一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法 【技术领域】
本发明属于香蕉生物技术育种领域，特别涉及一种有效提高大蕉(MusaABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)和巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)胚性悬浮细胞(ECS)体胚发生频率并成功再生植株的方法。
背景技术
香蕉(包括大蕉)是世界上最重要的经济作物和农作物之一，也是许多热带亚热带国家和地区的主要粮食，为近五亿人口提供主食，是继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食来源。我国香蕉的总产量居全球的第三/四位，广泛种植于广东、福建、海南、广西和云南等省，产销数额一直雄居南方水果之冠，被誉称为我国南方的四大水果之一，有着巨大的经济和社会效益。但是目前香蕉病害猖獗，面临着包括真菌、细菌、病毒和生理性等多种病害的严重威胁，其中由尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病能侵染绝大多数香蕉栽培品种，已经成为我国乃至世界上香蕉毁灭性的病害。我国最受大众欢迎的巴西蕉(Musa AAACavendish cv.Baxi)正是易感香蕉枯萎病的品种之一，而另一栽培种大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)已被证实具有抗香蕉枯萎病4号生理小种的优良特性，但由于其风味口感较差而市场收益不高。因此，如何培育出抗香蕉枯萎病且具有高经济效益的香蕉新种是目前香蕉产业所面临的迫切问题。然而大多数栽培蕉是无法产生种子的三倍体，难于利用传统的杂交育种方式对其种质进行改良。而包括体外诱变、转基因、体细胞杂交等生物技术育种方式有望可解决香蕉面临的上述问题。建立稳定的香蕉胚性细胞悬浮系(ECSs)及高效的经体胚发生途径的植株再生体系则是香蕉生物技术育种的前提条件。目前香蕉ECSs可通过多种途径获得，包括未成熟合子胚培养、scalps培养及未成熟花序培养。以未成熟花序为外植体是获得香蕉ECSs并经体胚发生途径获得再生植株的较有效和重复性最好的方法，应用此法已经从多个品种的香蕉中成功获得再生植株。但是这一培养体系亦存在不足之处：花序外植体的采集受抽蕾季节的限制、不同植株花序生理状态的差异、样品采集时气候的不同等诸多因素都影响该体系的稳定性，致使其胚性愈伤组织诱导率通常低于4％；胚性愈伤组织转换为理想的ECS效率及其体胚发生能力、植株转换率(通常不高于20％)均非常低下。鉴于以上技术瓶颈，目前尚未有建立巴西蕉ECS和大蕉ECS及其通过体胚发生再生植株的相关报导。
【发明内容】
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎(简称体胚)发生再生植株的方法。该方法首次建立大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)和巴西蕉(Musa AAA Cavendishcv.Baxi)的胚性细胞悬浮系，并提供一种有效的提高其体细胞胚胎发生频率成功再生植株的方法，为大蕉和巴西蕉的生物技术育种奠定基础。
本发明的目的通过下述方案实现：一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)胚性愈伤组织的诱导：分别以大蕉或巴西蕉1～12梳未成熟雄花序为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织。
(2)均一稳定的胚性细胞悬浮系(ECS)的建立：挑取步骤(1)诱导出的大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织或巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织，分别转入M2液体培养基，置于90～110rpm摇床上悬浮培养3～4个月即可得较为分散、均质的大蕉胚性悬浮细胞或巴西蕉胚性悬浮细胞。
(3)体细胞胚胎的诱导：在体胚诱导前先将上述胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2液体培养基中预培养7～10天，随后经筛网过滤筛选出大小及生长状态较一致的细胞团，从中吸取0.2～2ml 20％SCV(settled cell volume，静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎的诱导；将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养直至体胚发育成熟，得到成熟体胚。
(4)体胚的萌发及其植株再生：将步骤(3)诱导出的成熟体胚转入体胚萌发培养基中；置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至MR生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的香蕉小植株。
所述不含2，4-D的M2液体培养基的组成为：MS基本培养基+4.1μmol·L-1生物素+680μmol·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+130mmol·L-1蔗糖，pH5.3，高温高压灭菌。
所述体胚诱导培养基的组成为：SH(Schenk和Hildebrandt 1972)大量和微量元素及其铁盐+MS维生素+4.5μmol·L-1生物素+680μmol·L-1谷氨酰胺+2mmol·L-1脯氨酸+100mg·L-1麦芽提取物+1.1μmol·L-1NAA+0.5μmol·L-1激动素+44μg·L-1玉米素+29mmol·L-1乳糖+130mmol·L-1蔗糖+1mg·L-1ABA+5mg·L-1抗坏血酸+2g·L-1Gelrite，其中ABA和抗坏血酸事先分别配置成10mg·ml-1母液，过滤灭菌后添加到pH5.8、经高温高压灭菌后温度降至45℃左右的其余培养基成分中混匀，分装于直径9.5cm的培养皿中，20～25ml/皿。
步骤(3)所述20％SCV悬浮细胞是按下述方法制备得到：吸取约5ml悬浮细胞于15ml刻度管中，静置10分钟后，弃上清，将所得的细胞沉淀体积用不添加凝固剂Gelrite的体胚诱导培养基稀释至5倍体积。
为了更好地实现本发明，步骤(3)中经筛网过滤所得细胞团优选大小范围为154μm～900μm的细胞团。
所述大蕉细胞接种量最佳为0.4ml 20％SCV；巴西蕉细胞接种量最佳为1ml 20％SCV。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)在体胚诱导前采用预培养的方式降低香蕉胚性悬浮细胞外源2，4-D的含量，可促进悬浮细胞的体胚发生频率。与文献报道的不经预培养直接进行体胚诱导的方法相比，前者的体胚诱导率及其后的植株转换率均比后者提高1倍左右(见表1)。
(2)在体胚诱导前使用两种不同孔径的筛网对香蕉胚性悬浮细胞进行过滤筛选出大小及生长状态较一致的细胞团，可在一定程度上实现体胚诱导的同步化，从而很大幅度上提高了悬浮细胞的体胚诱导频率。实验结果表明大小在154μm～900μm之间的大蕉细胞团的体胚诱导率比其余两种不同大小范围的细胞团平均高出7.2倍，这在巴西蕉上取得的效果更显著，平均可高出20.5倍(见表2)。
(3)采用不同的细胞接种量进行香蕉体胚的诱导，结果表明大蕉细胞的接种量为0.4ml 20％SCV、巴西蕉细胞的接种量为1ml 20％SCV时可获得最佳效果，比其余接种量平均可高出2.8倍(见表2)。本实验室在大蕉和巴西蕉以外的香蕉品种的试验中也获得了类似的效果，即体胚的诱导存在一个最佳的细胞接种量，不同的香蕉品种略有差异。
(4)在体胚诱导初期于体胚诱导培养基上同时添加1mgL-1ABA和5mgL-1抗坏血酸，这在一定程度上防止了大蕉在体胚诱导期间培养物容易褐化的现象，同时可使大蕉和巴西蕉胚性悬浮细胞的体胚诱导率均提高1倍以上(见表3)。
表1 预培养对胚性悬浮细胞体胚诱导及植株转换的影响
香蕉品种 体胚诱导前的细胞处理 体胚诱导率 (个/ml SCV) 植株转换率(％)大蕉巴西蕉 经预培养 不经预培养 经预培养 不经预培养 1600±67 950±44 18600±405 12500±276 20±3 10±2 35±4 17±3
实验重复3次，所得数据为平均值±标准误差。
表2 细胞团大小及接种量对体胚诱导的影响
香蕉品种及诱导体 胚的细胞接种量 (ml 20％SCV) 体胚发生频率(个/ml SCV) 细胞团大小＞ 900μm 154μm＜细胞团 大小＜900μm 细胞团大小＜ 154μm 大蕉 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2.0 巴西蕉 0.5 1.0 2.0 140±18 120±13 100±13 60±8 30±6 20±5 800±66 1500±76 500±32 1500±76 2000±87 1000±42 400±36 250±31 90±26 6000±76 25000±153 11000±126 240±26 320±31 200±36 80±26 100±15 50±12 400±36 700±53 200±25
实验重复3次，所得数据为平均值±标准误差。
表3 ABA和抗坏血酸对香蕉体胚诱导及培养物褐化程度的影响
香蕉品种 培养基 体胚诱导率 (个/ml SCV) 培养物褐化程度大蕉巴西蕉现有技术的体胚诱导培养基(M)M+1mg.L-1ABA+5mg.L-1抗坏血酸现有技术的体胚诱导培养基(M)M+1mg.L-1ABA+5mg.L-1抗坏血酸 950±44 2500±79 12500±276 28500±361 严重褐化 轻微褐化 部分轻微褐化 无褐化现象
实验重复3次，所得数据为平均值±标准误差。
【附图说明】
图1为大蕉胚性细胞悬浮系的建立及其经体胚发生途径再生植株的过程图。
图2为巴西蕉胚性细胞悬浮系的建立及其经体胚发生途径再生植株的过程图。
【具体实施方式】
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所需各种培养基如下：
愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基(Murashige and Skoog，1962)+4.5μmol·L-1生物素+18μmol·L-12，4-D+5.4μmol·L-1NAA+5.7μmol·L-1IAA+87mmol·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH 5.8。
M2液体培养基：MS基本培养基+4.5μmol·L-12，4-D+4.1μmol·L-1生物素+680μmol·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+130mmol·L-1蔗糖，pH5.3。
不含2，4-D的M2液体培养基：MS基本培养基+4.1μmol·L-1生物素+680μmol·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+130mmol·L-1蔗糖，pH5.3。
体胚诱导培养基：SH(Schenk和Hildebrandt 1972)大量和微量元素及其铁盐+MS维生素+4.5μmol·L-1生物素+680μmol·L-1谷氨酰胺+2mmol·L-1脯氨酸+100mg·L-1麦芽提取物+1.1μmol·L-1NAA+0.5μmol·L-1激动素+44μg·L-1玉米素+29mmol·L-1乳糖+130mmol·L-1蔗糖+1mg.L-1ABA+5mg.L-1抗坏血酸+2g·L-1Gelrite，pH5.8。
体胚萌发培养基：MS大量元素和微量元素及其铁盐+Morel and Wetmore维生素(Morel和Wetmore 1951)+0.2μmol·L-16-BA+1.1μmol·L-1IAA+87mmol·L-1蔗糖+2g·L-1gelrite，pH 5.8。
MR生根壮苗培养基：MS基本培养基+87mmol·L-1蔗糖+0.1％活性炭+7g·L-1琼脂，pH5.8。
实施例1
建立大蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉品种的选取。选用的品种为我国主栽品种之一、抗香蕉枯萎病4号生理小种的大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)。
(2)大蕉胚性愈伤组织的诱导。于八月中旬取大蕉结果后的顶端花蕾，剥除外部苞片及雄花至离花序顶端4～6cm部分，用75％酒精消毒处理5min左右，无菌水洗涤3次。在无菌条件下，进一步剥除外围花苞至1～1.5cm，以花蕾顶端分生组织为基准切取1～12梳未成熟的雄花序接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养5～6个月，期间视情况更新1～2次培养基；诱导出大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织。
(3)均一稳定的大蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立。挑取步骤(1)诱导出的黄色小颗粒状胚性愈伤组织2克左右，转入含30ml M2液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃，90～110rpm摇床上黑暗培养。在培养的第一个月每周吸弃约2/3的旧培养液，用新鲜的M2液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继代一个月后，用154μm孔径筛网过滤去除较大的细胞团，继续培养一月左右即可得较为分散、均质的大蕉胚性细胞悬浮系。
(4)大蕉体细胞胚胎的诱导。在体胚诱导前先将大蕉胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2液体培养基中预培养7天，随后经154μm孔径筛网过滤，取过滤所得的小于154μm的细胞团，吸取0.2ml 20％SCV(静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导。一个月后将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基继续培养2月左右直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；体胚诱导率约为380个/ml SCV。
(5)大蕉体胚的萌发及植株再生。将步骤(4)诱导出的成熟体胚转入萌发培养基中。萌发起始将培养物置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至MR生根壮苗培养基中于30μmol m-2s-1光强(白色荧光灯)，16h/8h光周期条件下继续培养一月左右，进一步发育成健壮的大蕉小植株；植株转换率约为14％。
实施例2
建立大蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉品种的选取。选用的品种为抗香蕉枯萎病4号生理小种的大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)。
(2)大蕉胚性愈伤组织的诱导。同实施例1步骤(2)诱导出大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织。
(3)均一稳定的大蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立。挑取步骤(1)诱导出的胚性愈伤组织2克左右，转入含30ml M2液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃，90～110rpm摇床上黑暗培养。在培养的第一个月每周吸弃约2/3的旧培养液，用新鲜的M2液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继代一个半月后，用154μm孔径筛网过滤去除较大的细胞团，继续培养一月左右即可得较为分散、均质的大蕉胚性细胞悬浮系。
(4)大蕉体细胞胚胎的诱导。在体胚诱导前先将大蕉胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2液体培养基中预培养8天，随后依次经900μm和154μm孔径筛网过滤，取过滤所得的小于900μm且大于154μm的细胞团，吸取0.4ml20％SCV(静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导。一个月后将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养2月左右直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；体胚诱导率约为2760个/ml SCV。
(5)大蕉体胚的萌发及植株再生。同实施例1步骤(5)将大蕉成熟体胚发育成健壮的大蕉小植株；植株转换率约为22％。
实施例3
建立大蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉品种的选取。选用的品种为抗香蕉枯萎病4号生理小种的大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)。
(2)大蕉胚性愈伤组织的诱导。同实施例1步骤(2)诱导出大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织。
(3)均一稳定的大蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立。挑取步骤(1)诱导出的胚性愈伤组织2克左右，转入含30ml M2液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃，90～110rpm摇床上黑暗培养。在培养的第一个月每周吸弃约2/3的旧培养液，用新鲜的M2液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继代两个月后，用154μm孔径筛网过滤去除较大的细胞团，继续培养一月左右即可得较为分散、均质的大蕉胚性细胞悬浮系。
(4)大蕉体细胞胚胎的诱导。在体胚诱导前先将大蕉胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2液体培养基中预培养10天，随后经900μm孔径筛网过滤，取过滤所得的大于900μm的细胞团，吸取2.0ml 20％SCV(静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导。一个月后将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养2月左右直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；体胚诱导率约为46个/ml SCV。
(5)大蕉体胚的萌发及植株再生。同实施例1步骤(5)将大蕉成熟体胚发育成健壮的大蕉小植株；植株转换率约为11％。
如图1所示为大蕉胚性细胞悬浮系的建立及其经体胚发生途径再生植株的过程，其中：A、诱导愈伤组织的大蕉未成熟雄花序外植体(bar＝1.5mm)；B、由大蕉未成熟雄花序诱导出的黄色颗粒状胚性愈伤组织(bar＝8mm)；C、大蕉胚性愈伤组织的起始悬浮培养(bar＝13mm)；D、依次经900μm和154μm孔径筛网过滤后培养3个月以上所得的分散均质的大蕉胚性细胞悬浮系(bar＝11mm)；E、大蕉胚性悬浮细胞体胚的起始诱导(bar＝15mm)；F、在体胚诱导培养基上培养20天后获得的球形胚(bar＝6mm)；G、更新体胚诱导培养基后继续培养一月后所得的体胚(bar＝17mm)；H、培养三个月后的成熟体胚(bar＝6mm)；I、萌发中的体胚(bar＝8mm)；J、萌发体胚转入MR培养基中一月后获得的大蕉小植株(bar＝12mm)。
实施例4
建立巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉品种的选取。选用的品种为我国目前栽培最广泛且最受大众欢迎的巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)。
(2)巴西蕉胚性愈伤组织的诱导。于八月中旬取巴西蕉结果后的顶端花蕾，剥除外部苞片及雄花至离花序顶端4～6cm部分，用75％酒精消毒处理5min左右，无菌水洗涤3次。在无菌条件下，进一步剥除外围花苞至1～1.5cm，以花蕾顶端分生组织为基准切取1～12梳未成熟的雄花序接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养5～6个月，期间视情况更新1～2次培养基。诱导出巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织。
(3)均一稳定的巴西蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立。挑取步骤(1)诱导出的浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织2克左右，转入含30ml M2液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃，90～110rpm摇床上黑暗培养。在培养的第一个月每周吸弃约2/3的旧培养液，用新鲜M2液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继代一个月后，用154μm孔径筛网过滤除去较大的细胞团，继续培养一月左右即可得较为分散、均质的巴西蕉胚性细胞悬浮系。
(4)巴西蕉体细胞胚胎的诱导。在体胚诱导前先将巴西蕉胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2培养基中预培养7天，随后经154μm孔径筛网过滤，取过滤所得的小于154μm的细胞团，吸取0.5ml 20％SCV(静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1 ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导。一个月后将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养2月左右直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；体胚诱导率约为720个/ml SCV。
(5)巴西蕉体胚的萌发及植株再生。将步骤(4)诱导的成熟体胚转入萌发培养基中。萌发起始将培养物置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至MR生根壮苗培养基中于30μmol m-2s-1光强(白色荧光灯)，16h/8h光周期条件下继续培养一月左右，进一步发育成健壮的巴西蕉小植株；植株转换率约为24％。
实施例5
建立巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉品种的选取。选用的品种为巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)。
(2)巴西蕉胚性愈伤组织的诱导。同实施例4步骤(2)诱导出巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织。
(3)均一稳定的巴西蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立。挑取步骤(1)诱导出的胚性愈伤组织2克左右，转入含30ml M2液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃，90～110rpm摇床上黑暗培养。在培养的第一个月每周吸弃约2/3的旧培养液，用新鲜M2液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继代一个半月后，用154μm孔径筛网过滤除去较大的细胞团，继续培养一月左右即可得较为分散、均质的巴西蕉胚性细胞悬浮系。
(4)巴西蕉体细胞胚胎的诱导。在体胚诱导前先将巴西蕉胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2培养基中预培养8天，随后依次经900μm和154μm孔径筛网过滤，取过滤所得的小于900μm且大于154μm的细胞团，吸取1.0ml20％SCV(静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导。一个月后将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养2月左右直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；体胚诱导率约为28500个/ml SCV。
(5)巴西蕉体胚的萌发及植株再生。同实施例4步骤(5)将巴西蕉成熟体胚发育成健壮的巴西蕉小植株；植株转换率约为37％。
实施例6
建立巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉品种的选取。选用的品种为巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)。
(2)巴西蕉胚性愈伤组织的诱导。同实施例4步骤(2)诱导出巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织。
(3)均一稳定的巴西蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立。挑取步骤(1)诱导出的胚性愈伤组织2克左右，转入含30ml M2液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃，90～110rpm摇床上黑暗培养。在培养的第一个月每周吸弃约2/3的旧培养液，用新鲜M2液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继代两个月后，用154μm孔径筛网过滤除去较大的细胞团，继续培养一月左右即可得较为分散、均质的巴西蕉胚性细胞悬浮系。
(4)巴西蕉体细胞胚胎的诱导。在体胚诱导前先将巴西蕉胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2培养基中预培养10天，随后经900μm孔径筛网过滤，取过滤所得的大于900μm的细胞团，吸取2.0ml 20％SCV(静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导。一个月后将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养2月左右直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；体胚诱导率约为930个/ml SCV。
(5)巴西蕉体胚的萌发及植株再生。同实施例4步骤(5)将巴西蕉成熟体胚发育成健壮的巴西蕉小植株；植株转换率约为19％。
如图2所示为巴西蕉胚性细胞悬浮系的建立及其经体胚发生途径再生植株的过程，其中：A、诱导愈伤组织的巴西蕉未成熟雄花序外植体(bar＝1.4mm)；B、由巴西蕉未成熟雄花序诱导出的浅黄色颗粒状胚性愈伤组织(bar＝4.8mm)；C、巴西蕉胚性愈伤组织悬浮培养3个月以上所得的分散均质的胚性细胞悬浮系(bar＝12mm)；D、巴西蕉胚性悬浮细胞在体胚诱导培养基上培养一月后所得的体胚(bar＝15mm)；E、培养三个月后的成熟体胚(bar＝13mm)；F、萌发中的体胚(bar＝16mm)；G、在MR培养基上培养一月后所得的巴西蕉小植株(bar＝10mm)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。