半连续和连续酶促水解方法 本发明涉及受保护的醇基团，例如酯或氨基酸酯或磷酸酯基团的区域选择性酶促水解的改进方法。
WO05/121162描述了通过在受保护的醇基团的核糖部分的5’-基团进行选择性水解而制备的某些D-呋喃核糖基化合物。然而，WO05/121162描述的酶促水解方法本身对非均相反应方法固有例如反应时间长、水解的选择性有限、每批需要大容器、数个过滤步骤和不易于回收酶等缺点。
本发明提供区域选择性酶促水解的改进方法，该方法克服了以前采用的区域选择性酶促水解方法的许多缺点。根据本发明，出乎意料地发现通过对具有一个以上可水解基团的底物进行区域选择性酶促水解的半连续或连续式方法，可实现较高的水解选择性和较少的杂质以及不良水解产物。此外，相对于以前采用的长时间、高成本、低处理量的间歇式方法，这种半连续或连续方法是长期而经济的解决之道。与例如WO05/121162描述的方法相比，本发明方法可显著缩短周期时间并尽可能降低对总容量性能低的影响。这与处理量增加的大规模方法尤其相关。
因此，就其最宽的方面而言，本发明提供一种区域选择性酶促水解包含一个以上可水解基团的底物的方法，其中所述酶促水解以半连续或连续方式进行。
在本发明的半连续或连续式方法中，通常使加成物的缓冲溶液流过固定化酶。本发明的术语“半连续”或“连续”指或多或少连续地(有间断或没有间断)流过柱的过程。合适的停留时间后，加成物完全水解，该过程可原位监测，例如通过对柱后收集并随后提取的包含产物的溶液的pH监测。半连续或连续式方法的关键参数需要依据例如底物、酶等独立进行调整，具体情况可凭经验确定。这些参数包括，例如停留时间、柱的填料、最佳pH、温度、加成物的浓度、有机溶剂的选择。例如，可调整停留时间以使加成物达到最佳水解，即选择性高并且转化快，所述停留时间通常可以是0.1分钟到300分钟。例如，停留时间取决于酶活性、温度、pH、溶剂体系，可调整停留时间从而能允许半连续或连续处理和最佳水解，如上所述。通常根据酶水解反应所需的条件选择pH和温度。例如，pH可以介于，例如5-8，或者例如5.5-7.5之间。温度可以在，例如15℃-70℃。
可利用适合于酶促反应的任何缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、铵缓冲液、碳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液。
此外，为完全溶解加成物和产物，可利用合适的有机组分。典型的有机组分包括，例如丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮、甲醇、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、叔丁基甲基醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、离子性液体、压缩气体，如二氧化碳、水等等，或它们的混合物。也设想了其它醇类、醚类、酮类。
此外，可利用添加剂，例如来提高反应速率。典型的添加剂包括，例如PEG(1％-10％)、NaCl、Na2SO4、FeCl3。可凭经验确定这些添加剂的合适浓度，通常可以是0.05M-1M。为方便起见，可将添加剂加入加成物的溶液中。
将酶固定在物理支承物，例如固体支承物上。适合于本发明的固定化酶所用的物理支承物包括，例如柱、连续搅拌罐、填充床反应器、膜式反应器、膜。根据本发明可使用适合于水解的任何酶，例如酯酶、水解酶、脂肪酶。
本发明方法的合适底物含有至少两个可水解的基团，即，例如两个乙酸酯基、苯甲酸酯基。这种基团的典型例子是保护的醇基团，例如酯基、氨基酸酯基、磷酸酯基。在一个实施方式中，底物是吡喃糖苷或呋喃糖苷。
按照本发明的一方面，底物是通常由如以下式(1)-(21)所示的化合物(不具有立体化学特性)：
式中R独立地为H、烷基、羟基、羟基烷基、-NR′R″、-SR″′、卤代；R′和R″独立地为烷基、-SR″′、-SOR″′、-SO2R″′；R″′独立地为H、烷基、芳基；R1独立地为H、-C(O)R3、外消旋的、L-或D-氨基酸基团-C(O)CH2NHR4、-C(O)CH(C1-6烷基)NHR4、磷酸酯基；R3是C1-18烷基；R4是H、-C(O)CH(C1-6烷基)NH2、或-C(O)CH(CH2-芳基)NH2；B是核碱基(nucleobase)；X、Y和Y′独立地为-CH2-、-CHR′-、-CR′R″-或O、NR″′、S，其中R′和R″独立地为烷基和R″′是H或烷基或CO(Z)，Z是O-烷基或NH-烷基或N-烷基2；和R2是H、-C(O)CH(C1-6烷基)NH2、或-C(O)CH(CH2-芳基)NH2。
本文所用的术语“烷基”包括具有直链、支链或环状部分(包括稠合和桥连双环和螺环部分)或上述部分组合的饱和单价烃基团。优选的烷基的例子包括C1-18或C1-12烷基。芳基可以未取代或在任何位置取代。芳基通常有0、1、2或3个取代基。在另一优选的实施方式中，烷基是低级烷基，例如C1-6，更优选C1-4。特别优选地是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或支化的戊基。烷基可以未取代或在任何位置取代。烷基通常有0、1、2或3个取代基。
本文所用的术语“烯基”包括具有至少一个碳-碳双键的烷基部分，其中烷基如上定义，包括所述烯基部分的E和Z异构体。本文所用的术语“炔基”包括具有至少一个碳-碳三键的烷基部分，其中烷基如上定义。
本文所用的术语“芳基”包括通过自芳烃除去一个氢而衍生的有机基团，通常是C6-10芳基。芳基可以未取代或在任何位置取代。所述芳基通常有0、1、2或3个取代基。典型的例子包括苯基或萘基。
本文所用的术语“磷酸酯基”包括一个或多个磷酸酯基团，例如-(HO(PO)OH)m-(HO(PO(OH))OH)，m是0、1或2，n是0、1、2、3、4、5。
本发明的烷基或芳基还可以进一步取代，例如用一个或多个卤素(F、Cl、Br、I)取代基或一个或多个以下取代基取代：氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、羟基、C1-C6烷氧基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-芳基、-N(烷基)(芳基)、-N(芳基)2、-NHCHO、-NHC(O)烷基、-NHC(O)芳基、-N(烷基)C(O)H、-N(烷基)C(O)烷基、-N(芳基)C(O)H、-N(芳基)C(O)烷基、-NHCO2烷基、-N(烷基)CO2烷基、-NHC(O)NH2、-N(烷基)C(O)NH2、-NHC(O)NH-烷基、-NHC(O)N(烷基)2、-N(烷基)C(O)NH-烷基、N(烷基)C(O)N(烷基)2、-NHSO2-烷基、-N(烷基)SO2-烷基、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-OC(O)烷基、-OC(O)芳基、-CO2-烷基、-CO2-芳基、-CO2H、-C(O)NH2、-C(O)NH-烷基、-C(O)N(烷基)2、-C(O)NH-芳基、-C(O)N(芳基)2、-C(O)N(烷基)(芳基)、-S(O)烷基、-S(O)芳基、-SO2烷基、-SO2芳基、-SO2NH2、-SO2NH-烷基和-SO2N(烷基)2。
本文所用的术语“卤素”或“卤代”指F、Cl、Br或I。
本发明中的术语“核碱基”指适合掺入核酸的任何碱基，例如WO05/121162所示例的。
在一个实施方式中，在有一个或多个受保护的可水解仲醇基团，例如仲醇的酯存在下，选择性水解受保护的可水解伯醇基团，例如伯醇的酯。
在本发明的优选方面，所述呋喃糖苷是呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶。例如，合适的化合物在WO05/121162中描述，其涉及3-β-D-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶核苷。在一个实施方式中，所述化合物是WO05/121162中的化合物89。
因此，在一优选实施方式中，所述底物是式22所示的化合物：
式中：
R1a、R1b和R1c独立为H、-C(O)R3、外消旋的、L-或D-氨基酸基团-C(O)CH2NHR4、-C(O)CH(C1-6烷基)NHR4、或者R1b和R1c共同为-C(O)-，它们与氧原子一起形成5-元碳环；
R2是H、OR5、或N(R6)2；R3是C1-18烷基；R4是H、-C(O)CH(C1-6烷基)NH2、或-C(O)CH(CH2-芳基)NH2；R5是独立为H、C1-6烷基、C3-7烯基、C3-7炔基、-(CR7R8)t(C6-C10芳基)、-(CR7R8)t(C3-C10环烷基)、-(CR7R8)t(C4-C10杂环)、-(CR7R8)t＞1OH、-(CR7R8)t＞0CO2C1-18烷基、和-(CR7R8)t＞0N(R9)CO2C1-18烷基、和SO2(芳基)，其中t是0-6的整数，其中上述基团的烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基和杂环部分任选被独立选自下组的取代基取代：卤素、氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、羟基、C1-C6烷氧基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-芳基、-N(烷基)(芳基)、-N(芳基)2、-NHCHO、-NHC(O)烷基、-NHC(O)芳基、-N(烷基)C(O)H、-N(烷基)C(O)烷基、-N(芳基)C(O)H、-N(芳基)C(O)烷基、-NHCO2烷基、-N(烷基)CO2烷基、-NHC(O)NH2、-N(烷基)C(O)NH2、-NHC(O)NH-烷基、-NHC(O)N(烷基)2、-N(烷基)C(O)NH-烷基、N(烷基)C(O)N(烷基)2、-NHSO2-烷基、-N(烷基)SO2-烷基、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-OC(O)烷基、-OC(O)芳基、-CO2-烷基、-CO2-芳基、-CO2H、-C(O)NH2、-C(O)NH-烷基、-C(O)N(烷基)2、-C(O)NH-芳基、-C(O)N(芳基)2、-C(O)N(烷基)(芳基)、-S(O)烷基、-S(O)芳基、-SO2烷基、-SO2芳基、-SO2NH2、-SO2NH-烷基、和-SO2N(烷基)2；R6独立地为H、C1-6烷基、C3-C10环烷基，或与氮一起形成5-元或6-元杂环；R7和R8独立为H、C1-6烷基、C2-6烯基、或C2-6炔基；和R9是H、C1-6烷基、或-CH2-芳基；其中所述化合物包含至少两个可水解基团。
在一个实施方式中，本发明涉及式22所示的化合物，式中R2是H或者OR5，其中所述化合物包含至少两个可水解的基团。
在另一实施方式中，本发明涉及式22所示的化合物，式中R1a、R1b和R1c独立地为H、-C(O)R3、外消旋的、L-或D-氨基酸基团-C(O)CH(C1-6烷基)NH2；R2是OR5；R3是C1-18烷基；R5独立为C1-6烷基、C3-7烯基、C3-7炔基、-(CR7R8)t(C6-C10芳基)、-(CR7R8)t(C4-C10杂环)、和-(CR7R8)t＞0N(R9)CO2C1-18烷基，除非另有表明，其中t是0-4的整数，其中上述基团的烷基、烯基、芳基和杂环部分任选被1-3个选自下组的取代基取代：卤素、氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、羟基、C1-C6烷氧基、-CO2-烷基、-CO2-芳基、-OC(O)烷基、和-OC(O)芳基；R7和R8独立地为H、C1-6烷基、或C2-6烯基；和R9是H、-CH3、或-CH2CH3。
在另一实施方式中，本发明涉及式22所示的化合物，式中R1a、R1b和R1c独立为H、-C(O)R3；R2是H，且其中R3是低级烷基。在另一实施方式中，R1a、R1b和R1c为H、-C(O)R3；R2是H，且其中R3是低级烷基。
适合由本发明的连续方法区域选择性水解的其它底物的例子包括：
和其它非对映体和其它非对映体，和其它非对映体，
式中R如上定义；其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H、烷基、羟基、羟基烷基、-NR′R″、SR″′、卤素；其中R′、R″和R″′如上定义，其中B是核碱基。
实施例1
给直径1cm的滤器Nutsche装载约1克极地假丝酵母(CandidaAntarctica)脂肪酶Novozym 435。使加成物的溶液(约1克溶解于9mL叔丁醇和16mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液中)流过该滤器，流速约1.6毫升/分钟(约0.2巴压力)直至结束。用Na2HPO4溶液将过滤后混合物的pH持续维持在6.3-6.5。约2小时后反应完成。随后，容易地分离诸相，用约20mL 2-甲基四氢呋喃萃取水相1次。用水洗涤合并的有机相1次，减压浓缩得到粗产物，其产率＞90％，具有＜1％的过度水解(over-hydrolysis)的副产物。
本发明的半连续或连续方法相对于例如WO05/121162描述的分批方法具有多种优点，例如产率提高、反应更快、可能连续进行后处理、没有太多的过滤、易于回收酶、处理量增加、废物减少，而且，更重要的是，选择性提高并且尽可能减少了不良的单乙酸酯和三羟基(tris-hydroxy)化合物的水解。采用WO05/121162所述方法获得粗产物，产率约为90％，过度水解为3-5％，而采用连续或半连续方式可以获得高于90％的产率以及小于1％的过度水解副产物。