PLGA吉西他滨缓释微球及其制备方法.pdf

本发明公开了一种PLGA吉西他滨缓释微球，属于制剂学领域。PLGA吉西他滨缓释微球，由辅料聚乳酸-乙醇酸和原料药吉西他滨以95∶5～35∶65的重量比制成。本发明的优点是：将吉西他滨与聚乳酸-乙醇酸制成缓释微球，用注射器直接送至肿瘤部位行区域性缓释化疗，吉西他滨被缓慢释出，肿瘤部位药物浓度高，作用时间长，作用强度大，对肿瘤细胞的杀伤力大，从而可以提高肿瘤的疗效；药物集中作用于局部，全身药物量很少，不良反应极小。药物释毕后，聚乳酸-乙醇酸开始降解为乳酸和乙醇酸，进一步降解为二氧化碳和水，对人体无影响。

权利要求书
1.  一种PLGA吉西他滨缓释微球，其特征在于：由辅料聚乳酸-乙醇酸和原料药吉西他滨以95∶5～35∶65的重量比制成。

2.  根据权利要求1所述的PLGA吉西他滨缓释微球，其特征在于：所述吉西他滨是抗肿瘤药物2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷盐酸盐。

3.  根据权利要求1所述的PLGA吉西他滨缓释微球，其特征在于：所述聚乳酸-乙醇酸分子中乳酸与乙醇酸分子比为95∶5～10∶90。

4.  根据权利要求1所述的PLGA吉西他滨缓释微球，其特征在于：所述微球直径为1μm～250μm。

5.  一种PLGA吉西他滨缓释微球的制备方法，其特征在于：粉碎吉西他滨制成直径小于20μm的细粉；将聚乳酸-乙醇酸溶解于溶剂内，按配方比例将吉西他滨细粉加入PLGA溶液内，混合均匀，真空下喷雾干燥，筛分得PLGA吉西他滨缓释微球；聚乳酸-乙醇酸和吉西他滨的重量比为95∶5～35∶65。

6.  根据权利要求5所述的一种PLGA吉西他滨缓释微球的制备方法，其特征在于：所述溶剂选自二氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、和二氧化碳中的一种或几种。

7.  根据权利要求5所述的一种PLGA吉西他滨缓释微球的制备方法，其特征在于：所述微球还可以采用溶剂法、乳化法、超临界法等常规方法制备。

说明书PLGA吉西他滨缓释微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种可注射的PLGA(聚乳酸一乙醇酸)吉西他滨缓释微球及其制备方法，更具体地，是以生物降解的聚乳酸一乙醇酸为辅料、吉西他滨为有效药制成的可注射的缓释微球及其制备方法，属于药剂学领域。
背景技术
聚乳酸一乙醇酸是一种生物相容性好、可生物降解、安全性好、理化性能优异的医药用高分子材料，用于药物缓释制剂的辅料和人体内医用材料；该材料进入人体后先降解为人体内存有的乳酸和乙醇酸，再进一步降解为二氧化碳和水排出体外，对人体无害。聚乳酸-乙醇酸在体内的降解速率可通过其分子中乙醇酸的含量与排序进行调节。
吉西他滨化学名称是2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷盐酸盐，本品是细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，即S期细胞，在一定条件下，可以阻止G1期向S期的进展，从而抑制肿瘤细胞生长，适用于非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他实体肿瘤的治疗，其抗癌活性与给药方式有关，肿瘤部位吉西他滨浓度越高，维持有效药物浓度时间越长，对肿瘤治疗的效果越好。吉西他滨半衰期短，全身给药，肿瘤部位药物浓度低，维持的时间短，疗效差，而全身药物浓度高，不良反应严重。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种毒性低、不良反应小、可直接注射于肿瘤部位行区域性缓释化疗的PLGA吉西他滨缓释微球。
本发明的另一个目的是提供这种PLGA吉西他滨缓释微球的的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种可注射的PLGA吉西他滨缓释微球，由辅料聚乳酸-乙醇酸和原料药吉西他滨以95∶5～35∶65的重量比制成。
所述吉西他滨是抗肿瘤药物2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷盐酸盐。
所述聚乳酸-乙醇酸分子中乳酸与乙醇酸分子比为95∶5～10∶90。
所述微球直径为1μm～250μm。
试验显示，本发明所制备的PLGA吉西他滨缓释微球体外释放度为：24小时：10％～80％；120小时：25％～95％；360小时：60％以上。
PLGA吉西他滨缓释微球的制备方法：粉碎吉西他滨制成直径小于20μm的细粉；将聚乳酸-乙醇酸溶解于溶剂内，按配方比例将吉西他滨细粉加入PLGA溶液内，混合均匀，真空下喷雾干燥，筛分得PLGA吉西他滨缓释微球；聚乳酸-乙醇酸和吉西他滨的重量比为95∶5～35∶65。
所述溶剂选自二氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、和二氧化碳中的一种或几种。
微球还可以采用溶剂法、乳化法、超临界法等常规方法制备。
本发明的使用方法：按照临床上规定的用量，将微球与碘油(或水、表面活性剂如吐温-80)混合均匀后，通过注射器直接注入到肿瘤病灶行区域性缓释化疗。
本发明的优点是：
1.本发明提供的新型PLGA吉西他滨缓释微球可直接注射于肿瘤病灶部位行区域性缓释化疗，使肿瘤部位药物量多，药物浓度高持续时间长，作用强度大，局部疗效好；全身药物量少，血药浓度低，几乎无不良反应；从而达到提高疗效显著降低不良反应的作用。
2.PLGA吉西他滨缓释微球直接注射于肿瘤病灶部位行区域性缓释化疗，全身药物量少，血药浓度低，几乎无不良反应；使不能承受传统化疗的肿瘤患者(不能承受多次给药的体弱患者、晚期患者)能得到较好的治疗。
3.PLGA吉西他滨缓释微球直接在肿瘤部位注入，药物直接于肿瘤细胞作用，避免了肝脏等首过效应，药物利用率高。
下面结合附图和较佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
附图说明
图1为高效液相色谱法测定吉西他滨标准曲线图。
图2为吉西他滨和内标物的高效液相色谱图，G为吉西他滨，T为替加氟。
图3为A组瘤内药物浓度-时间曲线图。
图4为B组药物浓度-时间曲线图。
图5为肿瘤生长曲线图。
图6为肿瘤相对增殖率图。
图7为治疗组抑瘤率图。
具体实施方式
实施例1：制备PLGA吉西他滨缓释微球
用超细粉碎机将吉西他滨制成直径小于20μm的细粉；将PLGA[90∶10(乳酸与乙醇酸分子比)]4g溶解于40mL丙酮制成PLGA丙酮溶液，加入吉西他滨细粉0.4g，混合均匀，真空下喷雾干燥，收集微球，筛分得粒径小于100μm的PLGA吉西他滨缓释微球(A)。
实施例2：制备PLGA吉西他滨缓释微球
将PLGA(80∶20)4g溶解于40mL四氢呋喃制成PLGA四氢呋喃溶液，加入吉西他滨细粉0.8g，混合均匀，真空下喷雾干燥，收集微球，筛分得粒径小于100μm的PLGA吉西他滨缓释微球(B)。
实施例3：制备PLGA吉西他滨缓释微球
将PLGA 4g溶解于40mL二氯甲烷制成PLGA二氯甲烷溶液，加入吉西他滨细粉1.2g，混合均匀，真空下喷雾干燥，收集微球，筛分得粒径小于100μm的PLGA吉西他滨缓释微球(C)。
实施例4：制备PLGA吉西他滨缓释微球
将PLGA(75∶25)4g溶解于40mL三氯甲烷制成PLGA三氯甲烷溶液，加入吉西他滨细粉1.8g，混合均匀，真空下喷雾干燥，收集微球，筛分得粒径小于100μm的PLGA吉西他滨缓释微球(D)。
实施例5：制备PLGA吉西他滨缓释微球
将PLGA(55∶50)4g溶解于40mL乙酸乙酯制成PLGA乙酸乙酯溶液，加入吉西他滨细粉4.2g，混合均匀，真空下喷雾干燥，收集微球，筛分得粒径小于100μm的PLGA吉西他滨缓释微球(E)。
实施例6：含量测定
以水为溶剂，吉西他滨原料药为对照品，紫外法测定实施例1～5中制得PLGA吉西他滨缓释微球A、B、C、D、E的药物含量分别为：
A    8.87±0.12；
B    16.39±0.36；
C    22.74±0.41；
D    30.94±0.56；
E    49.85±0.47；
实施例7：释放度试验
将实施例1～5中制得的微球各取三份，每份含吉西他滨5mg，分别装入尼龙滤袋中，封口，置10mL具塞试管内，加蒸馏水10mL，密塞，置37℃水浴中保温，于不同时间点取出试管内的水溶液，同时加入同温度同体的蒸馏水，密塞，继续在37℃水浴中保温。用紫外法测定水中吉西他滨量，计算释放度，结果如下：
表1：实施例1-5PLGA吉西他滨缓释微球的释放度

实施例8：PLGA-吉西他滨缓释微球急性毒性试验
一、实验材料
1.动物和细胞株
Balb/c-nu裸鼠：SPF级，体重：16±2克，四周龄，雌性；北京维通利华实验技术有限公司，合格证：SCXK(京)2007-0001。
人胰腺癌可移植瘤细胞株(JF305)：中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室提供。
2.药品和试剂
PLGA-吉西他滨缓释微球：合肥工业大学控释药物研究所提供，粒径小于100μm，含药量20％，设计缓释时间为30天。按照实施例1方法制备。
碘油：Guerbet，Roissy，France.06LU003B有效期：2009-03
二、细胞培养及瘤株接种
1.将细胞从液氮中取出，迅速放在37℃水浴中摇动使其快速溶解，逐滴放入10ml无血清1640培养液中，1000r·min-1，离心10分钟。弃去上清液，加入含10％血清的1640培养液中。放入培养瓶内，37℃，5％CO2孵箱中培养。
2.待其90％复合后，用PBS洗两遍，加入0.1％胰酶消化液约1ml，反复覆盖细胞层，弃去消化液，将瓶口盖好，放置于37℃，5％CO2孵箱中2-5分钟，倒置显微镜下观察消化细胞，细胞之间成圆形，加入新培养液，用滴管将细胞吹打成细胞悬液，计数后，将细胞分装培养瓶中，传代细胞的密度不低于5×105/ml。放入37℃，5％CO2孵箱中培养。
3.继续培养使细胞浓度达到1×108/ml。
4.从液氮内取出肿瘤细胞，37℃迅速解冻复苏后，接种于裸鼠的右侧腋窝皮下，使每只接种接种0.2ml(1×107/ml)。3周后移植肿瘤生长达1.5cm直径左右。按常规方法传代。
5.处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，生理盐水清洗数次，剔除坏死的组织，选择生长良好的肿瘤组织，用手术刀片将肿瘤组织切割成3-4mm大小的组织块，以特制的组织接种器将肿瘤组织移植到右侧腋窝皮下。
三、分组及给药方法
1.分组：
A组：健康裸鼠，将PLGA-吉西他滨缓释微球注射入裸鼠皮下。
B组：荷瘤裸鼠，将PLGA-吉西他滨缓释微球注射入瘤内。
2.给药方法：
荷瘤裸鼠肿瘤直径达到0.6cm-0.8cm时开始给药。将碘油与PLGA-吉西他滨缓释微球混匀，采用1ml注射器针筒连接22G注射针头，将上述混悬液注入健康裸鼠皮下以及荷瘤裸鼠瘤内，每只裸鼠注射量为0.05ml。
四、实验方法
采用UDP法先设定给药剂量，A组以270mg为初始剂量，B组以8.64mg为初始剂量，根据动物有无死亡给药剂量以1.2倍级差上升或下降。
五、评价指标：LD50
采用最大似然法测定LD50，公式为：
N＝受试动物个数
C＝算术平均和
公比＝1.2
LogLD50＝Log(i＝0的药物剂量)+C/N×Log1.2求反对数，得出LD50
六.结果
1.A组共使用动物7只，通过计算得出PLGA-吉西他滨缓释微球健康裸鼠皮下给药时LD50＝256.30mg/Kg(表2)。
表2：PLGA-吉西他滨缓释微球健康裸鼠皮下给药时受试动物情况

注：△代表存活，×代表死亡，n代表每个剂量的死活只数。
2.B组共使用动物12只，通过计算得出荷瘤裸鼠瘤体内给药时LD50＝8.91mg/Kg(表3)。
表3：PLGA-吉西他滨缓释微球荷瘤裸鼠瘤内给药时受试动物情况

注：△代表存活，×代表死亡，n代表每个剂量的死活只数。
本实验结果说明：
1.PLGA-吉西他滨缓释微球全身给药和肿瘤间质内给药时动物的反应有较大差别。
2.肿瘤局部应用PLGA-吉西他滨缓释微球进行间质化疗给药剂量应低于常规化疗的给药剂量。
实施例9：PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗药动学研究
一.实验材料
1.动物和细胞株
Balb/c-nu裸鼠：SPF级，体重：16±2克，四周龄，雌雄各半；北京维
通利华实验技术有限公司，合格证：SCXK(京)2007-0001。
人胰腺癌可移植细胞细胞株(JF305)：中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室提供。
2.药品和试剂
PLGA-吉西他滨缓释微球：合肥工业大学控释药物研究所提供，粒径小于100μm，含药量20％，设计缓释时间为30天。
吉西他滨：江苏豪森药业有限公司提供
碘油：Guerbet，Roissy，France.06LU003B  有效期：2009-03
二.细胞培养及瘤株的接种
同实施例8。
三.分组及给药方法
1.分组：
A组：将50只移植成功的荷瘤裸鼠随机分为10个亚组，每组5只，给以PLGA-吉西他滨缓释微球瘤体内给药间质化疗。
B组：将60只移植成功的荷瘤裸鼠随机分为12个亚组，每组5只，给以吉西他滨腹腔给药全身化疗。
2.给药方法：
荷瘤裸鼠肿瘤直径达到0.6cm-0.8cm时开始给药，A组：将碘油与PLGA-吉西他滨缓释微球混匀，采用1ml注射器针筒连接22G注射针头，将上述混悬液注入荷瘤裸鼠瘤内，每只裸鼠注射量为0.05ml；B组：将碘油与吉西他滨混匀，采用1ml注射器针筒连接22G注射针头，将上述混悬液注入荷瘤裸鼠腹腔内，每只裸鼠注射量为0.05ml。
四.标本提取及处理
1.标本提取
A组(PLGA-吉西他滨缓释微球荷瘤裸鼠瘤体内给药间质化疗组)标本提取方法：于给药后2h、12h、24h、48h、72h、120h、240h、480h、720h、960h时间点随机抽取一个亚组，处死动物后剥离肿瘤，标本放置于-20℃冰箱冻存。
B组(吉西他滨荷瘤裸鼠腹腔给药全身化疗组)标本提取方法：于给药后0min、5min、10min、30min、1h、4h、8h、24h、48h、72h、120h、240h时间点随机抽取一小组，处死动物后剥离肿瘤，标本放置于-20℃冰箱冻存。
2.标本处理
每份标本加入醋酸铵缓冲液2ml，使用研钵充分研磨后，置于离心管内离心，3000r·min-1，离心10分钟，提取上清液，-20℃冰箱冻存。
五.样品分析
1.仪器
Waters高效液相色谱系统，包括：515泵，717自动进样器，助温箱，温
度控制器，2487紫外检测器，Epower色谱工作站，Millipore超纯水系统。
2.试剂与药品
吉西他滨标准品：江苏豪森药业有限公司提供
内标：替加氟，纯度99.46％，济南制药厂提供
乙腈：Fisher公司提供
去离子水：Millipore公司提供
3.色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6mm×250nm，5um)
流动相：50mmol·L-1醋酸铵缓冲液(取醋酸铵3.85g加去离子水1000ml，
用冰醋酸调节PH值至4.2)
乙腈：(90∶10)
流速：1mL·min-1
进样量：20μL
检测波长：268nm
柱温：25℃
4.对照品与内标储备液的配制
精密称取吉西他滨标准品20.0mg于100mL量瓶中，用去离子水(pH6.8)溶解并稀释至刻度，得浓度为200.0μg·mL-1对照品储备液，于冰箱4℃保存；精密称取替加氟对照品20.2mg于100mL量瓶中，用去离子水(pH6.8)溶解并稀释至刻度，得浓度为202.0μg·mL-1内标储备液，于冰箱4℃保存。临用时稀释成10μg·mL-1的内标溶液。
5.组织样品处理
取处理后的组织样品100μL，加10μg·mL-1的内标溶液150μL，混匀，加甲醇-乙腈(1∶9)3mL，涡旋1min后放置5min，于3500r·min-1离心10min，取上清液于60℃水浴放置，氮气吹干，残渣用1.5mL流动相溶解，离心(15000r·min-1，10min)，取上清液，进样20μL。
6.标准曲线的建立
分别取吉西他滨标准品储备液适量，加入去离子水(pH6.8)稀释，使之成为0.5，1，5，25，50，100，200μg·mL-1浓度梯度的标准品溶液，按上述组织样品处理方法处理，分别配制0.05，0.1，0.5，2.5，5，10，20μg·mL-1的组织标准品各7份，进样20μL检测，以吉西他滨和内标物的峰面积比值为纵坐标，吉西他滨的浓度为横坐标，进行线性回归。
六.数据处理
将吉西他滨药物浓度原始数据输入药代动力学分析软件Das2.0处理，得到药代动力学参数，数据用Mean±SD表示，SPSS11.5软件包进行统计学分析，计量资料用t检验，P＜0.01认为有统计学差异。
七.结果
1.标准曲线的回归方程与线性关系
吉西他滨标准曲线的回归方程为Y＝7.76e-001X+1.23e-001；R＝0.999851。显示标准曲线在0.05～20μg·mL-1范围内具有良好的线性关系(图1)。
2.种给药方法瘤体内药物浓度-时间曲线(简称药-时曲线)
A组在给药后72小时出现波峰，以后逐渐下降且趋于平缓，曲线在0.34μg/ml以上持续时间达40天；B组在给药后5分钟曲线达到最高峰，随后急剧下降，30分钟时浓度为0.30μg/ml，10天时为0.09μg/ml(图3和图4)。
3.半衰期
PLGA-吉西他滨缓释微球瘤内给药间质化疗组半衰期为97.39±8.93小时，吉西他滨腹腔给药全身化疗组半衰期为2.97±0.25，2组比较，结果具有统计学差异，P值小于0.01(表4)。
表4：2种给药方式半衰期、曲线下面积、峰浓度

4.曲线下面积(AUC)
PLGA-吉西他滨缓释微球瘤内给药间质化疗组曲线下面积为383.17±0.83ug·mL-1，吉西他滨腹腔给药全身化疗组曲线下面积为37.08±0.22ug·mL-1，2组比较，结果具有统计学差异，P值小于0.01(表4)。
5.峰浓度(Cmax)
PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗组峰浓度为1.33±0.21，吉西他滨腹腔给药全身化疗组相峰浓度为0.75±0.23，2组相比，结果具有统计学差异，P值小于0.01(表4)。
本试验说明：
1.PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗能够显著提高肿瘤局部的药物浓度，延长药物的作用时间。
2.PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗能够减少化疗药物的全身毒副作用。
实施例10：PLGA-吉西他滨缓释微球药效学研究
一、实验材料
1.动物和细胞株
Balb/c-nu裸鼠：SPF级，体重：16±2克，四周龄，雌雄各半；北京维通利华实验技术有限公司，合格证：SCXK(京)2007-0001。
人胰腺癌可移植细胞细胞株(JF305)：中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室提供。
2.药品和试剂
PLGA-吉西他滨缓释微球：合肥工业大学控释药物研究所提供，粒径小于100μm，含药量20％，药物缓释时间30天。
PLGA-5-氟尿嘧啶缓释微球：合肥工业大学控释药物研究所提供，粒径小于100μm，含药量20％，药物缓释时间30天。
PLGA微球：芜湖中人药业有限责任公司提供，粒径小于100μm。
吉西他滨：江苏豪森药业有限公司提供
碘油：Guerbet，Roissy，France.06LU003B有效期：2009-03
二.细胞培养及瘤株的接种
同实施例8。
三.动物分组
将移植成功的荷瘤裸鼠随机分为8组：
A1组：瘤体内植入PLGA-吉西他滨缓释微球吉西他滨5mg/kg
A2组：瘤体内植入PLGA-吉西他滨缓释微球吉西他滨2.5mg/kg
A3组：瘤体内植入PLGA-吉西他滨缓释微球吉西他滨1.25mg/kg
B组：荷瘤裸鼠瘤体内注射吉西他滨吉西他滨5mg/kg
C组：荷瘤裸鼠腹腔内注入吉西他滨吉西他滨5mg/kg
D组：荷瘤裸鼠瘤体内植入PLGA-5-氟尿嘧啶缓释微球5-氟尿嘧啶5mg/kg
E组：荷瘤裸鼠瘤体内植入PLGA微球PLGA5mg/kg
F组：荷瘤裸鼠不给予任何治疗
四.药物配制及给药方法
1.药物配制
PLGA-吉西他滨缓释微球、PLGA-5-氟尿嘧啶缓释微球、吉西他滨、PLGA微球均使用碘油溶解，每只动物注射量为0.05ml。
2.给药方法
移植瘤大小为0.6cm-0.8cm时开始给药。在无菌条件下，将药物与碘油混匀，采用1ml注射器针筒连接22G注射针头将上述混悬液注入瘤内或腹腔内。
五.观察指标观察时间为24天
1.动物给药后反应
给药后动物局部反应、全身反应以及生存状况的观察。
2.动物体重的观察
给药前及给药后4，8，12，16，20，24天，用电子天平测量荷瘤小鼠体重。
3.肿瘤体积的观察
给药前及给药后4，8，12，16，20，24天，用游标卡尺测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。
肿瘤体积计算公式：V＝(A×B2)/2A为长径，B为短径。
肿瘤相对增殖率计算方法：
(某一观察点肿瘤平均体积-给药前肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积
4.肿瘤重量测定
处死动物后测量肿瘤重量，计算抑瘤率，计算方法：
肿瘤抑制率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
5.免疫组织化学
实验结束后处死动物，取肿瘤组织，切片后行免疫组织化学染色，测定肿瘤组织中VEGF表达情况。
免疫组化实验材料：
一抗  VEGF抗体(鼠抗人单克隆抗体)0.1ml
      PV-9000通用二步法3ml
二抗  试剂1：聚合物辅助剂
试剂2：辣根酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG多聚体
DAB显色试剂盒
以上试剂由北京金桥生物技术有限公司提供
枸橼酸钠枸橼酸二甲苯无水乙醇95％乙醇85％乙醇70％乙醇
50％乙醇盐酸酒精分化液(含0.25％HCL的70％乙醇溶液)1％氨水
以上试剂由北京市化学试剂公司提供
6.实验操作步骤：
(1)脱蜡：
二甲苯(1)20min→二甲苯(2)20min→100％乙醇(1)20min→100％乙醇(2)20min→95％乙醇10min→85％乙醇10min→70％乙醇10min→50％乙醇10min→PBS过三次。
(2)抗原修复(微波法)：
高火3-4min加热枸橼酸缓冲液至沸→从PBS中取出切片，浸入枸橼酸缓冲液，高火0.5-1min至沸→低火4min→中低火4min(共12-14min)→室温下冷却至室温→PBS过三次。
(3)3％H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗2分钟3次。
(4)加适当比例稀释的一抗(根据说明书按1∶5稀释)4℃过夜。
(5)PBS 2min×3，滴加试剂I(ploymer helper)，37oC孵育30分钟。
(6)PBS 2min×3，滴加试剂II(ploy peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG)，37℃孵育30分钟。
(7)PBS 3min×3，DAB显色剂显色.镜下观察决定终止时间→自来水洗终止显色→苏木素复染1-5min→自来水洗→盐酸酒精分色10-30sec。镜下观察决定分色时间→1％氨水返蓝5sec→自来水洗。
(8)苏木素复染，脱水透明，封片。
(9)50％乙醇5min→70％乙醇5min→85％乙醇5min→95％乙醇5min→无水乙醇5min→空气中放置3min→二甲苯(1)10min→二甲苯(2)10min→中性树胶封片→切片封固好后读片。
7.结果判断：
以胞浆出现棕色颗粒为阳性细胞，随机观察10个高倍视野，先按染色强度记分：无着色为0分，淡棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分，再按照阳性细胞所占百分率记分：阳性细胞＜10％为0分，10％～为1分，30％～为2分，50％～70％为3分，＞70％为4分。两者之和≥2分可判为阳性并分级：2～3分为弱阳性(+)、4～5分为中等阳性(++)、6～7分为强阳性(+++)。
六.统计学分析
本实验数据用mean±SD表示，spss11.5软件包进行统计学分析，计数资料用卡方检验，计量资料用t检验，p值小于0.05认为有统计学差异。
七.结果
1.动物给药后反应：
(1)局部和全身反应
A1组、A2组给药后第3天出现倦怠，不进食，体重下降，皮肤颜色发红，此现象持续2周左右。A3组、B组、C组、D组给药后第2天动物活动减少，饮食下降，2天后好转，E组F组无上述反应。
(2)观察期间动物存活情况
A1组动物死亡1只，B组死亡2只，C组死亡1只。动物在死亡前均表现为活动减少，不进食，腹泻，皮肤颜色发红，流涎。
(3)观察期间动物体重的变化
治疗组在给药前与对照组比较，体重之间无差异，P值均大于0.05。给药后PLGA-吉西他滨缓释微球治疗组(A1组、A2组、A3组)、吉西他滨瘤内给药(B组)及腹腔给药组(C组)体重都呈下降趋势，其中以A1组、A2组、B组、C组在给药后第4天体重下降较为明显，其余各组体重都呈现上升趋势。A1、A2组在给药后第4天，A3组在给药后第8天，B、C组在给药后第12天以后，体重呈上升趋势。治疗组体重在给药后各观察时间点与0天比较，对照组
在0天以后各观察时间点与0天比较，结果均无统计学差异，P＞0.05(表5)。
表5：治疗组及对照组动物体重的变化

注：*表示各观察时间点与0天相比较。
2.肿瘤体积的变化
A1、A2组肿瘤体积在给药后16、20、24天与对照组相比，结果有统计学差异，P值均小于0.05。A3组、B组、D组肿瘤体积在给药后16天与对照组相比，结果有统计学差异，P值均小于0.05。C组、E组肿瘤体积在上述观察时间点与对照组相比，无统计学差异(表6)。
A1、A2组肿瘤增长缓慢，曲线平缓，其中以A1组最为明显。A3、D、B、C组在给药后12天前曲线较为平缓，12天后变为陡峭，以C组最为明显。对照组曲线最陡，其次为E组(图5)。
表6：治疗组及对照组肿瘤体积的变化

注：治疗组与对照组相比较
3.PLGA-吉西他滨缓释微球瘤内给药间质化疗组(A1组、A2组、A3组)肿瘤相对增殖率
A1组肿瘤增长速度最慢，其次为A2组，A3组最快，PLGA-吉西他滨缓释微球对肿瘤的抑制作用呈剂量-效应关系。(图6)
4.治疗组抑瘤率
A1组对肿瘤的抑制作用最强，抑瘤率达到了66％，其次为A2组，为40％；A3组为23％，与D组(24％)接近(图7)，B组、C组、E组的抑瘤率分别为30％、20％、5％。
5.VEGF表达情况
A1组、A2组、A3组、F组VEGF均有阳性表达，其中A1组VEGF表达最低，A2组其次，与对照组比较，结果具有统计学差异，P＜0.05，A3组VEGF表达最强，与对照组相比，结果无显著性差异，P＞0.05(表7)。
表7A1组、A2组、A3组、F组VEGF表达情况

注：A1组、A2组、A3组分别与F组相比较。
本试验说明：
1.PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗能够显著抑制肿瘤的生长。
2.PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗对肿瘤的抑制作用呈剂量-效应关系。
3.PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗能够显著抑制肿瘤组织VEGF的表达，且抑制作用随给药剂量的增加而加强。
4.PLGA-吉西他滨缓释微球间质化疗是安全的。
综上，将吉西他滨与聚乳酸-乙醇酸制成缓释微球，用注射器直接送至肿瘤部位行区域性缓释化疗，吉西他滨被缓慢释出，肿瘤部位药物浓度高，作用时间长，作用强度大，对肿瘤细胞的杀伤力大，从而可以提高肿瘤的疗效；药物集中作用于局部，全身药物量很少，不良反应极小。药物释毕后，聚乳酸-乙醇酸开始降解为乳酸和乙醇酸，进一步降解为二氧化碳和水，对动物体无影响。