抗HER2单链抗体力达霉素强化融合蛋白HER2FVLDM.pdf

本发明涉及一种强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)，它是由抗HER2单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾形成的融合蛋白HER2(Fv-LDP)(分子量约为40kDa)以及活化型烯二炔发色团AE(分子量为843Da)构成的，基因全长1110bp，编码369个氨基酸，体内、外实验结果证明，所说强化融合蛋白对HER2高表达肿瘤细胞体内、外均具有明显的杀伤作用，可望开发成为临床上高效、小型化抗体导向药物。

权利要求书
1.  一种强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)，其特征在于它由抗HER2单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾形成的融合蛋白Fv-LDP(分子量约为40kDa)以及活化型烯二炔发色团AE(分子量为843Da)构成的，基因全长1110bp，编码369个氨基酸。

2.  如权利要求1所述的强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)，其特征在于其中的Fv基因全长732bp，编码244个氨基酸，LDP基因全长342bp，编码114个氨基酸，二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸，编码羧基端的组氨酸六聚尾基因18bp，编码6个氨基酸，终止密码子3bp。

3.  制备如权利要求1所述强化融合蛋白的方法，其特征在于所说方法主要采用DNA重组和分子强化两条技术路线，具体步骤如下：
A.力达霉素辅基蛋白LDP与抗HER2单链抗体Fv的融合基因构建；
B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pET-Fv-LDP的构建；
C.融合蛋白HER2(Fv-LDP)在大肠杆菌(保藏编号：CGMCC No.1990)中的诱导表达；
D.融合蛋白HER2(Fv-LDP)的亲和层析纯化及分离；
E.强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)的制备分离。

4.  如权利要求3所述的制备方法，其特征是运用基因工程技术分别克隆得到力达霉素辅基蛋白LDP基因和抗HER2单链抗体Fv基因，将二者以编码一段柔性小肽的DNA序列相连，构建成Fv-spacer-LDP形式的融合基因，同时在spacer区引入特异性酶切位点。

5.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是将所得到的融合基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)中，构建重组表达质粒pET-Fv-LDP。

6.  如权利要求3或5所述的制备方法，其特征是将pET-Fv-LDP转化至大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达，获得周质腔形式的融合蛋白Fv-LDP，并进行条件优化获得最佳表达。

7.  如权利要求3或6所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白HER2(Fv-LDP)，浓缩冻干，制备功能性融合蛋白。

8.  如权利要求3或7所述的制备方法，其特征是将纯化分离得到的融合蛋白HER2(Fv-LDP)与经甲醇提取制备的力达霉素活性型烯二炔发色团AE，按1∶5分子比进行分子强化，获得强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)。

9.  强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)在制备抗HER2高表达肿瘤新型抗体导向药物中的应用。

说明书抗HER2单链抗体-力达霉素强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)
技术领域：
本发明涉及一种强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)，具体来讲，所涉及的强化重组蛋白含有抗HER2的单链抗体和力达霉素辅基蛋白的氨基酸序列以及与力达霉素辅基蛋白结合的烯二炔类发色团，可以用作肿瘤治疗的新型抗体导向药物。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增高，人们迫切需要采用新的治疗方法(包括新药)来提高患者的生存率及生活质量。分子靶向治疗在肿瘤治疗中的地位日益上升，已成为肿瘤治疗的一个新热点。目前已有多种分子靶向治疗药物应用于乳腺癌的治疗或正在临床试验阶段，如赫赛汀、Iressa、细胞周期调节蛋白抑制剂、COX-2(环氧化酶-2)抑制剂、PKC(蛋白激酶C)抑制剂等。
HER2受体是人表皮生长因子受体家族四成员之一，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中均有表达。HER2过表达会增加肿瘤细胞侵袭、转移的能力。通过启动多种转移相关机制而增加转移能力，包括细胞迁移率，体外侵袭力，IV型胶原酶活性，也能影响某些粘附分子如上皮细胞钙粘蛋白等的合成，从而促进转移。研究表明，HER2表达的高低与乳腺癌的临床诊断、药物疗效及愈后判断关系密切。HER2是治疗乳腺癌及卵巢癌的特异性靶点。
Herceptin(商品名赫赛汀)的有效成分为重组人源性抗HER2单克隆抗体Trastuzumab，是将人IgGl的稳定区(Fc)和针对HER2受体胞外区的鼠源单克隆抗体的抗原决定簇嵌合在一起的人源化单克隆抗体，由美国旧金山基因技术公司和罗氏药厂联合研究生产，1998年被美国FDA批准上市。据国外报道，单用抗HER2的单克隆抗体Herceptin，对HER2过度表达的转移性乳腺癌有较好效果，与紫杉醇、诺维本、卡铂和顺铂等化疗药联合应用，优于单用Herceptin或单用化疗。HER2的单链抗体可与barnase、SEC2、ERP5、TNF-α等偶联，作为载体将药物导向靶抗原。HER2/neu(erbB2)在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、非小细胞肺癌中均有高表达。以抗HER2单抗e23为基础，构建与免疫毒素的融合蛋白有e23(Fv)-PE38、e23(ds-Fv)-PE38、FRP5scFv-ETA等。e23(ds-Fv)-PE38对HER2阳性细胞有特异性细胞毒作用，并能促使免疫缺陷小鼠体内生长的人胃癌消退。但是，将HER2的单链抗体与力达霉素偶联作为抗肿瘤导向药物的强化融合蛋HER2(Fv-LDM)，迄今为止尚未见有相关报道。
作为高活性的“弹头”药物力达霉素(lidamycin，LDM，又称C1027)，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的由一株球孢链霉菌Streptiomycesglobisporus(2007年4月3日保藏于CGMCC，菌种保藏号为：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，体外实验显示出强烈的肿瘤细胞杀伤作用。LDM的分子由两部分组成：一部分为烯二炔结构的发色团，具有细胞毒作用，但不稳定；另一部分为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定性起保护作用。力达霉素具有独特的可拆分的分子结构特点，便于DNA重组以及分子强化；另一方面，LDM分子量只有10.5kDa，LDP与单链抗体制备的融合蛋白分子量只有40kDa左右，低于其它已知的免疫毒素融合蛋白。
单抗靶向药物的小型化、高效化以及寻找新的特异性肿瘤靶标，是解决当前单抗治疗剂存在问题的主要有效途径。运用基因工程技术构建获得的单链抗体scFv与力达霉素制备的免疫导向融合蛋白，能够有效地将效应分子导向特异性肿瘤靶部位，比用化学偶联技术获得的免疫偶联物更具分子均一性及高效小型化等优点。
本实验室采用噬菌体展示技术，筛选出HER2高亲和力单链抗体scFv，越过细胞融合、杂交瘤细胞克隆基因的步骤，直接从免疫小鼠的脾细胞中获取抗体基因，省时省力，扩大了筛选容量，有利于筛选高亲和力抗体，而且筛选到的抗体更易于在大肠杆菌中表达。单链抗体(scFv)分子量为30kD，是完整IgG抗体的1/6，是目前研究最活跃的基因工程抗体之一。由于scFv分子量小，所以作为异种蛋白的免疫原性小；用于肿瘤治疗时，因组织穿透能力强，较易进入实体瘤内部；构建也方便，易于与酶基因或毒素基因等连接形成融合蛋白分子，表达出酶联抗体或免疫毒素等，有利于发挥其免疫诊断、治疗的作用。本发明所说强化融合蛋白中的单链抗体靶点，是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌等肿瘤高表达的HER2胞外段蛋白，不同于本实验室先前以基质金属蛋白酶等与肿瘤侵袭转移有关的蛋白酶靶点构建的单域抗体，在临床上有确切的治疗应用价值，且所说单链抗体比单域抗体亲和力高，组织穿透能力强。
本发明的目的是在构建新的融合蛋白HER2(Fv-LDP)基础上，严格控制所用发色团的质量，使用具有高活性的活化型烯二炔(AE)进行分子强化，构建、提供以力达霉素为“弹头药物”，scFv为载体可用于HER2高表达肿瘤治疗的高效、小型化抗体导向药物HER2(Fv-LDM)。
发明内容：
本发明所提供的强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)是由抗HER2单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP以及活化型烯二炔发色团AE组装而成的，基因全长1110bp，编码369个氨基酸。其制备方法为：

本发明利用噬菌体抗体库技术制备鼠源性的HER2单链抗体(scFv)，其具有分子量小，容易穿透各种屏障进入肿瘤组织，免疫原性低，清除率快等优点。本发明利用噬菌体展示技术筛选HER2高亲和力单链抗体，与力达霉素构建具有靶向杀伤HER2高表达肿瘤的强化融合蛋白，有助于乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的导向治疗。力达霉素辅基蛋白与抗体形成的融合蛋白，可与具有细胞毒活性的烯二炔发色团非共价结合，使发色团具有靶向杀伤肿瘤活性。
该融合蛋白以抗HER2的单链抗体scFv，将弹头药物力达霉素靶向于HER2抗原高表达的乳腺癌或卵巢癌组织部位，发挥对肿瘤细胞的杀伤作用，体外试验证明具有明显的效果，展示出良好的临床应用前景。
本发明所提供的强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)，其制备方法包括以下步骤：
HER2噬菌体抗体库的构建及筛选；
融合蛋白HER2(Fv-LDP)重组表达质粒的构建；
融合蛋白HER2(Fv-LDP)在大肠杆菌BL21star1M(DE3)中的诱导表达；
融合蛋白HER2(Fv-LDP)亲和层析纯化及分离制备；
强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)的制备。
本发明还提供了融合蛋白HER2(Fv-LDP)及强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)的生物学活性试验，包括：
融合蛋白HER2(Fv-LDP)的免疫学活性测定；
融合蛋白与SKBR3细胞的结合免疫荧光测定；
融合蛋白与强化融合蛋白对细胞周期的影响；
强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)诱导肿瘤细胞凋亡的作用；
MTT法检测强化融合蛋白对HER2高低表达的肿瘤细胞的细胞毒作用；
强化融合蛋白对人乳腺癌SKBR3裸鼠移植瘤的生长抑制作用。
发明效果：
本发明的优点与积极效果在于，应用基因工程技术和分子强化技术路线制备获得的强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)，是一种以HER2为靶点的高效小型化靶向融合蛋白药物，基本保留了完整单抗的抗原结合活性，同时能够促进肿瘤细胞凋亡，体内外抑制肿瘤的活性，具有良好的临床应用前景。
附图说明：
图1：重组HER2胞外段蛋白表达纯化
其中：1-低分子量蛋白Marker；
2-全菌(BL21)诱导前；
3-全菌(BL21)诱导4h后；
4-超声沉淀；
5-包涵体；
6、7-复性纯化GST-HER2蛋白。
图2：RT-PCR扩增出VH、VL，SOE-PCR得到scFv
其中：1-DNA分子量标准DL2000；
2-VH；
3-VL；
4-scFv。
图3：HER2(Fv-LDP)重组克隆载体限制性内切酶分析
其中：1-DNA Marker DL15000；
2-pET-30a(+)30a(+)；
3-pET-30a(+)30a(+)/Nde I+Xho I：
4-重组质粒pET-30a(+)-LDP；
5-重组质粒pET-30a(+)-LDP/Xho I+EcoR I：
6-重组质粒pET-30a(+)-HER2(Fv-LDP)；
7-重组质粒pET-30a(+)-HER2(Fv-LDP)/Xho I+Nde I：
8-重组质粒pET-30a(+)-HER2(Fv-LDP)/Nde I+EcoR I。
图4：融合蛋白HER2(Fv-LDP)表达产物的SDS-PAGE分析
其中：1-蛋白分子量标准；
2-IPTG诱导后全菌蛋白；
3-IPTG诱导后菌液上清；
4-IPTG诱导后周质腔蛋白；
5-IPTG诱导后菌体包涵体沉淀；
6-IPTG诱导后菌体上清；
7、8、9-纯化融合蛋白HER2(Fv-LDP)。
图5：强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)的分离纯化
其中：▲-0D280；
      ●-0D343。
图6：ELISA分析融合蛋白HER2(Fv-LDP)与HER2蛋白亲和力
其中：HER2蛋白浓度分别为
      ◆-5pg/ml：
      ■-10μg/ml：
      ▲-20μg/ml。
图7：ELISA分析融合蛋白HER2(Fv-LDP)与不同肿瘤细胞的免疫反应性
其中：1-SKBR3细胞；
      2-SKOV3细胞：
      3-MCF7细胞。
      -L87
      -HER2(Fv-LDP),
      □-阴性对照。
图8：融合蛋白与SKBR3细胞的结合免疫荧光测定
其中：A-SKBR3细胞阴性对照；
B-融合蛋白与SKBR3胞膜结合荧光。
图9：强化融合蛋白对SKBR3细胞周期的影响
其中：A—SKBR3细胞对照
G1：63.1％；S：24.4％；G2/M：12.5％；
B—0.01nM HER2(Fv-LDM)
G1：51.4％；S：34.2％；G2/M：14.4％；
C—0.1nM HER2(Fv-LDM)
G1：44.3％；S：22.6％；G2/M：33.1％；
D—1nM HER2(Fv-LDM)
G1：2.8％；S：44.6％；G2/M：52.6％。
图10：强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)诱导细胞凋亡形态变化
其中：A-正常SKBR3；
      B-0.1nM强化融合蛋白处理SKBR3；
      C-1nM强化融合蛋白处理SKBR3；
      D-正常MCF7；
      E-0.1nM强化融合蛋白处理MCF7；
      F-1nM强化融合蛋白处理MCF7。
图11：强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)SKBR3细胞的杀伤活性
其中：▲-HER2(Fv-LDM)；
      ■-LDM。
图12：强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)对MCF7细胞的杀伤活性
其中：▲-HER2(Fv-LDM)；
      ■-LDM。
图13：强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)处理的人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长曲线
其中：◆Control
      ■Fv-LDP(0.5mg/kg)；
      ※LDM(0.05mg/kg)；
      △Fv-LDM(0.2mg/kg)。
以下实施例，可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>.HER2噬菌体抗体库的构建及筛选
1.1抗原蛋白表达、纯化及小鼠免疫：
利用PGEX2T载体(Pharmacia产品)在大肠杆菌BL21(Invitrogen产品)中表达HER2胞外段蛋白，具体方法参照韩梅等关于p185胞外区基因表达载体构建[宁夏医学杂志，2001；23(3)：131-133]，优化诱导时间为4h，诱导温度为37℃，IPTG浓度为0.8mM。GST-HER2胞外段以包涵体的形式表达，分子量70kD左右，透析复性后用GST-Sephrose4B柱(Pharmacia产品)纯化(图1)。纯化后的HER2胞外段蛋白100μg/只，免疫6-8周雌性BALB/c小鼠3只。以后每两周加强免疫1次。每次加强免疫3天后眼眶采血，以纯化的重组HER2胞外段蛋白包被酶标板，直接ELISA测定血清抗体效价。待效价达到1∶106以上时，尾静脉直接注射100μg蛋白加强免疫，3天后取脾待用。
1.2噬菌体抗体库构建及筛选：
参照Pharmacia公司产品Expression Module/Recombinant Phage Antibodysystem试剂盒说明书，进行噬菌体抗体库构建及抗HER2抗体的筛选。简要步骤如下：
上述免疫小鼠脾脏RNA提取→mRNA纯化+OligdT→cDNA合成+建库引物混合物→VH，VL→scFv+PCANTAB5E(噬菌粒Pharmacia产品)→M13K07辅助噬菌体超感染→SKBR3抗原进行筛选→吸附、洗涤、洗脱、扩增(重复3次)→筛选出高亲和力scFv(图2)。经菌体PCR验证阳性克隆，以PCANTAB5-S1，S6为引物，进行双向测序。scFv基因长度为732bp。
<实施例2>.HER2(Fv-LDP)融合蛋白重组表达质粒的构建
重组质粒PET-30A(+)-LDP中带有LDP基因，由本实验室保存。重组噬菌粒PCANTAB-5E中含有scFv基因，通过PCR引入Nde I、EcoR I两个酶切位点，PET-30A(+)-30a Vector为Novagen公司产品。PCR引物由Invitrogen公司合成。分别引入相应的酶切位点。
ScFv5’端引物(PH1)：5’GATACATATGGCCCAGGTCAAGCTGCAG3’
                               Nde I
ScFv3’端引物(PL2)：5’CGGAATTCGGATCCGCCACCGCCCCGTTTTATTTCCAACTT3’
                          EcoR I         spacer
以重组噬菌粒PCANTAB5E-scFv为模板，PH1为5’端引物，PL2为3’端引物，进行PCR扩增，获得C端带有一段小肽spacer的单链抗体基因片段。PCR反应体系为94℃预变性2min，然后进行25轮PCR循环：94℃变性1min，55℃退火50sec，72℃延伸1min，最后一个循环后72℃保温10min。PCR产物利用玻璃奶回收试剂盒(BioDev公司产品)纯化回收后，用Nde I、EcoR I进行双酶切，回收，克隆至经同样双酶切的pET-30a-LDP中，得到重组质粒PET-30a-Fv-LDP，进行酶切鉴定(图3)，测序(序列1)结果显示，HER2(Fv-LDP)正确插入载体pET-30a。scFv基因全长732bp，编码244个氨基酸；LDP基因全长342bp，编码114个氨基酸；二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸；编码羧基端的组氨酸六聚尾基因18bp，编码6个氨基酸；终止密码子3bp，基因总长1110，编码369个氨基酸。
<实施例3>.融合蛋白HER2(Fv-LDP)在大肠杆菌BL21(DE3)starTM中诱导表达
鉴定后的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)starTM，随机挑取重组转化子接种到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；次日按照1∶50的比例接种，37℃震荡培养至OD600为0.8，加入IPTG至终浓度为0.8mM，诱导培养4-6h，取适量菌液，对全菌、培养基上清、细胞周质腔组分、可溶性胞质组分及包涵体进行表达产物定位分析。12％SDS-PAGE电泳分析外源蛋白表达情况，融合蛋白以可溶形式表达在周质腔中。凝胶成像系统定量分析显示，以最佳条件诱导表达获得的融合蛋白表达量占菌体总蛋白10％左右。最终挑出最优表达融合蛋白的转化菌株，其中含有能够表达融合蛋白HER2(Fv-LDP)的PET-30A(+)-30a质粒(图4)，命名为CAMS/HERFL，于2007年4月送交位于北京市海淀区中关村北一条13号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号：(CGMCC NO.1990)。
<实施例4>.融合蛋白HER2(Fv-LDP)亲和层析纯化及分离制备
采用His·bind纯化试剂盒(Novagen公司产品)纯化蛋白样品。经预处理亲和柱后，以3倍体积含1×binding Buffer平衡层析柱，再以可溶蛋白样品上柱后，依次以10倍体积的1×binding buffer(20 mMTris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.9)，6倍体积1×washing buffer(20mMTris-HCl，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH7.9)洗涤层析柱，最后以6倍体积1×Elute Buffer洗脱结合蛋白，收集洗脱组份，获得纯化后的融合蛋白HER2(Fv-LDP)。
<实施例5>.强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)的制备
5.1活性发色团(AE)的制备：取高活性的LDM冻干品(专利申请号：001215272，公开号：1284566)10mg，加5ml冷甲醇振摇5min，-20℃放置1h，中间振摇1次；0℃，12000rpm离心20min，上清中富含发色团AE，沉淀为肽链，重复提取2次。4℃，避光蒸发浓缩发色团。-70℃保存。
5.2强化融合蛋白的制备：取一定体积和浓度的HER2(Fv-LDP)溶于PBS(pH
7.4)中，加入5倍摩尔数的AE甲醇溶液(体积比为1∶50)，混合振摇，室温放置12h，将混合液进行PD-10柱(商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经280nm、343nm紫外监测后，弃过量未反应AE，收集强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)(图5)。
<实施例6>.ELISA分析融合蛋白HER2(Fv-LDP)与不同肿瘤细胞及HER2蛋白的免疫反应性
6.1HER2蛋白ELISA：将纯化的HER2蛋白用PBS稀释成5、10、20μg/ml，100μl每孔包被96孔板，4℃固定过夜。1％BSA室温封闭2h后，PBS洗3遍。加入1000μg/ml至0.001μg/ml10倍稀释的融合蛋白HER2(Fv-LDP)100μl，37℃孵育1h后洗涤3次，加入anti-His tag抗体为二抗，孵育1h后，洗涤3次，加入羊抗鼠-HRP酶标抗体孵育1h，洗涤3次，每孔加入100μl OPD底物反应液，37℃进行显色反应30min，加入50μl/孔的2M H2SO4终止反应，测OD490值。检测融合蛋白HER2(Fv-LDP)与HER2抗原的亲和力，根据酶标仪测定结果，扣除阴性对照值，然后以吸光值为纵坐标，以抗体浓度横坐标作剂量反应曲线，计算每个抗原浓度下最大吸光值一半时对应的抗体浓度。即为抗体的相对亲和力。根据公式计算亲和常数Ka。Ka＝(n-1)/2(nAb-Ab’)。其中Ab、Ab’分别为包被抗原浓度为Ag、Ag’时，最大吸光值一半所对应的抗体浓度。n＝Ag/Ag’，n一般取2。结果(图6)表明，利用亲和力公式可计算出亲和常数为5×10-8M。说明融合蛋白保留了scFv与HER2蛋白的亲和活性。
6.2细胞ELISA：将乳腺癌细胞SKBR3、MCF7细胞、卵巢癌细胞SKOV3104/孔接种于96孔板，培养24h后弃培养液，PBS洗涤后晾干，用0.05％预冷的戊二醛固定细胞15min，洗涤液洗3遍。1％BSA室温封闭2h后，洗涤液洗3遍。加入10μg/ml的融合蛋白HER2(Fv-LDP)100μl，37℃孵育1h后洗涤3次，加入anti-Histag抗体为二抗，孵育1h后，洗涤3次，加入羊抗鼠-HR酶标抗体孵育1h，洗涤3次，每孔加入100μl OPD底物反应液，37℃进行显色反应30min，加入50μl/孔的2M H2SO4终止反应，测OD490值。实验以鼠IgG为无关抗体对照，以商品抗P185erbB2胞外区单抗L87为阳性对照。结果(图7)显示融合蛋白与SKBR3、SKOV3细胞均呈阳性反应，亲和力低于商品化L87抗体，而与MCF7呈阴性反应。
<实施例7>.融合蛋白与SKBR3细胞的结合免疫荧光测定
将灭菌处理的盖玻片置于六孔板中，加入一定浓度稀释的SKBR3细胞，培养24h至细胞贴壁后，吸弃培养基，PBS洗3遍，每遍5min。冷甲醇-20℃固定10min，PBS洗3遍。3％BSA37℃封闭1h，PBS洗3遍。滴加融合蛋白HER2(Fv-LDP)(一抗)，室温1h，PBS洗3遍。加anti-His tag抗体(二抗)，室温1h，PBS洗3遍。滴加FITC标记的羊抗鼠抗体，室温避光1h。PBS洗3遍。荧光显微镜照相。结果显示，SKBR3细胞胞膜表面有绿色荧光(图8)。
<实施例8>.强化融合蛋白对SKBR3细胞周期的影响
SKBR3细胞接种于6孔板中，待细胞长至75％左右，更换为含HER2(Fv-LDM)的培养基，浓度分别为0.01nM、0.1nM、1nM，分别作用24h。胰酶消化、收集悬浮细胞，PBS洗2遍后，70％冰乙醇固定30min，PBS洗细胞两遍，调细胞浓度为106/ml，加入400μl含RNaseA(100μg/ml)的PI(25μg/ml)，室温避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期。Cell Quest及Motif软件分析(图9)。结果显示，强化融合蛋白主要将细胞周期阻滞于G2/M期。
<实施例9>.强化融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的作用
将SKBR3、MCF7接种至有无菌盖玻片的6孔培养板中，培养24h，待细胞长至50％-80％时，更换培养基，同时加入HER2(Fv-LDM)，终浓度分别为0.1nM、1nM，同时设立空白对照，作用48h后，吸出培养基，用PBS洗细胞2遍。加入70％培养基固定10min，弃固定液，PBS洗2遍，加入Hoechst(5μg/ml)，37℃避光染30min。吸弃染液，PBS洗2遍。加入400μl含60％甘油的PBS封片，倒置荧光显微镜下观察、照相，可以见到典型的凋亡细胞，细胞核出现典型的染色质凝聚及核碎裂(图10)。
<实施例10>.MTT法检测强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)对HER2高、低表达乳腺癌细胞的细胞毒作用
取对数生长期的SKBR3、MCF7细胞消化、计数，4000个/孔铺于96孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，加入100nM至10-7nM10倍稀释的不同浓度的强化融合蛋白或力达霉素，每个药物浓度设3个平行孔，培养48h后，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)，37℃继续培养4h，吸弃培养基，加入150μlDMSO，摇床震荡10min，酶标仪上监测A570值。按照下列公式计算细胞抑制率及IC50值(图11、12)。细胞抑制率＝(1-加药组OD/对照组OD)×100％。SKBR3与MCF7的IC50分别为HER2(Fv-LDM)：4.5×10-11M、3.3×10-9。LDM：5.9×10-10M、1.58×10-8M。强化融合蛋白与LDM对两种细胞都有强烈的细胞毒作用，强化融合蛋白的作用强于力达霉素，尤其是强化融合蛋白对SKBR3的IC50比力达霉素降低13倍，说明其杀伤活性明显强于LDM。
<实施例11>.强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用
取6-8周的雌性BALB/c裸鼠36只，体重18～22g，将SKBR3细胞消化成单细胞悬液后，用无血清DMEM洗一遍，计数，用0.2ml无血清的DMEM培养基重悬107个细胞，接种于右侧腋窝皮下。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm3的小块，用套管针将肿瘤移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。待瘤块长至4×4×4mm3大小时，将裸鼠按照瘤块大小、体重分为6组，使每组瘤块大小平均值为4×4×4mm3，且各组体重平均值接近。每组6只裸鼠，在瘤块接种后第10天和第17天尾静脉注射给药。LDM 1个剂量组，其剂量为0.05mg/kg；融合蛋白1个剂量组，0.5mg/kg；强化融合蛋白3个剂量组，分别为0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg。实验期间每4天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V=ab2/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)。根据体积绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。实验结果(图13，表1、表2)表明，HER2(Fv-LDM)对乳腺癌SKBR3都有抑制作用，三个剂量组抑瘤率分别为66.5％，72.0％，82.4％。与LDM相比有显著差异(P<0.05)。体内实验结果说明，强化融合蛋白可以提高动物对力达霉素的耐受剂量，同时显著改善治疗效果，可望成为具有良好前景的抗体靶向药物。
表1强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)对人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

其中BWC-Average Body Weight Change
*-p<0.05 vs control；**-P<0.01 vs contro；△-P<0.05 vs LDM；
△△--P<0.01 vs LDM。
The results were recorded on day 35 after tuInor incubation(day 0)。
表2强化融合蛋白对人乳腺癌裸鼠移植瘤不同时间的生长抑制率


序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所
<120>抗HER2单链抗体-力达霉素强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)
<160>1
<170>
<210>1
<211>1110
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>
<400>1
atggcccagg tcaagctgca ggagtctgga cctgagctag tgaagactgg ggcttcagtg    60
aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggtt actacatgca ctgggtcaag    120
cagagccatg gaaagagcct tgaatggatt ggatatatta gttgttacaa tggtgctact    180
aggtacactc agaagttcaa gggcaaggcc acattgactg cagataaatc ctccagcaca    240
gcctacatgc aactcagcag cttggcatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga    300
gggggggatt acgactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca    360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact    420
cagtctccaa ccaccatggc tgcatctccc ggggagaaga tcactatcac ctgcagtgcc    480
agctcaagta taagttccag ctacttctac tggtaccagc agaaaccagg atcctccccc    540
aaactctgga tttatagcac attcaacctg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc    600
agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca atcagcagca tggaggctga agatgctgcc    660
tcttatttct gccatcagtg gagtagttac ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg    720
gaaataaaac ggggcggtgg cggatccgaa ttcgcgcccg ccttctccgt cagtcccgcc    780
tcgggtctga gtgacggaca gagcgtgtcg gtgtcggtca gcggtgccgc cgccggcgag    840
acctactaca tcgcccagtg cgctccggtc ggtggccagg acgcgtgcaa cccggcgacc    900
gcgacgtcct tcaccacgga cgcgtccgga gcggcgtcgt tcagcttcgt cgtgcgcaag    960
tcgtacacgg gctccacgcc cgaaggcacg ccggtcggca gcgtcgactg cgccacggcc    1020
gcctgtaacc tcggcgccgg caactccggg ctcgacctcg gccacgtggc tctgaccttc    1080
ggcctcgagc accaccacca ccaccactga                                     1110