5-羟甲基糠醛在制备保护血管内皮细胞药物中的应用 一、技术领域：
本发明涉及医药领域的细胞生物学技术，具体地说是涉及5-羟甲基糠醛药物的新用途，即在制备保护血管内皮细胞药物中的应用。
二、背景技术
中药化学成分复杂，但从多种单味药及复方中发现，多数中药存在一个共同的成分-5羟甲基糠醛(5-HMF)。5-HMF是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，一般经炮制或加热后含量会升高，有的甚至升高极其明显。现阶段对于5-HMF探讨存在着很大的争论。有报道称该化合物对人体横纹肌和内脏有毒副作用等。因此，医药、食品等工业中往往对其产品进行5-HMF含量的控制。但近年来有研究发现，5-HMF具有抗氧化，抗心肌缺血等对人体有益的作用。现将5-HMF的形成、性状、影响因素、检测方法、毒副作用及其药理作用等研究现状综述如下。
(一)5-HMF概况
1.形成[吴立军主编.天然药物化学(第四版).人民卫生出版社，2004：73-74]、结构：
5-羟甲基糠醛(简称5-HMF)，又称5-羟甲基-2-糠醛，由单糖化合物加热分解产生。多糖及苷类化合物在浓酸作用下首先水解成单糖，单糖在浓酸(4-10N)加热作用下，再脱去三分子水，生成具有呋喃环结构的糠醛化合物。该物质稳定性欠佳，可进一步分解为乙酰丙酸和甲酸或是聚合。
5-羟甲基糠醛的化学结构式为：
2.存在
5-HMF主要存在于可能发生糖降解反应和美拉德反应的食品和植物中，如在蜂蜜、婴儿乳品、葡萄干及大多水果(如日本黄杏)中等均有发现。而其他植物中近来发现也不少，如[刘美丽.地黄炮制研究I熟地黄中5-羟甲基糠醛的提取分离及含量测定[J].中草药，1995，26(1)：13]等从熟地黄中分离得到5-HMF；再如[贾天柱，陈焕亮，解世全，周鹤，李功妍.饮片炮制狗脊升华物中5-羟甲基糠醛分析[J].中成药，2002，24(10)：768-771]等首次从狗脊升华物中分离鉴定了有一定刺激性的5-HMF，同时认为可将其作为狗脊炮制品的一个指标物质。对于葡萄糖输液剂而言，在其储存、加热灭菌过程中均有可能产生5-HMF。
3.影响因素
由于5-HMF稳定性欠佳，其含量影响因素较多。加热时间和温度是影响5-HMF的首要因素，一般均使5-HMF含量呈规律变化[王俊平，李百华，蔡磊.高温高压灭菌对血液保养液质量的影响[J].中国输血杂志，1995，8(3)：136-137]。高温液态水中有机酸的存在对5-HMF含量也有不同程度的影响[刘昕，吕秀阳，夏文莉，任其龙.高温液态水中有机酸对果糖分解反应动力学的影响[J].化工学报，2006，5(7)152-56]。另外，高温状态下，存在溶液的电解质价数越高，分解的5-HMF量越多[迟文，曹永红，黄桂芳.电解质对5-羟甲基糠醛的影响[J].中国医院药学杂志.1995，15(3)：128-129]。再者，复方配伍对其也有一定的影响。中国药科大学中药研究所严永清[夏云，李志明，朱丹妮，严永清.化学生脉散复方化学动态变化与药效关系的研究——生脉散复方化学的研究(I)[J].中国中药杂志，1998，23(4)：230-231]等对生脉散复方进行研究，研究表明，单味药在煎煮前均不含5-HMF，而生脉散全方及麦冬与五味子配伍的水煎液中5-HMF的含量显著增高，由此推断，5-HMF的形成可能与五味子的酸性有关而其含量主要受麦冬的影响。
4.检测方法
常见的5-HMF检测方法有UV法和HPLC法。由于UV吸收度法简单、通用、不需对照品，ChP(2000)、BP(1998)和USP(24)均采用此法控制产品中的5-HMF含量。如[张嵩，徐卫国，陈蔚林，饶高堂.葛根素葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的双波长测定[J].药品监管，2000，9(12)：13-14]等用双波长比色法测定葛根素葡萄糖注射液中5-HMF。但若主药等干扰检测时，可采用HPLC外标法，该法克服了5-HMF和其他成分在同一波长处有吸收的问题，从而能更准确地测定其含量和控制注射液的质量。如[戴其昌，范小萍.HPLC法检查甲硝唑葡萄糖注射液中5-HMF[J].西北药学杂志，1999，14(3)：99-100]等用HPLC法测定甲硝唑葡萄糖注射液中5-HMF，测得平均回收率为99.2％(RSD％＝0.61％)。
(二)5-HMF毒副作用及其代谢研究
1.毒副作用
有研究利用结肠致癌剂造模的45F344雄性大鼠进行实验，造模一周后，将动物随机分成4组，并分别在正常饮食中加入未加热的蔗糖、加热后的蔗糖、加热后蔗糖的丁醇提取物(去除5-HMF)和1％的5-HMF进行饲养。结果显示，蔗糖加热组和1％5-HMF组均出现明显的结肠小囊异常生长(ACF)，而丁醇提取物组大鼠未出现ACF。进一步实验还证实5-HMF能直接导致ACF的产生，并呈剂量依赖性。由此得出结论，对糖进行加热后(包括家庭烹制)如能产生含量为1％的5-HMF，就有可能引发并促进ACF[Zhang XM，Chan CC，Stamp D，et al.Initation andpromotion of colonic aberrant crypt foci in rats by5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde in thermolyzed sucrose.Carcinogenesis，1993，14(4)：773-775]。另有研究显示5-HMF还可产生一定程度的基因毒性，推测其机制可能为5-HMF在体内经过硫化和氯化的过程而产生的致突变作用[Surh Y，Tannenbaum SR.Activation of the Maillard reaction product5-Hydroxymethylfurfural to strong mutagens via allylic sulfonation andchlorination.Chem Res Toxicol，1994，7(3)：313-318]。另外，5-HMF对人体横纹肌和内脏有毒副作用。
但也有大量报道称5-HMF不具有某些毒副作用。在对8种碳水化合物的热降解产物对小鼠皮肤癌的作用研究中，5-HMF并未显示出诱导和促进皮肤癌作用[Miyakawa Y，Nishi Y，Kato K，et al.Initiating activity of eightpyrolysates of carbohyates in a two-stage mouse skin tumorigenesis model.Carcinogenesis，1991，12(7)：1169-1173]。通过5-HMF对蛋白质损伤和影响谷胱甘肽活性的研究，得出结论，5-HMF虽能使正常cell内谷胱甘肽活性受到一定影响，但远远不会给人体造成严重的损害[Janzowski C，Glaab V，Samimi E，etal.5-Hydroxymethylfurfural：assessment of mutagenicity，DNA-damaginhpotential and reactivity towards cellular glutathione.Food ChemToxicol，2000，38(9)：801-809]。
2.代谢研究
5-HMF主要经肾排泄。将5-HMF用14C标记后大鼠口服给药，8h后发现14C主要集中在肾脏和膀胱，其次是肝脏，胃肠道较少，推测肾排泄是5-HMF的主要排泄方式。在大鼠给药8h后的尿液中检测到了两种呋喃环的成分，5-羟甲基-2-糠酸(HMFA)和HMFA的甘氨酸结合物(HMFG)，并且尿液中的14C含量高达85％，给药24h后其含量大大降低。由此可见，5-HMF在大鼠体内主要经肾排泄，且代谢速度较快[Jacques-Edouard Germond，Grorges Philippossian，Urs Richli，etal.Rapid and complete urinary elimination of[14C]-5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde administered orally or intravenously torats.Journal of Toxicology and Environmental Health，1987，22：79-89]。
Godfrey等采用管饲法对雄性F344大鼠和B6C3F1小鼠给予5，10，100或者500mg/Kg[14C]-HMF(5-HMF)，研究其在体内的分配情况，从组织分配的情况表明：HMF在雄性大鼠和小鼠的吸收是迅速的，在雄性小鼠组织中的浓度在早期时间点与剂量并不呈直线比例关系，其分泌途径主要经由尿排出，口服剂量的60％-80％在48h内经由这条途径排出。对于肝、肾、组织/血液的HMF放射比活性大于1，尿液中的代谢物中一种为：N-5-羟甲基-2-呋喃。
(三)5-HMF的药理作用研究
1.抗心肌缺血
近年来，在中药复方研究中发现，5-HMF有一定的抗心肌缺血作用，[夏云，李志明，朱丹妮，严永清.化学生脉散复方化学动态变化与药效关系的研究——生脉散复方化学的研究(I)[J].中国中药杂志，1998，23(4)：230-231]等对生脉散的化学成分进行研究，从其合煎剂中分离得到一个新成分，经UV、IR、MS、及NMR谱鉴定为5-HMF。同时，研究发现，单味药在煎煮前不含5-HMF，单味五味子水煎后能产生少量5-HMF，人参、麦冬水煎液中未发现5-HMF，而生脉散全方及麦冬与五味子配伍的水煎液中5-HMF的含量显著增高，推测5-HMF生成可能与五味子酸性有关，而其含量主要受麦冬影响。进一步进行药效学研究后发现，全方合煎的药效明显优于该方单煎或两两组合配伍或三方单煎后混合的药效，推测该结果可能与其中所含的5-HMF及其含量有关。对分离所得5-HMF进行初步药效学实验，研究表明，5-HMF能降低心肌缺血小鼠血清中LDH含量，降低心肌缺血小鼠心肌组织中MDA含量，提示生脉散全方煎煮后化学成分的变化有利于其抗心肌缺血作用，它的产生对复方整体疗效是有利的，是生脉散抗心肌缺血的物质基础之一。
2.抗氧化作用
近年来严永清[严永清.生脉散复方化学成分的动态变化与药效关系研究5-羟甲基糠醛的分离、鉴定及含量变化[C].全球华人中药现代化学术研讨会论文集，1998，213]等从生脉散煎剂中分离鉴定了原三药材没有的5-HMF，证明5-HMF除具有抗心肌缺血作用外，还具有良好的抗氧化作用。同时，有报道称茅台酒中含有5-HMF，有较强的抗氧化性，有益于口腔健康，且同样具有抗心肌缺血作用。
3.Ca2+拮抗活性
研究发现，梅果实(如乌梅)中所含的蔗糖经加工炮制后可生成5-HMF，具有Ca2+拮抗活性，有较强的拮抗由钾离子引起的豚鼠结肠带收缩的活性。同时，乌梅具有抗过敏作用，其抗过敏机理可能是非特异性刺激产生的游离抗体中和侵入体内的过敏原的结果，有人认为该作用机理可能与其中所含的5-HMF有关[许腊英，余鹏，毛维伦，刘芬.中药乌梅的研究进展[J].湖北中医学院学报，2003，5(1)：52-57]。
4.改善血液流变学
Kubo M等[Kubo M，Asano T，Matsuda H，et al.Studies on Rehmanniaeradix.III.The relation between changes of constituents and improvableeffects on hemorheology with the processing of roots of Rehmannia glutinosa.Yakugaku Zasshi，1996，116(2)：158-168]研究发现，生地黄在蒸制过程中生成5-HMF，随蒸制时间延长，熟地黄中5-HMF含量增加，炮制成熟地黄后其含量增加约20倍左右。而药效学实验发现熟地黄可以通过改善红细胞变形能力、红细胞集合体形成等红细胞动态，并通过使纤溶系功能增强而改善血液流变学，从而呈现血液促进的作用，与熟地相比，生品在这方面作用较弱，这可能与两者所含5-HMF含量的差异有关。
另外，从产于日本的黄杏中分离得到了5-HMF，通过实验同样证实5-HMF在改善血液流变性方面有一定作用。
5.影响甘草酸代谢
有报道称，蜂蜜中含有葡萄糖、蔗糖、5-HMF等成分，将这3种成分分别家兔口服给药后，观察其对家兔体内甘草酸和甘草次酸代谢情况的影响。结果表明，5-HMF能抑制甘草次酸氧化为3-脱氢甘草次酸，增加甘草次酸在体内的吸收，从而促进甘草酸和甘草次酸的抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇的作用[Hou YC，Ching H，Chao PD，et al.Effects of glucose，fructose and5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde on the presystemic metabolism andabsorption of glycyrrhizin in rabbits.J Pham Pharmacol，2005，57(2)：247-251]。
6.其它
近年来，有人以线粒体呼吸链复合体IV抑制剂叠氮钠微泵恒速灌注30天导致大鼠神经元能量代谢障碍和学习记忆能力减低，从而研究补肾中药山茱萸单体成分5-HMF作用，结果显示，5-HMF能够拮抗叠氮钠致神经细胞线粒体跨膜电位下降，并且可升高转AD患者线粒体DNA融合细胞的线粒体膜电位。
同时，有实验采取药效追踪的方式对山茱萸的甲醇提取物进行分离得到5-HMF，药效学实验发现5-HMF对于黑腹果蝇幼虫有杀虫作用[Miyazawa M，AnzaiJ，Fujioka J，et al.Insecticidal compounds.Againt Drosophila melanogasterfrom Cornus officinalis Sieb.et Zucc.Nat Prod Re，2003，17(5)：337-339]。
三、发明内容：
本发明的目的在于提供5-羟甲基糠醛(5-HMF)的新医疗用途，即在制备保护血管内皮细胞药物中的应用。
本发明是以人体血管的内皮细胞为材料，通过综合形态学观察、MTT检测、流式细胞仪分析、SOD检测结果，5-羟甲基糠醛对血管内皮细胞有一定的保护作用，能拮抗H2O2造成的细胞损伤，对H2O2造成的SOD减低及诱导的细胞凋亡有缓解作用。5-羟甲基糠醛可能通过改善抗氧化系统，抑制细胞凋亡等作用，保护血管内皮细胞，以改善肝肾组织血管微循环功能发挥补肝益肾的功效。同时对心脑血管病可能有一定的预防作用。
四、附图说明
图1倒置显微镜观察血管内皮细胞形态学变化状况-细胞对照组；
图2倒置显微镜观察血管内皮细胞形态学变化状况-H2O2模型组；
图3倒置显微镜观察血管内皮细胞形态学变化状况-5羟甲基糠醛给药组；
图4荧光显微镜观察血管内皮细胞对照组；
图5荧光显微镜观察血管内皮细胞H2O2模型组；
图6荧光显微镜观察血管内皮细胞5羟甲基糠醛给药组
五、具体实施方式
实施例：本发明是以人体血管内皮细胞为材料，观察5-HMF的保护作用，具体实验如下：
1仪器与材料
CO2培养箱(FAMER，USA)，酶标仪(BIO-RAD，USA)，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)，流式细胞仪(FACSCaliuber)，荧光显微镜(OLYMPUS，日本)，超净工作台：苏州净化器材厂，三洋低温冰箱(MDF-U281)。
血管内皮细胞(购自上海细胞所)。
5-羟甲基糠醛(购自上海友思生物科技有限公司)，RPMI1640培养基(GIBCO，USA)，MTT(sigma公司)，碘化丙啶(PI)染料(Sigma公司)，吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)(南京建成生物工程研究所)。小牛血清(GIPICO)，胰蛋白酶(Typrin，1∶250，Amerso，USA，批号：0428S05)，二甲基亚砜(分析纯，MERCK)
2方法与结果
2.1供试药制备：用生理盐水配制5-羟甲基糠醛溶液浓度为1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。
2.2细胞培养：按文献[吴立军主编.天然药物化学(第四版).人民卫生出版社，2004：73-74]方法培养。
2.3分组及给药：实验分为正常对照组、H2O2模型组(终浓度为100μmol/L)，葡萄糖糖模型组(终浓度为30mmol/L))，5-羟甲基糠醛给药组，见表1、2、3。
2.4倒置显微镜观察：在终止细胞培养前，采用倒置显微镜观察各组细胞形态变化，并进行显微摄影。
2.5荧光显微镜观察：
取处于指数生长期的细胞，加入适量0.25％胰酶消化，用含10％新生牛血清的RPMI 1640培养液配成细胞悬液，用血球细胞板计数，并以培养液稀释细胞，配成2×105/ml细胞悬液，加入含有处理过的盖玻片的六孔细胞板中，继续培养待细胞爬上盖玻片后，加入药液处理24小时后，取出盖玻片，滴上AO/EB染液，荧光显微镜观察。
2.6MTT检测
取处于指数生长期的细胞，加入适量0.25％胰酶消化，用含10％新生牛血清的RPMI 1640培养液配成细胞悬液，用血球细胞板计数，并以培养液稀释细胞，配成2×105·mL-1细胞悬液，加入96孔细胞板，使每孔含细胞悬液及药液共200μl，药液占20μl，每组重复8孔，在37℃，5％CO2的培养箱中分别孵育24h时间后，每孔加入50μl用PBS配成1mg·mL-1的MTT溶液，37℃温育4h，使MTT还原为formazan，倾出上清液，加入100μl DMSO使formazan溶解，混悬仪混匀后用酶标仪在490nm处测定每孔吸光度。
2.7流式细胞仪检测
取处于指数生长期的细胞加药培养一定时间后，用适量0.02％EDTA进行消化，制成单细胞悬液，1000r·min-1离心，PBS洗涤2次，配成1×106mL-1细胞悬液，75％冷乙醇-20℃固定，上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次，用0.5mL PBS悬浮细胞制成细胞悬液，加入PI染液0.5mL，4℃避光染色30分钟以上，经300目尼龙网过滤后，上流式细胞仪检测凋亡细胞的含量，并观察分析细胞周期。所得资料用ModFitLT3.0分析软件分析结果。
2.8抗氧化检测：
购置抗氧化检测试剂盒，取细胞上清，按试剂盒说明书检测。
3实验结果
3.15-羟甲基糠醛对H2O2和葡萄糖高糖所致血管内皮细胞损伤的保护作用形态学结果：
倒置显微镜观察结果如图1-3
由图1-3可见对照组血管内皮细胞生长状态良好，贴壁较牢，细胞间连接紧密，细胞呈多角形或短棱形边界清晰大小均匀，H2O2模型组内皮细胞增殖受到抑制，有较多的细胞脱落，细胞形态不佳，5-羟甲基糠醛给药组，5-羟甲基糠醛对细胞有一定的保护作用，减轻了H2O2对细胞的影响。
荧光显微镜观察结果如图4-6
上图可见模型组与对照组相比，有相当数目的细胞染色质固缩、细胞界限不清，细胞表现出明显的凋亡特征，5-羟甲基糠醛组与模型组相比，则细胞染色质固缩情况相对减轻，说明了其具有一定的保护作用。
MTT检测结果：
MTT检测结果如下表所示：
表1 5-羟甲基糠醛对H2O2所致血管内皮细胞损伤的保护作用
组别 终浓度 吸光度值 正常细胞组 H2O2模型组 糠醛(1) 糠醛(2) 糠醛(3) 糠醛(4) 100μmol/L 0.1μg/ml 1μg/ml 10μg/ml 100μg/ml 0.580±0.035** 0.469±0.037 0.580±0.037** 0.566±0.005** 0.532±0.055** 0.520±0.025**
注：**与模型组相比p＜0.01。
表1MTT检测结果表明：四种浓度的5-羟甲基糠醛组OD值与H2O2模型组有显著差异，表明5-羟甲基糠醛能拮抗H2O2对血管内皮细胞造成的损伤，反映了5-羟甲基糠醛对血管内皮细胞的保护作用。表2的结果同样证明了5-羟甲基糠醛对血管内皮细胞的保护作用。
表2 5-羟甲基糠醛对H2O2所致血管内皮细胞损伤的保护作用(24h)
组别 OD值(24h) OD值(36h) 细胞对照组 阳性对照(丹参) 组 5-羟甲基糠醛组2 H2O2模型组 0.482±0.031* 0.437±0.029* 0.440±0.033* 0.216±0.009 1.223±0.059* 0.606±0.038* 0.952±0.048* 0.797±0.048
*与H2O2组比，p＜0.05
表3 5-羟甲基糠醛对高糖所致血管内皮细胞损伤的保护作用
组别 浓度 吸光度值 正常细胞组 葡萄糖模型组 糠醛(1) 糠醛(2) 糠醛(3) 糠醛(4) 30mmol/L 0.1μg/ml 1μg/ml 10μg/ml 100μg/ml 0.776±0.048* 0.721±0.051 0.839±0.078* 0.836±0.068* 0.714±0.101 0.607±0.018**
注：*与模型组相比p＜0.05。
表3MTT检测结果表明：四种剂量的5-羟甲基糠醛，其中两种较小的剂量0.1μg/ml、1μg/ml能拮抗葡萄糖对血管内皮细胞的增殖抑制，而10μg/ml却不具这种拮抗作用，100μg/ml增强了葡萄糖对血管内皮细胞的增殖抑制。
2.25-羟基糠醛对血管内皮细胞保护作用可能的机理研究
SOD检测
以SOD为检测指标进行5-羟基糠醛对血管内皮细胞保护作用可能的机理研究，实验结果见下表：
表4 5-羟基糠醛对血管内皮细胞作用机制研究结果
组别 T-SOD活力(U·mL-1) 过氧化氢模型组 正常细胞组 阳性药 糠醛组(1μg/ml) 糠醛组(0.1μg/ml) 8.97±1.03 19.08±3.38** 13.06±1.96** 12.50±1.77** 12.00±3.35*
注：**代表与过氧化氢组相比p＜0.01，*代表与过氧化氢组相比p＜0.05
实验结果显示：5-羟基糠醛对H2O2所致血管内皮细胞SOD活力减低有逆转作用，抗氧化作用可能是保护血管内皮细胞的机制之一。
流式细胞仪检测
以流式细胞仪为检测手段对血管内皮细胞进行实验，结果见表5。
表5 5-羟甲基糠醛对H2O2所致血管内皮细胞损伤的保护作用
组别 测定细胞数 Apoptosis(％ ) 模型组 细胞对照组 5-羟甲基糠醛组(1μg/ml) 5-羟甲基糠醛组(0.1 μg/m1) 10000 10000 10000 10000 8.17 0.32 0.95 0.72
注：与模型组相比，p＜0.05
由以上结果可见模型组细胞凋亡率为8.17％，细胞对照组细胞凋亡率为0.32％，5-羟甲基糠醛组细胞凋亡率分别为0.95％、0.72％，5-羟基糠醛组细胞凋亡率显著低于模型组，显示5-羟基糠醛对H2O2所引起的血管内皮细胞损伤的保护作用的机理之一(对H2O2引起的血管内皮细胞凋亡有拮抗作用)。
3讨论
综合形态学观察、MTT检测、流式细胞仪分析、SOD检测结果，5-羟甲基糠醛对血管内皮细胞有一定的保护作用，能拮抗H2O2造成的细胞损伤，对H2O2造成的SOD减低及诱导的细胞凋亡有缓解作用。5-羟甲基糠醛可能通过改善抗氧化系统，抑制细胞凋亡等作用，保护血管内皮细胞，以改善肝肾组织血管微循环功能发挥补肝益肾的功效。同时对心脑血管病可能有一定的预防作用。