抗人B7-H3单克隆抗体的制备及其应用 发明的领域
本发明涉及免疫球蛋白超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4，其制备方法以及这些单克隆抗体在肿瘤(胃癌)预后评价及作为标记分子在鉴定人树突状细胞(DC)的中的应用。
发明的背景
已知有许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、非MHC限制性的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：6550，1992；Allen RC et al.，Science.259：990，1993)。
近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL和Fas/FasL等。另一类是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(Korthauer U et al.，Nature，361：539，1993)。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。
人B7-H3(CD276)是2001年由Chapoval等人克隆的由316个氨基酸组成的I型跨膜球蛋白(包括信号肽、一对VC免疫球蛋白胞外段、跨膜区和胞浆区)。在空间结构上，该分子的配体-受体结构域与B7家族其他成员的同源性分别为27％(B7-H1)、25％(B7-H2)、21％(B7-1)和20％(B7-2)。Northern印迹分析表明，B7-H3 mRNA在人类很多组织如心脏、肝脏、前列腺、胎盘、睾丸、胰腺、小肠和大肠都有很高的表达。最初的研究发现，B7-H3能协同刺激CD4+，CD8+T细胞的增殖，增加CTL活性和提高IFN-γ分泌的表达。而且，B7-H3对IL-8，TNF-α产生也有上调作用。因此，认为B7-H3是一种正性调控分子(Chapoval AI et al.Nat.Immunol.，2001，2：269-274.)。但在随后的研究中发现，2IgB7-H3和4IgB7-H3融合蛋白均可抑制CD4+T淋巴细胞的体外增殖，下调T细胞对IFN-γ、I1-10、IL-2、IL-6和IL-8等细胞因子的分泌(Ling V et alGenomics，2003，82：365-377.)。Suh等人通过建立B7-H3基因敲除小鼠模型，在实验性自身免疫性脑炎(EAE)实验研究中发现，B7-H3基因敲除小鼠体内辅助T细胞难以分化成I型辅助T细胞，而可以向II型辅助T细胞正常分化；基因敲除小鼠体内CD4+，CD8+T细胞数量均低于野生型小鼠。因此认为，B7-H3通过下调I型辅助T细胞介导的免疫反应下调机体的免疫应答(Suh WK et al.Nat.Immunol.，2003，4：899-906.)。
关于B7-H3分子在肿瘤免疫中所起的生物学作用的研究也刚刚起步。例如，Sun等人首先将含有小鼠B7-H3的表达载体注入EL-4淋巴瘤组织中，然后把处理后的肿瘤组织移植到小鼠体内，结果显示，B7-H3可以有效的抑制直径小于0.3厘米的肿瘤的生长甚至使其完全消退(＞50％)，而对直径大于0.3厘米的肿瘤则可明显减慢其增殖的速度。进一步研究表明，B7-H3是通过调控CD8+的CTL和NK细胞来实现其体内抗肿瘤免疫应答的(Sun X et al.Gene Ther.，2003，10：1728-1734.)。Luo等人发现，B7-H3分子能明显抑制肿瘤的生长速度。分析接种小鼠体内的淋巴细胞的变化，发现B7-H3主要是通过作用于CD8+T淋巴细胞来发挥其抗肿瘤的生物学作用的(Luo L et al.J.Immunol.，2004，173：5445-5450.)。
但也有学者发现，B7-H3可通过某种未知的信号通路来下调NK细胞的生物学功能，从而使得表达该分子的神经母细胞瘤细胞免于被NK细胞杀伤(Roberta C et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，2004，101：12640-12645.)。
最近的研究发现，表达于DCs及T细胞上的B7-H3分子能促进T淋巴细胞的体外活化增殖。在应用免疫抑制剂的前体下，阻断B7-H3信号可显著提高同源异体移植植物的存活时间、减弱急慢性移植物排斥反应(Wang L et al.J.Immunol.，2005，35：428-438.)。
B7-H3作为一个新近发新的共刺激分子，其生物学功能的研究刚刚起步且存在较大争议。鉴于该家族中其他成员(如B7-1，B7-2，B7-H1，B7-H2，B7-H4等)在肿瘤的发生发展中都起了重要的作用，因此推测B7-H3在肿瘤发生发展中也具有重要作用。本发明人利用自行研制的两株鼠抗人B7-H3单克隆抗体(4H7，21D4)，进行了大规模的临床肿瘤标本筛选，结果发现B7-H3分子的表达与胃癌预后呈正相关关系。因此，B7-H3在肿瘤组织上的表达水平有可能作为评价肿瘤患者术后生存的一重要评价指标。DC是实体内最重要的、功能最强的APC，其最大的特点是能激发未致敏的T淋巴细胞活化。因此，DC在免疫应答中有着独特的地位。近年来的研究表明，机体有可能通过调节DC的功能来调节免疫应答，从而对肿瘤，移植排斥和自身免疫疾病的治疗与预防中发挥重要作用。然而，由于DC在组织当中数量极少而且细胞表面缺乏特征性标记，大大限制了对DC功能的深入研究。尽管继后建立了DC的体外扩增方法，但仍因缺乏特征性表面标记，而使DC分离的纯化和表型鉴定遇到困难。
我们还发现，B7-H3分子可持续稳定地在CD14+/CD34+来源的树突状细胞上高表达，而在外周血T，B，NK，单核细胞上则不表达或表达水平很低。据此我们认为，B7-H3分子可能是一种较为特异的DC表面标记分子。有鉴于此，B7-H3单克隆抗体可望在DC表型鉴定、分离和纯化上发挥重要的应用价值。
发明目的
本发明的一个目的是提供一组选自4H7和21D4的抗人B7-H3单克隆抗体。
根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4是抗可溶性人B7-H3的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供制备如上限定的抗人B7-H3单克隆抗体的方法，该方法包括：
(1)用预制备的高表达人B7-H3分子的转基因细胞作为免疫原免疫动物；
(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的骨髓瘤细胞融合；
(3)筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；
(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。
根据本发明的优选实施方案，其中产生抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4的杂交瘤细胞株的保藏编号分别为CGMCC No.1638和CGMCC No.1639。
本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4在胃癌预后评价中的应用。
本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人B7-H3单克隆抗体21D4和4H7作为标记分子在DC表型鉴定及筛选中的应用。
附图简要说明
图1显示以流式细胞术分析抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4对转基因细胞上B7-H3分子的识别。其中灰色峰为阴性对照，第一抗体(简称一抗)为兔IgG，第二抗体(简称二抗)为荧光素PE标记的羊抗兔IgG。透明峰显示转基因细胞与兔抗人B7-H3多抗反应的结果，其中第一抗体分别是兔抗人B7-H3多克隆抗抗体，第二抗体是荧光素PE标记的羊抗兔IgG。
图2显示流式细胞技术分析两株特异性抗B7-H3单抗的特异性鉴定。将生长良好的L929/B7-H3细胞或L929/mock细胞(L929细胞株源于美国典型培养物保藏中心(ATCC，CCL1))，用含2％小牛血清的PBS洗涤后分于流式管中(5×105个/管)。其中灰色峰为阴性对照，第一抗体(以下有时简称一抗)为鼠IgG，第二抗体为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示转基因细胞与鼠抗人B7-H3单抗(4H7或21D4)反应的结果，其中第一抗体分别是兔抗人B7-H3单克隆抗体(以下有时简称单抗)(4H7或21D4)，第二抗体(以下有时简称二抗)是荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。
图3显示以蛋白印迹法(Western blot)分析两株抗B7-H3单抗的特异性。收集生长良好的293T、L929/B7-H3和L929/mock细胞(各5×107个)，用预冷的PBS洗涤细胞并孵育后，依次加入细胞膜裂解液(RIPA)0.5ml和蛋白酶抑制剂(PMSF)100μl，分别抽提3种细胞的膜蛋白。对三种蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳并电转移到硝酸纤维素膜上。5％脱脂奶粉封闭后，4℃过夜。次日，用PBS-T洗涤并加入稀释的抗体4H7(1∶1000稀释)或21D4(1∶1000稀释)，封闭1小时。然后，用PBS-T充分洗涤并加入碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗鼠IgG二抗，室温孵育2小时。再次洗细胞并用NBT/BCIP显色系统显色。
图4显示以流式细胞术分析单抗4H7和21D4识别的抗原位点的竞争性抑制。L929/B7-H3细胞(5×105/管)用PBS洗涤后，依次加入单克隆抗体(每管2g)、生物素标记的单抗、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，并洗涤和温育后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照组。1：抗体21D4竞争结合抗体4H7所识别的B7-H3位点。透明峰为阴性对照，其中一抗为生物素标记的小鼠IgG，二抗为Streptavidin-PE。灰色峰和黑色峰显示4H7与21D4对位点的竞争性。将4H7加入L929/B7-H3反应后，再与生物素标记的4H7(灰色峰)或21D4(黑色峰)作用，最后加入藻红蛋白标记的链亲和素(Streptavidin-PE)，流式细胞仪进行检测2：同方法1，观察抗体4H7竞争结合抗体21D4所识别的B7-H3位点。
图5显示以流式细胞术分析4H7、和21d4对外周血淋巴细胞上的B7-H3分子的识别。常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMCs)，将B7-H3单抗(21D4)或同型对照鼠IgG1与新鲜分离的PBMCs或经过处理活化后的PBMCs 4℃反应30分钟，离心洗净未结合到细胞膜上的抗体后加入FITC标记的羊抗鼠二抗，4℃避光反应30分钟。然后将细胞分成数管，分别与PE标记的抗CD3、CD14和CD19单克隆抗体4℃避光反应30分钟。离心洗涤后，以流式细胞技术检测B7-H3在外周血淋巴细胞上的表达。其中灰色峰为阴性对照，一抗为鼠IgG，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示转基因细胞与鼠抗人B7-H3单抗(4H7或21D4)反应结果，其中第一抗体分别是兔抗人B7-H3单抗21D4，第二抗体是荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。
图6显示以流式细胞术分析单抗21D4对Mo-DCs上B7-H3分子的识别能力。参照文献分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)(金伯泉，第四军医大学出版社，2002)，洗细胞后，将细胞(3×106/ml)加入6孔培养板(2ml/孔)中，37℃培养2小时。培养后除去细胞在培养板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)、10％FCS、0.02mmol/LL-谷氨酰胺、二巯基乙醇(2-ME，5×10-5mol/L)的RPMI-1640继续培养(每3天换液一次)。培养7天后，加入5C11(5μg/ml)或TNF-α(10ng/ml)诱导3天。然后，收集各诱导组处于不同发育阶段的DCs，通过流式细胞仪分析细胞表面B7-H3的表达。(a，)单抗21D4对未成熟Mo-DCs表面分子B7-H3的识别能力。其中灰色峰为阴性对照，一抗为鼠IgG，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示转基因细胞与鼠抗人B7-H3单抗(4H7或21D4)反应的结果，其中第一抗体分别是兔抗人B7-H3单抗21D4，第二抗体是荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。单抗4H7也有类似的识别能力(图略)。(b，)单抗21D4对成熟Mo-DCs表面分子B7-H3的识别能力。其中灰色峰为阴性对照，一抗为鼠IgG，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示转基因细胞与鼠抗人B7-H3单抗(4H7或21D4)反应的结果，其中第一抗体分别是兔抗人B7-H3单抗21D4，第二抗体是荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。
图7显示以Western blot免疫印迹法分析单抗21D4及4H7对Mo-DCs的识别。收集生长状态良好的Mo-DCs(约5×107个)，用预冷的PBS洗涤两遍并冰育后，依次加入细胞膜裂解液(RIPA，0.5ml)和蛋白酶抑制剂(PMSF，100μl)后分别抽提细胞膜蛋白。电泳后将所需的分离物电转移到硝酸纤维素膜上。5％脱脂奶粉封闭硝酸纤维膜，4℃震荡保温过夜。次日，PBS-T洗涤后加入稀释的抗体4H7(1∶1000稀释)或21D4(1∶1000稀释)或同型对照鼠IgG，封闭并充分洗涤后，加入碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗鼠IgG二抗，室温孵育2小时，用NBT/BCIP显色系统显色。
图8显示单抗21D4对肿瘤细胞上B7-H3分子的识别。采用间接免疫荧光法检测B7-H3分子在B淋巴瘤细胞系、多发性骨髓瘤细胞系、上皮性肿瘤细胞系以及扁桃体和外周血淋巴细胞上的表达。结果显示，B7-H3分子在上皮来源的肿瘤细胞表面上有较高水平的表达。而在多发性骨髓瘤细胞系U266、8266和XG系列细胞；白血病细胞HL60、K562；T细胞系细胞Jurkat；B细胞系细胞Raji、Daudi上几乎不表达。单抗4H7也有类似的识别能力(图略)。
图9单抗21D4对新鲜组织上B7-H3分子的识别。取样本组织，常规制备石蜡切片(4μm)。切片经脱蜡和修复抗原后，用蒸馏水洗涤并加入0.3％过氧化氢-甲醇以阻断内源过氧化物酶，于室温下孵育30分钟。再次洗涤后，每张切片依次滴加入10％正常羊血清、特异性鼠抗人B7-H3抗体21D4(1∶50，作为一抗)、入生物素标记的兔抗鼠IgG(第二抗体)、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液。每次加如试剂前均用PBS洗细胞并于37℃孵育40-60分钟。反映后，加入0.04％DAB+0.03％H2O2显色，并用苏木素衬染。水洗、脱水并透明处理后封片。显微镜观察可见，胃癌细胞、胃腺瘤细胞膜和细胞浆中均可见B7-H3分子阳性表达。A，10例正常胃组织未见B7-H3分子的表达；B，10例胃腺瘤细胞中B7-H3分子表达阳性率100.0％；C，102例胃癌细胞(细胞膜和细胞浆)中B7-H3分子表达阳性率为58.8％。
图10显示B7-H3的表达与胃癌患者预后的正相关关系。单变量分析提示，肿瘤浸润深度、生存期、组织类型与B7-H3的表达有关。多变量分析显示，B7-H3的表达对胃癌生存期的相对危险度为2.803，95％可信区间为1.051-7.477，P值为0.040。并且与肿瘤浸润深度、组织类型密切相关。因此可以认为，B7-H3的表达是影响胃癌生存期的独立因素。与患者术后生存时间的关系分析显示，生存期大于5年的胃癌患者B7-H3的表达阳性率(74.5％)显著高于生存期小于2年的胃癌患者(43.1％)。可见，B7-H3的表达与胃癌患者预后有关。
【发明内容】
本发明涉及免疫球蛋白超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4，其制备方法以及这些单克隆抗体作为DCs表面标记分子鉴定和分选DCs以及作为评价肿瘤患者(胃癌)术后预后评价的指标的应用。
本说明书中所说的“受体”是指抗原活化的T细胞表面上表达的蛋白质；配体是某些哺乳动物细胞上表达的可与受体特异结合的蛋白质。
术语“B7-H3”包括完整的配体、可溶配体及包括配体之功能活性部分的融合蛋白。术语“抗B7-H3抗体”可以是特异性单克隆或多克隆抗体或它们的免疫学活性部分。本发明中，优选的是单克隆抗体，特别是小鼠抗人B7-H3抗体。
可以按照本领域已知的常规方法制备本发明的抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4(参见Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要时，也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗单克隆抗体。
根据本发明的优选实施方案，最好使用被携带人B7-H3基因的表达载体转化的并可在适当的培养条件下高效表达人多肽的重组体细胞作为制备本发明单克隆抗体的免疫原。
因此，为了制备本发明的抗人B7-H3单克隆抗体，首先构建高表达人B7-H3的转基因细胞(L929/B7-H3)。高表达人B7-H3分子的转基因细胞L929/B7-H3具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于L929细胞是鼠源性的成纤维细胞，细胞表面其他分子具有相对较弱的抗原性，因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产生，使单克隆抗体的筛选更为方便并大大提高阳性检出率。
为了制备L929/B7-H3细胞，可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour，1989)进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养
可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein，Nature 265：495-497，1975)制备本发明的抗人B7-H3单克隆抗体4H7和21D4。简单地说，用转基因细胞L929/B7-H3免疫BALB/C小鼠。当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，分离动物的脾细胞并制备单细胞悬液。例如，可以将脾细胞悬液加到B7-H3抗原蛋白质包被的平板或小孔内，表达B7-H3多肽特异性免疫球蛋白的B细胞即结合到平板上，而不能被其余的悬液洗掉。然后可以收集所得到的B细胞或所有解离的脾细胞，并在适当的融合剂例如聚乙二醇的诱导下与骨髓瘤融合以形成杂交瘤，并在选择性培养基例如HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞。然后，用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。于体外(例如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌抗人B7-H3抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化所需的抗体。
流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的抗人B7-H3单克隆抗体4H7、和21D4均能识别成熟DC和活化单核细胞表面上表达的B7-H3分子。竞争抑制试验结果进一步显示，本发明的抗人B7-H3单克隆抗体4H7与21D4识别完全不同的抗原位点。因此，有可能利用4H7和21D4制备用于检测可溶性人B7-H3的试剂盒。
以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1：抗人B7-H3单克隆抗体的制备
本实施例描述本发明的抗人B7-H3单克隆抗体4H7、和21d4的制备。
(1)转基因细胞L929/B7-H3和L929/mock的建立
(a)人B7-H3基因的克隆：使用TRIZOL试剂(Gibco，BRL)抽提抗原诱导成熟的DC的总RNA。按照MBI逆转录试剂盒使用说明书推荐的方法，将mRNA逆转录成cDNA。取5μl cDNA为模板，使用上游引物5’-AA CTG CAGATG GAA AGG GTC CAA CCC-3’，和下游引物5’-CG GGA TTC TCA AAGGAC ACA GAA TTC-3’进行PCR扩增(94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸5分钟)。纯化后，在T4DNA连接酶作用下直接将PCR产物与pMD18-T载体连接过夜。用所得连接产物转化感受态细菌TOP10，并对筛选的阳性克隆进行PCR和酶切鉴定以及DNA测序。结果显示，所获得的cDNA序列与GenBank中注册的人B7-H3 cDNA序列完全一致。
(b)重组逆转录病毒载体的构建：分别用核酸内切酶PstI和BamHI消化测序正确的pMD18-T/B7-H3质粒和逆转录病毒载体pEGZ-Term(现代免疫学，2004，24(2)：99-103)(37℃，4小时)。回收含目的基因的片段，并用连接产物转化感受态细菌。用上述方法鉴定证实后，将所获得的重组逆转录病毒载体定名为pEGZ-Term/B7-H3。
(c)稳定表达人B7-H3的L929转基因细胞的构建：首先以试剂盒操作手册推荐的脂质体法，用重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/B7-H3和辅助病毒pHIT456与pHIT60(现代免疫学，2004，24(2)：99-103)(体积比2∶1∶1)共转染6孔板中60-70％汇合生长成片的293T细胞(ATCC，CRL-1573)。48小时后收集含病毒颗粒的293T培养上清，以其感染L929细胞。加入polybrene至终浓度为8ng/ml，继续37℃感染6小时。再加入含10％胎牛血清(FCS)的1640培养基(2ml/孔，隔天换液)。重复感染3次后收集细胞，将1∶6稀释的细胞培养物置于含Zeocin(Invitrogen，500μg/ml)的选择培养基中筛选培养2周。待抗性单克隆生长至足够大，挑取单克隆菌落进行扩大培养。同时制备用作阴性对照的转基因细胞L929/mock。流式细胞仪检测显示，L929/B7-H3细胞膜上人B7-H3蛋白的表达率约为97％。
(2)抗人B7-H3单克隆抗体的制备
使用如上得到的高表达B7-H3分子的转基因细胞(L929/B7-H3)作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠(107/500μl/只)(间隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共20块96孔板)。以高表达B7-H3分子的L929/B7-H3为阳性对照及表达B7-H3分子的L929/mock为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定(参见图2)。阳性克隆经3次有限稀释后，克隆的阳性率达到约95％。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人B7-H3的杂交瘤细胞株，并分别被命名为4H7(CGMCC No.1638)和21D4(CGMCC No.1639)。这些杂交瘤细胞经体外持续传代(40代)后，仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株4H7和21d4的染色体分析显示，这三株杂交瘤细胞的染色体数目为80-110(参见图3)。
(3)抗人B7-H3单克隆抗体的生产与特性鉴定
(a)采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞(1×107/只)，同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0.2ml/只)。5-10天后收获腹水，并离心取上清于-80℃保存。
(b)腹水型单抗的纯化和定量。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8～10mg/ml。间接免疫荧光法分析结果表明，纯化的单克隆抗体的效价在1∶1000以上。
(c)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法鉴定Ig亚类，结果显示4H7和21D4均为小鼠IgG1型抗体。
(d)抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验。在L929/B7-H3细胞(5×105/管)悬液分别加入单克隆抗体(每管2μg)，4℃孵育45分钟。洗细胞后依次加入生物素标记的单抗，和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(Streptavidine-PE)，并分别4℃孵育30分钟。再次洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照。如图5所示，单抗4H7部分阻断单抗与L929/B7-H3细胞上B7-H3分子的结合，单抗4H7和均不能阻断单抗21d4与L929/B7-H3细胞上B7-H3分子的结合。由此表明，4H7与识别的B7-H3分子抗原位点不完全相同，而21d4则具有不同于4H7和的抗原识别位点。
(e)单抗的Western印迹鉴定。12％SDS-PAGE电泳分离表达GST-B7-H3的重组菌体蛋白，电转移至硝酸纤维素膜上并用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。第二天，加入纯化的抗体室温孵育1小时。用TBST溶液洗去未结合的抗体，加入AP标记的二抗。孵育后加入底物显色。结果证实，4H7和21D4均能与B7-H3蛋白特异性结合，形成阳性条带。表明这两株单抗均具有识别B7-H3分子的良好特异性(参见图5)。
实施例2：单抗21D4对表达在Mo-DCs表面的B7-H3分子的识别能力
1)常规分离健康人外周血获得单个核细胞(PBMC)，RPMI-1640洗涤两遍后，用含有10％FCS的RPMI-1640调整细胞密度至3×106/ml，加入6孔培养板(2ml/孔)中。然后5％CO2、37℃培养2小时。将悬浮细胞吸出后于培养板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)、10％FCS、0.02mmol/LL-谷氨酰胺、5×10-5/mol/L2-ME的RPMI-1640继续培养，每3天换液一次。培养7天后，加入5C11(5μg/ml)或TNF-α(10ng/ml)诱导3天。
2)收集各诱导组处于不同发育阶段的DCs，通过流式细胞仪分析细胞表面B7-H3的表达。结果表明：B7-H3在Mo-DCs上呈现极为稳定的高水平表达。单核细胞在含GM-CSF、IL-4的1640培养基中诱导培养24小时，即能检测到B7-H3分子的表达，表达一直持续到Mo-DCs凋亡。鉴于在外周血T细胞、B细胞及单核细胞上不能检测到B7-H3分子表达或表达水平很低，所以B7-H3有望作为Mo-DCs一个极为重要的表面标记分子，用于Mo-Dcs的鉴定和筛选。
实施例3：B7-H3在肿瘤细胞上的表达与肿瘤预后的关系
1)病例来源
102例胃癌标本取自苏州大学附属第三医院于1998-1999年间收住的胃癌手术患者。其中男性75例，女性27例。年龄28-77岁，平均55岁。肿瘤位于粘膜内和粘膜下10例，位于浅肌层20例，肿瘤浸润深度达到或超过深肌层72例。组织学类型分为：分化型腺癌(乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌)及低分化型腺癌(低分化腺癌、印戒细胞癌、粘液细胞癌)。所有患者术前未接受化疗或放疗。
10例胃腺瘤标本取自苏州大学附属第三医院1998-1999年间收住的胃腺瘤手术患者，其中男性7例，女性3例。年龄55-67岁，平均60岁。
2)免疫染色及评估
常规制备肿瘤组织切片，脱蜡并水化后，用PBS(PH 7.4)冲洗三次并进行相应的修复。每张切片滴加(50μl％)H2O2(阻断内源性过氧化物酶)、第一抗体(50μl％)、聚合物增强剂(试剂A，50μl)、酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B，50μl)。每加入新的试剂后均充分洗涤并于37℃或室温下孵育。最后，在切片上滴加新鲜配制的DBA显色液(约100μl)并在显微镜下观察结果。肿瘤细胞明显着色者记作B7-H3阳性细胞(胃癌组织中B7-H3阳性细胞少于20％记作表达阴性，大于20％记作表达阳性)。
3)统计学处理
采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，B7-H3表达阳性及阴性组间的比较采用X2检验，预后与诸因素的关系采用多变量Logistic regression分析
4)B7-H3在胃癌和胃腺瘤中的表达
胃癌细胞和胃腺瘤细胞膜和细胞浆中均可见B7-H3分子阳性表达，10例胃腺瘤细胞中B7-H3分子表达阳性率100.0％，胃癌细胞中B7-H3分子表达阳性率58.8％。
5)B7-H3表达与患者年龄、性别和预后的关系
B7-H3的表达与患者年龄、性别无关(p＞0.05)。与患者术后生存时间的关系分析表明，B7-H3的表达与胃癌患者预后有关，生存期大于5年的胃癌患者B7-H3的表达阳性率(74.5％)显著高于生存期小于2年的胃癌患者(43.1％)(x2＝10.36，P＜0.01)。
6)B7-H3表达与胃癌临床病理的关系
B7-H3表达与肿瘤有无淋巴结转移、肿瘤部位、大小无关(P＞0.05)；而与浸润深度、生存期、组织学类型有关。在胃癌组织类型为分化型(x2＝4.55，P＜0.05)、肿瘤浸润未达深肌层(x2＝5.56，P＜0.05)B7-H3表达阳性率较高。
7)胃癌生存期相关因素的多变量分析
将浸润深度、生存期、组织类型、B7-H3的表达等纳入相关因素变量分析表明，单变量分析提示，肿瘤浸润深度、生存期和组织类型与B7-H3的表达有关。多变量分析显示，.B7-H3的表达对胃癌生存期的相对危险度为2.803，95％可信区间为1.051-7.477，P值为0.040。可见，B7-H3的表达与肿瘤浸润深度、组织类型相关。因此可以认为，B7-H3的表达是影响胃癌生存期的独立因素，具有重要的临床意义。
有关实验数据详见下列表1。
B7-H3表达与胃癌临床病理的关系(阳性率％)
项目 总例数 阳性例数(阳性率％) X2 p值性别男女年龄＞60岁＜60岁生存期＜2年＞5年组织类型分化型低分化型浸润深度未侵及深肌层侵及深肌层淋巴结转移阴性阳性胃癌部位胃上1/3胃中1/3胃下1/3肿瘤大小＜5cm＞5cm 75 27 64 38 51 51 72 30 30 72 54 48 31 30 41 55 47 42(42.7) 18(44.4) 36(56.3) 24(63.2) 22(43.1) 38(74.5) 48(66.7) 12(40.0) 23(76.7) 37(51.3) 33(61.1) 27(56.3) 19(61.2) 17(56.7) 24(58.5) 35(63.6) 25(53.2) 0.993 0.470 10.362 6.217 5.586 0.248 0.137 1.141 0.334 0.493 0.001 0.013 0.018 0.619 0.934 0.285
由以上表1所示的结果可以看出，B7-H3的表达与患者的年龄、性别无关(p＞0.05)，而且与肿瘤肿瘤发生部位和大小，以及有无淋巴结转移无关(P＞0.05)。相反，B7-H3的表达水平与肿瘤浸润深度、生存期及组织学类型有关。特别是，胃癌组织类型为分化型(x2＝4.55，P＜0.05)、肿瘤浸润未达深肌层(x2＝5.56，P＜0.05)的细胞的B7-H3表达阳性率明显升高。
因此，可以使用本发明的单克隆抗体制备用于胃癌预后评价，或鉴定人树突状细胞(DC)的试剂盒。所说的试剂盒除包括本发明的抗细胞表面B7-H3分子的单克隆抗体外，还可包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液和标准品等。
杂交瘤样品保藏
鉴于阳性杂交瘤特别是以高产率产生本发明单克隆抗体的杂交瘤筛选的偶然机遇性，也是作为对本说明书文字描述部分的补充，本申请人在微生物保藏机构中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)保藏了分别产生本发明的单克隆抗体4H7和21D4的两个杂交瘤细胞株，它们的保藏编号分别为CGMCCNo.1638和CGMCC No.1639。