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1、(10)申请公布号 CN 104293758 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293758 A (21)申请号 201410474222.7 (22)申请日 2014.09.17 C12N 9/90(2006.01) C12N 15/61(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 陈平 地址 430000 湖北省武汉市常青花园学府南 路 68 号 申请人 张绍鹏 陈燕 杨涛 朱闻君 曾万勇 霍梦蕊 伍翀 王如峰 邓琛 (72)发明人 陈平 张绍鹏 陈燕 杨涛 朱闻君 曾万勇 霍梦蕊 伍翀 王如峰 邓。
2、琛 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (54) 发明名称 一种珠子参 - 香树素合酶基因及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种珠子参 - 香树素合酶 基因及其应用， 利用以珠子参 cDNA 为模板， 利用 P1 ： 5ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3 ； 反向引物 P2:5TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG3 进行 PCR 反 应， 可获得珠子参 - 香树素合酶基因， 将珠子参 - 香树素合酶 （PBAS） 基因通过农杆菌介导的 遗传转化转入珠子参， 可获得高齐墩果烷型皂苷 含量的的转基因植株， 为获得高皂苷含量的珠子 。
3、参提供理论基础和应用实例， 具有广大的应用前 景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104293758 A CN 104293758 A 1/1 页 2 1. 一种分离的蛋白质， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.2 所示。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白质的核苷酸序列。 3. 根据权利要求 2 所述的核苷酸序列， 其序列为 SEQ ID NO.1 所示。 4. 含有权利要求 2 所述核苷酸序列的植。
4、物表达载体。 5. 含有权利要求 4 所述植物表达载体的转基因植株。 6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物齐墩果烷型皂苷含量中 的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于 ： 权利要求 1 所述蛋白质或权利要求 2 所 述的基因在提高珠子参齐墩果烷型皂苷含量中的应用。 8.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高珠子参齐墩果烷型总皂苷含 量中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104293758 A 2 1/6 页 3 一种珠子参 - 香树素合酶基因及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 主要涉及珠子参中 - 香树素合酶 (-amyr。
5、in synthase) 基因的克隆和应用， 背景技术 0002 珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y Wu et K.M.Fen g)是 五加科人参属 (Panax L.) 植物竹节参的变种， 也是传统的名贵中药材之一， 主要分布在我 国陕西、 四川、 湖北、 云南等省。具有较高的药用价值， 用于气阴两虚、 烦热口渴、 虚劳咳嗽、 跌扑损伤、 关节疼痛、 咳血、 吐血、 外伤出血等。其主要有效成分是三萜皂苷， 以齐墩果烷型 五环三萜类皂苷为主。 0003 珠子参是中国药典收载品种， 具有广阔的应用前景和可观的经济价值 , 通过研究 珠。
6、子参中活性成分五环三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制， 找出其中的关键 酶， 实现其基因的定位、 克隆及高效表达， 在分子水平上对齐墩果烷型五环三萜皂苷生物合 成进行人工调控， 进一步实现齐墩果烷型五环三萜皂苷类化合物的规模生产， 以提供医药 市场的需求。 0004 - 香树素合酶 (-amyrin synthase， AS) 基因在三萜类皂苷的生物合成途径 中起着重要的作用。AS 催化 2， 3- 氧化角鲨烯生成 - 香树素， - 香树素再经一系列生 化反应生成齐墩果烷型皂苷。AS 被公认为是控制 2， 3- 氧化角鲨烯流向齐墩果烷型皂苷 合成途径的关键酶。 0005 本研究首次利用第。
7、二代 Solexa HiSeq2000 进行珠子参全株的转录组测序及 De novo 拼接。分析找到珠子参中编码 - 香树素合酶的候选基因并进行体外克隆表达， 验证 其功能， 为珠子参齐墩果烷型皂苷的生物合成提供理论基础。 0006 在本发明被公布之前， 尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的珠子参 - 香树素合酶基因及其氨基酸序列， 此基因编码的酶在珠子参中齐墩果烷型皂的生物合 成的过程中有重要的作用， 本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控 珠子参中齐墩果烷型皂苷化合物生物合成的关键点。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基。
8、因， 其序列为 SEQ ID NO.1 所示。该基因编码的 - 香树素合酶催化 2， 3- 氧化角鲨烯生成 - 香树素， 在齐 墩果烷型五环三萜皂苷合成途径中起关键性作用， 可通过调节酶量提高齐墩果烷型皂苷合 成量。 0008 本发明的第二个目的是提供一种珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因编码的蛋 白质， 其序列为 SEQ ID NO.2 所示。 0009 本发明的最后一个目的在于珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因在提高珠子参 齐墩果烷型皂苷含量中的应用。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到珠子参中， 可提高 说 明 书 CN 104293758 A 3 2/6 页 4 珠子参中。
9、齐墩果烷型皂苷的含量。 0010 为了达到上述目的， 本发明采取以下技术措施 ： 0011 一种珠子参-香树素合酶(PBAS)基因(以下称为PBAS基因)， 其制备方法 如下 ： 0012 以珠子参cDNA为模板， 利用正向引物P1 ： 5ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3 ； 反向 引物 P2:5TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3 进行 PCR 反应。 0013 反应条件 ： 35 个 PCR 反应循环， 94变性 1min， 42退火 2min， 75延伸 3min。最 后 75延伸 10min。 0014 最终获得了 PBAS 基因， 其序列为 SEQ。
10、 ID NO.1 所示， 编码的蛋白质为 SEQ ID NO.2 所示。 0015 一种珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因在提高珠子参齐墩果烷型皂苷含量中 的应用， 其应用过程如下 ： 0016 将珠子参 - 香树素合酶蛋白质 (SEQ ID NO.2 所示 ) 对应的 PBAS 基因 ( 优选 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参， 可获得高齐墩果烷 型皂苷含量的的转基因植株。 0017 本发明的所要保护的内容还包括 ： 编码 SEQ ID NO.2 所示氨基酸的核苷酸序列 ； 优选 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列。 0018 含有本发明。
11、的珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因全序列或其 ORF 序列的重组 载体， 如原核类载体， 真核类表达载体及 RNAi 载体均属于本发明的保护范围， 包括但不限 于 pBI121， pCAMBIA1301。 0019 含有本发明的珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因全序列或其 ORF 序列的宿主 细胞， 如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围， 所述的宿主细胞包括 但不限于酵母菌、 大肠杆菌、 珠子参。 0020 本发明的珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因的应用， 包括用所述的重组载体， 如植物表达载体转化植物细胞 ； 或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞。
12、共培养， 得到 转基因的植物发根系 ； 或者用所述的发根细胞再生植株 ； 或者用所述的珠子参 - 香树素 合酶(PBAS)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体， 所述的转基因生物体包 括但不限于烟草、 酵母、 拟南芥、 珠子参发根。 0021 本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆 菌 ； 常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 烟草细胞和其它植物细胞。 0022 利用本发明的珠子参 - 香树素合酶 (PBAS)， 通过各种常规筛选方法， 可筛选 出与珠子参-香树素合酶(PBAS)发生相互作用的物质， 或者受体、 抑制剂或拮抗剂等。 0023 与现有技术相比，。
13、 本发明具有以下优点 ： 0024 本发明所提供的珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因是首次从珠子参植物中克 隆制备所得， 利用本发明的技术可以对珠子参等含有同类化合物的药用植物进行基因工 程改造， 通过转基因来提高植物体内的齐墩果烷型皂苷的含量。珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因可参与珠子参齐墩果烷型皂苷的生物合成， 因此本专利为珠子参齐墩果烷型 皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。 0025 进一步添加其产业上积极的效果本发明利用转基因技术得到了齐墩果烷型皂苷 说 明 书 CN 104293758 A 4 3/6 页 5 含量增加的高产株， 为齐墩果烷型皂苷的的。
14、工业化生产提供了技术支撑。 附图说明 0026 图 1 为珠子参总 RNA 电泳图。 0027 图 2 为 PBAS 功能域预测分析。 0028 图 3 为 PBAS 系统进化树。 0029 图 4 为表达载体 pYES2-PBAS 构建示意图。 0030 图 5 为酶活力检测示意图。 具体实施方式 0031 本发明所述方案如未特别说明， 均为本领域的常规方案， 所用试剂如未特别说明， 均购自生化商店。 0032 实施例 1 ： 0033 珠子参转录组测序及数据分析 0034 1、 样品采集 0035 珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.。
15、Y Wu et K.M.Fen g)植 株来源于湖北恩施， 分别取根茎、 叶、 花， 果实置液氮中速冻后， 在 -80冰箱中冷冻保存备 用。 0036 2、 珠子参总 RNA 的分离和检测 0037 对 -80保存的各类样本于液氮中充分研磨， 然后采用优化的 Trizol 法对样本进 行总 RNA 的提取， 全过程保证在低温条件下进行， 加入一定浓度的 PVP 溶液 ( 聚乙烯吡咯烷 酮 )， 并适当加大 - 巯基乙醇的浓度， 离心去除 PVP 和 - 巯基乙醇后， 采用高浓度 NaAc 溶液析出 RNA， DNase 去除残留 DNA 完成 RNA 的纯化。用 1.0琼脂糖电泳检测 RNA 。
16、的完整 性 ( 图 1), 用 Nanodrop2000 核酸定量仪测定 A260、 A280 比值和浓度， RNA 样本置于 -80 冰箱备用。 0038 3、 转录组测序 (RNA-Seq) 0039 用 oligo(dT) 的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA， 接加入 fragmentation buffer 将 mRNA 打断成短片段， 以 mRNA 为模板， 用六碱基随机引物 (random hexamers) 合成第一条 cD NA 链， 然后加入缓冲液、 dNTPs、 RNase H 和 DNA polymerase I 合成第二条 cDNA 链， 在经 过 QiaQuick 。
17、PCR 试剂盒纯化并被 EB 缓冲液洗脱之后进行末端修复、 加 poly(A) 并连接测 序接头， 琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小， PCR 扩增构建测序文库， 利用第二代 Solexa HiSeq2000 进行 RNA 测序， 及 De novo 拼接。 0040 4、 候选基因初步筛选 0041 通过 GO 注释， Blast 比对分析以及 MEGA5.0 构建系统发育树 ( 图 3) 等软件分析 初步筛选到珠子参中编码 - 香树素合酶的候选基因。 0042 实施例 2 ： 0043 珠子参 - 香树素合酶基因的克隆 0044 分析候选基因读码框范围， 以珠子参根茎 cDNA 文库为模板。
18、利用正向引物 P1:5ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG 3 ； 反向引物 P2:5TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3 克 说 明 书 CN 104293758 A 5 4/6 页 6 隆候选基因全长序列， 链接到克隆载体 pMD18-T 上并转化到大肠杆菌感受态细胞 E.coli DH5 中， 步骤如下 ： 0045 a) 从 -80超低温冰箱中取 100L 感受态细胞悬液， 解冻后置于冰上 ； 0046 b) 加入 5L 连接产物， 用移液器轻轻吹打混匀， 冰浴 30min ； 0047 c)42热激 90s， 迅速置冰上 5min ； 0048 d) 向。
19、 EP 管中加入 1mL LB 液体培养基 ( 不含抗生素 )， 37 200rpm 45min ； 0049 e) 摇菌后取 100L 菌液涂布于含抗生素的平板上， 37培养箱过夜 ； 0050 f) 挑取单菌落于 4mL 含抗生素的 LB 液体培养基中， 37 200rpm 振荡培养过夜选 取阳性克隆送样测序。 0051 至此获得了珠子参 - 香树素合酶基因， 其序列为 SEQ ID NO.1 所示。 0052 实施例 3 ： 0053 PBAS 基因的生物信息学分析 0054 本发明涉及的珠子参 - 香树素合酶 (PBAS) 基因全长为 2280bp， 其序列为 SEQ ID NO.1 。
20、所示， 其中开放读码框位于 1 2280bp， 编码的蛋白质序列为 SEQ ID NO.2 所示。 将拼接分析好的-香树素合酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。 该基因具有典型的 ISOP REN_C2_like superfamily 结构域， 如图 2。 0055 实施例 4 ： 0056 PBAS 基因功能的研究 0057 1、 表达载体的构建 0058 依据珠子参 AS 基因全长序列 (SEQ ID NO.1) 的 ORF， 设计扩增完整开放阅读框 的引物， 分别在正、 反向引物上分别引入限制性酶切位点 KpnI 和 XhoI， 利用正向引物 P1 ： 5 GGTACCATGT。
21、GGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3 反向引物 P2 ： 5CTCGAGTCAGACGCTTTTAGATGGTAATC G3 进行 PCR 反应， 进行琼脂糖凝胶电泳， 30min 后照相， 观察胶图， 扩增片段为 2292bp， TA 克隆， 提取质粒。以 KpnI 和 XhoI 酶切扩增产物 2h， 利用回收试剂盒 (Takara 公司， 中国 ) 纯化酶切产物。同时利用 KpnI 和 XhoI 酶在 37下酶切 pYES2 载体 2h， 进行琼脂糖凝胶电 泳， 观察胶图， 并利用试剂盒回收大小约 5856bp 的片段。 0059 二者经连接酶在16连接过夜。 转化大肠杆菌DH5a。
22、感受态细胞， 在含有氨苄青霉 素的LB平板上筛选重组子。 PCR检测阳性菌斑， 提取阳性克隆质粒， 进行限制性内切酶酶切 电泳鉴定， 保存且有正确目标的重组质粒 pYES2-PBAS 用于表达转化。该表达载体命名为 pYES2-PBAS( 图 4)。 0060 2、 蛋白的诱导表达 0061 以 pYES2-PBAS 质粒转化突变酵母宿主菌 GIL77， 在缺少尿嘧啶的完全合成培养 基 SC-U(20ug/ml 麦角固醇， 13ug/ml 血红素， 5mg/mlTween80) 上 30震荡培养 2d， 收集细 胞在不含葡萄糖的SC-U培养基(20ug/ml麦角固醇， 13ug/ml血红素， 。
23、5mg/mlTween80， 2半 乳糖 ) 上 30培养 10h. 收集细胞悬浮于 0.1M， pH7.0 的磷酸钾溶液中添加 3葡萄糖和血 红素 30培养 24h。回收菌体， 分离微粒体， 纯化蛋白。 0062 3、 酶促反应鉴定 0063 对表达纯化的 - 香树素合酶进行酶活力的检测， 加入 2ug 的纯化表达蛋白到反 应体系 0.1M 磷酸钾缓冲液 (pH7.5)， 2， 3- 环氧角鲨烯， 1mM 的 DDT， 1mg/ml 的 BAS， 0.05的 说 明 书 CN 104293758 A 6 5/6 页 7 T riton X-100。2， 3- 环氧角鲨烯作为反应底物， 底物浓。
24、度越高产生的 - 香树素含量越 高。反应总体系在 37下预孵 20min。在 100下加热 3min 终止反应， 用氯仿提取反应产 物。检测 - 香树素的含量， 当添加的底物 2， 3- 环氧角鲨烯浓度越高时产生的 - 香树素 含量越高， 反应速率随着 - 香树素合酶的减少而逐渐减少， 如图 5。 0064 实施例 5 ： 0065 珠子参 - 香树素合酶在提高珠子参中齐墩果烷型皂苷含量中的应用， 其步骤如 下 ： 0066 转基因用的受体材料珠子参 (Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y Wu et K.M.Feng) 采自湖北恩施。 006。
25、7 根据珠子参 - 香树素合酶基因的全长 cDNA 序列 (SEQ ID NO.1)， 在扩增编码区 的正反方向引物上引入限制性内切酶位点 ( 视选用的载体而定 )， 构建植物表达载体， 通过 农杆菌介导遗传转化转入珠子参， 筛选转基因植株检测其齐墩果烷型皂苷的含量。 0068 以实施例 2 中获得的含有 PBAS 基因编码区 (SEQ ID NO.1 所示 ) 的 pMD18-T 为 模版， 在上述构建的正向引物前引入BamH I酶切位点， 在反向引物前引入Sac I酶切位点， 正向引物 P1 ： 5GGATCCATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3 ； 反向引物 P2 ： 5。
26、GAGCTCTCAGACGCT TTTAGATGGTAATCG3 进行 PCR 扩增后， TA 克隆， 提取质粒。以 BamH I 和 Sac I 酶切扩增产 物 4h， 利用回收试剂盒 (Takara 公司， 中国 ) 纯化酶切产物。同时利用 BamH I 和 Sac I 酶 在 37下酶切 pBI121 载体 4h， ， 在 16下利用 T4 连接酶连接产物过夜在保证阅读框正确 的前提下将珠子参AS基因的编码区克隆到植物表达载体pBI 121上， 将酶切鉴定好的表 达载体 pBI121-AS 转入农杆菌中， 遗传转化珠子参。 0069 利用发根农杆菌介导的珠子参的遗传转化， 所需的材料和操。
27、作步骤如下 ： 0070 发根农杆菌 A4， 使用前自冰箱中取出， 用 YEB 培养基传代 2 次， 菌种在使用前接种 于 YEB 液体培养基中， 28培养过夜。 0071 取珠子参细嫩叶片， 洗净后置于 70酒精中浸泡 1min， 弃酒精， 加入 2次氯酸钠 消毒10min， 期间摇动数次， 弃去消毒液， 用无菌水漂洗45次， 置于无菌滤纸上晾干， 用无 菌刀片将珠子参叶片切成 5mm5mm 小片， 置于预培养固体培养基上， 在 (231)暗箱培 养箱中预培养 2d。 0072 经过夜培养的发根农杆菌 A4 菌液离心后， 菌体沉淀用 1/2MS 重悬， 置于 4中 2h 后取出。将预培养过的。
28、珠子参叶片浸泡于 1/2MS 重悬的菌液中 5min， 用无菌滤纸吸去多余 菌液， 放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中， (231)黑暗条件下培养， 每 2 周转移到新鲜培养基中 1 次， 待长出毛状根后分离毛状根， 转移至含 250-500mg/L 卡那霉 素的无激素1/2MS固体培养基中培养， 每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止， 然后再转移 至不含卡那霉素的无激素 1/2MS 培养基中培养。 0073 把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有 150ml 无激素 1/2MS 液体培 养基的 500ml 三角瓶中， 培养温度、 光照、 转速等培养条件与愈伤组织。
29、液体悬浮培养条件 相同， 培养 25d 后， 将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥， 然后称重， 贮 存 -80中备用。 0074 阳性株筛选步骤如下 ： 0075 提取具有卡那霉素抗性的转化珠子参植株的总 RNA， 利用 Takara 反转录试剂盒将 说 明 书 CN 104293758 A 7 6/6 页 8 RNA 反转录成 cDNA， 半定量所用引物为珠子参珠子参 - 香树素合酶基因特异引物 ( 正向 引物 5 -CACTGTCGGATGGTTTAT-3 ； 反向引物 5 -TAGCGAGGTGCTTCTTG-3 )， 反应程序为 94 时 3 分钟， 94变性 30 秒， 。
30、61退火 30 秒， 72延伸 45 秒， 25 个循环 ； 循环完成后 72延 伸 5 分钟。用植物 beta-actin 基因做为内参基因 ( 正向引物 5-GGAAAAGATTTGGCATC-3， 反向引物 5-GGGCGTAACCCTCATA-3 )。对珠子参的野生型和转化系在相同生长状态下进行 目的基因表达水平的分析。选择相对于野生型植株， 基因表达量的 Fold-change 值高于 4 倍以上 (P 陈平 张绍鹏 陈燕 杨涛 朱闻君 曾万勇 霍梦蕊 伍翀 王如峰 邓琛 一种珠子参 - 香树素合酶基因及其应用 一种珠子参 - 香树素合酶基因及其应用 2 PatentIn versi。
31、on 3.3 1 2280 DNA 珠子参 1 atgtggaagc ttaaaattgc agagggagga aatccatggc ttcggagtct gaacgatcac 60 gtcggccggc aaacttggga gttcgatccc aaactcggat ctccggaaga gcttgcggag 120 atcgagaaag ctcgcgaaac ttttcgcaaa catcgtttcg agaaaaagca tagttccgat 180 ctcctcatgc gcattcagtt ttccaatgag aatcgaggca gtatactctt accacaagtt 2。
32、40 aaagtaaaag atacagaaga tatttcagat gacaaagtaa cagttacgtt aaaaagagct 300 attaatttcc attcaactct tcaggcccat gatggacatt ggccaggaga ttatggtggt 360 cctatgtttc taatgcctgg tttggttatt acgctatcga taactggggc actgaatgca 420 gtcttatcca aagaacataa acgtgagatg tgccgttatc tttacaatca tcagaacaga 480 gatggtgggt ggggtt。
33、tgca cattgagggt ccaagtacta tgtttggtac tgctttgaac 540 tatgttactt tgaggttgct tggcgaggga gctaatgatg gacaaggggc aatggaaaaa 600 序 列 表 CN 104293758 A 9 2/6 页 10 gggcgtcaat ggattctgga tcatggtggt gctactgcaa tatcatcatg gggaaaaatg 660 tggctttcag ttcttggtgt atttgaatgg tccggaaata atcctctgcc cccagagata 720 tggct。
34、atttc catatatcct tccgttccac ccaggaagga tgtggtgtca ctgtcggatg 780 gtttatctgc ctatgtcata cttgtatggg aagaggtttg ttggtccaat cactcctctt 840 attttacaat taagagaaga actttatgct caaccctaca atgaaatcaa ttggagaaaa 900 acacgtcatg tgtgtgccaa ggaggacatc tactatcctc atcctttaat acaagacctg 960 ctctgggata gtctctatgt att。
35、aactgaa ccacttttaa ctcgttggcc atttaacaag 1020 ttgagagaga aagctctgca gactaccatg aaacacattc actacgaaga tgagaacagt 1080 cgatatatta ccattggaaa tgtggaaaag gttttgtgta tgcttgcttg ttgggttgag 1140 gatccaaatg gtgattactt caagaagcac ctcgctagga tcccagatta tatatgggtt 1200 gctgaagatg gaatgaaaat gcagagtttt ggcagtca。
36、ag agtgggatac tggttttgcc 1260 atacaagcat tgttggcgag tgatctcact gatgaaattc gtcctaccct tatgaaaggg 1320 catgacttca taaaaaagtc ccaggtcaag gagaaccctt ctggcgactt caaaagcatg 1380 catcgccaca tttctaaagg atcctggacc ttttcagatc aagatcatgg atggcaagtt 1440 tcggattgta ctgcagaagc tttgaagtgt tgcctactct tttcaaggat gc。
37、caacagaa 1500 attgttggtg ataaaatgga agacaaccaa ttgtttgatg ctgtcaatat actgctatcc 1560 ctacagagca aaaatggcgg cctagctgca tgggagcctg caggatcatc agaatggttg 1620 gagctgctca atcctacaga attctttgaa gacattgtca ttgaacatga gtatgtcgaa 1680 tgcacttcat cagcaattca ggctatggtt atgtttaaga agttataccc tgggcatagg 1740 aa。
38、gaaagaga tagaagtttc aatcacaaat gctgtacagt accttgaaga catacaaaag 1800 序 列 表 CN 104293758 A 10 3/6 页 11 cctgatggtt catggtacgg aaactggggt gtgtgcttca catatggtac ttggtttgct 1860 atgggaggtc taaccgcggc tggaaagaca tacaacaaca gccaaactct tcataaagca 1920 gtggattttc taataaaatc gcaacgcagt gatggtggtt ggggagaaag c。
39、tatctttct 1980 tgcccaaaca aggaatatac acctttagaa ggaaataggt caaatttggt acacacttca 2040 tgggccatga tgggtctgat tcattctggg caggccgaaa gagacccaac acctcttcat 2100 cgtgcagcca agttgttgat caattcccaa atggaaagtg gtgattttcc ccaacaggaa 2160 atcactggag ttttcatgaa gaactgcatg ttacactatg cagcgtatag aaacatatat 2220 c。
40、cgttgtggg ctttagcaga atatcgaaaa aatgttcgat taccatctaa aagcgtctga 2280 2 759 PRT 珠子参 2 Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Gly Asn Pro Trp Leu Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asn Asp His Val Gly Arg Gln Thr Trp Glu Phe Asp Pro Lys Leu 20 25 30 Gly Ser Pro Glu Glu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Ala Arg Glu Thr Phe 35 。
41、40 45 Arg Lys His Arg Phe Glu Lys Lys His Ser Ser Asp Leu Leu Met Arg 50 55 60 Ile Gln Phe Ser Asn Glu Asn Arg Gly Ser Ile Leu Leu Pro Gln Val 65 70 75 80 Lys Val Lys Asp Thr Glu Asp Ile Ser Asp Asp Lys Val Thr Val Thr 85 90 95 Leu Lys Arg Ala Ile Asn Phe His Ser Thr Leu Gln Ala His Asp Gly 100 105 。
42、110 His Trp Pro Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Met Phe Leu Met Pro Gly Leu 序 列 表 CN 104293758 A 11 4/6 页 12 115 120 125 Val Ile Thr Leu Ser Ile Thr Gly Ala Leu Asn Ala Val Leu Ser Lys 130 135 140 Glu His Lys Arg Glu Met Cys Arg Tyr Leu Tyr Asn His Gln Asn Arg 145 150 155 160 Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile。
43、 Glu Gly Pro Ser Thr Met Phe Gly 165 170 175 Thr Ala Leu Asn Tyr Val Thr Leu Arg Leu Leu Gly Glu Gly Ala Asn 180 185 190 Asp Gly Gln Gly Ala Met Glu Lys Gly Arg Gln Trp Ile Leu Asp His 195 200 205 Gly Gly Ala Thr Ala Ile Ser Ser Trp Gly Lys Met Trp Leu Ser Val 210 215 220 Leu Gly Val Phe Glu Trp Ser。
44、 Gly Asn Asn Pro Leu Pro Pro Glu Ile 225 230 235 240 Trp Leu Phe Pro Tyr Ile Leu Pro Phe His Pro Gly Arg Met Trp Cys 245 250 255 His Cys Arg Met Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg 260 265 270 Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Leu Gln Leu Arg Glu Glu Leu 275 280 285 Tyr Ala Gln Pro Tyr。
45、 Asn Glu Ile Asn Trp Arg Lys Thr Arg His Val 290 295 300 Cys Ala Lys Glu Asp Ile Tyr Tyr Pro His Pro Leu Ile Gln Asp Leu 305 310 315 320 Leu Trp Asp Ser Leu Tyr Val Leu Thr Glu Pro Leu Leu Thr Arg Trp 325 330 335 Pro Phe Asn Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Thr Met Lys His 340 345 350 Ile His Tyr。
46、 Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr Ile Gly Asn Val 355 360 365 Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Ala Cys Trp Val Glu Asp Pro Asn Gly 370 375 380 Asp Tyr Phe Lys Lys His Leu Ala Arg Ile Pro Asp Tyr Ile Trp Val 385 390 395 400 Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser Gln Glu Trp Asp 405 410 415 Thr。
47、 Gly Phe Ala Ile Gln Ala Leu Leu Ala Ser Asp Leu Thr Asp Glu 420 425 430 序 列 表 CN 104293758 A 12 5/6 页 13 Ile Arg Pro Thr Leu Met Lys Gly His Asp Phe Ile Lys Lys Ser Gln 435 440 445 Val Lys Glu Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ser Met His Arg His Ile 450 455 460 Ser Lys Gly Ser Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp His Gly Trp Gln Val 465 470 。