一种含荷叶和田基黄总黄酮提取物的药物复合物及其用途.pdf

本发明属中药领域，涉及荷叶、田基黄总黄酮提取物制成的药物复合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的新用途，本发明所述的荷叶、田基黄总黄酮是从我国产的荷叶、田基黄中分离提取得到总黄酮提取物，二者的复合物经分离纯化、质谱和13C、1H NMR测定，证实含有化学成分：槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖、异槲皮素、山奈酚等。所述总黄酮提取物的复合物经体外细胞模型和体内动物模型试验，证实其具有较强的抗乙肝病毒和保护肝脏的活性。所述总黄酮提取物复合物可进一步制备抗乙肝病毒药物，制成胶囊，片剂，颗粒和针剂等剂型。

权利要求书
1.  含荷叶和田基黄总黄酮提取物的药物复合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

2.  按权利要求1所述的用途，其特征是所述的药物复合物由荷叶总黄酮提取物和田基黄总黄酮提取物按2∶1的重量配比组成，所述的复合物的化学组分有：槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖、山奈酚和异槲皮素，其化学结构分别如下：

槲皮素                槲皮素-3-O-β-D-吡哺半乳糖

山奈酚                异槲皮素

3.  按权利要求1的所述的用途，其特征是所述的药物复合物通过下述方法制备：
取中药材荷叶、田基黄，用50-95％酒精提取，浓缩，上D-101大孔树脂，用水和酒精梯度洗脱，收集洗脱液，经镁粉/盐酸检测，收集黄酮含量高的部分，浓缩至干，分别制得荷叶、田基黄总黄酮，其中总黄酮含量分别超过50％；所述的荷叶、田基黄总黄酮以2∶1的重量配比制成药物复合物。

4.  按权利要求1的用途，其中所述的药物复合物制成胶囊、片剂、颗粒。

说明书一种含荷叶和田基黄总黄酮提取物的药物复合物及其用途
技术领域
本发明属中药领域，涉及抗乙肝病毒药物，具体涉及一种含荷叶和田基黄总黄酮提取物的药物复合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
背景技术：
荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶，是“药食两用”的食物。荷叶苦，平，归肝、脾、胃经，用于暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚泄泻，血热吐衄，便血崩漏。研究显示，荷叶富含多种活性成分，如：胡萝卜素、黄酮、挥发油、皂类、甾体等，同时它也含有荷叶碱、N一去甲荷叶碱、O一去甲荷叶碱等多种生物碱。荷叶中富含的黄酮类物质，是大多数氧自由基的清除剂，可以提高超氧化物歧化酶(SOD)的活力，减少脂质过氧化物丙二醛(MDA)及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)的生成，增加冠脉流量，对实验性心肌梗塞有对抗作用；对急性心肌缺血有保护作用；对治疗冠心病、高血压等有效果；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病等也有重要作用；印度学者证明荷叶提取物可以有效降低小鼠的血糖水平，提高小鼠糖耐量，加强胰岛素的作用并抑制血糖的吸收，该作用与提取物中的黄酮有关。因此荷叶黄酮是一类极有价值和待开发的物质，它既可作为心血管疾病的原料药，还可广泛应用于功能食品、保健食品和饮料中。此外，荷叶中另一大类活性物质——生物碱，生理活性显著，具有明显的降血脂、抗病毒等功效，柏田良树等发现荷叶中的生物碱具有抗艾滋病毒(HIV)的作用，Boustie.J等发现荷叶生物碱具有抗脊髓灰质炎病毒的作用。喻泽兰等通过观察荷叶水提物对小鼠的急性毒性反应，发现在中药毒性分析的7项指标中，荷叶符合其中5项指标。因此认为荷叶水提物毒性极小，具有广阔的应用前景。但迄今尚物未见有关荷叶提取物抗乙肝病毒的报导。
田基黄原名地耳草，始载于《生草药性备要》、《植物名实图考》，别名雀舌草，系藤黄科金丝桃属植物地耳草(Hypericum japonicum Thum b.)的干燥全草。味甘、微苦，性凉。归肝、胆、大肠经。具有清热利湿、散瘀止痛、消肿解毒的功效。有研究从田基黄中分离出内酯、香豆素、酚类、蒽醌、黄酮类、维生素类等有效成分。黎七雄等研究表明田基黄注射液对四氯化碳(CCl4)所致肝损伤有明显保护作用，其实验结果显示田基黄对正常小鼠肝细胞色素P-450含量无明显影响，但能明显恢复CCl4所致的肝细胞色素P-450含量的降低，并对肝细胞超微结构粗面内质网(RER)和滑面内质网(SER)具有保护作用。肝细胞色素P-450是机体解毒过程中起关键作用的酶系统，田基黄对细胞色素P-450的保护作用有利于肝脏发挥更好的解毒作用。黎七雄等在田基黄注射液对醋氨酚(A P)肝脏毒性的保护作用的研究中，发现田基黄注射液也有保肝作用，能提高肝细胞GSH的含量和保护微粒体GSH的活性，使生成的醋氨酚亲电子活性代谢产物与GSH结合而排出，从而抑制醋氨酚肝脂质过氧化，致使肝脏免受损害。方瑞英等研究结果显示田基黄对半乳糖胺(Glan)或四氯化碳(CCl4)引起原代培养大鼠肝细胞损伤有明显的保护作用。许多学者研究结果表明田基黄能明显提高外周血中性粒细胞(PMN)吞噬率、T淋巴细胞比率、脾脏特异性抗体形成细胞率以及特异性玫瑰花环形成细胞数，但对血液白细胞移行抑制因子及肺泡巨噬细胞吞噬功能无显著影响。说明田基黄能提高大鼠全身的特异性和非特异性细胞免疫功能。实验结果证明田基黄能作用于机体的免疫器官和免疫细胞，促进T淋巴细胞的分化与成熟，从而增强机体的特异细胞免疫和免疫调节作用；田基黄还能增强中性粒细胞的吞噬杀菌功能，从而提高机体抗细菌感染能力，但对肺泡巨噬细胞吞噬功能无显著影响；田基黄对T淋巴细胞分泌白细胞移行抑制因子的作用不明显，但可明显提高脾细胞中特异性抗体形成细胞的比例，显示出对体液免疫的兴奋作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的抗乙肝病毒药物，具体涉及一种含荷叶和田基黄总黄酮提取物的药物复合物。
本发明的进一步目的是提供上述药物复合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
本发明所述药物复合物由荷叶总黄酮提取物和田基黄总黄酮提取物按2∶1的重量配比组成。
本发明从我国产的荷叶或田基黄中分别分离提取得到总黄酮提取物，二者的总黄酮提取物按2∶1的重量配比制成复合物，其中的的组分之一为槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷。
所述的复合物经分离纯化及质谱和13C、1H测定，其中的化学组分有：槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖、山奈酚和异槲皮素，其化学结构分别如下所示：

槲皮素                         槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖

山奈酚                         异槲皮素
本发明所述的药物复合物通过下述方法制备：
取中药材荷叶、田基黄，用50-95％酒精提取，浓缩，上D-101大孔树脂，用水和酒精梯度洗脱，收集洗脱液，经镁粉/盐酸检测，收集黄酮含量高的部分，浓缩至干，分别制得荷叶、田基黄总黄酮，其中总黄酮含量分别超过50％；制得的荷叶和田基黄总黄酮以2∶1的重量配比制成复合物。
所述的复合物经体外细胞模型和体内动物模型试验后，结果证实其具有较强的抗乙肝病毒活性。
所述的复合物可进一步制成抗乙肝病毒的胶囊、片剂、颗粒剂等药物。
具体实施方式：
实施例1
1、提取荷叶、田基黄总黄酮：分别取300克荷叶、田基黄药材，用50-95％酒精提取三次，浓缩提取液至1/4-1/5体积，上D101大孔树脂，用水和70％酒精洗脱，收集洗脱液，经镁粉/盐酸检测验证，收集黄酮含量高的部分，洗脱液浓缩至干得固形物即有效部位产物，称重且测定总黄酮含量。
表1是荷叶总黄酮的提取收率及总黄酮含量。
表2是田基黄总黄酮的提取收率及总黄酮含量。
表1
批号    1  2    3    平均产物产量(克)    6.15  6.53    6.23    6.30产物收率％    2.05  2.17    2.07    2.09总黄酮量(克)    3.35  3.62    3.46    3.48总黄酮含量％    54.47  55.44    55.53    55.23
注：总黄酮含量为总黄酮提取物中黄酮的含量
表2
批号    1    2    3    平均产物产量(克)    4.35    4.72    4.56    4.54产物收率％    1.45    1.57    1.52    1.51总黄酮量(克)    2.65    2.54    2.43    2.47总黄酮含量％    60.91    53.81    53.28    56.00
2、取荷叶总黄酮的提取物和田基黄的总黄酮提取物以2∶1的重量配比制成复合物。
3、结构鉴定
制得的复合物进行分离纯化和经质谱和13C、1H测定，结果显示，其中的化学组分有：槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖、山奈酚、异槲皮素等，其化学结构分别如下所示：

槲皮素                       槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖

山奈酚                          异槲皮素
实施例2
取荷叶总黄酮提取物50克和田基黄总黄酮提取物25克，粉碎混匀过100目筛，加入淀粉3克混合均匀，再加入10％淀粉浆适量制成软材，20目筛网制粒，60-70℃干燥，过30目筛整粒，加入羟丙基纤维素3克和硬脂酸镁1克充分混匀，压片，薄膜包衣，即得片剂：1000片。
实施例3
取荷叶总黄酮提取物50克和田基黄总黄酮提取物25克，粉碎混匀过100目筛，加入淀粉3克，微晶纤维适量，用稀乙醇制粒，20目筛网制粒，60-70℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁适量，充分混匀，填入胶囊即得胶囊剂，1000粒。
实施例4
取取荷叶总黄酮提取物50克和田基黄总黄酮提取物25克，混匀粉碎过100目筛，加入淀粉300克加入10％淀粉浆适量制成颗粒，60-70℃干燥，得颗粒剂，分装200袋。
实施例5
抗乙肝病毒体外试验
按卫生部新药临床前药理指南规定，采用HepG22.215细胞，对药物的抗乙肝病毒作用进行测试，实验结果表明，本发明制得的荷叶和田基黄的总黄酮提取物的复合物具有较强的抑制乙肝病毒s抗原和e抗原的作用，联合用药比单一用药对s抗原的抑制分别提高6.19％(荷叶)和40.62％(田基黄)，联合用药比单一用药对e抗原的抑制分别提高31.90％(荷叶)和26.48％(田基黄)。
表3是荷叶、田基黄总黄酮及其复合物体外抗病毒效果。
表3
  HBsAg的抑制率   HBeAg的抑制率荷叶总黄酮(50μg/ml)田基黄总黄酮(50μg/ml)  33.9％  25.6％   46.7％   48.7％荷叶总黄酮：田基黄总黄酮复合物(50μg/ml)  36.0％   61.6％
抗乙肝病毒体内试验：
按卫生部新药临床前药理指南规定，采用北京芙蓉鸭作为乙肝新药的动物模型，连续给药所述的复合物10天，分别在0天、5天、10天和停药后3天，测定鸭血清中DNA的抑制情况。结果证明本药物复合物，给药量为100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg时，显示对鸭乙肝病毒DNA有较强的抑制作用，其中50mg/kg的给药量抗乙肝病毒的作用最强。
将试验鸭在实验结束后取出肝脏，做电镜检测，未见因乙肝病毒感染而引起的肝坏死，鸭肝脏肿胀得到明显改善。结果证实口服荷叶、田基黄总黄酮复合物后，对鸭乙肝病毒感染引起的肝损伤有明显的保护作用。
表4是荷叶、田基黄总黄酮复合物对鸭乙肝病毒DHBV-DNA的抑制。
表4
 组号  动物  数目大剂量(100mg/kg)  中剂量(50mg/kg)  小剂量(25mg/kg)    抑制率    P值    抑制率  P值 抑制率  P值 0天  6 5天  6    38.1％    0.367    69.8％  0.005* 38.3％  0.164 10天  6    56.8％    0.112    66.9％  0.006* 77.1％  0.003* 13天  6    21.5％    0.759    52.6％  0.033* 51.4％  0.046*
*The mean difference is significant at the.05 level.