，图5显示了典型的F2群体的AFLP分析。
取决于起始材料的多态性的量，可以获得未减数孢子/配子及其植物，其仅含有一个或十分有限数目的杂合区段。如果在这种情形中，SDR-1代中的分离性性状和在SDR-0植物中的杂合区段位置之间存在因果关系，那么作图是十分容易的并且可以进行精细作图以便通过本领域技术人员已知的方法进一步降低杂合区段的大小。
为了获得SDR配子，可以使用许多不同的方法。在许多物种中，二倍体配子自发产生，在雄性和雌性两边都产生，这可以通过特定的胁迫条件来增强。再生可以通过的孤雄发育、雌核发育或经针刺授粉(prickle pollination)的孤雌生殖来进行。可以通过用二倍体花粉进行授粉并确定后代的倍性水平来进行优化。
当SDR性母细胞通过雄性减数分裂产生时，有可能通过流式细胞术和荧光激活细胞分选术来富集双倍体细胞。这些技术本身是本领域技术人员所熟知的，并且过去已经应用到小孢子上(参见例如Deslauriers C等人，(1991)Biochem.Biophys.Acta 1091，165-172)，但这些技术还没有用于本发明的作图方法中。
未减数孢子或花粉比它们的单倍体同等物要大。令人惊讶地，2n孢子在物理上不同于n孢子这一仅有的事实使得有可能通过流式细胞术来特异地富集2n孢子。图8显示了试验的结果，在所述试验中将来自四倍体植物(产生二倍体(2n)孢子)的甘蓝小孢子与来自二倍体植物(产生单倍体(n)孢子)的小孢子相混合。较大的孢子是2n。
因而，根据它的进一步方面，本发明提供了用于富集细胞特别是孢子或配子的群体中的SDR细胞特别是SDR孢子或配子的方法，所述方法包括基于大小、质量或DNA含量来分选细胞特别是孢子或配子的群体，并选择具有增加的大小、质量或DNA含量的细胞特别是孢子或配子作为未减数细胞特别是未减数孢子或配子。在一个特定的实施方案中，本发明提供了用于富集孢子或配子群体中的SDR孢子或配子的方法，所述方法包括借助于分选设备，特别是借助于FACS来分选孢子或配子群体的成员。
因此，本发明涉及从SDR或SDR-样未减数配子再生的植物和它们的子代用于对多基因性状或效应进行作图，用于对数量性状作图或效应进行作图，用于对相互依赖的基因座进行作图，用于对显示出上位相互作用的基因座进行作图，用于对效应如杂种优势或配合进行作图力，以及用于对单或寡基因性状进行作图的用途。
在此特别涉及植物地描述了本发明，但所述技术不限于植物而是也可以用于对其他生物体例如真菌或动物中的性状进行作图。
当在本申请中使用术语“未减数细胞”时，旨在指“未减数的生殖细胞”，例如孢子或配子。
本发明将在后面的实施例中进一步举例说明，并且无意于以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
通过引入Elongatel在玉米中产生SDR-0生物体
将核酸整合入玉米的基因组中是常规程序，并且如何完成这一过程的方法已经在例如EP-801134、US-5,489,520中描述。EP-97114654.3教导了DSM6009玉米原生质体的土壤杆菌转化。
Elongatel(Barell，PJ和Grossniklaus，U.(2005)Plant J.43，309-320)是一种扰乱减数分裂从而导致省略第二次减数分裂的核酸序列，使用在上面的专利出版物中描述的转化方法将其引入玉米中。因而，获得了SDR类型的异常孢子。由于转基因核酸序列整合的不同基因组位点，所形成的SDR孢子的频率有时候在独立的转化体之间不同。
由于SDR-事件而产生的小孢子或大孢子含有一套二倍染色体。这些二倍体小孢子或大孢子是用于产生SDR-0再生体的起始材料。按常规从小孢子获得玉米中的单倍体：PescitelliS和Petolino J(1988)Plant Cell Reports 7：441-444；Coumans M等人，(1989)Plant CellReports 7：618-621；Pescitelli S等人，(1989)Plant Cell Reports7：673-676；Buter B(1997)Invitro haploid production in maize.In：In Vitro Haploid Production in Higher plants，vol 4，37-71，Kluwer Academic Publishers.Eds.S Jain，S Sopory & R Veilleux。
备选地，单倍体玉米植物可以在用单倍体诱导者进行天然和人工授粉后获得。在这种情形中，根据Rotarenco V(2002)Maize GeneticsCooperation News Letter 76：16获得含有单倍体胚的种子。
将上面用于产生DH玉米植物的方案也应用于从SDR-0细胞产生SDR-0玉米胚，所述SDR-0细胞的形成是通过将Elongatel整合入基因组中来诱导。
为了在SDR-0谷粒的胚乳范围内于母本和父本基因组之间获得正确的平衡，优选将所述诱导者品系用作四倍体传粉者。
实施例2
通过低温或一氧化氮气体处理在玉米中产生SDR-0生物体
如Kato，A和Birchler，JA(2006)J.Hered.1，39-44所描述的，通过用低温处理玉米植物或通过施加一氧化氮增加了SDR孢子的频率。
由于应用了低温或一氧化氮处理，产生了许多SDR类型的小孢子或大孢子。基于SDR小孢子在大小上与正常单倍体小孢子相比较而言较大这一事实，通过使用流式细胞术或荧光激活细胞分选术富集了孢子群体中的SDR小孢子。由于SDR-事件而产生的小孢子或大孢子含有一套二倍染色体。这些二倍体小孢子或大孢子是用于产生SDR-0再生体的起始材料。如实施例1中所描述的，按常规从小孢子获得玉米中的单倍体。
在用所谓的单倍体诱导者进行天然或人工授粉后还获得了单倍体玉米植物。在这种情形中，根据Rotarenco V(2002)(如上)获得了含有单倍体胚的种子。
将上面产生D H玉米植物的方法也应用于从SDR-0细胞产生SDR-0玉米胚，所述SDR-0细胞的形成是通过该实施例中详细说明的处理来诱导。
如实施例1中提到的，优选使用所谓的单倍体诱导者作为四倍体传粉者以便在胚乳水平上平衡父本和母本基因组。
实施例3
SDR-0生物体的鉴定和表征
可以将来自实施例1和2的SDR-0玉米植物与未经历SDR的DH植物(或与FDR(第一次分裂重建)植物)相区分，因为它们是部分杂合的但具有纯合的着丝粒区。如实施例5中对黄瓜所描述的，使用AFLP分析，未经历SDR的DH-0玉米植物将显示出没有杂合区域的AFLP标记模式，而已经经历SDR的DH玉米植物将在AFLP标记模式中显示出杂合区域。然后，如实施例5中对黄瓜所描述的，进行图谱构建和统计学分析。
实施例4
玉米中SDR-1群体的分析和性状的精细作图
在一致的条件下观察每个在它们基因组中携带杂合区域的SDR-0植物的子代，并且根据发生分离的性状将分离性子代分类。将导致产生对于特定性状来说出现分离的SDR-1子代的SDR-0植物相互比较，以及与对于该性状来说不分离的品系进行比较。SDR-1代中的分离可能与SDR-0植物基因组的杂合区段相关联。这可以通过经典的QTL分析来确证，所述QTL分析确定大多数的侧翼标记和性状基因座之间的最大似然间隔。负责SDR-1代中的分离的基因座的精细作图根据Peleman，J等人，(1995)Genetics 171：1341-1352来进行。
实施例5
用于在黄瓜SDR-0植物中进行作图的杂合区段的产生和鉴定
1.双单倍体和SDR-0植物
从来源于2个纯合(纯的)黄瓜品系之间的杂交的F1再生出双单倍体和SDR-0植物。所有单独的DH和SDR-0植物通过AFLP进行基因型分析。
双单倍体和SDR-0植物的产生根据EP 0374 755来进行。
2.AFLP分析
如Vos P等人，(1995)Nucleic acids Research 23(21)：4407-4414所描述的，进行对DH-0和SDR-0植物的AFLP分析。
用Quantar Pro(Keygene，Wageningen，The Nether lands)处理和分析数据，允许AFLP标记的共显性打分。
3.图谱构建和统计学分析
用计算机程序包JoinMapversion 2.0(Stam，P.，(1993)Plant J.3：739-744)来计算遗传图谱。
4.分离特征
预期下面的特征发生分离。
顶端分裂
叶大小
生长速率
每节的果实数
节间长度
花的大小
果实大小
果实颜色
5.结果
图10显示了对SDR-0和DH-0植物的AFLP分析的结果。每条单独的线表示单个DH-0植物和SDR-0植物。每一竖栏表示一连锁群。在DH系和携带杂合区段(浅灰色区域)的品系之间可以作出明显不同的分类。因此，上述性状在SDR-1代中的分离与杂合区段相关联。
6.精细作图
负责SDR-1代中的分离的基因座的精细作图根据Peleman，J等人，(2005)Genetics 171：1341-1352来进行。
实施例6
甜椒(Capsicum annuum L.)中未减数孢子/配子形成的增强
为了增加未减数孢子/配子形成的频率，将冷胁迫作为诱导剂应用，完全如Zhang X等人，(2002，同上)所描述的。
为此，将含有成熟前的花芽并在23℃下生长的有花甜椒植株暴露于11℃下2天。这种冷击后，采集花芽并且通过用解剖镊和解剖刀打开花药来提取花粉。随后将花粉转移至显微镜载玻片上，并用一滴乙酸洋红就生存力进行染色。将盖玻片放在悬浮液上面，并用光学显微镜观察所述悬浮液。
作为对照，从在23℃下生长的甜椒植株收集花粉。图9显示了从冷处理的植物(9A)相对于从对照植物(9B)收集的花粉的形态学的代表性实例。可以看出，对于经冷处理的植物，具有更大的大小(表明来源于未减数孢子)的花粉的数目大大增加。在这个特定的实例中，据估计，由于冷处理，变大的孢子的％升高至25。因此，显示出，通过温度胁迫来增强未减数孢子的形成是十分可行的。