抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410730395.0 (22)申请日 2014.12.04 C12N 15/82(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号重大工程楼 501 室 (72)发明人 邱丽娟 郭兵福 郭勇 张丽娟 金龙国 洪慧龙 化宿南 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 白艳 (54) 发明名称 抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用 (57) 摘要 本发明。

2、公开了抗草甘膦转基因大豆及其制备 方法与应用。本发明提供了一种培育转基因大豆 的方法， 为将外源 DNA 片段插入目的大豆基因组 第 17 号染色体的第 7,980,527-7,980,541 位间， 得到转基因大豆。本发明的转基因大豆对高剂量 的草甘膦具有耐受性， 可进一步通过与优良大豆 株系杂交来改良以优化其他农艺性状如产量、 品 质等。本发明的检测方法可以鉴定插入的 T-DNA 和植物基因组 DNA 的结合区域并进一步鉴定转基 因大豆及其后代的细胞、 组织、 器官、 制品等。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 。

3、序列表13页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104450775 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104450775 A 1/2 页 2 1.一种培育转基因大豆的方法， 为将外源 DNA 片段插入目的大豆基因组第 17 号染色 体的第 7,980,527-7,980,541 位间， 替换掉第 17 号染色体的第 7,980,527-7,980,541 位间 13bp 的碱基序列， 得到转基因大豆 ； 所述转基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆 ； 所述外源 DNA 片段为含有 5- 烯醇丙酮酸莽草酸 -3- 磷酸合成酶基因和 N- 乙酰转移酶 基因的 DNA 分子。 2。

4、.根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 5- 烯醇丙酮酸莽草酸 -3- 磷酸合成酶基因为 G2-aroA ； 所述 N- 乙酰转移酶基因为 GAT ； 所述外源 DNA 片段为序列表中序列 10 或序列 1 自 5 末端第 6189-10927 位核苷酸。 3.根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述外源 DNA 片段在所述转基因大 豆的上游侧翼片段为所述目的大豆基因组第 17 号染色体的自第 7,980,527 位核苷酸起向 其上游方向延伸得到的长度为 0 至 5Kb 的任意一个 DNA 片段 ； 所述外源 DNA 片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段为所述。

5、目的大豆基因组第 17 号 染色体的自第 7,980,541 位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为 0 至 5Kb 的任意一个 DNA 片段。 4.根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于 ： 所述上游侧翼片段为序列表中序列 8 所示的核苷酸 ； 所述下游侧翼片段为序列表中序列 9 所示的核苷酸。 5.根据权利要求 1-4 中任一所述方法， 其特征在于 ：； 所述外源 DNA 片段通过含有所述外源 DNA 片段的重组载体导入所述目的大豆 ； 所述重组载体的核苷酸序列具体为序列表中序列 1 ； 所述目的大豆为中黄 10 号。 6.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求 1-5 中任一所述。

6、方法制备的转 基因大豆或其后代的方法， 包括如下步骤 ： 检测所述植物样品的基因组 DNA 中是否含有 DNA 片段A， 所述DNA片段A由权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼 片段、 权利要求 3 中的所述外源 DNA 片段和权利要求 3 中的所述外源 DNA 片段在所述转基 因大豆的下游侧翼片段组成 ； 若含有所述 DNA 片段 A， 则所述植物样品为或候选为所述转基因大豆或其后代 ； 若不含有所述 DNA 片段 A， 则所述植物样品不为或候选不为所述转基因大豆或其后代。 7.根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法为如下 1) 或 2) 或 3) ：。

7、 1) 直接测序植物样品的基因组 DNA， 判断所述测序植物样品含有所述 DNA 片段 A ； 2)用引物对1或引物对2进行PCR扩增， 若有目的扩增产物， 则所述测序植物样品含有 所述 DNA 片段 A ； 所述引物对 1 为能够扩增由所述外源 DNA 片段 5 端和紧邻其的所述上游侧翼序列部 分或全部片段组成的 DNA 分子甲的引物对 ； 其对应的目的扩增产物为所述 DNA 分子甲 ； 所述引物对 2 为能够扩增含有所述外源 DNA 片段 3 端和紧邻其的所述下游侧翼序列 的部分或全部组成的 DNA 分子乙的引物对 ； 其对应的目的扩增产物为所述 DNA 分子乙 ； 权 利 要 求 书 C。

8、N 104450775 A 2 2/2 页 3 3)用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述待测植物样品DNA进行 Southern 杂交， 若能杂交得到杂交片段， 则所述植物样品来源于所述转基因大豆或其后代。 8.根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 2) 中， 所述引物对 1 由序列表中序列 10 所示的单链 DNA 分子和序列表中序列 11 所示 的单链 DNA 分子组成 ； 所述引物对 2 由序列表中序列 12 所示的单链 DNA 分子和序列表中序列 13 所示的单链 DNA 分子组成 ； 3) 中， 所述探针的核苷酸序列为序列 6。 9.用于检测样品是否来源。

9、于所述转基因大豆或其后代的试剂盒， 其包括 ： 1) 权利要求 6 中所述外源 DNA 片段、 2) 权利要求 6 中所述引物对 1、 3) 权利要求 6 中所述引物对 2 或 4) 权利要求 6 中所述探针 ； 所述试剂盒还具体记载权利要求 1-8 中任一所述方法的说明书。 10.权利要求 1-8 中任一所述方法制备的转基因大豆在育种中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104450775 A 3 1/9 页 4 抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及植物基因工程技术或育种领域， 具体地， 本发明涉及转基因大豆及其 应用， 更具体地， 本发明涉及抗草甘膦转基因大。

10、豆及其制备方法与应用。 背景技术 0002 大豆 (Glycine max(L.).Merr) 起源于中国， 是重要的油料作物和经济作物， 也是 食用植物油与植物蛋白质的主要来源。杂草是农业生态系统中的重要组成部分， 杂草与作 物竞争光、 水、 养分等资源， 使作物减产。 因此， 大豆田间杂草的有效防除是大豆稳产高产的 关键因素之一。 传统的人工除草包括手工拔草和使用简单农具除草等， 耗时耗力， 功效低且 不能大面积及时防除。除草剂的使用大大提高了农田杂草的防治效率， 传统除草剂氯嘧磺 隆、 甲磺隆等在土壤中残留严重、 污染环境， 使用范围较小。 0003 草甘膦 (Glyphosate) 为。

11、内吸传导型、 广谱灭生性除草剂， 具有杀草谱广、 高效、 低 毒、 无残留等优点， 尤其对人畜毒害小， 是全球应用范围最广的除草剂之一， 其作用机制是 通过不可逆地与植物体内 EPSPS 合酶 (5- 烯醇丙酮酸莽草酸 -3- 磷酸合成酶 ) 结合催化植 物和微生物体内莽草酸的代谢途径， 扰乱莽草酸合成途径导致代谢过程紊乱， 干扰蛋白质 合成， 阻止次生产物的形成， 最终使植株死亡 ； 另一个重要的作用机理是抑制植物的光合磷 酸化。但草甘膦在杀灭杂草的同时也伤害大豆， 培育抗草甘膦转基因作物是保护作物不受 草甘膦伤害， 提高杂草综合防治效率的重要途径之一。已有的研究和转基因作物商业化发 展历史。

12、证明大豆对除草剂草甘膦的耐受性将是对于杂草防除、 管理的有用性状。 0004 为赋予农作物草甘膦的耐受性， 研究者集中于向植物体内导入能增加草甘膦耐受 性的基因， 如 EPSPS， EPSPS 基因通常来自于微生物， 具有草甘膦抗性， 因而在存在草甘膦的 情况下保持了他们的催化活性(PCT/CN03/00651)。 当前全球商业化种植的草甘膦抗性转基 因作物绝大多数为针对 EPSPS 所设计。 0005 在植物组织中 N- 乙酰转移酶 (GAT) 能够通过 N- 乙酰化作用使得草甘膦被有效的 降解， 从而失去除草剂活性， 且乙酰化的草甘膦不是 EPSPS 的有效作用底物， 从而赋予植物 对草甘。

13、膦的耐受性(ZL 2005 1 0086626.X)。 利用N-乙酰化的手段培育转基因作物可以使 得草甘膦在植物整个生长周期都可以应用， 不受生长发育阶段的限制。 发明内容 0006 本发明的一个目的是提供一种培育转基因大豆的方法。 0007 本发明提供的方法， 为将外源 DNA 片段插入目的大豆基因组第 17 号染色体的第 7,980,527-7,980,541位间， 替换掉第17号染色体的第7,980,527-7,980,541位间13bp的 碱基序列， 得到转基因大豆 ； 0008 所述转基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆 ； 0009 所述外源 DNA 片段为含有 5- 烯醇丙酮酸莽。

14、草酸 -3- 磷酸合成酶基因和 N- 乙酰转 移酶基因的 DNA 分子。 说 明 书 CN 104450775 A 4 2/9 页 5 0010 上述方法中， 所述 5- 烯醇丙酮酸莽草酸 -3- 磷酸合成酶基因为 G2-aroA ； 0011 所述 N- 乙酰转移酶基因为 GAT ； 0012 所述外源 DNA 片段为序列表中序列 10 或序列 1 自 5 末端第 6189-10927 位核苷 酸。上述方法中， 所述外源 DNA 片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段为所述目的大豆基 因组第17号染色体的自第7,980,527位核苷酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至5Kb 的任意一个 DNA 。

15、片段 ； 0013 所述上游侧翼片段具体为序列表中序列 8 所示的核苷酸 ； 0014 所述外源 DNA 片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段为所述目的大豆基因组第 17号染色体的自第7,980,541位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意 一个 DNA 片段 ； 0015 所述下游侧翼片段具体为序列表中序列 9 所示的核苷酸。所述上游侧翼片段为所 述转基因大豆基因组中紧邻所述外源 DNA 片段 5 末端的片段 ； 0016 所述下游侧翼片段为所述转基因大豆基因组中紧邻所述外源 DNA 片段 3 末端的 片段 ； 0017 上述方法中， 所述外源 DNA 片段通过含有所述外源 D。

16、NA 片段的重组载体导入所述 目的大豆 ； 0018 所述重组载体的核苷酸序列具体为序列表中序列 1。 0019 上述方法中， 所述目的大豆为中黄 10 号。 0020 本发明另一个目的是提供用于检测植物样品是否来源于上述方法制备的转基因 大豆或其后代的方法。 0021 本发明提供的方法， 包括如下步骤 ： 检测所述植物样品的基因组 DNA 中是否含有 DNA 片段 A， 所述 DNA 片段 A 由权利要求 3 中的所述外源 DNA 片段在所述转基因大豆的上游 侧翼片段、 权利要求 3 中的所述外源 DNA 片段和权利要求 3 中的所述外源 DNA 片段在所述 转基因大豆的下游侧翼片段组成 ；。

17、 0022 若含有所述 DNA 片段 A， 则所述植物样品为或候选为所述转基因大豆或其后代 ； 0023 若不含有所述 DNA 片段 A， 则所述植物样品不为或候选不为所述转基因大豆或其 后代。 0024 上述方法中， 0025 所述方法为如下 1) 或 2) 或 3) ： 0026 1) 直接测序植物样品的基因组 DNA， 判断所述测序植物样品含有所述 DNA 片段 A ； 0027 2)用引物对1或引物对2进行PCR扩增， 若有目的扩增产物， 则所述测序植物样品 含有所述 DNA 片段 A ； 0028 所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5 端和紧邻其的所述上游侧翼序列 部分或全部。

18、片段组成的 DNA 分子甲的引物对 ； 其对应的目的扩增产物为所述 DNA 分子甲 ； 0029 所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3 端和紧邻其的所述下游侧翼序 列的部分或全部组成的 DNA 分子乙的引物对 ； 其对应的目的扩增产物为所述 DNA 分子乙 ； 0030 3) 用能特异结合所述 DNA 分子甲或其 DNA 分子乙的探针对所述待测植物样品 DNA 进行 Southern 杂交， 若能杂交得到杂交片段， 则所述植物样品来源于所述转基因大豆或其 后代。 说 明 书 CN 104450775 A 5 3/9 页 6 0031 上述方法中， 所述引物对 1 由序列表中序列 10。

19、 所示的单链 DNA 分子和序列表中序 列 11 所示的单链 DNA 分子组成 ； 0032 所述引物对 1 对应的目的特异片段大小为 810bp， 其核苷酸序列具体为序列 15 ； 0033 所述引物对 2 由序列表中序列 12 所示的单链 DNA 分子和序列表中序列 13 所示的 单链 DNA 分子组成 ； 0034 所述引物对 2 对应的目的特异片段大小为 1627bp， 其核苷酸序列具体为序列 16 ； 0035 3) 中， 所述探针的核苷酸序列为序列 6。 0036 本发明第三个目的是提供用于检测样品是否来源于所述转基因大豆或其后代的 试剂盒。 0037 本发明提供的试剂盒， 包括1。

20、)所述外源DNA片段、 2)所述引物对1、 3)所述引物对 2 或 4) 所述探针。 0038 上述试剂盒还可以记载上述方法的说明书。 0039 上述方法制备的转基因大豆在育种中的应用。 0040 本发明的实验证明， 本发明采用在大豆 17 号染色体的 7980527 至 7980541 位置间 插入外源DNA片段， 得到含有外源DNA片段的转基因大豆 ； 外源DNA片段包括草甘膦抗性基 因G2-aroA和草甘膦降解基因N-乙酰转移酶基因GAT基因 ； 转基因大豆草甘膦抗性高于未 转基因的野生型大豆。该转基因大豆对高剂量草甘膦有耐受性， 其可进一步通过与优良大 豆株系杂交来改良以优化其他农艺性。

21、状如产量、 品质等。该转外源 DNA 片段大豆共表达抗 草甘膦基因 EPSPS(G2-aroA) 和草甘膦降解基因 N- 乙酰转移酶基因 (GAT)， 在苗期 ( 子叶 出土且真叶未展开时期 ) 单株对 1-1.5ul 的草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 原液处理具有耐受 性， 田间对每公顷约 3 至 12 升的草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 处理具有耐受性。获得良好杂 草控制的总标准计量根据杂草压力在每公顷 3-6 升之间变动。本发明中的转基因大豆在这 些浓度处理时甚至更高浓度 (12 升 / 公顷 ) 处理时， 除草剂处理对植物活力和叶持绿等性 状不产生任何可测的影响。 附图说明 0。

22、041 图 1 为转基因大豆 T0 代耐 1.5L/ 公顷草甘膦喷施鉴定材料 PCR 分析 0042 图 2 为转基因大豆 ZH10-6 外源 T-DNA 的拷贝数分析 0043 图 3 为转基因大豆 ZH10-6 的 T1 植株的草甘膦抗性鉴定 0044 图 4 为转基因大豆 ZH10-6 纯合抗性株系在 12L/ 公顷草甘膦异丙胺盐处理下抗性 0045 图 5 为转基因大豆 ZH10-6 纯合株系的 PCR 分子检测 0046 图 6 为转基因大豆 ZH10-6 外源 T-DNA 插入位点及整合方式示意图 0047 图 7 为转基因大豆 ZH10-6 验证引物所在位置示意图 0048 图 。

23、8 为所述转基因大豆 ZH10-6 后代植株定性 PCR 扩增图 具体实施方式 0049 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0050 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0051 大豆品种为中黄 10 号 (Zhonghuang10， 其统编号 ： ZDD23873， 记载在如下文献中 ： 说 明 书 CN 104450775 A 6 4/9 页 7 ， 邱丽娟、 王曙明主编， 中国农业出版社， 2007， 公众可从中国农业科 学院作物科学研究所获得， 取中黄 10 号的子叶节作为转化材料 ； 0052 根癌农杆菌 (Agroba。

24、cterium tumefaciens) 菌株为 Ag10， 记载在如下文献中 ： 程 伟 .AtMGT4 基因在水稻中异位表达的初步研究 (D). 湖南师范大学， 2012 ； 公众可从中国农 业科学院作物科学研究所获得。 0053 大豆组织培养基以 MS 和 B5 培养基为主 ,121灭菌 15-20min。 0054 萌发培养基 ： B5+20g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂粉， pH5.8 ； 0055 共培养基 ： 1/10 B5+30g/L 蔗糖 +3.9g/L 2-(N- 吗啡啉 ) 乙磺酸 (MES)+1.67mg/ L6-BA+39mg/L 乙酰丁香酮 +0.25mg/L 赤霉。

25、素 (GA3)+1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫 酸钠 +1mmol/L 半胱氨酸 +5g/L 琼脂粉， pH5.4 ； 0056 共培养液 ： 1/10 B5+30g/L 蔗糖 +3.9g/L 2-(N- 吗啡啉 ) 乙磺酸 (MES)+1.67mg/ L6-BA+39mg/L 乙酰丁香酮 +0.25mg/L 赤霉素 (GA3) ； 0057 丛生芽诱导培养基 ： B5+30g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂粉 +0.6g/L 2-(N- 吗啡啉 ) 乙磺 酸 (MES)+1.67mg/L 6-BA+150mg/L 噻孢霉素 +400mg/L 羧苄青霉素 +15mg/L gl。

26、yphosate， pH5.7 ； 0058 芽伸长培养基 ： MS+B5 有机 +30g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂粉 +0.6g/L 2-(N- 吗啡啉 ) 乙磺酸 (MES)+50mg/L 天冬氨酸 +50mg/L 谷氨酰胺 +0.3mg/L 吲哚 -3- 乙酸 (IAA)+0.5mg/ L 赤霉素 (GA3)+150mg/L 噻孢霉素 +400mg/L 羧苄青霉素 +0.1mg/L 玉米素 (Ze)+5mg/L glyphosate， pH5.7 ； 0059 生根培养基 ： MS+B5 有机 +30g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂粉 +0.6g/L 2-(N- 吗啡啉 ) 乙磺 酸 (。

27、MES)50mg/L 天冬氨酸 +50mg/L 谷氨酰胺 ,pH5.7 ； 0060 农杆菌培养用 YEP 和 LB 培养基。 0061 乙酰丁香酮、 MS 和 B5 干粉培养基和乙酰丁香酮为 sigma 公司产品， 2-(N- 吗啡 啉 ) 乙磺酸 (MES)、 噻孢霉素、 羧苄青霉素、 琼脂粉、 玉米素、 天冬氨酸、 谷氨酰胺、 赤霉素素 (GA3) 和 6- 苄氨基腺嘌呤 (6-BA) 为 Biodee 公司产品， 蔗糖为国产试剂。 0062 以下实施例进一步描述了得到本发明和随后的结果时所用的材料和方法， 它们通 过举例说明提供， 并且它们的叙述不应认为是要求权利和本发明的限制。 00。

28、63 实施例 1、 转基因大豆的遗传转化 0064 1、 重组载体的获得 0065 (1)根据A.thaliana-rbcS加G2-EPSPS基因优化后合成序列， 重新设计PCR引物， 上游带有酶切位点是 XbaI， 下游带有酶切位点 SacI， PCR 扩增 rbcS-G2-EPSPS 片段 ( 序列 1 自 5 末端第 8204-9784 位核苷酸 )， 连接到 T-A 载体上， 获得质粒 prbcS-G2-EPSPS， 酶切 及测序验证。 0066 (2)pBI121( 王华新， 曹家树， 向珣等 .pBI121 表达载体构建及其转化植株的快速 鉴定 . 浙江大学学报 ( 农业与生命科学。

29、版 )， 2008， 34(2) ： 137-142 ； 公众可从中国农业科 学院作物科学研究所获得 ) 和 pCAMBIA2300( 巩元勇 , 冯永坤 , 倪万潮等 . 植物表达载体 pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm 的构建及验证 . 中国生物工程杂志， 2013， 33(3):86-91 ； 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得 ) 用 Hind /EcoR 双酶切， 将 pBI121 带 有 p35S-GUS-Nos 的 3.0kb 片段连入 pCAMBIA2300， 形成中间载体 p35S-2300-GUS ； 说 明 书 CN 104450775 A 7。

30、 5/9 页 8 0067 (3)p35S-2300-GUS 载 体 及 prbcS-G2-EPSPS 用 XbaI/Sac 酶 切 后， 9.8kb 的 p35S-2300-GUS 载 体 骨 架 与 1.5kb rbcS-G2-EPSPS 片 段 连 接，得 到 中 间 载 体 p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS， 该载体为将prbcS-G2-EPSPS中的rbcS-G2-EPSPS片段替换(2) 得到的 p35S-2301-GUS 相应酶切位点中的 GUS 片段形成的。将 p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS 用 XhoI 单酶切除掉植物筛选标记 kan， 收集 1。

31、0.4kb 中间载体载体骨架。(4) 根据优化后 GAT 基因合成序列， 基因上下游带有单酶切位点 XhoI， 连接优化后 GAT 基因和上述 (3) 得到 的中间载体载体骨架到重组载体 pKT-rGE ； ， 其全序列为序列 1。 0068 序列表中序列 1 中， 自 5 末端第 9789-10360 位核苷酸为导肽 Rbcs 和草甘膦抗 性基因 Rbcs-EPSPS(G2-aroA) 的启动子增强型 35S、 5 末端第 8255-9784 位核苷酸为导肽 Rbcs 和草甘膦抗性基因 Rbcs-EPSPS(G2-aroA)、 5 末端第 7926-8196 位核苷酸为草甘膦抗 性基因EPS。

32、PS(G2-aroA)终止子NOS、 5 末端第6903-7673位核苷酸为草甘膦降解基因N-乙 酰转移酶基因增强型 35S、 5 末端第 6456-6896 位核苷酸为草甘膦降解基因 N- 乙酰转移酶 基因 GAT、 5 末端第 6248-6455 位核苷酸为草甘膦降解基因 N- 乙酰转移酶基因终止子 CaMV 35S polyA。 0069 2、 转基因大豆的获得 0070 1)、 重组根瘤农杆菌的获得 0071 将上述 1 获得的重组载体 pKT-rGE 导入根癌农杆菌 Ag10 中， 得到重组农杆菌 Ag10/pKT-rGE。 0072 2) 再生大豆植株的获得 0073 重组农杆菌 。

33、Ag10/pKT-rGE 转化离体培养的大豆 (Glycine max) 中黄 10 号的子叶 节外植体， 农杆菌与外植体共侵染后共培养 3 天， 在含有草甘膦的筛选环境下经器官再生 途径诱导转基因植株， 丛生芽诱导阶段， 使用 15mg/L 浓度的草甘膦 (Sigma 公司 ) 作为筛选 剂， 诱导 3-6 周 ； 伸长芽诱导阶段， 使用 5mg/L 浓度的草甘膦 (sigma 公司 ) 作为筛选剂， 诱 导4-8周 ； 诱导和伸长阶段， 每2周更换一次培养基， 使转化细胞再生， 为抑制根癌农杆菌的 快速生长， 在诱导和伸长培养基中分别添加 150mg/L 浓度的噻孢霉素和 400mg/L 。

34、浓度的羧 苄青霉素， 待伸长芽伸长至 4-6cm 时， 转入生根培养基中诱导生根， 获得再生大豆植株。 0074 3) 转基因大豆的鉴定 0075 (1) 草甘膦筛选 0076 将再生植株移栽至土壤中温室或培养箱继续培养， 光照条件是 16h 光照和 8h 黑 暗， 在第一至第三复叶期， 用草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 喷施处理来自独立转化体， 使用刻 度喷雾器， 以每公顷 1.5L 的草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 剂量施用除草剂水溶液。草甘膦施 用 2 周后， 调查每个植株对草甘膦处理的反应， 其中 5 个转化子对 1.5L/ 公顷的草甘膦异丙 胺盐 (Roundup) 喷施处理。

35、表现出较强的耐受性 ( 给予编号为 ZH10-1， 2， 3， 5， 6)， 其中编号 ZH10-6耐受性最高， 较对照植株(中黄10号)生长旺盛， 生长活力不受影响， 叶片未发现变 黄褪绿的症状， 编号为 ZH10-1， 2， 3， 5， 6 的再生植株为 T0 代转基因大豆， T0 代转基因大豆 的草甘膦抗性高于野生型大豆中黄 10 号。 0077 (2)PCR 筛选 0078 聚合酶链式反应 (PCR) 用于鉴定 EPSPS(G2-aroA) 和 GAT 基因的存在， 从编号 ZH10-1， 2， 3， 5， 6 的 T0 代转基因大豆植株上收集 20-50mg 新鲜幼嫩的叶子置于 2m。

36、L 离心管 说 明 书 CN 104450775 A 8 6/9 页 9 中用于提取植物基因组 DNA， DNA 提取方法参照 Murray and Thompson(1980) 介绍的方法。 用 Takara 公司生产的 EX-Taq PCR 试剂盒， 参照说明书进行 PCR 反应， 20l PCR 反应体系 含 10EX-Taq buffer 2l,2mM dNTPs 2l,10M 的基因特异性上下游引物各 0.5l， EX-Taq 酶 0.2l， 补水至 20l ； PCR 反应程序为 94 ,4min(1 循环 ) ； 94 ,30s( 变 性 ),60 ,30s( 退火 ),72 ,。

37、45s( 延伸 )35 循环 ； 72 ( 终延伸 )10min(1 循环 )。 0079 扩增 EPSPS(G2-aroA) 的引物对 ： 0080 5 -ACCAGGAGCCTTGTACCTTGAG-3 ( 序列 2) 和 5 -ATCGGGTTCGATCAGGTAATC-3 ( 序 列 3) 0081 扩增 GAT 基因的引物对 ： 0082 5 -CTCAGACCAAACCAGCCGATAG-3 (序列4)和5 -GTGTCGAATACCTCTCCCTGCTC3 (序 列 5) 0083 PCR 鉴定结果如图 1 所示， M 为 100bp DNA Marker ； 1 为野生型中黄 。

38、10 号阴性对 照 ； 2 为无菌水对照 ； 3 为质粒 pKT-rGE 阳性对照 ； 4、 5、 6、 7、 8 分别为转基因大豆 ZH10-1， 2， 3， 5， 6 ； 结果表明， 编号为 ZH10-1， 2， 3， 5， 6 的转基因大豆均呈 PCR 阳性， 编号为 ZH10-1， 2， 3， 5， 6 的转基因大豆均转入了外源基因 EPSPS 和 GAT。 0084 用传统的栽培和育种办法繁殖具有草甘膦抗性的转基因大豆， 收获该转基因大豆 种子。 0085 实施例 2、 转基因大豆的草甘膦抗性分析 0086 对实施例 1 中所得到的 T0 代转基因大豆 ZH10-6 进行连续多代的草。

39、甘膦抗性分析 发现， 其比非转基因对照中黄 10 号对草甘膦具有显著的抗性， 具体如下 ： 0087 收集 T0 代转基因大豆 ZH10-6 种子， 播种， 得到 T1 代转基因大豆 ZH10-6， 其在苗 期 ( 子叶出土真叶未完全展开时期 ) 每株涂抹 1l 草甘膦异丙胺盐 (Roundup)， 2 周后调 查药害。 0088 不抗植株表型为叶片失水褪绿， 叶卷曲、 皱缩， 顶端分生组织坏死， 直至整株死亡 ； 抗性植株表型为生长趋势旺盛、 叶片不褪绿、 不卷曲、 不皱缩。 0089 结果如图 3 所示， 1 ： 不抗 T1 代转基因大豆 ZH10-6 ； 2 ： 未处理 T1 代转基因大。

40、豆 ZH10-6 ： 3、 4 ： 抗性 T1 代转基因大豆 ZH10-6， 表明， T1 代转基因大豆 ZH10-6 在苗期对 1l 草甘膦异丙胺盐 (Roundup)/ 株处理的耐药性存在分离， 处理 3 株， 具有抗性植株 2 株， 不抗 植株 1 株 ； 与未处理的 T1 代转基因大豆 ZH10-6 相比， 抗性 T1 代转基因大豆 ZH10-6 植株株 高、 生长趋势不受抑制， 叶片不褪绿。 0090 利用传统的育种方法， 收集抗性 T1 代转基因大豆 ZH10-6 的种子， 播种， 得到 T2 代 转基因大豆 ZH10-6。 0091 将 T2 代转基因大豆 ZH10-6 不同株系。

41、分别进行 3L/ 公顷和 6L/ 公顷的草甘膦异丙 胺盐 (Roundup) 喷施鉴定， 从中选择出 2 个抗性不分离 T2 代转基因大豆 ZH10-6 为 T2 代转 基因大豆 ZH10-6 纯合株系 ； 0092 对 2 个 T2 代转基因大豆 ZH10-6 纯合株系、 转 CP4-EPSPS 耐草甘膦转基因材料 Ag4501， ( 王秀荣、 廖红、 何勇等 . 不同大豆种质材料蛋白质和脂肪含量分析 . 华南农业 大学学报， 2006， 27(3) ： 9-11) 和野生型对照中黄 10 号进行 12 升 / 公顷草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 喷施处理。 说 明 书 CN 10445。

42、0775 A 9 7/9 页 10 0093 结果如图 4 所示， 1 ： 纯合株系未处理 ； 2 ： 纯合株系喷施 12L/ 公顷草甘膦异丙胺 盐 (Roundup) ； 3 ： 转 CP4-EPSPS 抗草甘膦转基因材料 Ag4501 喷施 12L/ 公顷草甘膦异丙胺 盐 (Roundup) ； 4 ： 转 CP4-EPSPS 抗草甘膦转基因材料 Ag4501 未处理 ； 5 ： 纯合株系喷施 12L/ 公顷草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 新叶不变黄不褪绿 ； 6、 转 CP4-EPSPS 抗草甘膦转基因材料 Ag4501 喷施 12L/ 公顷草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 新叶变。

43、黄褪绿 ； 表明， 较未喷施对照， 上 述2个纯合株系无植株枯死死亡， 上述2个纯合株系生长不受抑制， 叶片不褪绿、 不皱缩。 且 在高浓度 12 升 / 公顷草甘膦异丙胺盐 (Roundup) 喷施处理条件下， 上述 2 个纯合转基因株 系较转 CP4-EPSPS 耐草甘膦转基因材料对照， 新叶未发现黄化的现象。 0094 在上述喷施剂量下， 中黄 10 号不具备任何抗性， 2 周后植株全部枯死， 死亡 ； 0095 上述 T2 代转基因大豆 ZH10-6 纯合 2 个株系具有更好的育种前景和利用价值。 0096 抗草甘膦转基因大豆 ZH10-6 获得纯合株系， 抗性能在后代中稳定遗传。 0。

44、097 实施例 3、 转基因大豆中外源 DNA 拷贝数及分子整合稳定性分析 0098 1、 整合的外源 T-DNA 的拷贝数 0099 通过对在所用转化载体的左和右边界序列之外延伸的限制性片段的 Southern blotting 分析测定 T1 代转基因大豆 ZH10-6 的基因组内整合的外源 DNA 片段的拷贝数。 0100 Southern blotting分析的探针为， 从载体T-DNA区域选择338bp的载体DNA序列 设计探针 ( 序列 6)， 参照北京美莱博医学科技有限公司生产的 PCR 法 DIG 标记试剂盒使用 说明书， 制备地高辛标记的探针。 0101 参照北京美莱博医学科。

45、技有限公司生产的地高辛杂交试剂盒使用说明书， 所用重 组质粒 pKT-rGE 为阳性对照， 中黄 10 号的基因组 DNA 为阴性对照。 0102 提取转基因大豆ZH10-6的基因组DNA， 用5个单位的限制性内切酶在200l的总 体积中于 37中消化 50-70g 基因组 DNA 5-10h， 使消化的 DNA 沉淀并重新溶解于 25l 的无菌水中， 每样品加 6l 6Loading Buffer， 消化的 DNA、 阳性对照、 阴性对照、 标准 的分子大小标记 (DNA molecular weight marker III,Digoxigenin-labeled(Roche) 和 Hin。

46、d III marker)， 45V 电压下在 0.8-1.0的琼脂糖凝胶电泳上分离 DNA。用溴化乙锭 观察 DNA， 并包括荧光标尺进行摄像记录。然后再参照 Whatman Schleicher&Schuell 公司 的 Rapid Downward transfer system 的使用说明书， 将 DNA 转移至 Hybond 尼龙膜上， 所述 与探针杂交， 用化学显示法显示杂交结果 ( 北京美莱博医学科技有限公司 )。 0103 拷贝数测定可以通过对临近左右边界区域的基因组 DNA 的分析进行， 用限制性内 切酶 DraI、 HindIII、 XbaI 消化基因组 DNA。 0104。

47、 不同酶切后的 Southern blotting 杂交结果如图 2 所示， 1:DIG Marker、 2: 质粒 pKT-rGE 阳性对照、 3 ： ZH10-6-HindIII、 4:ZH10-6-XbaI、 5:ZH10-6-DraI、 6: 中黄 10 号阴性 对照 ； 结果表明， 整合的外源 DNA 为单拷贝插入。 0105 2、 纯合抗性株系的 PCR 分析 0106 提取实施例 2 中所得到的 T2 代转基因大豆 ZH10-6 纯合株系的基因组 DNA， 在 20ul 的 PCR 反应体系中， 约 50ng 的基因组 DNA 用作模板 DNA， 且使用实施例 1 中扩增 EPS。

48、PS(G2-aroA) 引物对和扩增 GAT 基因引物对分别进行 PCR 扩增。 0107 结果如图5所示， 1-19 ： 纯合株系不同单株 ； 20 ： 质粒pKT-rGE为阳性对照 ； 21、 22 ： 无菌水对照 ； 23、 24 ： 野生型中黄10号阴性对照 ； M ： 100bp DNA marker， 表明， 纯合株系的所 说 明 书 CN 104450775 A 10 8/9 页 11 有单株均呈 PCR 阳性。草甘膦抗性与 PCR 阳性能完全对应。 0108 实施例 4、 转基因大豆中外源 DNA 分子插入位置确定 0109 用改良的 CTAB 法提取 T2 代转基因大豆 ZH。

49、10-6 纯合株系基因组 DNA， 以已经公 布 的 大 豆 基 因 组 (http:/phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html# ！ info ？ alias Org_Gmax ； 2010) 为参照， 对上述最耐草甘膦转基因材料进行测序分析， 通过比对分析， 发现在 T2 代转基因大豆 ZH10-6 纯合株系中， T-DNA 插入到大豆 17 号染色体物理位置为 7,980,527-7,980,541 位， 未插入已知大豆内源基因编码区。T-DNA 整合替换了基因组上 13bp 碱基序列， 被替换序列为 5 CAAATGCAAAAAT 3 ( 序列 7)， 该被替换序列未破坏大豆内 源基因编码。