海藻溴酚类化合物及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及食品添加剂领域，具体地说是海藻溴酚类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
自由基诱导引起的氧化反应能导致食品特别是含油食品酸败变质。不仅如此，氧化反应还能导致食品退色、褐变等，从而严重影响食品的质量，降低食品的营养价值。另一方面，自由基引发的许多氧化产物和中间产物是公认的致癌物，会严重损害有机体的生物膜、蛋白质、酶及细胞功能，直接或间接引起许多疾病如癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性疾病以及机体老化等的发生。
目前常用的防止食用油脂和含油食品氧化变质的主要途径之一是加入抗氧化剂，以防止或者延缓包括自由基氧化在内所引起的氧化反应的发生。其中BHT(叔丁基羟基甲苯)、BHA(叔丁基羟基茴香醚)是较常用的化学合成抗氧化剂、自由基清除剂。但是随着生活水平的提高，人类对合成抗氧化剂、自由基清除剂的安全问题越来越关注，特别是研究发现BHT、BHA存在一定的毒性(如能引起肝脏扩大并有可能致癌)，天然抗氧化剂、自由基清除剂的研究受到越来越广泛的重视。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种天然的海藻溴酚类化合物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
海藻溴酚类化合物结构式(I)
其中：R1为OH、OCH3或Br；R2为OH、OCH3或Br；R3为H、CH3或Ac；R1和R2至少其一为Br。
海藻溴酚类化合物的制备方法包括如下步骤：
1)将海洋红藻鸭毛藻冲洗、阴干、粉碎到60-80目，而后用有机溶液提取2-5次，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；
2)将步骤1)中的粗提物内加入过量的水，并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2-4次，萃取物各自浓缩得相应的提取物，备用；
3)取步骤2)中的乙酸乙酯提取物进行硅胶层析，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测、合并得层析的各组分；
4)将步骤3)中以40∶1到30∶1梯度下洗脱得到的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物A。
所述得到的目标化合物A还可经酰化、甲氧基化或乙氧基化反应得目标化合物B。
步骤1)中的有机溶液提取液可为浓度在50-100％的乙醇或甲醇。
步骤3)中可用100∶0到0∶100的梯度的氯仿-甲醇或100∶0到0∶100的梯度乙酸乙酯-甲醇的洗脱液进行洗脱硅。
步骤4)中硅胶层析采用梯度在20∶80到0∶100的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱剂为甲醇或梯度为50∶50的氯仿-甲醇进行洗脱。
海藻溴酚类化合物可作为延缓或防止自由基诱导引起的氧化变质的食用油脂或含油食品添加剂。
本发明具有以下优点：
本发明涉及的化合物为新的溴酚类化合物，属于小分子天然有机化合物，容易制备获得；本发明涉及的溴酚类化合物具有显著的DPPH自由(α，α-diphenyl-β-picrylhydrazyl，即，二苯代苦味酰自由基)活性，可作为食品添加剂延缓或防止食用油脂和含油食品因自由基诱导引起的氧化变质。
本发明涉及的海洋红藻鸭毛藻(Symphyocladia latiuscula(Harvey)Yamada)属于红藻门、松节藻科、鸭毛藻属海藻，主要分布于中国、日本、韩国等沿海地区，一般生长在潮间带的岩石上。本发明通过海洋红藻鸭毛藻经提取、分离获得的溴酚类天然化合物，经实验表明，这类化合物具有显著的DPPH自由基清除活性，在相同的浓度条件下其作用强度明显高于化学合成品BHT，可广泛应用于食用油脂或含油食品中，替代化学合成抗氧化剂、自由基清除剂，防止或延缓由自由基引起的氧化反应的发生，从而延长保质期，提高产品质量。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
溴酚类化合物的制备方法：
新鲜采集的鸭毛藻经海水清洗，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处凉干备用。取凉干后的样品2.5Kg，粉碎后用7.5升95％的乙醇在室温下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在温度40℃左右减压浓缩、回收乙醇，获得乙醇粗提物。在粗提物中加入适量蒸馏水使之混悬于水中，依次用适量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物(108克)进行硅胶柱(220克，200-300目)层析，用氯仿-甲醇以100∶0、90∶1、85∶1，70∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1到0∶100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测，合并相同或类似部分，薄层层析(TLC)检测时用三氯化铁作为显色剂，获得九个组分(I-IX)。将组分IV(7.1克)，即以氯仿-甲醇40∶1到30∶1梯度洗脱下的组分再进行硅胶柱层析分离和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，硅胶柱层析时用梯度在20∶80到0∶100的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物11.0毫克。经波谱分析，其结构鉴定为双-(2，3，6-三溴-4，5-二羟基苯基)乙烷，英文名Bis(2，3，6-tribromo-4，5-dihydroxyphenyl)ethane，结构式如(II)所示，即通式(I)中R1、R2为Br、R3为H的化合物
该化合物具有以下理化和波谱特性：
黄色粉末状固体，熔点230-232℃；核磁共振氢谱(1H NMR，acetone-d6，500MHz)δ8.63(4H，brs，OH)，3.42(4H，s，H-7，7′)；核磁共振碳谱(13C NMR，acetone-d6，125MHz)δ144.0(s，C-4，4′)，143.9(s，C-5，5′)，132.8(s，C-1，1′)，118.2(s，C-2，2′)，113.9(s，C-3，3′，6，6′)，37.5(t，C-7，7′)；低分辨质谱EIMS m/z(％)726(＜1)，724(＜1)，722(1.6)，720(2.4)，718(1.6)，716(＜1)，714(＜1)[M]+，564(1)，562(4)，560(6)，558(3.5)，556(1)[M 2Br]+，481(6)，480(10)，478(7)，402(6)，400(13)，398(7)，363(31)，361(96)，359(100)，357(35)，281(23)，279(20)，201(11)，199(13)，131(23)，91(22)，82(84)，80(88)，79(35)，63(25)；高分辨质谱HRFABMS m/z719.5485[M+H]+(calcd for C14H879Br381Br3O4，719.5461)。
实施例2
与实施例1不同之处在于：
将干燥粉碎的鸭毛藻用浓度50％的乙醇提取4次，每次三天，合并提取液，室温下减压浓缩获得粗提物，同时乙醇回收。将粗提物悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱(220克，200-300目)层析，用梯度为100∶0到0∶100的梯度的乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，以薄层层析(TLC)检测，合并相同的组分；将以乙酸乙酯-甲醇在40∶1到30∶1梯度洗脱下的洗脱液，再进行硅胶柱层析分离和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，硅胶层析采用梯度在20∶80到0∶100的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱剂为梯度为50∶50的氯仿-甲醇进行洗脱，洗脱液减压浓缩后的物质通过常规方法采用醋酐和吡啶进行乙酰化反应得到其相应的乙酰化衍生物，其也具有显著的DPPH自由基清除活性。
实施例3
与实施例1不同之处在于：
将由实施例1中获得的溴酚类化合物，通过常规方法采用甲基化试剂(重氮甲烷)进行甲基化反应得到相应的甲基化衍生物，其也具有显著的DPPH自由基清除活性。
实施例4
DPPH自由基清除活性实验：
DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm附近有强吸收，加入抗氧化剂后，一部分自由基被清除，使吸收减弱，可借此来评价其抗氧化活性、自由基清除活性的强弱。这种方法操作简便，重现性好。
实验方法：
在2mL实施例1中所得样品中加入2mL DPPH(甲醇溶液，0.16mmol/L)混合均匀后，室温暗处放置50min后，于517nm处测定其吸光度Asample。
在2mL实施例1中所得样品中加入2mL甲醇溶液于517nm处测定其吸光度Asample blank。
2mLDPPH中加入2mL甲醇氯仿混合溶剂于517nm处测定其吸光度Acontrol。
2mL甲醇中加入2mL甲醇氯仿混合溶剂于517nm处测定其吸光度Ablank。
自由基清除率的计算：
清除率％＝100-(Asample-Asample blank)×100/(Acontrol-Ablank)。
将实施例1得到的样品在2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL不同浓度下分别测试，每个浓度平行测定三次，取平均值即为样品清除率，并计算IC50值。所有测试均以BHT为标准品作为阳性对照。
实验结果：
参见表1，数据表明上述获得的溴酚类化合物具有显著的DPPH清除活性，在低浓度下溴酚类化合物的活性与BHT相当，在中浓度和高浓度时活性显著高于BHT。另外，实验表明，BHT的IC50为81.8μM，而溴酚类化合物的IC50为10.2μM，仅为阳性对照BHT的八分之一，表明溴酚类化合物的自由基清除活性显著高于阳性对照BHT。
表1
实施例5
溴酚类化合物在食用油脂抗氧化中的应用：
取食用油脂1千克，按照0.02％的重量比加入上述实施例1-3中得到的溴酚类化合物中，混合均匀，制得抗自由基氧化的食用油脂。与不含溴酚类化合物的食用油脂相比，含溴酚类化合物的食用油脂其保存期是前者的2倍以上。
本发明所涉及的溴酚类化合物可应用于任何食用油脂中，以防止或延缓自由基引起的氧化变质，延长保质期。