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1、(10)申请公布号 CN 104059136 A (43)申请公布日 2014.09.24 CN 104059136 A (21)申请号 201310090193.X (22)申请日 2013.03.20 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100101 北京市。
2、朝阳区北辰西路 1 号院 2 号 (72)发明人 张劲松 陈受宜 刘云峰 李擎天 张万科 马彪 林晴 何锶洁 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 大豆转录因子 GmMYB172 在植物油脂代谢调 控中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种与油脂代谢调控相关的大 豆转录因子GmMYB172及其编码基因与应用。 本发 明提供的蛋白， 名称为 GmMYB172， 来源于大豆属 大豆 （Glycine max(L.)Merrill） ， 是如下 （a）或 （b） 的蛋白质 ：（a） 由序列表中序列 2 所示的氨基 酸序列组成的蛋白质 ；。
3、（b） 将序列 2 的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失 和 / 或添加且与植物组织总油脂含量相关的由序 列 2 衍生的蛋白质。本发明的实验证明， 转录因 子 GmMYB172 及其编码基因可以调控植物种子中 油脂含量， 过表达后提高植物种子中油脂含量。 该 基因对提高和改良作物油脂成份、 特别是对于提 高大豆等油料植物籽粒中油脂成份， 培育高油脂 品种具有重要的理论和现实意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图。
4、1页 (10)申请公布号 CN 104059136 A CN 104059136 A 1/1 页 2 1. 如下 1） -3） 中任一种物质在调控植物组织总油脂含量中的应用 ： 1） 蛋白 GmMYB172 ； 2） 编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子 ； 3） 含有编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌 ； 所述蛋白 GmMYB172 的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子的核 苷酸序列为序列表中的序列 1 ； 所述含有编码蛋白 Gm。
5、MYB172 的 DNA 分子的重组载体为将所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子插入表达载体中， 得到表达蛋白 GmMYB172 的重组载体。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述调控植物组织总油脂含量为提 高植物组织总油脂含量。 4.根据权利要求1-3中任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述组织为种子 ； 所述植物为单 子叶植物或双子叶植物。 5. 一种培育转基因植物的方法， 为将编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子导入目的植物中， 得到转基因植物 ； 所述转基因植物组织中总油脂含量高于所述目的植物 ； 所述蛋白 GmMYB172 的氨基酸序。
6、列为序列表中的序列 2。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子通过 重组载体导入所述目的植物中 ； 所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子的核苷酸序列为序列表中的序列 1 ； 所述重组载体为将所述编码蛋白GmMYB172的DNA分子插入表达载体中， 得到表达蛋白 GmMYB172 的重组载体。 7.根据权利要求5或6所述的方法， 其特征在于 ： 所述组织为种子 ； 所述植物为单子叶 植物或双子叶植物。 8. 一种重组载体， 为将编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子插入表达载体中， 得到表达蛋白 GmMYB172。
7、 的重组载体 ； 所述蛋白 GmMYB172 的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 9. 根据权利要求 8 所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子 的核苷酸序列为序列表中的序列 1。 权 利 要 求 书 CN 104059136 A 2 1/6 页 3 大豆转录因子 GmMYB172 在植物油脂代谢调控中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种大豆转录因子 GmMYB172 在植物油脂代 谢调控中的应用。 背景技术 0002 人类饮食中 71的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中， 大豆总产 油量约占 30， 居世界植。
8、物油产量的第一位 ( 表 1)。 0003 表 1 为世界上主要的产油作物 0004 0005 脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一， 它存在于植物体的任何一个细 胞中， 是生长发育所必须的。 对它的阻断会导致细胞的死亡， 因而至今为止还没有发现一个 阻断脂肪酸合成的植物突变体。 0006 植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰 CoA 和丙 二酰 CoA 合成 16 或 18 个碳原子的脂肪酸至少需要 30 个不同的酶催化的反应来完成这一 过程， 而在动物、 真菌及一些细菌中， 以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成 的。植物中， 参与脂肪酸合成的酶以可。
9、溶的形式存在于质体的胞质中。 0007 大多数植物中， 油脂都以三酰甘油 （Triacylglycerols， TAG） 的形式储藏， 它的含 量是一个非常重要的农艺性状， TAG 的生物合成称之为 Kennedy 途径， 如同真核生物中合成 膜甘油酯的途径， 脂肪酸去除 CoA 后被转移到 3- 磷酸甘油的 1 和 2 位， 形成中间产物 PA。 PA 去磷酸化产生 DAG。在 TAG 合成的最后一步， 第三个脂肪酸分子被转移到空的 DAG3 -OH 位置， 这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶 （diacylglycerolacyltransferase， DGAT） 催化 的， 此反应被认为。
10、是 TAG 生物合成中唯一的限速步骤。人们已对脂类合成途径有了认知， 并 且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。 然而， 植物中， 对脂类合成的调控机理及其相关 基因仍然知之甚少。 说 明 书 CN 104059136 A 3 2/6 页 4 0008 本实验室早期的研究表明， GmMYB172 及其编码基因 GmMYB172 在大豆中与非生物 胁迫的应答反应相关 （ACCESSION ： DQ822946,Liao,Y.,Tian,A.-G.,Zhang,J.-S.,Chen,S. -Y） 。 发明内容 0009 本发明的一个目的是提供如下 1） -3） 中任一种物质的新用途。 0010 本。
11、发明提供的如下 1） -3） 中任一种物质在调控植物组织总油脂含量中的应用 ： 0011 1） 蛋白 GmMYB172 ； 0012 2） 编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子 ； 0013 3） 含有编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组 菌 ； 0014 所述蛋白 GmMYB172 的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 0015 上述应用中， 所述编码蛋白GmMYB172的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列 1 ； 0016 所述含有编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子的重组载体为将所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA。
12、 分子插入表达载体中， 得到表达蛋白 GmMYB172 的重组载体。 0017 用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可 用于植物微弹轰击的载体等， 如 pBin438、 pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、 pCAMBIA1301、 pCAMBIA1300、 pBI121、 pCAMBIA1391-Xa 或 pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA 公司） 。使用 GmMYB172 构建植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、 组成型、 组织特异 型或诱导型启动子， 如花椰菜花叶病毒 （CAMV） 35S 启动子、 泛生素基因 Ub。
13、iquitin 启动子 （pUbi） 等， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因构建 植物表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整个序 列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是 合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 0018 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行 加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 （。
14、GUS 基因、 萤光素酶基因等） 、 具有抗性的抗生素标记物 （庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等） 或是抗 化学试剂标记基因 （如抗除莠剂基因） 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性 标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。 0019 携带有本发明 GmMYB172 的植物表达载体可通过使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒 载体、 直接 DNA 转化、 微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并 将转化的植物细胞或组织培育成植株。 被转化的植物宿主既可以是单子叶植物， 如水稻、 小 麦、 玉米等， 也可以是双子叶植物， 如大豆、 烟草、 拟南芥或棉花等。
15、。 0020 在本发明的实施例中， 表达载体为双元表达载体 pPROKII， 重组载体具体为将序列 表中序列 1 所示的核苷酸插入 pPROKII 载体的 BamHI 和 KpnI 酶切位点间得到的载体。 0021 上述应用中， 所述调控植物组织总油脂含量为提高植物组织总油脂含量。 0022 上述应用中， 所述组织为种子 ； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物 ； 具体为大 说 明 书 CN 104059136 A 4 3/6 页 5 豆、 百脉根、 苜蓿、 水黄皮、 油菜、 向日葵、 拟南芥或玉米 ； 在本发明的实施例中采用的是双子 叶植物拟南芥。 0023 本发明的另一个目的是提供一种培育转。
16、基因植物的方法。 0024 本发明提供的方法， 为将编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子导入目的植物中， 得到转 基因植物 ； 所述转基因植物组织中总油脂含量高于所述目的植物 ； 0025 所述蛋白 GmMYB172 的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 0026 上述方法中， 所述编码蛋白GmMYB172的DNA分子通过重组载体导入所述目的植物 中 ； 0027 所述编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子的核苷酸序列为序列表中的序列 1 ； 0028 所述重组载体为将所述编码蛋白GmMYB172的DNA分子插入表达载体中， 得到表达 蛋白 GmMYB172 的重组载体。 0029。
17、 在本发明的实施例中， 表达载体为双元表达载体 pPROKII， 重组载体具体为将序列 表中序列 1 所示的核苷酸插入 pPROKII 载体的 BamHI 和 KpnI 酶切位点间得到的载体。 0030 上述方法中， 所述组织为种子 ； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物 ； 具体为大 豆、 百脉根、 苜蓿、 水黄皮、 油菜、 向日葵、 拟南芥或玉米 ； 在本发明的实施例中采用的是双子 叶植物拟南芥。 0031 本发明的第三个目的是提供一种重组载体。 0032 本发明提供的重组载体， 为将编码蛋白 GmMYB172 的 DNA 分子插入表达载体中， 得 到表达蛋白 GmMYB172 的重组载体 。
18、； 0033 所述蛋白 GmMYB172 的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 0034 上述重组载体中， 所述编码蛋白GmMYB172的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的 序列 1。 0035 在本发明的实施例中， 表达载体为双元表达载体 pPROKII， 重组载体具体为将序列 表中序列 1 所示的核苷酸插入 pPROKII 载体的 BamHI 和 KpnI 酶切位点间得到的载体。 0036 本发明的实验证明， 本发明提供了一种与植物组织总油脂含量相关的转录因子 GmMYB172 及其编码基因， 将该编码基因转入野生型拟南芥中， 得到转基因拟南芥， 该转基因 拟南芥与野生型拟南芥相比， 其种子。
19、中的总油脂含量提高。说明转录因子 GmMYB172 及其编 码基因可以调控植物种子中总油脂含量， 过表达后提高植物种子中总油脂含量。该基因对 提高和改良作物油脂成份、 特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份， 培育高油脂 品种具有重要的理论和现实意义。 0037 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 附图说明 0038 图 1 为植物表达载体 pPROKII-GmMYB172 的示意图 0039 图 2 为转 GmMYB172 拟南芥植株的 Real Time-PCR 鉴定结果 0040 图 3 为转 GmMYB172 拟南芥种子中油脂含量测定 具体实施方式 0041 下述实施例中。
20、所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 说 明 书 CN 104059136 A 5 4/6 页 6 0042 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0043 下述实施例中所用引物均由三博生物公司合成。 0044 实施例1、 大豆与油脂代谢调控相关的转录因子GmMYB172编码基因的cDNA克隆和 植物表达载体的构建 0045 1、 转录因子 GmMYB172 的获得 0046 在进行大豆种子发育过程中脂肪酸积累代谢的分析时获得一个 MYB 转录因子家 族的基因 GmMYB172 有较高的表达。 0047 提取大豆绥农 14 （黑龙江省农科院绥化农科。
21、所用合丰 25/ 绥农 8 号为材料育成的 中熟春大豆新品种， 见中国农业科技网， http:/ html。由黑龙江农科院满为群提供。记载在如下文献中 ： 秦君等， 遗传， 28 （11） ， 1421-1427， 2006. ； 公众也可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得） 幼苗的总 RNA， 将 RNA 用逆转 录酶反转录合成 cDNA。 0048 根据大豆基因组序列中 GmMYB172 的信息， 设计引物， 引物序列如下 ： 0049 GmMYB172-up（带 BamhI 酶切位点的上游引物） ： 5 -GGATCCATGGCTGACTCGGAT（序 列 3） ； 0050 GmM。
22、YB172-dp（带 KpnI 酶切位点的下游引物） ： 5 -GGTACCTCATTCACTAGAGCCCG（序 列 4） 。 0051 以 cDNA 为模板， 用 GmMYB172-up 和 GmMYB172-dp 为引物， 进行 PCR 扩增 , 得到约 222bp 的 PCR 产物。经过测序， 该 PCR 产物具有序列表中序列 1 所示的核苷酸， 该核苷酸所 示的基因为 GmMYB172， 编码区为序列表中序列 1 在 5 末端第 1-222 位核苷酸， 该基因编码 的蛋白命名为 GmMYB172， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 0052 2、 植物表达载体的构建 0053。
23、 将 上 述 1 得 到 的 PCR 产 物 连 接 到 TaKaRa 公 司 的 T 载 体 pMD-18 上， 得 到 pMD-18-GmMYB172， 测序该载体含有正确的 GmMYB172 编码序列。 0054 将 pMD-18-GmMYB172 用 限 制 性 内 切 酶 BamHI 和 KpnI 酶 切， 回 收 约 222bp 的 GmMYB172片段， 将222bp的GmMYB172片段与经过同样酶切的12.8Kb双元表达载体pPROKII （D.C.Baulcombe,G.R.Saunders,M.W.Bevan,M.A.Mayo and B.D.Harrison,Expre。
24、ssion of biologically active viral satellite RNA from the nuclear genomeof transformed plants.Nature321(1986),pp.446449 ； 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获 得） 骨架连接， 得到重组载体 pPROKII-GmMYB172。 0055 测序重组载体 pPROKII-GmMYB172， 该载体为将序列表中序列 1 所示的核苷酸插入 pPROKII 载体的 BamHI 和 KpnI 酶切位点间得到的载体， 且插入的位置为 CaMV35S 启动子下 游 ； 该重组载体为 。
25、GmMYB172 的植物表达载体， 该载体的部分物理图谱如图 1 所示。 0056 实施例 2、 转 GmMYB172 拟南芥的获得 0057 一、 重组农杆菌的获得 0058 将实施例 1 得到重组载体 pPROKII-GmMYB172 用电击法导入农杆菌 GV3101 （Lee CW 等， Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogendefense in Arabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62 ； 公众可从 中国科学院遗传与发育。
26、生物学研究所获得） ， 挑取重组农杆菌， 提取重组农杆菌的质粒并通 说 明 书 CN 104059136 A 6 5/6 页 7 过 BamHI 和 KpnI 双酶切验证， 插入片段约为 222bp 的阳性质粒， 含有该阳性质粒的重组农 杆菌命名为 GV3101/pPROKII-GmMYB172。 0059 二、 转 GmMYB172 拟南芥的获得及鉴定 0060 将 重 组 农 杆 菌 GV3101/pPROKII-GmMYB172 培 养 至 对 数 期， 然 后 用 抽 真 空 法 将 其 转 化 哥 伦 比 亚 生 态 型 拟 南 芥 (col-0)（种 子 购 自 Arabidops。
27、is Biological ResourceCenter(ABRC)， 以下简称为野生型拟南芥） 中， 经培育后收获种子， 将种子播于含 卡那霉素 （50mg/L） 的MS筛选培养基上， 待筛选得到的T1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生 长， 收获 T1代单株， 各单株种子分别播种， 用相同的 MS 筛选培养基继续筛选以观察 T2代的 分离情况， 如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系， 获得21个T2代转GmMYB172 拟南芥株系。 0061 提取 T2代转 GmMYB172 拟南芥苗 3 个株系的 RNA， 反转录得到 cDNA 作为模板， 引物 为 ： 5 -GGATCCATGG。
28、CTGACTCGGAT 和 5 -GGTACCTCATTCACTAGAGCCCG， 进行 RealTime-PCR 鉴 定。 以野生型拟南芥 （col-0） 为对照。 大豆GmTubulin基因为内标， 所用引物为Primer-TF和 Primer-TR。内标引物序列为 Primer-TF ： 5 -AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3 和 Primer-TR ： 5 -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3 。 0062 结果如图 2 所示 ： T2代转 GmMYB172 拟南芥株系 OE-9 中 GmMYB172 的相对表达量约 为 135 ； 0063 T2代转 G。
29、mMYB172 拟南芥株系 OE-10 中 GmMYB172 的相对表达量约为 151 ； 0064 T2代转 GmMYB172 拟南芥株系 OE-11 中 GmMYB172 的相对表达量约为 112 ； 0065 在野生型拟南芥 （col-0） 中未能检测出 GmMYB172 的相对表达量。 0066 上述结果进一步证明， GmMYB172 转入拟南芥中， 且得到表达。 0067 采用同样的方法， 将空载体 pPROKII 转入野生型拟南芥中， 得到转空载体拟南芥 ； 采用上述 Real Time-PCR 方法鉴定， 结果与野生型无显著差异。 0068 三、 转 GmMYB172 基因拟南芥。
30、的表型分析 0069 测定野生型拟南芥、 转空载体拟南芥、 T2代转GmMYB172拟南芥株系OE-9、 OE-10和 OE-11 的种子总油脂含量， 具体方法如下 ： 0070 彻底干燥待测种子， 研磨成粉， 取10mg加入螺口的2ml离心管中， 每份样品平行称 取四份。加入 10l 的 17:0 脂肪酸 （10mg/ml） 做内标。加含 2.5% 浓硫酸的甲醇溶液 1ml， 85水浴中保温1小时， 期间晃动数次。 自然冷却后， 取上清500l到新管中， 加入600l 的 0.9%NaCl 溶液、 300 正己烷， 震荡混匀几分钟， 4000 转离心 10 分钟， 取上清至新管中。通 风橱中。
31、过夜使正己烷挥发完全， 然后加入 50l 乙酸乙酯溶解甲酯化的脂肪酸。将甲酯化 的脂肪酸样品用气相色谱质谱联用仪测 （Perkin-Elmer Turbomass)各个组分的相对含量， 然后各个成分的脂肪酸与加入的 17:0 内标比较得出相对含量 （方法可以参见 ： Shen,B.,et al.,The homeobox gene GLABRA2affects seed oil contentin Arabidopsis,Plant Mol. Biol.,60,377-387,2006.)。 0071 每个株系取 30 株的种子， 实验重复三次， 结果取平均值 标准差。 0072 结果如图 3。
32、 所示， 0073 野生型拟南芥种子总油脂量为 338%（即为种子总重量的百分比） ； 0074 T2代转 GmMYB172 拟南芥株系 OE-9 种子总油脂量为 384% ； 说 明 书 CN 104059136 A 7 6/6 页 8 0075 T2代转 GmMYB172 拟南芥株系 OE-10 种子总油脂量为 372% ； 0076 T2代转 GmMYB172 拟南芥株系 OE-11 种子总油脂量为 373%。 0077 野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。 0078 结果表明， 3 个转基因株系种子中的总油脂含量明显高于野生型对照。 0079 上述实验表明， 大豆MYB类转录因子GmMYB172对种子中总油脂的合成呈正调控作 用， 其编码基因 GmMYB172 的过量， 可提高转基因植株种子中总油脂的含量。 说 明 书 CN 104059136 A 8 1/2 页 9 0001 序 列 表 CN 104059136 A 9 2/2 页 10 0002 序 列 表 CN 104059136 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104059136 A 11 。