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1、(10)申请公布号 CN 102793743 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102793743 A *CN102793743A* (21)申请号 201210312552.7 (22)申请日 2012.08.29 A61K 36/532(2006.01) A61P 1/12(2006.01) A61K 35/74(2006.01) (71)申请人 蔡光先 地址 410208 湖南省长沙市含浦科教园区 (72)发明人 蔡光先 谭周进 曾奥 张华玲 肖嫩群 郭抗萧 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所 43114 代理人 魏娟 (54) 发明名称 一种用于菌群失调所致腹。
2、泻的组合药剂 (57) 摘要 一种用于菌群失调所致腹泻的组合药剂， 所 述药剂的有效成分是由 0.4-0.7 倍剂量的七味白 术散与活菌数为 1.2 2.0 亿个地衣芽孢杆菌的 组合 ； 每剂量的七味白术散是由 ： 人参 6g、 木香 6g、 白茯苓10g、 炒白术10g、 藿香叶10g、 葛根10g、 甘草3g组成。 本发明通过七味白术散与地衣芽孢 杆菌的协同起作用， 药用植物中的有效成分与微 生物的结合研究对推动药用植物的研究开发及中 药资源的可持续利用具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权。
3、利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种用于菌群失调所致腹泻的组合药剂， 其特征在于， 所述药剂的有效成分是由 0.4-0.7 倍剂量的七味白术散与活菌数为 1.2 2.0 亿个地衣芽孢杆菌的组合 ； 每剂量的 七味白术散是由 ： 人参 6g、 木香 6g、 白茯苓 10g、 炒白术 10g、 藿香叶 10g、 葛根 10g、 甘草 3g 组成。 2. 根据权利要求 1 所述的药剂， 其特征在于， 所述的七味白术散由经过水煎煮得到。 3. 根据权利要求 1 所述的药剂， 其特征在于， 所述的水煎煮是 ： 加冷水漫过药面， 浸泡 半小时后， 煎煮 2 次， 先用大火煮沸， 再。
4、改用小火煎煮， 每次煎煮时间为 15 20 分钟。 4. 根据权利要求 1 所述的药剂， 其特征在于， 所述的地衣芽孢杆菌配制在无菌水中。 5.根据权利要求1-4任一项所述的药剂， 其特征在于， 所述药剂的有效成分是由0.5倍 剂量的七味白术散与活菌数为 1.4 1.6 亿个地衣芽孢杆菌的组合。 6.根据权利要求5所述的药剂， 其特征在于， 所述药剂的有效成分是由0.5倍剂量的七 味白术散与活菌数为 1.5 亿个地衣芽孢杆菌的组合。 权 利 要 求 书 CN 102793743 A 2 1/5 页 3 一种用于菌群失调所致腹泻的组合药剂 技术领域 0001 本发明属于中医药微生态制剂领域， 确。
5、切地说是将中药复方与微生态调节菌种配 伍来防治菌群失调所致腹泻的药剂。 背景技术 0002 腹泻既是一种独立的疾病， 又是多种疾病病理进程中的一个症状， 具有很高的发 病率， 特别是在发展中国家。统计表明， 我国每年有 8.36 亿人次患腹泻， 因此卫生部把腹泻 列为我国重点防治的疾病之一。近年来， 抗生素的广泛使用所致菌群失调甚至产生耐药性 现象也日益严重。七味白术散原方载于 小儿药证直诀下卷 ：“人参二钱五分， 白茯苓五 钱， 白术(炒)五钱， 藿香叶五钱， 木香二钱， 甘草一钱， 葛根五钱(渴者加至一两)” ， 功效主 要是健脾生津， 行气消胀， 能达到扶正祛邪的目的。七味白术散治疗根本。
6、在于补气健脾， 临 床实践研究表明， 七味白术散对抗生素使用所致肠道腹泻、 小儿迁延性腹泻等多种肠道疾 病有很好的治疗效果。现代药理药效研究表明， 七味白术散可使失衡肠道微生物恢复到生 理性组合， 并使肠道微生物达到一个新水平上的平衡。但目前， 中药材的成本日益上涨， 如 何有效的节约中药材， 节约资源， 研发替代产品， 是本领域的技术人员需要突破和创新的地 方。 发明内容 ： 0003 本发明的目的旨在提供一种组合药剂， 对菌群失调所致腹泻具有良好的协同治疗 效果， 可加快治愈速度， 并可有效地节约中药材， 节约资源， 并进一步减少抗生素的使用。 0004 为达到以上目的， 发明人也进行了多。
7、年的研究发现， 可以尝试考虑选用微生物菌 种来实现。但毕竞， 前者是中医药配方， 后者属具微生态调节作用的微生物菌种 ； 应选用何 种微生物菌种， 它们之间作用后是否有效果， 是相互协同， 或相互间产生冲突， 这都是发明 人所无法确定的。 0005 在经过反复试验， 多次的尝试后， 发明人确定了以下技术方案 ： 0006 一种用于菌群失调所致腹泻的组合药剂， 所述药剂的有效成分是由 0.4-0.7 倍剂 量的七味白术散与活菌数为1.22亿个地衣芽孢杆菌的组合 ； 每剂量的七味白术散是由 ： 人参 6g、 木香 6g、 白茯苓 10g、 炒白术 10g、 藿香叶 10g、 葛根 10g、 甘草 。
8、3g 组成。 0007 所述的七味白术散由经过水煎煮得到。 0008 七味白术散的熬制 ： 加冷水漫过药面， 浸泡半小时后， 煎煮 2 次， 先用大火煮沸， 再 改用小火煎煮， 每次煎煮时间 15 20 分钟。 0009 所述的地衣芽孢杆菌配制在无菌水中。 0010 所述药剂的有效成分是由 0.5 倍剂量的七味白术散与活菌数为 1.4 1.6 亿地衣 芽孢杆菌的组合。最优选的所述药剂的有效成分是由 0.5 倍剂量的七味白术散与活菌数为 1.5 亿个地衣芽孢杆菌的组合。 0011 本发明所采用七味白术散中人参、 甘草味之甘者也 ； 白术、 茯苓甘而微燥者也 ； 木 说 明 书 CN 102793。
9、743 A 3 2/5 页 4 香、 藿香辛香而燥， 可以开胃醒脾 ； 葛根鼓舞胃气， 升阳生津。七味白术散中含有丰富的多 糖、 黄酮、 异黄酮、 甾醇、 氨基酸以及酪氨酸酶等多种活性成分， 上述物质在增殖肠内有益 菌， 抑制有害菌生长， 调节消化道微生物区系的平衡上发挥着重要的作用。 0012 本发明所采用的地衣芽孢杆菌在肠道内生长代谢过程中能产生多种抗菌活性物 质， 对葡萄球菌、 白色念珠菌有很强的拮抗作用， 对双歧杆菌、 乳酸杆菌、 拟杆菌、 消化链球 菌有促进作用。 同时该菌在肠道内通过夺氧效应， 消耗肠道内游离氧， 造成生态环境低氧状 态， 为肠道内的生理性厌氧菌如双歧杆菌、 乳酸杆。
10、菌的生长创造了条件， 厌氧菌群调整了肠 道的内环境， 使肠道的正常功能得以恢复。 0013 发明人通过实验发现七味白术散与地衣芽孢杆菌共同作用时， 仍能起到增加肠道 中有益菌群的数量， 同时减少有害菌群量， 而实验结果表明两者具有良好的协同作用， 应是 因为两者的作用机理方面并不冲突。 本发明的这一研究也对传统中医药与现代微生态学的 有机结合提供了重要依据， 为中医药的作用机理提供了现代生物学实验证据， 对中医药的 现代化与国际化将起到促进作用。 0014 本发明的地衣芽孢杆菌和七味白术散配伍能够改善小鼠肠道菌群， 提高七味白术 散对菌群失调小鼠腹泻的治疗效果。 本方法是将中药复方与肠道益生菌。
11、配合使用来治疗疾 病， 能够减少中药材的使用， 节约中药材。 具体实施方式 0015 以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。 0016 本发明通过设正常组、 模型组、 七味白术散组、 半量七味白术散 + 半量地衣芽孢杆 菌组、 地衣芽孢杆菌组， 通过动物实验疗效研究七味白术散与地衣芽孢杆菌的配伍方法与 技术， 对七味白术散与地衣芽孢杆菌配伍对肠道失调小鼠的治疗效果进行了研究， 并且运 用现代微生态学技术对七味白术散和地衣芽孢杆菌配伍对肠道菌群的影响进行了研究。 明 确了七味白术散对小鼠菌群失调腹泻的疗效， 将传统中药和现代微生物制剂配伍， 建立了 七味白术散与地衣芽孢杆菌联用治愈。
12、菌群失调腹泻的方法。 0017 地 衣 芽 孢 杆 菌 的 制 备 ： 菌 种 为 冻 干 保 存 的 地 衣 芽 孢 杆 菌 （Bacillus licheniformis) ； 接种在牛肉膏蛋白胨培养基 （蛋白胨 5g， 牛肉膏 1.5g， 氯化钠 2.5g， 蒸馏 水 500mL， pH7.2-7.4） 中 36培养 36 小时， 离心取菌体用无菌水制成 10 亿个 /mL 的地衣 芽孢杆菌。 0018 将头孢拉定胶囊 （石药集团欧意药业有限公司生产 ； 批号 ： 101005） 硫酸庆大霉 素注射液 （山东鲁抗辰欣药业有限公司 ； 批号 ： 100928353） ， 用无菌生理盐水配成。
13、浓度为 62.5g/L 的抗生素混合液， 4冰箱中保存备用。正常组给予无菌水 0.35mL/（只 * 次） 灌 胃， 其余各组采用抗生素混合液 0.35mL/（只 * 次） 灌胃。每天 2 次， 连续 6d。制备菌群失 调腹泻小鼠。 0019 1 倍剂量的七味白术散的用量 ： 人参 （吉林） 6g、 木香 （云南） 6g、 白茯苓 （云南） 10g、 炒白术 （安徽） 10g、 藿香叶 （广东） 10g、 葛根 （广西） 10g、 甘草 （内蒙古） 3g。 0020 本方法是将0.4-0.7倍剂量七味白术散煎出液配合活菌数为1.2-2.0亿个地衣芽 孢杆菌组合， 可以治愈菌群失调腹泻， 减少抗。
14、生素的使用。 0021 实施例 ： 说 明 书 CN 102793743 A 4 3/5 页 5 0022 实验材料 ： 0023 实验动物及饲料昆明种 SPF 级小白鼠， 18 21g， 雌雄各半， 饲料均由湖南中医药 大学实验动物中心提供。 0024 造模药品及剂量选择 0025 头孢拉定胶囊 （石药集团欧意药业有限公司生产 ； 批号 ： 101005） 硫酸庆大霉素注 射液 （山东鲁抗辰欣药业有限公司 ； 批号 ： 100928353） ， 用无菌生理盐水配成浓度为 62.5g/ L 的抗生素混合液， 4冰箱中保存备用。正常组给予无菌水 0.35mL/（只 * 次） 灌胃， 其余 各组采。
15、用抗生素混合液 0.35mL/（只 * 次） 灌胃。每天 2 次， 连续 6d。 0026 七味白术散 0027 人参 （吉林） 6g、 木香 （云南） 6g、 白茯苓 （云南） 10g、 炒白术 （安徽） 10g、 藿香叶 （广 东） 10g、 葛根 （广西） 10g、 甘草 （内蒙古） 3g。由湖南中医药大学附属第一医院提供。 0028 培养基 0029 细菌总数 ： 牛肉膏蛋白胨培养基。蛋白胨 5g， 牛肉膏 1.5g， 琼脂 10g， 氯化钠 2.5g， 蒸馏水 500mL， pH7.2-7.4。 0030 大肠杆菌 ： 伊红美蓝琼脂 （EMB） 。蛋白胨 10g， 氯化钠 5g, 曙。
16、红钠 0.4g， 乳糖 10g， 牛肉浸粉 5g， 亚甲蓝 0.065g， 琼脂 14.5g， 蒸馏水 1000mL， pH7.2-7.4。 0031 乳杆菌 ： MRS 琼脂培养基。蛋白胨 10g， 牛肉浸膏 10g， 酵母提取物 5g， 葡萄糖 20g， 磷酸氢二钾 2g， 吐温 801ml， 柠檬酸二铵 2g， 乙酸钠 5g， MnSO47H2O 0.58g， MnSO44H2O 0.25g, 琼脂 15g， 蒸馏水 1000ml,pH6.26.4。 0032 双歧杆菌 ： BBL琼脂培养基。 肝提取液80ml， 蛋白胨15g， 酵母粉2g， 葡萄糖20g， 可 溶性淀粉 0.5g， 氯。
17、化钠 5g， 琼脂 20g， 5半胱氨酸 10ml， 西红柿浸出液 400ml， 吐温 801ml， 蒸馏水 520mL,pH7.00.1。 0033 实验仪器 0034 离心机、 刻度试管、 恒温水浴锅、 微量移液器、 50ml 容量瓶、 250ml 三角烧瓶、 酒精 灯、 超净工作台、 高压灭菌锅、 培养箱， 培养皿、 解剖剪， 等。 0035 实验方法 0036 七味白术散的熬制 ： 加冷水漫过药面， 浸泡半小时后， 煎煮 2 次， 先用大火煮沸， 再 改用小火煎煮， 每次煎煮时间一般 15 20 分钟。 0037 试验分组 ： 将实验小鼠随机分为 5 组 , 即正常组、 模型组、 1 。
18、倍剂量的七味白术散 组、 活菌数为 3.0 亿个的地衣芽孢杆菌组及半倍剂量的七味白术散加活菌数为 1.5 亿个的 （即半量） 地衣芽孢杆菌混合组， 10 只 / 组， 雌雄各半。正常组给予无菌水和普通饲料， 其余 四组用阿莫西林灌胃成模后， 模型组给无菌水和普通饲料， 其余 3 组分别按各自组名进行 药物灌胃， 给予普通饲料， 均自由取食。灌胃 1 周。 0038 肠道取样 ： 将灌胃 1 周后的小鼠断颈处死， 将处死的小鼠立即放于超净工作台上， 无菌采集各组盲肠段内容物， 收集同组小鼠肠道内容物通过无菌操作进行混匀。备用。 0039 细菌培养及计数 ： 按组分别无菌操作称取一定量的肠道内容物。
19、放入装有玻璃珠和 无菌水的三角瓶中， 摇床120rpm振摇30min使微生物充分分散， 选择合适的稀释度， 采用混 菌法进行 4 类可培养的需氧和厌氧微生物的菌落计数， 细菌及大肠杆菌在 37培养箱中培 养 24h 后计数菌落， 乳酸菌、 双歧杆菌在 37厌氧培养箱中培养 48h 后计数菌落， 每一个稀 说 明 书 CN 102793743 A 5 4/5 页 6 释度做 3 次重复， 求其平均值并计算每克肠道内容物所含的菌数。 0040 结果 0041 从小鼠表观特征来看， 正常组小鼠新鲜粪便干燥呈黄色， 造模后， 小鼠新鲜粪便颜 色由黄转黑， 出现中度腹泻。治疗第 5 日， 半量七味白术散。
20、 + 半量地衣芽孢杆菌组小鼠腹 泻完全转好， 七味白术散组和地衣芽孢杆菌组小鼠腹泻基本治愈， 治疗第 6 日， 七味白术散 组和地衣芽孢杆菌组小鼠腹泻完全转好， 粪便转黄。可见地衣芽孢杆菌和七味白术散在菌 减半的情况下联用可加快菌群失调腹泻的治愈。 造模期间， 模型小鼠部分出现精神萎靡， 嗜 睡， 畏冷等现象， 治疗后， 各组小鼠萎靡， 嗜睡， 畏冷等现象好转。对各组小鼠的体重监控表 明， 半量七味白术散 + 半量地衣芽孢杆菌组小鼠体重增长明显快于其他各组。 0042 从表 1 可以看出， 使用半量七味白术散加半量地衣芽孢杆菌治疗后， 粪便的稀湿 度恢复正常， 与七味白术散及地衣芽孢杆菌一样，。
21、 均达到治愈效果。 0043 表 1 超微七味白术散对菌群失调腹泻小鼠疗效的影响 0044 0045 注 ： 表示粪便干燥， 表示粪便稀湿。 0046 通过肠道微生物的计数对七味白术散与地衣芽孢杆菌治疗菌群失调腹泻的疗效 进行了评价分析， 4类微生物指标的计数结果见表2。 由表2可知， 模型组各种菌群的数目均 比正常对照组低， 说明抗生素通过杀灭肠道内部分微生物改变了肠道菌相， 从而引起腹泻。 比较发现， 治疗各组的大肠杆菌数、 细菌总数、 乳杆菌数及双歧杆菌数都恢复到接近正常组 水平， 其中肠道益生菌乳杆菌和双歧杆菌的恢复效果很好， 说明本发明的药物可以促进肠 道内有益菌群的增长、 减少有害。
22、菌群的繁殖， 调整肠道微生态环境， 从而治愈腹泻， 明确了 七味白术散与地衣芽孢杆菌对小鼠菌群失调性腹泻的疗效。由表 2 结合表观结果来看， 半 量七味白术散加半量地衣芽孢杆菌治疗后， 治愈效果要快于七味白术散组和地衣芽孢杆菌 组， 虽然肠道细菌总数和大肠杆菌数稍高于七味白术散组和地衣芽孢杆菌组， 而乳杆菌数 和双歧杆菌数稍低于七味白术散组和地衣芽孢杆菌组， 但并没有显著性差异。说明肠道益 生菌的调整可能主要与七味白术散中的某些益生元有关， 这些益生元通过促进肠道有益菌 的生长， 从而调整肠道微生态。 但是肠道有益菌地衣芽孢杆菌的使用， 可以直接补充肠道益 生菌的数量， 从而直接调整肠道微生态。 因此， 本发明通过七味白术散与地衣芽孢杆菌的联 用， 一方面七味白术散促进肠道内的益生菌繁殖， 另一方面地衣芽孢杆菌直接补充肠道有 说 明 书 CN 102793743 A 6 5/5 页 7 益菌， 从而使治愈速度加快。这说明七味白术散与具肠道微生态调节作用的地衣芽孢杆菌 联用， 在小鼠菌群失调腹泻的治愈上具有良好的协同作用。 0047 表 2 七味白术散与地衣芽孢杆菌配伍对菌群失调小鼠肠道菌群的影响 0048 0049 *CFU/g ： 每 g 肠道内容物的菌落形成单位 （Colony-forming unit） 数。 说 明 书 CN 102793743 A 7 。