《一种组织工程化搏动组织的构建方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种组织工程化搏动组织的构建方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104232571A43申请公布日20141224CN104232571A21申请号201410043551622申请日20140129C12N5/0775201001A61F2/02200601A61L27/38200601A61K49/0020060171申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433上海市杨浦区翔殷路800号72发明人杨向群陈磊姬瑞娟李玉泉刘芳邓子军张喜张传森74专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所普通合伙31268代理人赵青54发明名称一种组织工程化搏动组织的构建方法57摘要本发明涉及生物医学工程技术和再生医学领域，具体涉及一种组织工程化搏动组织。
2、的构建方法。本发明将棕色脂肪来源的干细胞诱导为窦房结样细胞，种植于胶原海绵上，在体外构建组织工程化的窦房结样搏动组织。本发明获得了一种具有起搏特性的组织工程化组织，为筛选心律失常药物等研究提供了一种组织模型，为治疗病态窦房结综合征、房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页10申请公布号CN104232571ACN104232571A1/1页21一种组织工程化搏动组织的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤A、起搏细胞的获取将动物棕色脂肪组织，利用二次消化法、II型胶原。
3、酶，分离出棕色脂肪来源的干细胞；起搏细胞的诱导吸弃上清，加入15的FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35MM培养皿中或6孔板中，每皿/孔大约接种70106个细胞，加适量15的FBS/DMEM培养基，放于37细胞培养箱培养，每3天换一次液；在培养过程中，加入80NG/ML的DIKKOPF1，培养至1014天，每23天换一次液。鉴定起搏细胞；B、起搏细胞胶原海绵复合体的构建胶原海绵的准备将胶原海绵剪成080602CM大小，消毒备用；起搏细胞的准备将原代培养13天的脂肪来源的干细胞制成细胞悬液，调至细胞密度为10107个/ML；起搏细胞胶原海绵复合体的构建将起搏细胞均匀接种于胶原海绵上，总量。
4、大约100L，静置1小时后，用15的FBS/DMEM培养基培养7天。2根据权利要求1所述的一种组织工程化搏动组织的构建方法，其特征在于，所述的动物棕色脂肪组织，为小鼠、大鼠的肩胛间棕色脂肪组织。3根据权利要求1所述的一种组织工程化搏动组织的构建方法，其特征在于，所述的二次消化法的具体步骤如下棕色脂肪约011克，置于4PBS中清洗，移入离心管中，加入022ML01的II型胶原酶高糖DMEM中，剪碎；将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入520ML的01的型胶原酶高糖DMEM，37消化45MIN，期间反复震荡混匀；3000RPM离心13分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第一次滤液；再向上述离心管。
5、中加入110ML的01的型胶原酶高糖DMEM，37消化20MIN，期间反复震荡混匀；3000RPM离心1分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并入另一离心管中，加入15ML10的FBS/DMEM，1500RPM离心3分钟，吸去上层漂浮的白色脂肪；所述的型胶原酶高糖DMEM中还含有1BSA。4一种如权利要求1、2或3所述的组织工程化搏动组织的构建方法得到的组织工程化搏动组织。5一种如权利要求4所述的组织工程化搏动组织在制备治疗严重缓慢型心律失常移植物中的应用。6一种如权利要求4所述的组织工程化搏动组织在筛选抗心律失常药物中的应用。权利要求书CN10423257。
6、1A1/6页3一种组织工程化搏动组织的构建方法技术领域0001本发明涉及生物医学工程技术和再生医学领域，具体涉及一种组织工程化搏动组织的制备方法。背景技术0002目前，构建心脏生物起搏点的方法主要有利用基因转染的方法调制心肌细胞离子电流；向心脏种植起搏细胞或工程化的起搏细胞。0003在这些方法中，基因转染的方法有可能引起心律失常。而且，外源性基因在体内难以有效地调控，体内存留病毒载体。细胞移植可以克服基因转染的缺陷，但移植的细胞极易在心脏内迁移、弥散，不能形成稳定统一的心脏节律点，而且目前用于移植的细胞不适合用于临床生物心脏起搏器的构建成体窦房结细胞、幼稚心肌细胞不仅来源困难，而且对移植部位微。
7、环境适应能力差；胚胎干/祖细胞不仅来源困难，还存在伦理学问题，而且其在体内的分化方向亦难以精确控制。针对上述基因转染和细胞移植治疗病态窦房结综合征和房室传导阻滞存在的问题和面临的困难，并综合考虑生物起搏治疗研究的现状，寻找容易获取的起搏细胞，在体外与天然的支架材料复合，构建组织工程化的自发性搏动组织，将之移植到心脏中修复或再建心脏起搏点，应为严重缓慢型心律失常治疗课题的理想解决方案。不仅如此，组织工程化的搏动组织还可以为临床心血管药物的筛选提供组织学水平的平台。0004YAMADA等认为小鼠棕色脂肪组织中存在心脏祖细胞，分离的棕色脂肪来源的干细胞（BROWNADIPOSEDERIVEDSTEM。
8、CELLS,BASCS）部分可以定向分化为自发跳动的心肌样细胞（YAMADAY,ETALCARDIACPROGENITORCELLSINBROWNADIPOSETISSUEREPAIREDDAMAGEDMYOCARDIUMBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN2006342662670）。LIU改进了YAMADA的BASCS分离方法，得到更高比例的中心肌样细胞LIUZ,ETALEFFICIENTISOLATIONOFCARDIACSTEMCELLSFROMBROWNADIPOSEJBIOMEDBIOTECH2010DOI101155/2010/104296，本发明人所在的实验室在前期的。
9、工作中，进一步改进了组织消化、细胞分离的方法，并证明了跳动的心肌样细胞具有起搏细胞特征。0005目前国内、外尚无构建组织工程化搏动组织的研究报道，仅CHOI等（CHOIYH,ETAL2006,CARDIACCONDUCTIONTHROUGHENGINEEREDTISSUEAMJPATHOL200616917285）利用骨骼肌细胞和基质胶（MATRIGEL）在体外构建了一个组织体，并将之移植到大鼠心脏冠状沟心外膜下，对再建房室传导通路做了初步的尝试。结果表明该构建物可以和周围宿主心肌建立电机械耦联，并且允许房室之间有电冲动传导。但该组织体不是组织工程化搏动组织，因为它不能自发地搏动，只是将心房的。
10、冲动传导至心室。0006构建的组织工程化搏动组织的意义还在于，它可以作为筛选抗心律失常药物的一种组织模型。发明内容说明书CN104232571A2/6页40007本发明的目的在于提供一种组织工程化搏动组织的构建方法。0008本发明人所在的实验室在前期工作中改进了YAMADA的BASCS分离方法，得到更高比例的中心肌样细胞，我们进一步改进了分离培养方法，得到的跳动的心肌细胞可以高达40（阳性细胞和总细胞的比例）。经进一步鉴定，这种自发跳动的心肌样细胞具有起搏细胞的特性。0009本发明人设想，利用这种自发跳动的心肌样细胞起搏细胞作为种子细胞，以天然生物材料为支架材料，体外构建组织工程化的自发性搏动。
11、组织。将来可以将其移植至心脏重建窦房结或新的起搏点，达到治疗病态窦房结综合和严重房室传导阻滞等严重缓慢型心律失常的目的；同时也可以作为筛选心律失常药物的一种组织模型。0010本发明的主要技术方案是将棕色脂肪来源的干细胞诱导为窦房结样细胞，种植于胶原海绵上，在体外构建组织工程化的窦房结样搏动组织。0011本发明的技术关键在于0012（1）如何在体外获得足够数量的、活力好的能用于组织工程构建的起搏细胞。我们在前期的工作中，已将棕色脂肪来源的脂肪来源的干细胞诱导为起搏细胞，但诱导率尚不高，诱导获得的起搏细胞数量尚不能满足组织工程构建的需求。因此，在不影响细胞活力的前提下，提高起搏细胞的诱导率，即提高。
12、起搏细胞的数量是用起搏细胞和胶原海绵构建组织工程搏动组织的关键之一；0013（2）如何使起搏细胞在胶原海绵上增殖，并进一步分化为起搏细胞。种子细胞在支架材料上的增殖、分化受种植的密度、时机、方式的影响。因此，控制种子细胞种植的密度、时机、方式等，是利用起搏细胞和胶原海绵构建组织工程搏动组织的关键之二。0014本发明提供了一种组织工程化搏动组织的构建方法，该方法包括以下步骤0015A、起搏细胞的获取0016（A1）取动物棕色脂肪组织，利用二次消化法、II型胶原酶，分离出棕色脂肪来源的干细胞；0017所述的动物棕色脂肪组织，可以取自小鼠、大鼠等动物的肩胛间棕色脂肪组织等。0018所述的二次消化法，。
13、具体为取棕色脂肪约011克，置于4PBS中清洗，移入离心管中，加入022ML01的II型胶原酶高糖DMEM中（含1BSA），剪碎；将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入520ML的01的型胶原酶高糖DMEM（含1BSA），37消化45MIN，期间反复震荡混匀；3000RPM离心13分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第一次滤液；再向上述离心管中加入110ML的01的型胶原酶高糖DMEM（含1BSA），37消化20MIN，期间反复震荡混匀；3000RPM离心1分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并入另一离心管中，加入15ML10体积比的FBS/DMEM，15。
14、00RPM离心3分钟，吸去上层漂浮的白色脂肪；0019（A2）起搏细胞的诱导0020吸弃上清，加入15体积比的FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35MM培养皿中或6孔板中，每皿/孔大约接种70106个细胞，加适量15体积比的FBS/DMEM培养基，放于37细胞培养箱培养，每3天换一次液；0021在培养过程中，加入80NG/ML的DIKKOPF1一种WNT通路的抑制剂，每23天换一次液，培养1014天。说明书CN104232571A3/6页50022（A3）鉴定起搏细胞0023相差显微镜观察步骤A2获得的细胞形态、搏动情况。免疫化学染色检测心肌细胞和起搏细胞相关标志肌动蛋白（ACTINI。
15、N）、肌钙蛋白（TROPONINT/TROPONINI）、缝隙连接蛋白（CX40，CX302）、起搏细胞特征蛋白超极化激活环核苷酸门控通道（HYPERPOLARIZATIONACTIVATEDCYCLICNUCLEOTIDEGATEDCHANNEL,HCN；用激光共聚焦显微镜进行胞内钙离子变化的测定；用膜片钳、微电极阵列细胞外电生理记录仪记录细胞外和细胞内电位，自发性动作电位；检测分化后的细胞对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应；透射电镜观察细胞超微结构。0024B、起搏细胞胶原海绵复合体的构建0025（B1）胶原海绵的准备将胶原海绵剪成080602CM大小，消毒备用；0026（B。
16、2）起搏细胞的准备将原代培养13天的脂肪来源的干细胞（已分化为起搏细胞）制成细胞悬液，调至细胞密度为10107个/ML；0027（B3）起搏细胞胶原海绵复合体的构建将起搏细胞均匀接种于胶原海绵上，总量大约100L，静置1小时后，用15的FBS/DMEM培养基培养7天。0028本发明构建的起搏细胞胶原海绵复合体的体外鉴定00291、搏动频率观察构建的起搏细胞胶原海绵复合体会产生自发性的搏动。00302、起搏细胞胶原海绵复合体的电生理学特征使用光学电位检测仪（OPTICALMAPPING）或微电极阵列细胞外电生理记录仪，可以检测到复合体产生自发性的动作电位。00313、药学理检测同起搏细胞的检测，。
17、分别检测搏动组织对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应。异丙肾上腺素使起搏组织搏动频率增加，心得安则可以阻断异丙肾上腺素的作用；乙酰胆碱使起搏组织搏动频率减少，而阿托品可以阻断乙酰胆碱的作用。00324、组织学观察将上述起搏细胞胶原海绵复合体制备成石蜡切片，HE染色，观察细胞的密度、分布。细胞均匀分布于胶原海绵中，有些帖附在胶原纤维中，有些位于胶原海绵的孔隙中。00335、免疫组织化学检测起搏细胞的标志物将构建的组织工程化搏动组织进行冰冻切片，常规免疫组织化学检测组织内心肌细胞和起搏细胞相关标志起搏组织中细胞表达肌动蛋白（ACTININ）、肌钙蛋白（TROPONINT/TROPONI。
18、NI）、缝隙连接蛋白（CX40，CX302）和起搏细胞特征蛋白HCN。00346、电镜观察复合体内细胞的超微结构，以及细胞之间的连接。细胞内有不规则的肌丝，细胞与细胞之间形成了缝隙连接。0035本发明方法中用到的百分比，未加特殊说明的，均为质量/体积百分比0036本发明方法中用到的II型胶原酶高糖DMEM（含1BSA），具体配方为01II型胶原酶，高糖DMEM（45葡萄糖），1BSA。0037本发明方法中用到的FBS/DMEM，是指DMEM里含有FBS。0038本发明采用的二次消化可以比一次消化增加10的细胞量。0039本发明最初采用I型胶原酶，用于棕色脂肪细胞上消化效果差，而II型胶原酶对棕。
19、色脂肪细胞的消化效果好，有利于起搏细胞的分离。0040本发明采用的DIKKOPF1一种WNT通路的抑制剂，比不用DIKKOPF1又增加10说明书CN104232571A4/6页6的细胞量。0041本发明欲将起搏细胞种植于三维支架上构建起搏组织，在众多生物材料中作了筛选，发现本发明的棕色脂肪组织来源的干细胞在胶原海绵上面长得非常好，本发明进一步地在接种的方法、密度、在培养皿中静置的时间等影响细胞生长的因素上作子选择，从而成功构建起搏组织。0042本发明还提供了根据上述方法制备得到的组织工程化起搏组织。0043本发明获取了一种具有起搏特性的组织工程化组织，为筛选心律失常药物等研究提供了一种组织模型。
20、，为治疗病态窦房结综合征、房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。附图说明0044图1起搏细胞的肌丝样结构（透射电镜示超微结构）；0045图2起搏细胞接种于胶原海绵上（HE染色）。具体实施方式0046现结合实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。0047实施例中的胶原海绵由无锡贝迪生物有限公司提供。0048实施例1将小鼠棕色脂肪组织来源的脂肪来源的干细胞诱导为起搏细胞00491脂肪来源的干细胞的分离、培养0050（1）切开小鼠肩胛间皮肤，去除肩胛间棕色脂肪组织被覆的白色脂肪层，取棕色脂肪约04克，即刻置于4PBS中洗3次，移入5ML离心管中，加入08ML01II型胶原酶高糖DME。
21、M中（含1BSA），剪碎。0051（2）将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入10ML的01型胶原酶高糖DMEM（含1BSA），37消化45MIN，期间反复震荡混匀。3000RPM离心1MIN，吸上清用100目滤网过滤，进入（4）。0052（3）再向上述离心管中加入5ML的01型胶原酶高糖DMEM（含1BSA），37消化20MIN，期间反复震荡混匀。3000RPM离心1MIN，吸上清用100目滤网过滤，进入（4）。0053（4）将上述2次所得滤液吸入15ML离心管中，加入3ML10FBS/DMEM，1500RPM3MIN，吸去上层漂浮的白色脂肪，1500RPM3MIN。00542起搏细胞的高比。
22、例诱导0055（1）吸弃上清，加入15FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35MM培养皿中或6孔板中，每皿/孔大约接种70106个细胞，加适量15FBS/DMEM培养基，放于37细胞培养箱培养，每3天换一次液。0056（2）在培养的第一个3天内，加入80NG/MLDIKKOPFDKK1，一种WNT通路的抑制剂。换液后细胞继续培养10天，3天换一次液。00573起搏细胞的鉴定0058（1）相差显微镜观察上述细胞在15FBS/DMEM培养基中培养，BASCS会增殖、分化。3天时即可在相差显微镜下发现一些自发跳动的细胞，1周即可定向分化成肌管状细胞及部分小圆形细胞，该分化的肌管状细胞或圆形细胞。
23、能够自发跳动，跳动频率从80200次说明书CN104232571A5/6页7/分钟不等，平均跳动频率为130次/分钟，部分圆形细胞可见微弱搏动。0059（2）脂肪来源的干细胞分化的起搏细胞特征蛋白表达检测分化1周的细胞做免疫化学染色，可见细胞表达心肌细胞和起搏细胞相关标志肌动蛋白（ACTININ）（呈明显肌节结构）、肌钙蛋白（TROPONINT/TROPONINI）、缝隙连接蛋白（CX40，CX302）、起搏细胞特征蛋白超极化激活环核苷酸门控通道（HYPERPOLARIZATIONACTIVATEDCYCLICNUCLEOTIDEGATEDCHANNEL,HCN。具体方法与常规的免疫细胞化学方。
24、法相同。0060（3）细胞内自发钙瞬变测定采用FLUO4,AM对单细胞的胞浆游离钙离子变化进行检测。用10M的FLUO4,AM加05L的20F127在37孵育细胞15MIN，然后用标准细胞外液清洗23遍，静置1520MIN后在激光共聚焦显微镜进行胞内钙离子变化的测定。实验中可用额定电压额定频率的连续电场刺激，同时记录钙瞬变。起搏细胞可以产生自发性的钙瞬变。0061（4）细胞自发动作电位记录在电流钳模式下，用膜片钳记录细胞外和细胞内电位。标准的细胞外液含（MM）150NACL，5KCL，2CACL2，1MGCL2，10HEPES，10DGLUCOSE，PH740。电极内液含（MM）130KGLU。
25、CONATE,10KCL，2MGCL2，10HEPES，25MGATP，025NAGTP,04NAGTP,PH72。其中细胞内微电极记录中，微电极内灌3M的KCL。细胞外记录玻璃微电极的电阻在24M（两步拉制），细胞内记录微电极电阻在3050M（一步拉制）。所有的实验均在室温（2225）进行。起搏细胞可以产生自发性的动作电位。0062（5）药理学检测检测分化后的细胞对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应，连续刺激并记录同一细胞在不同药物及不同浓度下的反应。所有实验均在室温下进行（2225），每次换药如是同种药物从低浓度换到高浓度直接换，如果换不同药物先洗2遍并记录洗后跳动次数。起搏细。
26、胞对上述药物有相应的反应。0063（6）细胞透射电镜观察超微结构常规固定、包埋，根据先前观察的细胞位置取样，进行制片，电镜观察。电镜下，起搏细胞内有不规则的肌丝（图1）。0064实施例2诱导获得的起搏细胞种植到胶原海绵构建组织工程化搏动组织00651起搏细胞胶原海绵复合体的构建0066（1）胶原海绵的准备胶原海绵直接购自商业公司（无锡贝迪生物有限公司），将胶原海绵剪成080602CM大小，用钴60照射12小时以上消毒备用。0067（2）起搏细胞的准备025胰酶消化原代培养13天（15FBS/DMEM，最初3天加80NG/MLDIKKOPFDKK1）的脂肪来源的干细胞（90以上已分化为起搏细胞）。
27、，5MIN，1500RPM离心5MIN。弃上清，制成细胞悬液，调至细胞密度为10107个/ML。0068（3）起搏细胞胶原海绵复合体的构建体视显微镜下使用微量注射器将细胞悬液分4点均匀接种于胶原海绵上，总量大约100L，细胞密度约为10107个/CM3。37，5CO2培养箱中放置12小时，加适量15FBS/DMEM培养基培养7天，隔天换一次液。00692起搏细胞胶原海绵复合体的体外鉴定0070（1）搏动频率观察构建的起搏细胞胶原海绵复合体会产生自发性的跳动。0071（2）HE染色观察起搏细胞在起搏细胞胶原海绵复合体生长将上述生长7天的起搏细胞胶原海绵复合体制备成石蜡切片进行HE染色，步骤如下苏。
28、木素液染10MIN，自来水冲洗，75盐酸乙醇溶液分化30S，水洗1H，95乙醇12MIN，伊红复染12MIN，95乙醇12MIN，脱水透明，中性树胶封片。通过HE染色观察细胞胶原海绵复合体中种子说明书CN104232571A6/6页8细胞生长均匀、接触紧密，起搏细胞与胶原海绵复合良好（图2）。0072（3）免疫组织化学检测起搏细胞的标志物将构建的组织工程化搏动组织进行冰冻切片，常规免疫组织化学检测组织内心肌细胞和起搏细胞相关标志肌动蛋白（ACTININ）、肌钙蛋白（TROPONINT/TROPONINI）、缝隙连接蛋白（CX40，CX302）、起搏细胞特征蛋白HCN。搏动组织内上述标志为阳性。。
29、0073（4）起搏细胞胶原海绵复合体的电生理学特征使用光学电位检测仪（OPTICALMAPPING）或微电极阵列细胞外电生理记录仪可检测到起搏细胞胶原海绵复合体的起搏电位，证明所构建细胞胶原海绵复合体是一组织工程化搏动组织，具有类似窦房结的特性。0074（5）药学理检测同起搏细胞的检测，分别检测搏动组织对异丙肾上腺素、心得安、乙酰胆碱以及阿托品的反应。异丙肾上腺素使起搏细胞搏动频率增加，心得安则可以阻断异丙肾上腺素的作用；乙酰胆碱使起搏细胞搏动频率减少，而阿托品可以阻断乙酰胆碱的作用。0075（6）细胞透射电镜观察超微结构常规固定、包埋，进行制片，电镜观察。电镜下，起搏细胞内有不规则的肌丝，细胞与细胞之间建立了缝隙连接。0076以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。说明书CN104232571A1/1页9图1图2说明书附图CN104232571A。