用于制备3-杂芳基-3-羟基丙酸衍生物的方法 【技术领域】
本发明涉及一种制备对映体富集的3-杂芳基-3-羟基丙酸衍生物和3-杂芳基-1-氨基丙-3-醇类的方法，及其应用。
背景技术
3-杂芳基-3-羟基丙酸衍生物和3-杂芳基-1-氨基丙-3-醇类具有重要的工业意义，特别是，作为生产药物的中间体。因而，例如一些3-杂芳基-3-羟基丙酸衍生物和3-杂芳基-1-氨基丙-3-醇类作为制备血清素或去甲肾上腺素吸收的抑制剂的前体物质使用。在某些此类抑制剂的情况下，某些对映体不但表现为没有活性或极低的活性，甚至还表现出一些不需要的副反应(US-A 5 104 899)。
在Chirality 2000，12，26-29中描述了一种从1-(2-噻吩基)-3-氯丙-1-酮制备对映体富集的(1S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法。在还原外消旋3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇后，其外消旋物进行酶拆分和其(S)对映体与NaI和甲胺进一步反应得到(S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)丙-1-醇。这个方法的缺点是，大体上，当外消旋物被酶拆分时，得到的所需对映体只能获得50％，因此，这样的总体的产量从经济上来考虑是不可取的。
已经知道微生物，如酵母或真菌，可以被用于还原3-氧代羧酸衍生物，以对映体选择性地得到相应的对映体富集的3-羟基羧酸衍生物(也参见Sybesmaetal.，Biocatalysis and Biotransformation，1998，Vol.16，95-134；Dahl et al.，Tetrahedron：Asymmetry10，1999，551-559，Dehli et al.，Tetrahedron：Asymmetry11，2000，3693-3700，Hayakawa et al，Tetrahedron letters，1998，Vol.39，67-70，Cabonetal.，Tetrahedron：Asymmetry6，1995，2199-2210和Smallridge et al.，Tetrahedron Letters，1998，Vol.39，5121-5124)。
另外，EP-A477 938公开了通过用各种生物体来还原2-卤代-3-氧代-3-苯基丙酸酯来对映体选择合成2-卤代-3-羟基-3-苯基丙酸酯。
而且，Chenevertetal.，Tetrahedron 1992，Vol.48，6769-6776公开了不对称合成抗抑郁剂fluoxetine(N-甲基-3-(4-三氟代甲基苯氧基)-3-苯基丙胺氢盐酸盐)的两个对映体。在多阶段合成中一个重要的步骤是利用微生物进行3-氧代-3-苯基丙酸乙酯对映体选择性还原。
在Kumar A.et al.，Tetrahedron Letters，1991，vol.32，1901-1904中公开了一种制备(R)-tomoxetine的类似合成，其是一种抗抑郁剂。3-氧代-3-苯基丙酸乙酯的对映体选择性还原得到3-羟基-3-苯基丙酸乙酯是该合成中的一个重要的步骤。
然而，杂芳基酮地对映体选择性还原在以前并没有公开。
因此，需要提供一种可以制备富含对映体的3-杂芳基-3-羟基丙酸衍生物的方法。
【发明内容】
一种制备富含立体异构体的3-杂芳基-3-羟基丙酸衍生物的方法现已经被发现，这个方法的特征在于
·式(I)的化合物
杂芳基-CO-CH2W (I)，
其中
杂芳基是具有总共5-10个环原子的单环或双环的芳香基，其中在每环中可以存在无，一个或两个环原子，选自氧，硫和氮，在整个芳香基中可以有一个或两个，其中单环或双环的芳香基任选地被下列基团取代一次，两次或三次，这些基团每种情况是相互独立地选自羟基，C1-C8-烷基，氰基，COOH，COOM，其中M表示碱金属离子或半当量的碱土金属离子，COO-(C1-C4-烷基)，O-(C1-C4-烷基)，N(C1-C4-烷基)2，NH-(C1-C4-烷基)，氟，NO2，氯，溴，C1-C4-氟化烷基，CONH2或CONH-(C1-C4-烷基)，和
W 表示C(O)YR1n，其中Y为＝氧并且n为＝1或Y为氮，n为
＝2，或
W 表示CN，和
R1 在每种情况下是相互独立地为氢，C1-C8-烷基，C4-C10-芳基或C5-C11-芳烷基或，当Y是氮时，这两个R1基一起是C3-C5亚烷基，
·在微生物和/或其细胞制剂的存在下反应，和
·在PH值的范围是3到11的水的存在下，在25℃的基础上，和，在这种方式，得到对映体富集的式(II)化合物，
杂芳基-CH(OH)-CH2W (II)，
其中杂芳基和W具有上述的含义。
在本发明上下文中，上面给出的或下面引用的所有基团的定义，参数和说明(其中是普通的或在优选范围中提及的)，能够在各自的范围内和优选的范围内以任意的方式互相组合。
本发明的意义中，术语对映体富集的包括，特别是对映体纯的化合物或任意的对映体的混合物，其中一种对映体比其他对映体以更大的比例存在，优选的相对比例从60％到100mol％，特别优选的，从80到100mol％，更优选的是90到100mol％。
在本发明上下文中，烷基，在每一种情况下独立地是一个直链或环，因此是其独立的分支或不分支，能够进一步被C1-C4-烷氧基取代的烷基。同样适用于芳烷基的非芳香部分。
例如，在本发明上下文中，C1-C4-烷基是甲基、乙基、2-乙氧基乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基和叔丁基，此外，C1-C8-烷基是n-戊基、环己基、n-己基、n-庚基、n-辛基或异辛基。
氟烷基在每种情况下独立地是直链、环、分支或无分支的烷基，其被氟原子取代一次、多于一次或完全取代。
例如，C1-C4-氟烷基是三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，五氟乙基、九氟丁基和七氟异丙基。
在本发明上下文中，例如，芳基优选是不含有、含有一个或两个但在整个杂芳基中至少一个杂原子的碳环芳香基或杂芳香基，杂原子选自氮、硫和氧。
另外，碳环芳香基或杂芳香基能够被每环一个或两个取代基取代，所述取代基在各种情况下彼此独立的例如优选选自羟基，C1-C4-烷基，氰基、COOH、COOM，其中M是碱金属离子或半当量碱土金属离子，COO-(C1-C4-烷基)，O-(C1-C4-烷基)，N(C1-C4-烷基)2，NH-(C1-C4-烷基)，氟、氯、溴、C1-C4-氟烷基，CONH2或CONH-(C1-C4-烷基)。同样可应用于芳烷基的芳基部分。
在结构式(I)和(II)中，杂芳基优选单环芳香基，这种基团总共有5或6个环原子，其中一个或两个环原子选自氧、硫和氮并且单环芳香基不含或含有一个或两个基团，所述基团在各种情况下独立地选自甲基、乙基、n-丙基、异丙基、氰基、COOH、COONa、COOK、COO-甲基，COO-乙基、COO-叔丁基、COO-苯基、甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、甲氨基、乙氨基、氟、氯、NO2，三氟甲基，五氟乙基，七氟异丙基、CONH2和CONH-甲基。
杂芳基特别优选2-或3-噻吩基，2-或3-呋喃基，2-或3-吡咯基，3-或4-吡唑基，1-，2-或4-噻唑基，1-，2-或4-噁唑基，2-，4-或5-咪唑基，2-，3-或4-吡啶基，2-或3-吡嗪基，2-，4-，或5-嘧啶基，3-，4-5-或6-哒嗪基，2-，或3-吲哚基，3-吲唑基，吲唑基，2-或3-苯并呋喃基，2-，或3-苯并噻吩基，2-3-或4-喹啉基或异喹啉基，其中每个提及的基团携带的取代基数为无，一或二，并优选无，所述取代基在各种情况下彼此独立地选自甲基，乙基，n-丙基，异丙基，氰基，甲氧基，乙氧基，氟，氯，三氟甲基，五氟乙基和七氟异丙基。
杂芳基非常特别优选2-噻吩基。
R1优选为CN或COOR1，这里的R1是氢或甲基或乙基。
结构式(I)的化合物优选3-氧代-3-(2-噻吩基)-丙酸甲酯，3-氧代-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(3-噻吩基)-丙酸甲酯，3-氧代-3-(3-噻吩基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(2-呋喃基)-丙酸甲酯，3-氧代-3-(2-呋喃基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(3-呋喃基)-丙酸甲酯，3-氧代-3-(3-呋喃基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(2-吡啶基)-丙酸甲酯，3-氧代-3-(2-吡啶基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(3-吡啶基)-丙酸甲酯，3-氧代-3-(3-吡啶基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(4-吡啶基)丙酸甲酯-，3-氧代-3-(4-吡啶基)-丙酸乙酯，3-氧代-3-(2-噻吩基)-丙腈，3-氧代-3-(3-噻吩基)-丙腈，3-氧代-3-(2-呋喃基)-丙腈，3-氧代-3-(3-呋喃基)-丙腈，3-氧代-3-(2-吡啶基)-丙腈，3-氧代-3-(3-吡啶基)-丙腈，3-氧代-3-(4-吡啶基)-丙腈，和N-(甲基)-3-氧代-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
微生物优选使用细菌，酵母或真菌，包括野生型和转化的菌株。
微生物更优选酵母和真菌，更特别优选的菌株是Saccharomyces，Geotrichum，Candida，Pichia，Hansenula，Yarrowia，Rhizopus，Mortierella，Mucor，Sporotrichum，Rhodotorula，Trichoderma，Aspergillus，Penicillium，Pullaria，Cunninghamella and Curvularia。
微生物更优选Saccharomyces cereviseae和Geotrichumcandidum。
细胞制剂理解为：在潮湿或干燥的环境下使用纯化或未纯化的细胞溶解物，例如冻干物。
优选应用微生物。
在优选的实施方案中，结构式(I)的化合物被反应前，微生物复合物或矿质营养素培养基上生长，应用所给出的微生物本身的常用方法进行培养，如摇床振荡培养，发酵罐培养，联合发酵培养或连续发酵，直到光密度为1到800，优选5到300，在波长为600nm(OD600)计算适当时，在生长后进行浓缩。
例如，微生物可以在例如温度为10到60℃，优选20到40℃生长。
另外，例如，微生物可以生长的pH值可在pH3到pH9之间，优选在pH4到pH8之间，更优选在pH5到pH7.5之间。就此而言，本发明全部范围内的pH值各自是在25℃的基础上获得的。
微生物可以在有氧或无氧的条件下生长，优选需氧生长。
对于反应，结构式(I)的化合物在优选的实施方案中，加入到生长培养基中或是适当时预先沉淀后在等渗溶液中再悬浮的微生物中。
关于这一点，等渗溶液可以是天然盐溶液也可以是微生物的营养培养基。
其混合物可以优选，例如振动或搅拌并且适当时通气。
关于本发明的方法可以在pH值的范围为pH3到pH11，优选pH4到pH10，更优选pH6到pH8来实施。
本发明方法还可在常规方式在10-60℃优选18-45℃温度下进行。
反应的持续时间从10分钟到96小时，优选60分钟到72小时并且更优选2小时到48小时。
本发明方法可以这样进行，使式(I)化合物一次，几次或连续加入。
细胞悬浮液中式(I)和式(II)的化合物的浓度总和可以在1到900mM之间，优选在2到500mM之间，更优选在3到250mM之间。
为了增加反应介质中起始的化合物的溶解性，可以在优选实施方案中加入辅助物质例如极性、与水互溶的溶剂，例如甘油、二甲基酰胺或二甲基亚砜或其他的辅助物质，例如环糊精。
另外，本发明方法可以在有机溶剂存在下例如在多相体系中特别例如是双相体系中进行。
适合于这种目的的有机溶剂，例如与水不互溶或最大体积溶解10％的有机溶剂，例如脂肪族或芳香族，适当时氯化的溶剂诸如石油醚、己烷、辛烷、庚烷、甲苯、同质异构的二甲苯、氯苯、二氯甲烷和硅油。初始化合物经常能够把自身作为有机相。
结构式(II)的化合物能够按照本身已知的方法分离，例如用有机溶剂萃取或分离，如果使用多相体系，可以通过分开有机相，然后适当时进行进一步的萃取并随后除去有机溶剂。
为了这种目的使用的溶剂优选甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、异丁酮、环己烷和甲基环己烷，优选乙酸乙酯。在这种情况下，通过连续或间断提供萃取剂进行萃取。最简单的情况，通过萃取提纯，同时采用前面提到的萃取剂进行震荡。
如果希望，能够通过蒸馏进一步提纯，或者在结构式(I)的化合物在室温下为固体的情况下，通过重结晶。
如果本发明方法在多相系统中进行，则产物还可以直接通过将有机相进行分馏来分离。
按照本发明的方法，可以获得对映体富集的结构式(II)的化合物。这种化合物带有立体碳原子，这些碳原子载有杂芳基和羟基，通常显示(S)构型。
本发明的方法特别适合于制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸甲酯，(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯，(S)-3-羟基-3-(3-噻吩基)丙酸甲酯，(S)-3-羟基-3-(3-噻吩基)丙酸乙酯，(S)-3-羟基-3-(2-呋喃基)丙酸甲酯，(S)-3-羟基-3-(2-呋喃基)丙酸乙酯，(S)-3-羟基-3-(3-呋喃基)丙酸甲酯、(S)-3-羟基-3-(3-呋喃基)丙酯乙酯、(S)-3-羟基-3-(2-吡啶基)丙酸甲酯，(S)-3-羟基-3-(2-吡啶基)丙酸乙酯，(S)-3-羟基-3-(3-吡啶基)丙酸甲酯，(S)-3-羟基-3-(3-吡啶基)丙酸乙酯，(S)-3-羟基-3-(4-吡啶基)丙酸甲酯，(S)-3-羟基-3-(4-吡啶基)丙酸乙酯，(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈，(S)-3-羟基-3-(3-噻吩基)丙腈，(S)-3-羟基-3-(2-呋喃基)丙腈，(S)-3-羟基-3-(3-呋喃基)丙腈，(S)-3-羟基-3-(2-吡啶基)丙腈，(S)-3-羟基-3-(3-吡啶基)丙腈，(S)-3-羟基-3-(4-吡啶基)丙腈，和N-(甲基)-(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
本发明工艺更加适合特别是作为步骤a)在制备结构式(VI)的对映体富集的化合物的方法中，
杂芳基-CH(OH)-CH2-CH2-NR2R3 (VI)
其中杂芳基有结构式(I)中给出的相同的意义并且R2和R3在每-种情况下都互相独立地为氢、C1-C8-烷基，C4-C14-芳基或C5-C15-芳烷基，或两个基团R2和R3一起为C3-C12-亚烷基，其特征在于，·在步骤a)中结构式(I)化合物中如前所述被转化为对映体富集的结构式(II)的化合物。
杂芳基-CH(OH)-CH2-CO-CH2W (II)
其中在每一种情况下，杂芳基和W具有在结构式(I)提到的意义并且
·步骤b)
i)当W是COOR1和R1是氢、C1-C8-烷基，C4-C10-芳基或C5-C11-芳烷基时，结构式(II)的对映体富集的化合物与结构式(III)的胺反应，
HNR2R3 (III)
其中R2和R3有结构式(VI)提到的意义，产生结构式(IV)的对映体富集的化合物，
杂芳基-CH(OH)-CH2-CO-NR2R3 (IV)
其中杂芳基、R2和R3有前面提到的意义，或
ii)当W是CON(R1)2和R1基在每一种情况下互相独立地为氢、C1-C8-烷基，C4-C10-芳基或C5-C11-芳烷基或两个R1基一起为C3-C5-亚烷基时，结构式(II)的对映体富集的化合物，适当时通过与结构式(III)的胺反应，被转变为对映体富集的结构式(IV)的化合物，和
iii)当W是CN时，这种结构式(II)化合物通过氨解/水解被直接转变为结构式(IV)的化合物，或通过水解、部分水解或混合醇解/水解初始就转化为结构式(V)的化合物，
杂芳基-CH(OH)-CH2-CO-R4 (V)
其中杂芳基具有结构式(I)中所给出的意义而且R4是OR1或NH2，R1具有上面提到的意义，然后通过类似i)的酰胺化作用，适当时类似ii)，转变化对映体富含的结构式(IV)的化合物。
·在步骤c)中，
通过还原，结构式(IV)的对映体富含的化合物转变为具有上述意义的结构式(VI)的对映体富集的化合物。
在结构式(III)，(IV)和(VI)中，R2和R3特别优选在每种情况下独立地为氢、甲基、乙基、异丙基、苯基或苄基。
在结构式(III)，(IV)和(VI)中，NR1R2以它的完全形式，特别优选是甲氨基、乙氨基和异丙氨基。
在式(III)，(IV)和(VI)中，NR1R2以其完全形式非常特别优选是甲氨基。
可用于本发明的包含步骤a)、b)和c)的方法中的式(I)的化合物或从文献中已知或可按照这些文献的类似方法进行制备。
结构式(I)的化合物中的W不是CN的，可以优选通过结构式(VII)的化合物与结构式(VIII)的化合物在碱的存在的反应获得，
杂芳基-CO-CH3 (VII)
其中，杂芳基具有在结构式(I)提及的意义和优选范围，
R1-O-W (VIII)
其中，
R1和W，具有在结构式(I)下所给出的相同的意义，W不是CN。
2-乙酰基噻吩与碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、碳酸二苯基酯或碳酸二苄基酯、N-甲基氨基甲酸甲酯，N-甲基氨基甲酸乙酯、N，N-二甲基氨基甲酸甲酯、或N，N-二甲基氨基甲酸乙酯的反应可以通过例子进行论述。
在Tetrahedron Lett，1998，39，4995中举例描述了这样的反应并以类似的方式应用，例如用于2-乙酰基噻吩与N-甲基氨基甲酸甲酯或N-甲基氨基甲酸乙酯反应生成N-(甲基)-3-氧代-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
在碱的存在下，结构式(VII)的化合物和结构式(IX)的化合物反应可以获得结构式(Ia)化合物
杂芳基-CH(OH)-CH2-CO-NHR2 (Ia)
R2-NCO (IX)
本发明的方法的步骤b)中，结构式(II)的对映体富集的化合物用本身已知的方法，按照i)、ii)或iii)转变为结构式(IV)的对映体富集的化合物。
Houben Weyl“Methoden der Organischen Chemie[Methods oforganic chemistry]”4th edition，volume E5，941-1010提供了一篇从羧酸、羧酸酯或其他羧酰胺制备羧酰胺的综述。
如果在室温使用结构式(III)的液体或气体胺，那么优选使用胺的溶液。例如，在甲胺的情况下，可以方便的使用甲基胺在水、甲醇或乙醇中的溶液用于与W是COOR1的结构式(II)的化合物进行反应。在偶合剂例如2-卤代吡啶鎓或2-卤代-1，3-噻唑鎓盐存在的情况下，或在酸阳离子交换剂存在的情况下，结构式(III)的胺反应合适于，例如将式(II)的游离羧酸转化为结构式(IV)的酰胺。
按照步骤(b)，是从对映体富集的结构式(II)的化合物获得对映体富集的结构式(IV)的化合物。
结构式(IV)的化合物可以被还原为结构式(VI)的化合物。羧酰胺的还原而带来相应的胺的原理是已知的，而且在Houben Weyl“Methoden der Orgaischen Chemie”，4thedition，volume E16d，987-1003被概括性公开。
优选结构式(VI)化合物与复合氢化硼或氢化铝反应，如氢化锂铝，Red-Al(二(2-甲氧基乙氧基)二氢铝酸钠)或硼氢化钠。
特别优选结构式(VI)的化合物和氢化锂铝反应。
这种还原优选通过温度的范围从室温到150℃，更优选50到110℃而实现的。这种还原通常是在醚作为溶剂时完成的，优选环醚如四氢呋喃或二氧杂环己烷，应用Red-Al以甲苯作为溶剂的反应也可以实现。
依照本发明的方式获得对映体富集的结构式(VI)的化合物。
可以提及下列为可以作为优选的结构式(VI)的化合物：
(1S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，(1R)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，(1S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇和(1R)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，更优选(1S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇。
可以按照本发明制出的对映体富集的结构式(VI)的化合物特别适合于制备对映体富集的结构式(X)的化合物，
杂芳基-CH(OR6)-CH2-CH2NR2R3 (X)
其中
杂芳基，R2和R3 具有结构式(I)中所指出的意义和优选范围，和R6为苯基或萘基，其可被取代，取代可以是没有，一次或多于一次，
所述取代基在各种情况下相互独立地选自氰基，CO-(C1-C12-烷基)，O-(C1-C12-烷基)，(C1-C12-烷基)氟，氯，溴或C1-C12-氟代烷基。
R6优选萘基。
优选的结构式(X)的化合物是
(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)丙胺和(R)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)丙胺和他们的铵盐。
因此，本发明也包含方法，其中
·步骤(d)，
包括对映体富集的结构式(VI)的化合物和结构式(XI)的化合物在碱的存在下反应，得到的对映体富集的结构式(X)的化合物。
结构式(XI)，
R6-Hal (XI)
R6为结构式(X)所提及的含义，和
Hal为氟，氯，溴或碘，优选氟。
1-氟萘和4-氯苯并三氟化物优选作为结构式(XI)的化合物。
这些能够使用的碱是那些能够至少部分除去结构式(VI)的化合物的醇官能团的质子的那些。
这些碱包括例如碱土金属或碱金属的氢化物、氢氧化物、氨基化合物、醇化物或碳酸盐，例如，氢化钠，氨基钠，二乙基氨基锂，甲醇钠、乙醇纳、叔丁醇钾、氢氧化钠和氢氧化钾。
可按本发明制备的化合物特别适合用作为药物的活性化合物例如特别是血清素或去甲肾上腺素的吸收抑制剂，或作为其中间体。
本发明的方法具有的先进性能够以工业生产的规模以高总产率高对映体过量和高纯度使用易获得的起始化合物合成对映体富集的3-杂芳基-3-羟基丙酸的衍生物和3-杂芳基-1-氨基丙-3-醇类，和它们的次级产品。
【具体实施方式】
实施例
实施例1和2
采用不同菌株的baker’s酵母Saccharomyces cereviseae还原3-氧代-(2-噻吩基)丙酸甲酯。
酵母菌株(Saccharomyces cereviseae NG247，Uniferm GmbH & CoKG，Monheim；Saccharomyces cereviseae Y278，Deutsche HefeWerke[Geman Yeast Works]GmbH & Co oHG，Hamburg)在28℃，振荡(200rpm)，在含有25ml的YM培养基(酵母提取物，3.0g/l；麦芽提取物，3.0g/l；蛋白胨，5.0g/l；葡萄糖，10.0g/l)的100ml的锥形烧瓶中生长过夜。
在28℃，振荡(200rpm)，在含有200ml的与12ml的原始培养基预先接种的YM培养基的3个1升的锥形烧瓶中培养两个酵母菌株的每一个。生长采用测量600nm(OD600)光密度的方法进行监测。在6到7小时后，培养基达到一个OD600的3，通过离心(15分，8000×g)分离收集并在冰箱中在4℃下储存过夜。这个反应是将250μl的1M的磷酸钾缓冲剂(pH7)和250μl的1M的3-氧代-(2-噻吩基)丙酸甲酯加入到5ml的细胞pellet并且全部在螺旋盖的13ml的玻璃管中振荡。300μl的反应混合物按照规定的间隔取出并用300μl的乙酸乙酯或甲苯进行萃取。在随后的离心分离(5分，5000xg)这些相后，有机相采用手性气相色谱进行分析。结果记录在表1。
表1
采用不同酵母菌株的3-氧代-(2-噻吩基)丙酸甲酯的还原。
实施例3
使用Saccharomyces cereviseae Y278的3-(2-噻吩基)-3-氧代丙-1-腈的还原。
如实施例1和2描述的方法，酵母细胞生长，并进行反应。结果记录在表2中。
表2
实施例4和5
使用Geotrichum candidum的3-(2-噻吩基)-3-氧代丙酸甲酯的还原。
在1升锥形烧瓶中，200ml的YM培养基接种上菌株Geotrichumcandidum ATCC34614，将烧瓶在28℃振荡条件下培养18小时，该培养基作为一级初始培养基。两个1升的锥形烧瓶各自加入200ml的GC培养基(KH2PO4，11.18g/l；K2HPO4，3.12g/l，甘油，30.0g/l；酵母提取物，10.0g/l；聚蛋白胨，5.0g/l)各自接种上10ml的一级初始培养基，并同样在28℃下振荡培养18小时作为二级初始培养基。
10升发酵罐装入4.6升的GC培养基并与400ml的二级初始培养基一起培养，作为主培养基。培养基在28℃以101/min的速度通入空气，搅拌速度为800rpm进行培养。在10小时后，发酵罐进行收集。采用6000×g离心分离15分钟进行细胞沉积，取出后放入100mM的磷酸钾缓冲液中(PP缓冲液)pH6.4，并且在4℃下保存在冰箱中。
1.8g的葡萄糖，9ml的1M PP缓冲剂(pH7.3)和71μl(最后浓度是20mM)或143μl(最后浓度40Mm)的3-(2-噻吩基)-3-氧代-丙酸甲酯加入到16g的湿的生物量，并且全部在28℃使用磁性搅拌器在25ml的Scott瓶中进行搅拌。300μl的反应混合物按照规定的间隔取出并用300μl的乙酸乙酯或甲苯进行萃取，有机相采用气相色谱进行分析。结果记录在表3。
表3
用菌株Geotrichum candidum ATCC34614还原3-(2-噻吩基)-3-氧代-丙酸甲酯。
实施例6至12
应用Saccharomyces cereviseae还原各种β-酮酯。
将菌株Saccharomyces cereviseaeNG247的初始培养基在28℃装有100ml的YM培养基的1升锥形烧瓶中震动过夜培养。作为主要培养基，三个1升锥形烧瓶中分别含有200ml的YM培养基，每个分别接种10ml的在28℃震动培养的初始培养基。6小时后，培养基达到在600nm(OD600)测得的光密度为7和8之间。通过离心(15min，6000xg)收集细胞，并在100mM PP缓冲液(pH7)+3％(w/v)葡萄糖中再悬浮作为10-倍浓缩的细胞悬浮液。制备检测物质的1M酒精溶液。在反应混合物中，细胞悬浮液中各自加入20mM的检测物质，并在30℃震荡培养。定期收回300ul的反应混合物并用300ul的乙酸乙酯或甲苯萃取，用气相色谱分析有机相。结果记录在表4中。
表4
杂环β-酮酯的对应体选择性还原。
实施例13
制备3-氧代-(2-噻吩基)丙酸甲酯
将510ml的碳酸二甲酯和1500ml甲苯在2L烧瓶中加热到100℃，在510ml的碳酸二甲酯中的257g的2-乙酰噻吩溶液间隔4小时逐滴加入。蒸除在反应中形成的甲醇作为共沸混合物。900g的冰中的120ml浓硫酸加入到在4L烧瓶中，加入冷却的反应混合物，使不超过40℃。然后搅拌混合物并将PH值调整到PHl。进行相分离，有机相通过硫酸钠的水溶液震荡萃取三次，在真空中浓缩。粗产品真空蒸馏得到278g的3-氧代-(2-噻吩基)丙酸甲酯，为一种透明的，微黄色的液体(按GC的98％纯度，理论产率的74％)。
实施例14
制备N-甲基-(3 S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺
实施例1中所描述实验的(3S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酸甲酯23g和[空白(lacuna)]最初加入，再加入130ml 2M的甲胺甲醇溶液。该混合物在60℃搅拌4小时，冷却然后在真空浓缩。通过这个方法获得24g(纯度87％，理论产率的90％)。粗产品可以就这样用在下一个步骤中，或从二氯甲烷和己烷中重结晶。这样得到18g N-甲基-(3S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺(理论产率的75％)白色结晶的形式。
实施例15
制备(1S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇
350ml的干四氢呋喃首先加入到10g的氢化锂铝中并加热回流。同时，开始逐滴加入在实施例14中获得的17g的N-甲基-(3S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺(溶解于150g四氢呋喃中)。逐滴加入完成后，混合物随后在回流的同时搅拌过夜。然后冷却混合物到室温，小心的逐滴加入200ml水。然后逐滴加入135ml的10％的氢氧化钠溶液，并将溶液过滤。溶剂被真空除去。将370ml的1N氢氧化钠溶液加入到粗溶液中，并全部分别在370ml的甲苯中萃取3次。有机相合并，且挥发性组分真空除去，由此得到76g(84％纯度，理论产率的70％)。
实施例16
纯化(1S)-3-(甲氨基)1-(2-噻吩基)-1-丙醇
由实施例15得到的产物15g溶解在150ml的沸腾加热的热水中，然后将5g活性木炭加入其中并将混合物再回流搅拌一个小时。在热的状态下过滤悬浮液。滤出液每次以100ml的二氯甲萃取三次。蒸发合并的有机相并在沸腾加热下以50ml环己烷溶解剩余物；然后在冷却过程中用600ml的石油醚结晶。结晶被过滤，用少量的石油醚清洗，并干燥。结果得到12g(1S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇(98％纯度，93％的产率)。