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1、(10)申请公布号 CN 104255710 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104255710 A (21)申请号 201410468248.0 (22)申请日 2014.09.15 A01N 3/00(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 张荻 张亚非 任丽 陈冠群 王路尧 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 梁海莲 (54) 发明名称 一种优化金线莲类原球茎玻璃化法超低温保 存效果的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种优化金线。
2、莲类原球茎玻璃 化超低温保存效果的方法， 为采用含有碳纳米材 料的玻璃化溶液处理金线莲类原球茎以提高其保 存效果， 具体包括 ： 预培养、 装载液处理、 玻璃化 溶液处理和液氮保存步骤， 其中所述玻璃化溶液 含有0.10.5g/L石墨烯量子点。 本发明中公开的 方法对金线莲类原球茎的保存效果优化显著， 通 过添加石墨烯量子点作为外源物质对植物玻璃化 超低温保存起到促进作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104255710 A 。
3、CN 104255710 A 1/1 页 2 1. 一种优化金线莲类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法， 其特征在于， 采用玻璃化 超低温保存的方法对金线莲类原球茎进行保存， 具体步骤如下 ： 1) 预培养 ： 将金线莲类原球茎置于预培养基上， 在光照培养箱中预培养 1 5 天 ； 2) 装载液处理 ： 室温下， 将金线莲类原球茎在装载液中浸泡处理 40 60 分钟后移除 装载液 ； 3) 玻璃化溶液处理 ： 在 0 25下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理金线莲类原球茎 40 60 分钟 ； 4) 液氮保存 ： 保持金线莲类原球茎浸泡在玻璃化溶液中的状态， 并将其置于液氮中超 低温保存 ； 所述玻璃化。
4、溶液为含有 0.1 0.5g/L 石墨烯量子点的玻璃化冷冻保护液。 2. 如权利要求 1 所述优化金线莲类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法， 其特征在 于， 所述金线莲类原球茎预培养基为含有 40 80g/L 山梨醇的 MS 固体培养基。 3. 如权利要求 1 所述优化金线莲类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法， 其特征在 于， 所述装载液为含有 1 2mol/L 丙三醇、 0.3 0.5mol/L 蔗糖和 5 10mmol/L KNO3的 MS 培养液。 4. 如权利要求 1 所述优化金线莲类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法， 其特征在 于， 所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇， 150g。
5、/L乙二醇， 150g/L二甲基亚砜， 0.4mol/L蔗 糖和 0.1 0.5g/L 石墨烯量子点的 MS 培养液。 5. 一种金线莲类原球茎的解冻及再培养方法， 所述金线莲类原球茎为采用如权利要求 1 4 任一权利要求所述方法保存的金线莲类原球茎， 所述金线莲类原球茎的解冻及再培 养方法为将金线莲类原球茎从液氮中取出， 先水浴解冻， 然后去除玻璃化溶液后用洗涤液 洗涤， 最后转入恢复培养基中恢复培养。 6. 如权利要求 5 所述解冻及再培养方法， 其特征在于， 水浴解冻的条件为在 30 40 的水浴中解冻 60 120s。 7. 如权利要求 5 所述解冻及再培养方法， 其特征在于， 所述洗。
6、涤液为含有 1.0 1.5mol/L 蔗糖和 5 10mmol/L KNO3的 MS 培养液洗涤， 洗涤工艺为 ： 用洗涤液在室温下将 金线莲类原球茎浸泡 10 30 分钟。 8. 如权利要求 5 所述解冻及再培养方法， 其特征在于， 所述恢复培养基为含有 1 2mg/L 6- 苄基腺嘌呤、 0.1 0.5mg/L 萘乙酸和 30g/L 蔗糖的 MS 固体培养基。 权 利 要 求 书 CN 104255710 A 2 1/5 页 3 一种优化金线莲类原球茎玻璃化法超低温保存效果的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物或其局部的保存领域， 具体涉及一种优化金线莲类原球茎玻璃化 超低温保存效果的。
7、方法。 背景技术 0002 超低温保存是上世纪 70 年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常 在液氮中保存， 被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止， 处在相对稳定的 生物学状态， 达到长期保存种质的目的， 超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期 保存方式。 玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护 剂组成的玻璃化溶液中， 使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻 璃化态， 并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷， 成本低， 适宜保存种类 广泛， 保存材料遗传性稳定， 保存效果好等优点， 是近十年来用于优良种质资源。
8、中长期保存 的首选方法。 0003 金线莲为兰科开唇兰属多年生草本植物， 在民间具有广泛药用价值， 素有 “药王” 、 “金草” 、“神草” 、“鸟人参” 等美称， 因此建立有效保存金线莲种质资源的超低温保存技术至 关重要。 兰科是被子植物中的第一大科， 作为一种重要的观赏植物资源， 在园林和观赏园艺 的发展过程中占据重要地位。已成功实现超低温保存的兰科植物种类包括金钗石斛、 铁皮 石斛、 大花万代兰、 血色石斛、 舌唇兰属、 矮万代兰等。 目前建立的金线莲类原球茎超低温保 存体系成活率较低， 还不足以满足生产与科研的需求。 发明内容 0004 鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提。
9、供一种新的优化金线莲类原 球茎玻璃化超低温保存效果的方法， 以克服现有技术中植物种质资源中长期保存难以实 现， 以及超低温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。 0005 为了实现上述目的或者其他目的， 本发明是通过以下技术方案实现的。 0006 一种优化金线莲类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法， 采用玻璃化超低温保存 的方法对金线莲类原球茎进行保存， 具体步骤如下 ： 0007 1) 预培养 ： 将金线莲类原球茎置于预培养基上， 在光照培养箱中预培养 1 5 天 ； 0008 2) 装载液处理 ： 室温下， 将金线莲类原球茎在装载液中浸泡处理 40 60 分钟后 移除装载液 ； 0009 3。
10、)玻璃化溶液处理 ： 在025下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理金线莲类原球茎 40 60 分钟 ； 0010 4) 液氮保存 ： 保持金线莲类原球茎浸泡在玻璃化溶液中的状态， 并将其置于的液 氮中超低温保存 ； 0011 所述玻璃化溶液为含有 0.1 0.5g/L 石墨烯量子点的玻璃化冷冻保护液。 0012 所述 MS 培养液含有 1900mg/L KNO3， 1650mg/L NH4NO3， 170mg/L KH2PO4， 370mg/ 说 明 书 CN 104255710 A 3 2/5 页 4 LMgSO47H2O， 440mg/L CaCl22H2O， 37.3mg/L Na2-EDTA，。
11、 27.8mg/L FeSO47H2O， 100mg/ L 肌醇， 0.5mg/L 烟酸， 0.5mg/L 盐酸吡哆醇， 0.1mg/L 盐酸硫胺素， 2mg/L 甘氨酸， 0.83mg/L KI， 6.2mg/L H3BO3， 22.3mg/L MnSO44H2O， 8.6mg/L ZnSO47H2O， 0.25mg/L Na2MoO42H2O， 0.025mg/L CuSO45H2O， 0.025mg/L CoCl26H2O， 余量为水。所述 MS 培养液的 pH 为 5.8。 0013 优选地， 上述步骤 1) 中所述预培养基为含有 60g/L 的山梨醇的 MS 固体培养 基 ； 所述 。
12、MS 固体培养基含有 1900mg/L KNO3， 1650mg/L NH4NO3， 170mg/L KH2PO4， 370mg/ LMgSO47H2O， 440mg/L CaCl22H2O， 37.3mg/L Na2-EDTA， 27.8mg/L FeSO47H2O， 100mg/ L 肌醇， 0.5mg/L 烟酸， 0.5mg/L 盐酸吡哆醇， 0.1mg/L 盐酸硫胺素， 2mg/L 甘氨酸， 0.83mg/ LKI， 6.2mg/L H3BO3， 22.3mg/L MnSO44H2O， 8.6mg/L ZnSO47H2O， 0.25mg/L Na2MoO42H2O， 0.025mg/L。
13、 CuSO45H2O， 0.025mg/L CoCl26H2O， 30g/L 蔗糖， 10g/L 琼脂粉， 余量为水。所 述 MS 固体培养基的 pH 为 5.8。 0014 优选地， 上述步骤1)中所述的在MS固体培养基上培养的方法为 ： 将金线莲类原球 茎室温下置于预培养基上培养 1 5 天。 0015 更优选地， 将金线莲类原球茎室温下置于预培养基上培养 5 天。 0016 优选地， 所述装载液为含有 1 2mol/L 丙三醇、 0.3 0.5mol/L 蔗糖和 5 10mmol/L KNO3的 MS 培养液。 0017 优选地， 所述装载液为含有 2mol/L 丙三醇、 0.4mol/。
14、L 蔗糖和 10mmol/L KNO3的 MS 培养液。 0018 优选地， 上述步骤 2) 中， 室温下， 将金线莲类原球茎在装载液中浸泡处理 40 分钟 后移除装载液 ； 0019 优选地， 上述步骤 3) 中， 在 0下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理金线莲类原球茎 50 分钟。 0020 优选地， 所述玻璃化溶液为含有 300g/L 丙三醇， 150g/L 乙二醇， 150g/L 二甲基亚 砜、 0.4mol/L 蔗糖和 0.1 0.5g/L 石墨烯量子点的 MS 培养液。 0021 优选地， 所述玻璃化溶液为含有 300g/L 丙三醇， 150g/L 乙二醇， 150g/L 二甲基亚 砜、。
15、 0.4mol/L 蔗糖和 0.1 0.3g/L 石墨烯量子点的 MS 培养液。 0022 一种金线莲类原球茎的解冻及再培养方法， 所述金线莲类原球茎为采用如上述所 述方法保存的金线莲类原球茎， 所述金线莲类原球茎的解冻及再培养方法为将金线莲类原 球茎从液氮中取出， 先水浴解冻， 然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤， 最后转入恢复培养 基中恢复培养。 0023 优选地， 水浴解冻的条件为在 30 40的水浴中解冻 60 120s。 0024 更优选地， 水浴解冻的条件为在 40的水浴中解冻 60s。 0025 优选地， 所述洗涤液为含有 1.0 1.5mol/L 蔗糖和 5 10mmol/L K。
16、NO3的 MS 培 养液。 0026 优选地， 所述洗涤液为含有 1.2mol/L 蔗糖和 10mmol/L KNO3的 MS 培养液。 0027 洗涤工艺为 ： 用洗涤液在室温下将金线莲类原球茎浸泡 10 30 分钟。 0028 更优选地， 洗涤工艺为 ： 用洗涤液在室温下将金线莲类原球茎处理 20 分钟， 每隔 10 分钟更换洗涤液。 0029 优选地， 所述恢复培养基为含有12mg/L 6-苄基腺嘌呤、 0.10.5mg/L萘乙酸 说 明 书 CN 104255710 A 4 3/5 页 5 和 30g/L 蔗糖的 MS 固体培养基。 0030 优选地， 所述恢复培养基为含有2mg/L 。
17、6-苄基腺嘌呤、 0.1mg/L萘乙酸和30g/L蔗 糖的 MS 固体培养基。 0031 本发明中所述的金线莲类原球茎可以为现有技术中常用的方法获得。例如， 优选 地， 金线莲类原球茎的制备方法参考文献 ： 大花蕙兰 幻影 组培再生体系建立及离体保存 技术研究， 刘佩佩， 北京林业大学硕士学位论文， 2008。 0032 更优选地， 所述玻璃化溶液为含有 300g/L 丙三醇， 150g/L 乙二醇， 150g/L 二甲基 亚砜、 0.4mol/L 蔗糖和 0.3g/L 石墨烯量子点的 MS 培养液。 0033 更优选地， 为了证明本发明中方法的保存效果， 采用相对成活率来统计， 具体地， 在。
18、恢复培养 30 天后利用氯化三苯四氮唑 ( 缩写为 TTC) 法统计金线莲类原球茎相对成活 率， 并辅以荧光素二乙酸酯 ( 缩写为 FDA) 染色法观察。 0034 根据纳米科学原理， 向冷冻保护剂中添加纳米材料能够有效提高冷冻保护剂的粘 度和热导率， 改变冰晶的形成状况、 减少对细胞的伤害。 本发明对金线莲类原球茎在玻璃化 超低温条件下保存， 先进行预培养， 然后依次用装载液、 玻璃化溶液处理， 最后在液氮中超 低温保存， 其中玻璃化溶液又为添加了石墨烯量子点的玻璃化溶液， 这种外源物质的添加 配合方法中的其他工艺， 能够有效的提高金线莲类原球茎的保存效果。按照本发明公开的 保存方法， 采用。
19、浓度为 0.1 0.5g/L 的石墨烯量子点作为外源物质使用时， 金线莲类原球 茎玻璃化超低温保存后的恢复生长率均有显著提高， 本发明中公开的方法对金线莲类原球 茎的保存效果优化显著， 通过添加石墨烯量子点作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起 到促进作用。 附图说明 0035 图1为实施例中实验组和对照组中金线莲类原球茎超低温保存恢复生长的FDA染 色照片。FDA 能够进入活细胞原生质体内产生荧光， 可以作为判断细胞死活的标志。 0036 图 1 中有左到右分别为对照组超低温保存后的大花蕙兰类原球茎、 实验组 1 超低 温保存后的大花蕙兰类原球茎、 实验组2超低温保存后的大花蕙兰类原球茎、 实。
20、验组3超低 温保存后的大花蕙兰类原球茎。如图 1 所示， 亮度越大表示荧光强度越强， 细胞活力越高。 具体实施方式 0037 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式， 本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。 本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用， 本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用， 在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。 0038 实施例中所用的金线莲类原球茎由茎尖诱导， 具体方法参照 大花蕙兰 幻影 组 培再生体系建立及离体保存技术研究 ， 刘佩佩， 北京林业大学硕士学位论文， 2008。 0039 实施例中使用的。
21、实验试剂的配方如下 ： 0040 1)MS 培养液为 ： MS 培养液含有 1900mg/L KNO3， 1650mg/L NH4NO3， 170mg/L KH2PO4， 370mg/L MgSO47H2O， 440mg/L CaCl22H2O， 37.3mg/L Na2-EDTA， 27.8mg/L FeSO47H2O， 100mg/L 肌 醇， 0.5mg/L 烟 酸， 0.5mg/L 盐 酸 吡 哆 醇， 0.1mg/L 盐 酸 硫 胺 素， 2mg/L 甘 氨 说 明 书 CN 104255710 A 5 4/5 页 6 酸， 0.83mg/L KI， 6.2mg/L H3BO3， 2。
22、2.3mg/L MnSO44H2O， 8.6mg/L ZnSO47H2O， 0.25mg/ LNa2MoO42H2O， 0.025mg/L CuSO45H2O， 0.025mg/L CoCl26H2O， 余量为水， 所述 MS 培养液 的 pH 为 5.8。 0041 2)MS 固 体 培 养 基 为 ： MS 固 体 培 养 基 含 有 1900mg/L KNO3， 1650mg/L NH4NO3， 170mg/LKH2PO4， 370mg/L MgSO47H2O， 440mg/L CaCl22H2O， 37.3mg/L Na2-EDTA， 27.8mg/ LFeSO4 7H2O， 100m。
23、g/L 肌醇， 0.5mg/L 烟酸， 0.5mg/L 盐酸吡哆醇， 0.1mg/L 盐酸硫胺素， 2mg/ L甘氨酸， 0.83mg/L KI， 6.2mg/L H3BO3， 22.3mg/L MnSO4 4H2O， 8.6mg/LZnSO4 7H2O， 0.25mg/ L Na2MoO42H2O， 0.025mg/L CuSO45H2O， 0.025mg/L CoCl26H2O， 30g/L 蔗糖， 10g/L 琼脂 粉， 余量为水， 所述 MS 固体培养基的 pH 为 5.8。 0042 3) 预培养基为含有 60g/L 山梨醇的 MS 培养基。 0043 4) 装载液为 ： 含有 2m。
24、ol/L 丙三醇、 0.4mol/L 蔗糖和 10mmol/L KNO3的 MS 培养液。 0044 5) 玻璃化溶液为 ： 含有 300g/L 丙三醇， 150g/L 乙二醇， 150g/L 二甲基亚砜、 0.4mol/L 蔗糖和 0.1 0.5g/L 石墨烯量子点的 MS 培养液。 0045 6) 洗涤液为含有 1.2mol/L 蔗糖和 10mmol/L KNO3的 MS 培养液。 0046 7) 恢复培养基为含有 2mg/L 6- 苄基腺嘌呤、 0.1mg/L 萘乙酸和 30g/L 蔗糖的 MS 固体培养基。 0047 实施例 0048 1) 将金线莲类原球茎在含有 60g/L 山梨醇的。
25、 MS 固体培养基上光照预培养 5 天 ； 0049 2) 转至装载液中室温浸泡处理 40 分钟 ； 0050 3) 转入玻璃化溶液中在 0条件下脱水处理 50 分钟 ； 0051 4) 最后置于液氮中超低温保存。 0052 步骤 3) 结束后， 无需除去玻璃化溶液， 直接将浸泡于玻璃化溶液中的金线莲类原 球茎置于液氮中超低温保存。 0053 按照上述步骤将金线莲类原球茎分为实验组和对照组。 0054 其中， 实验组的玻璃化溶液中分别含有 0.1g/L、 0.3g/L、 0.5g/L 的石墨烯量子点。 0055 具体地， 实验组组 1 的玻璃化溶液中含有 0.1g/L 的石墨烯量子点。 005。
26、6 实验组组 2 的玻璃化溶液中含有 0.3g/L 的石墨烯量子点。 0057 实验组组 3 的玻璃化溶液中含有 0.5g/L 的石墨烯量子点。 0058 对照组中不同之处在于玻璃化溶液中不添加石墨烯量子点， 其他与实验组相同。 0059 在液氮中保存1小时后取出， 快速放入40水浴锅中， 解冻60s， 并不时轻轻摇动 ； 将玻璃化溶液吸除， 加入洗涤液， 室温处理20分钟， 每隔10分钟换一次洗涤液 ； 洗涤后的金 线莲类原球茎移到恢复培养基培养 30 天后， 比较实验组和对照组内金线莲类原球茎的相 对成活率。 0060 实验组与对照组的金线莲类原球茎的相对成活率见表 1。 0061 表 1。
27、 0062 说 明 书 CN 104255710 A 6 5/5 页 7 0063 实验结果 0064 由表 1 可知， 将浓度为 0.1g/L、 0.3g/L 和 0.5g/L 的石墨烯量子点添加到金线莲 类原球茎超低温保存的玻璃化溶液中， 使金线莲类原球茎恢复生长率由 4.52分别提高到 8.67、 10.72和 6.47， 具体效果见图 1。 0065 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效， 而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下， 对上述实施例进行修饰或改变。因 此， 举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变， 仍应由本发明的权利要求所涵盖。 说 明 书 CN 104255710 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104255710 A 8 。