抗草甘膦基因、专用表达载体及其在获得抗草甘膦转基因小麦中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104004777 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 104004777 A (21)申请号 201410250631.9 (22)申请日 2014.06.06 C12N 15/62(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号重大工程楼 501 室 (72)发明人 夏兰琴 王根平 林敏 陆伟 (74)专利代理机构 北京纪凯。

2、知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 抗草甘膦基因、 专用表达载体及其在获得抗 草甘膦转基因小麦中的应用 (57) 摘要 本发明公开了抗草甘膦基因、 专用表达载体 及其在获得抗草甘膦转基因小麦中的应用。本发 明提供的一种蛋白， 是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序 列表中序列 3 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列表中序列 3 所示的氨基酸序列经过一 个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且与抗草甘膦相关的由序列 2 衍生的蛋白 质。本发明的实验证明， 本发明利用小麦密码子 偏好性对其进行人工设计， 并在 N 段添加来自小 。

3、麦 RubisCO 小亚基的叶绿体导肽， 通过人工合成 法获得了改造的基因， 并将其应用于小麦转化时 的作为筛选标记基因， 获得了抗草甘膦的转基因 小麦， 经过研究证明， 该转基因小麦的抗性高于优 化前小麦的转基因抗性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 14 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表14页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104004777 A CN 104004777 A 1/1 页 2 1. 一种 DNA 分子， 是如下 (1)-(4) 中任一种的 DNA 分子 。

4、： (1) 编码区为序列表中的序列 1 所示的 DNA 分子 ； (2) 编码区为序列表中的序列 1 自 5 末端第 2338-3675 位所示的 DNA 分子 ； (3) 在严格条件下与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列杂交且与抗草甘膦相关的蛋白的 DNA 分子 ； (4) 与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列至少具有 70、 至少具有 75、 至少具有 80、 至少 具有 85、 至少具有 90、 至少具有 95、 至少具有 96、 至少具有 97、 至少具有 98或 至少具有 99同源性且与抗草甘膦相关的 DNA 分子。 2. 含有权利要求 1 所述 DNA 分子的重组载。

5、体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 3. 如权利要求 2 所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体为将权利要求 1 所述 DNA 分子插入表达载体中， 得到的重组载体。 4. 扩增权利要求 1 所述 DNA 分子全长或其任意片段的引物对。 5.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组 菌在调控植物对草甘膦抗性中的应用。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于 ： 所述植物为单子叶植物。 7.一种培育转基因植物的方法， 为将权利要求1所述DNA分子导入目的植物， 获得转基 因植物， 所述转基因植物抗草甘膦性高于所述目的植物。 8. 根据。

6、权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 DNA 分子通过权利要求 2 所述的重 组载体导入目的植物。 9. 根据权利要求 7 或 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述目的植物为单子叶植物， 所述单子叶植物具体为小麦。 权 利 要 求 书 CN 104004777 A 2 1/8 页 3 抗草甘膦基因、 专用表达载体及其在获得抗草甘膦转基因 小麦中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及抗草甘膦基因、 专用表达载体及其在获得抗 草甘膦转基因小麦中的应用。 背景技术 0002 草甘膦是美国Monsanto公司生产的除草剂农达(Roundup)的主要活性成份， 具有。

7、 高效、 广谱、 低毒、 低残留、 易于被微生物分解、 不破坏土壤环境， 对大多数植物具有灭生性 等优点。自 1976 年研制成功以来， 在农业领域得到了广泛应用， 成为当今世界上生产最大 的农药品种。草甘膦是一种内吸传导型除草剂， 喷洒于植物茎叶后， 即可被植物吸收， 并迅 速输导到整个植株及其根部， 从而杀灭杂草， 不仅能杀死地上部分， 并且能作用于根部， 真 正做到斩草除根， 可有效防除那些靠根系繁殖的多年生杂草。然而作为一种非选择型除草 剂， 其杀灭杂草的同时， 对农作物同样具有灭生性， 一定程度上限制了其使用范围和使用时 间。 因此， 培育具有草甘膦抗性或能降解草甘膦的农作物具有重要。

8、意义， 不仅可有效防控杂 草， 而且可减少农业生产费用。 0003 培育抗草甘膦作物最有效的方法是将草甘膦抗性基因导入作物， 从而提高转基因 作物对草甘膦的抗性， 达到田间喷洒控制杂草的目的。1983 年 Monsanto 公司从根癌农杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens)CP4 中分离得到首个草甘膦抗性基因 epsps， 之后将其转 入大豆， 成功获得了抗草甘膦大豆， 并于 1996 年开始商业化生产。目前， 抗草甘膦转基因作 物研究发展迅速， 除了大豆， 抗草甘膦棉花、 玉米、 甘蓝型油菜、 白菜型油菜、 苜蓿、 甜菜也已 获准商业化生产。另外， 利用此基因已经获得。

9、抗草甘膦转基因小麦 (Hu T et al.,2003)。耐 草甘膦作物的种植面积也在迅速递增， 据 ISAAA 统计， 2011 年全球 59的转基因种植面积 为耐除草剂作物， 种植面积达 9390 万 hm2， 其中多数为抗草甘膦转基因作物品种。 0004 EPSPS 是细菌、 真菌、 藻类和高等植物莽草酸途径中芳香族氨基酸合成的一个关键 酶， 催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和 3- 磷酸莽草酸 (S3P) 合成 5- 烯醇式丙酮酸 -3- 磷酸 莽草酸 (EPSP)。草甘膦是 PEP 的类似物， 可以竞争性地与 EPSPS 结合， 抑制其活性， 阻断芳 香族氨基酸的合成， 从而导致下。

10、游相关代谢受阻， 扰乱植物正常代谢而使其死亡。EPSPS 在 植物细胞中定位于叶绿体， 由细胞核合成后， 在 N 段导肽作用下进入叶绿体， 与莽草酸途径 中其它酶的共同作用下， 完成芳香族氨基酸的合成。 因此， 草甘膦抗性基因在植物体内的表 达需添加叶绿体导肽。 0005 草甘膦抗性基因的来源主要有 2 种， 一是通过筛选抗草甘膦物种， 从而克隆获 得草甘膦抗性基因。目前， 已在微生物 Salmonella typhimurium(Comai et al.,1985)、 Agrobacterium sp.CP4(Comai et al.,1985)、Achromobacter sp.LBAA(。

11、Barry et al.,1994)、 Pseudomonas sp.PG2982(Kishore and Jacob,1987)、 S.pneumoniae(Du et al.,2000) 和 Staphylococcus aureus(Priestman et al.,2005) 等中发现了具有抗性的 epsps 基因， 其中从 Salmonella typhimurium 和 Agrobacterium sp.CP4 中分离的 epsps 抗 说 明 书 CN 104004777 A 3 2/8 页 4 性基因， 在部分作物中已批准商业化生产。二是对 epsps 基因突变， 获得草甘膦抗。

12、性突变 体。如已商业化生产的抗草甘膦玉米 GA21 中抗性基因是利用位点突变后克隆获得的 ； 另 外， Padgette 等 (1987) 利用位点突变使矮牵牛 EPSPS 第 101 位的甘氨酸变为丙氨酸， 突变 基因表现出对草甘膦的低亲和力。 0006 目前 , 国内外已克隆多个对草甘膦有一定抗性的突变体基因。新基因的分离和 克隆对转基因抗除草剂植物的培育及防止抗除草剂转基因植物产生交叉抗性， 具有重要意 义。此外， 微生物中获得的草甘膦抗性基因， 如果直接转化植物， 因受不同植物受体密码子 使用的偏好性影响， 其抗性水平不一定达到生产要求， 因此， 通过宿主密码子偏好性对外源 基因密码子。

13、优化和改造， 提高其在植物中的表达水平具有重要应用价值。GR79 是从极端污 染环境草甘膦抗性菌株中， 分离获得的一个新型草甘膦抗性基因， 此基因表达可表现出很 强的草甘膦抗性活性， 已申请专利 ( 申请号 PCT/CN2007/071071)。 发明内容 0007 本发明的一个目的是提供一种抗草甘膦基因。 0008 本发明提供的DNA分子， 为融合基因wCTP:GR79m或其表达盒Ubi-wctp:GR79m-nos 表达盒， 也为抗草甘膦基因， 是如下 (1)-(4) 中任一种的 DNA 分子 ： 0009 (1) 编码区为序列表中的序列 1 所示的 DNA 分子， 其为 Ubi-wctp。

14、:GR79m-nos 表达 盒 ； 0010 (2) 编码区为序列表中的序列 1 自 5 末端第 2192-3675 位所示的 DNA 分子， 为融 合基因 wctp:GR79m ； 0011 (3) 在严格条件下与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列杂交且与抗草甘膦相关的蛋白的 DNA 分子 ； 0012 (4) 与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列至少具有 70、 至少具有 75、 至少具有 80、 至少具有 85、 至少具有 90、 至少具有 95、 至少具有 96、 至少具有 97、 至少具有 98或至少具有 99同源性且与抗草甘膦相关的 DNA 分子。 0013 上述严。

15、格条件为如下 ： 50， 在 7十二烷基硫酸钠 (SDS)、 0.5M NaPO4和 1mMEDTA 的混合溶液中杂交， 在 50， 2SSC， 0.1 SDS 中漂洗。含有上述 DNA 分子的重组载体、 表 达盒、 转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。 0014 上述重组载体为将上述 DNA 分子插入表达载体中， 得到的重组载体。在本发明中， 采用 pCS167 作为表达载体， 重组载体为将序列表中序列 1 所示的 Ubi-wctp:GR79m-nos 表 达盒插入 pCS167 载体 PacI 酶切位点间得到的重组质粒。 0015 表达载体多种， pCS167 表达效果最佳， 且其具。

16、有独立的可插入外源基因的 T-DNA， 与 pCG185-GUS 目的基因配合， 可以通过后代分离获得无标记转基因植株。 0016 扩增上述 DNA 分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。 0017 上述 DNA 分子或上述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌在调控植物对草 甘膦抗性中的应用也是本发明保护的范围。 0018 上述应用中， 所述植物为单子叶植物。 0019 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。 0020 本发明提供的方法， 为将上述 DNA 分子导入目的植物， 获得转基因植物， 所述转基 说 明 书 CN 104004777 A 4 3/8 页 5。

17、 因植物抗草甘膦性高于所述目的植物。 0021 上述方法中， 所述 DNA 分子通过上述的重组载体导入目的植物。 0022 上述方法中， 所述目的植物为单子叶谷物作物， 在实施例中， 具体采用单子叶植物 小麦。 0023 本发明的实验证明， 本发明利用小麦密码子偏好性对其进行人工设计， 并在 N 段 添加来自小麦 RubisCO 小亚基的叶绿体导肽， 通过人工合成法获得了改造的基因， 并构建 了在小麦转化时将改造后的 GR79 基因用作为筛选标记基因和目的基因的农杆菌转化载 体， 通过农杆菌介导的转化， 获得了抗草甘膦的转基因小麦。 附图说明 0024 图 1 为 pCG185-wCTP:GR。

18、79m 载体结构示意图及酶切电泳图 0025 图 2 为 pCS167-wCTP:GR79m 载体结构示意图及酶切电泳图 0026 图3为转pCG185-wCTP:GR79m/pCS167-wCTP:GR79m的部分T0代植株PCR检测结果 0027 图 4 为 T0代部份转基因植株的 Southern 杂交结果 0028 图 5 为转基因小麦的 wCTP:GR79m 表达 0029 图 6 为转基因小麦的草甘膦抗性测定 0030 图 7 为优化前后密码子使用度 具体实施方式 0031 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0032 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如。

19、无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0033 pClean-G185(pCG185) 记载在如下文献中 ： Thole V.,Worland B.,Snape JW.,Vain P.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Physiology145:1211-1219 ； 公众可从中国农业科学院作物科学研 究所获得。 0034 pClean-S167(pCS167) 记载在如下文献中 ： Thole V.Worland B.Snape JW.V。

20、ain P.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Physiology145:1211-1219. 公众可从中国农业科学院作物科学研 究所获得。 0035 pCG185-GUS 为将 gus 表达盒 (ubi:gus:nos 表达盒， 核苷酸序列为序列 4) 通过 gateway 重组的 LR 反应同源重组到 pCG185 的 T-DNA 内插入， 得到载体 pCG185-GUS。 0036 四倍体小麦 Sterward， 记载在如下文献中 。

21、： He Y,Jones HD,Chen S,Chen XM,Wang DW,Li KX,Wang DS,Xia LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improved effi ciency.Journal of Experimental Botany61:1567-1581. ； 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。 0037 实施例 1、 GR79 基因的优化及合成融合基因 wCTP:GR79m 0038 G。

22、R79 基因从极端污染环境草甘膦抗性菌株中分离， 由中国农业科学院生物技术研 究所提供。优化时主要考虑以下几个方面 ： 小麦密码子偏好性、 GC 含量、 导肽。本发明的导 肽是来自小麦RubisCO小亚基的叶绿体导肽(wCTP)。 优化前后基因序列及GC含量特征见。 说 明 书 CN 104004777 A 5 4/8 页 6 按小麦密码子偏好性优化后的序列与原核苷酸序列同源性为 73.62， 优化前后密码子使 用度如图 7。 0039 优化后的 GR79m 基因与叶绿体导肽 (wCTP) 的基因结合的融合基因命名 wCTP:GR79m， 其核苷酸序列为序列表中的序列 1 自 5 末端第 21。

23、92-3675 位核苷酸， 其中序 列 1 自 5 末端第 2338-3675 位核苷酸为 GR79m 基因， 自 5 末端第 2192-2337 位核苷酸为 叶绿体导肽基因 wCTP。 0040 融合基因 wCTP:GR79m 编码的蛋白命名为 wCTP:GR79m， 其氨基酸序列为序列表中 的序列 2， 其中序列 2 自 5 末端第 50-494 位氨基酸残基为 GR79m， 自 5 末端第 1-49 位氨 基酸残基为叶绿体导肽 wCTP。 0041 融合基因 wCTP:GR79m 可以人工合成。 0042 实施例 2、 wCTP:GR79m 基因在抗草甘膦中的应用 0043 一、 pCS。

24、167-wCTP:GR79m 过表达载体的构建 0044 pCG185-UMN 载体具体构建方法为 ： 从 pAHC-PSK 中扩增约 2500bp 的 Ubi:MCS:Nos 片段， 引物两端加 PacI 位点， 扩增产物 PacI 酶切后插入 pCG185T-DNA 内的 PacI 位点， 得到 中间载体 pCG185-UMN。 0045 优化后的基因由上海生工合成， 并克隆到 pUC57 载体中， 得到载体质粒 pUC57-wCTP:GR79。 用SpeI酶切pUC57-wCTP:GR79回收1503bp wCTP:GR79m片段， 回收片段 与 SpeI 酶切去 P 的 pCG185-。

25、UMN 载体连接， 获得由 Ubiqutin 启动子驱动的表达载体， 命名 为 pCG185-wCTP:GR79m， 构建过程如图 1A。 0046 重组质粒 pCG185-wCTP:GR79m 用 SpeI 酶切鉴定， 结果如图 1B 所示， 正确连接会产 生约 6.3kb 大小的载体条带和 1.5kb 大小的 wCTP:GR79 条带， 鉴定正确。经测序， 序列比对 一致且方向正确。 0047 将重组质粒 pG185-wCTP:GR79m 中用 PacI 酶切， 回收 Ubi-wctp:GR79m-nos 表达 盒， 回收片段与 PacI 酶切去 P 的 pCS167 连接， 得到 pCS。

26、167-wCTP:GR79m 表达载体， 构建过 程如图 2A。 0048 重组质粒 pCS167-wCTP:GR79m 用 PacI 酶切鉴定， 结果如图 2B 所示， 可以看出， 如 正确会产生约 10.4kb 大小的载体条带和 4.0kb 大小的 Ubip-wCTP:GR79 条带， 酶切结果正 确。 0049 经 测 序，质 粒 pCS167-wCTP:GR79m 为 将 序 列 表 中 序 列 1 所 示 的 Ubi-wctp:GR79m-nos 表达盒插入 pCS167 载体 PacI 酶切位点间得到的重组质粒。 0050 序列 1 所示的 Ubi-wctp:GR79m-nos 表。

27、达盒， 其中， 自 5 末端第 123-2162 位核苷 酸为 Ubi 启动子， 2192-2337 位核苷酸为 wctp， 2338-3675 位核苷酸为 GR79m， 3685-3991 位 核苷酸为终止子 nos。 0051 二、 质粒 pCS167-wCTP:GR79m 转入小麦得到转 wCTP:GR79 小麦 0052 1、 农杆菌的转化 0053 载 体 pCG185-GUS T-DNA 内 只 含 有 gus 基 因，作 为 报 告 基 因。 载 体 pCS167-wCTP:GR79m有3个功能， 一是作为pCG185-GUS的辅助质粒， 使其在农杆菌中正常复 制 ； 另一方面作。

28、为标记基因用于植物的筛选 ； 另外 gus 和 wCTP:GR79m 分别位于 2 质粒的独 立 T-DNA 内， 可通过后代分离获得无标记转基因植株。 说 明 书 CN 104004777 A 6 5/8 页 7 0054 用 pCS167-bar( 将序列 6 所示的 ubi:bar:nos 表达盒插入 pCS167 的 PacI 酶切位 点间得到的载体 ) 作为对照载体。 0055 将 pCG185-GUS 和上述二制备的 pCS167-wCTP:GR79m 质粒 1:1 混合， 参照 BIO-DAD 电击仪说明书， 将此载体组合通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中， 命名为5G7E-AG。

29、L1(提取 质粒， 测序后验证正确 )。 0056 对照载体pCG185-GUS和pCS167-bar按1 ： 1混合， 按上述电击转化方法， 转入根癌 农杆菌 AGL1 中， 命名为 5G7B-AGL1。 0057 2、 小麦转化 0058 取散粉后 12-15 天的小麦 ( 小麦为四倍体小麦 Sterward) 穗子， 剥取中部大而饱 满的种子， 用 70酒精漂洗 5min， 然后在 10的次氯酸钠中消毒 10min， 无菌水漂洗 3-5 次， 除去残留的次氯酸钠。在超净台中分离未成熟胚， 接种于共培养基上。 0059 将 1ml 保存的 5G7E-AGL1 菌液， 接种到 10ml MG。

30、L-1培养液中 ( 含 200mg L-1Carb、 100mg L-1的 Kan、 1mg L-1的 Biotin) 中， 28 ,250rpm min-1暗处过夜培养， 至菌液浓度 OD600 达到 0.5-1.0 之间。 0060 将上述菌液离心沉淀后， 菌体重悬于 8ml CM4C 中 (200M As)， 28 ,250rpm min-1 振荡培养1-3h， 使用时每管加入120l1silwet(15l ml-1)， 倒入已切好的胚中， 避光侵 染 15-30min， 期间轻轻晃动几次， 然后吸干菌液， 将胚转移至另一培养基中， 23 -25暗 处共培养 2-3 天。共培养后将胚转移。

31、至诱导培养基中诱导一周， 然后转入含 0.5mM 草甘膦 的诱导培养基上 2 周， 之后移至再生培养基上光照培养 ( 含 0.1mM 草甘膦和 0.1mM3AA( 其 中 3AA 为 ： 酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸 )21 天 ； 之后移至含 0.02mM 草甘膦和 0.1mM3AA 的再 生培养基上继续培养21天 ； 继续在含0.02mM和0.1mM3AA中培养21天 ； 抗性再生苗转移至 再生培养基上恢复培养 2 周。存活苗移入温室土盆中， 正常条件管理， 得到再生小麦 ( 优化 后 )。 0061 对照载体 5G7B-AGL1 转化过程同 5G7E-AGL1， 对照载体侵染后在含草甘膦的。

32、培养 基上， 不能正常生在， 表现为诱导后期， 愈伤变黄， 再生阶段无再生芽， 最终未形成再生苗。 0062 说明用 5G7E-AGL1 侵染转化后可在含草甘膦的培养基上获得再生苗， 而对照载体 侵染转化后诱导再生受到抑制， 无再生苗形成。 0063 3、 转基因小麦的获得 0064 因为 gus 基因和 wCTP:GR79 基因分别位于两双元载体的 T-DNA 内， 会出现单独整 合和共整合的情况。对存活苗分别进行， gus 和 wCTP:GR79m PCR 检测。 0065 根据其基因序列设计特异引物， 以 29 棵再生小麦 ( 优化后 ) 叶片总 DNA 为模板， 初步检测阳性植株。其中。

33、 gus PCR 检测引物为 ： 上游引物 ： 0066 5 -AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC-3 ， 下游引物 ： 0067 5 -ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3 ； wCTP:GR79m PCR 检测引物为， 上游引物 ： 0068 5-GGCGGAACTATCCAAGTG-3， 下游引物 ： 5-CGAAATAAGCGGGACAGG-3。 0069 PCR 反 应 体 系 为 25l，包 括 2.5l10PCR buffer、 2l250M dNTP、 0.5l10M 引 物 F0.5l10M 引 物 R、 rTaq DNA 聚 合 酶。

34、 0.2l、模 板 DNA1l 和 ddH2O18.3l。 反应条件为 ： 94预变性4min， 94变性40s， 60退火40s， 72延伸1min， 35 个循环， 最后 72延伸 10min。wCTP:GR79m PCR 检测引物为 ： 上游引物 ： 下游引物 :PCR 说 明 书 CN 104004777 A 7 6/8 页 8 反应体系同 gus 检测， 反应条件为 ： 94预变性 4min， 94变性 40s， 60退火 30s， 72延 伸 30s， 35 个循环， 最后 72延伸 10min。以野生型小麦对照。 0070 结果如图3所示， M ： Marker DL2000 ；。

35、 P ： 质粒pCS167-wCTP:GR79m ； CK ： 野生型小麦 ； 1-22 ： 再生小麦 ( 优化后 ) ； 可以看出， PCR 在 22 棵植株中可扩增出 wCTP:GR79m 特异条带， 条带大小与预期一致， 平均转化效率为 2.03。其中 14 棵中可同时扩增出与预期大小一 致的 gus 特异条带， 为共整合植株。具体为株系 2、 4、 5、 6、 9、 10、 14、 17、 21、 22 为只整合有 wCTP:GR79m 的植株， 1、 3、 7、 8、 11、 12、 13、 15、 16、 18、 19、 20 为 gus 和 wCTP:GR79m 共整合植 株。 。

36、0071 对初步获得的 14 棵 gus 和 wCTP:GR79m 共整合植株， GUS 染色进一步确定， 共整合 植株叶片可出现蓝色 ； 而只含 wCTP:GR79m 的植株染色无变化。 0072 对 14 棵 gus 和 wCTP:GR79m 共整合植株进行 wCTP:GR79m 的 Southern 分析。用 CTAB 法提取叶片基因组 DNA， 约 40g DNA 用 KpnI 酶切， 纯化后经 0.8琼脂糖凝胶电泳分 离， 用碱转移法转到hybond-N+膜上(Amersham Biosciences)， 80真空固定2h。 southern 杂交采用Roch DNA地高辛标记和检测。

37、试剂盒I， 随机引物法标记探针， 42预杂交1-3h后， 42过夜杂交。按说明书步骤洗膜， 染色。杂交的原理如图 4 的上图所示。 0073 杂交结果如图 4 下图所示， 用 500bp 的 wCTP:GR79m 探针杂交。M ： -HindIII ladder ； P ： 质粒 pCS167-wCTP:GR79m ； CK ： 野生型小麦 ； 1-7 ： gus 和 wCTP:GR79m 共整合植 株， 表明 wCTP:GR79m 已稳定整合到小麦基因组， 不同株系间拷贝数不同。 0074 上述结果证明， 14 棵 gus 和 wCTP:GR79m 共整合植株为 T0代转 wCTP:GR79。

38、m 小麦 (GM)。 0075 三、 转基因植株中 wCTP:GR79m 的表达水平分析 0076 1、 RNA 的提取 0077 准备工作 ： RNase-free 离心管、 RNase-free 枪头、 研磨棒及研钵 200烘烤 2h。 RNase-free H20 配制的 75乙醇。具体过程 ： 0078 取 -80保存的 T0代转 wCTP:GR79m 小麦 (GM) 叶片约 50-100mg， 置于液氮预冷的 研钵中， 充分研磨至粉末状 ； 加入1ml TransZol Up(TransGen)， 用力吹吸， 混匀， 移至离心管 中 ； 加入200l氯仿， 剧烈震荡30S， 室温孵育。

39、3min ； 10000rpm， 4离心15min ； 转移上层水 相至新离心管中， 加入 500l 异丙醇， 混匀， 室温孵育 10min ； 10000rpm， 4离心 10min， 管 底及管壁出现胶状沉淀 ； 沉淀中加入 1ml75的乙醇， 剧烈漩涡使沉淀漂浮。7500rpm， 4 离心5min ； 弃上清， 超净台放置5min， 沉淀中加入50l RNA溶解液， 55-60助溶。 -80 保存。琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测 RNA 的质量和浓度。 0079 2、 cDNA 第一链的合成 0080 cDNA 第 一 链 用 试 剂 盒 合 成 (TransScript One-Ste。

40、p gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit,TransGen,Beijing)。合成所用引物为 Oligo(dT)18， 模版用量 1g。反应体系 ： 说 明 书 CN 104004777 A 8 7/8 页 9 0081 0082 42孵育 30min。85加热 5 分钟失活II RT 与 gDNA Remover， 得 都 cDNA。 0083 3、 qRT-PCR 0084 qRT-PCR 用 TranStart Green qPCR SuperMix(TransGen,Beijing) 试剂盒。 0085 将上述获得的 cDNA 稀释 。

41、10 倍后用作 qRT-PCR 模版。引物为 qE-F ： 0086 5-ACCATGGTCTAAGGCAACCG-3， qE-R:5-TTGATGCCAAGCCTCCTCAG-3。 所用内参基因为 小麦 actin， 引物序列， actin-F:5-AGGTGCCCTGAGGTGCTGTT-3， actin-R ： 0087 5-GATCCAGACACTGTATTTCCTTTCA-3。 0088 反应体系 ： 0089 0090 反应条件为 ： 94 30S ； 94 5S， 58 20S， 72 10S， 40 个循环。 0091 根 据 qRT-PCR 获 得 的 wCTP:GR79m 。

42、CT 值 和 actin CT 值， 利 用 2- CT法 计 算 wCTP:GR79m 在不同株系的表达水平。以表达水平高的作为对照。 0092 结果如图5所示， wCTP:GR79m在各株系间表达水平存在差异， 在株系4中表达量最 高 ； 株系2、 3、 5中的表达量低， 分别为株系4表达量的0.05、 0.03、 0.03倍 ； 株系1、 6、 7分别 为株系 4 表达量的 0.19、 0.25、 0.23 倍。结合 Southern 结果进一步分析发现， wCTP:GR79m 拷贝数与表达量间并不存在对应关系， 如株系 4 有 2 个拷贝， qRT 结果显示其表达量最高， 而株系 2 。

43、有 3 个拷贝， 株系 3 有 1 个拷贝， 其表达量分别为株系 4 的 0.05 倍和 0.03 倍。 0093 四、 转 wCTP:GR79m 小麦对草甘膦抗性鉴定 0094 将 T0代转 wCTP:GR79m 小麦 (GM) 株系 4 和野生型小麦 (CK) 同时种植温室中培育 (15-24 )， 在苗期 4-5 片叶子时， 选取 15 个单株进行草甘膦抗性鉴定。喷浓度为 0.2 (W/V) 的商品化农达 ( 含 41草甘膦异丙氨盐 ),10 天后观察其除草剂抗性。叶片出现发 说 明 书 CN 104004777 A 9 8/8 页 10 黄萎蔫症状为不抗草甘膦， 叶片未出现发黄萎蔫症状。

44、为抗草甘膦。 0095 10 天后检测， 结果如图 6 所示， T0代转 wCTP:GR79m 小麦 (GM) 植株部分可正常生 长， 表明其抗草甘膦 ； 而野生型小麦 (CK) 生长受到抑制， 叶片不同程度发黄、 萎蔫甚至死 亡， 表明其不抗草甘膦。 0096 经过统计， T0代转 wCTP:GR79m 小麦 (GM) 中 57.1表现为抗草甘膦， 可正常生长 ； 0097 野生型小麦 (CK) 全部表现为不抗草甘膦， 出现发黄萎蔫症状。 0098 上述实验表明人工优化合成的 wCTP:GR79m 基因对草甘膦具有一定的抗性， 可应 用于小麦组织培养中作为筛选基因和抗除草剂小麦生产实践。 说。

45、 明 书 CN 104004777 A 10 1/14 页 11 0001 序 列 表 CN 104004777 A 11 2/14 页 12 0002 0003 序 列 表 CN 104004777 A 12 3/14 页 13 0004 序 列 表 CN 104004777 A 13 4/14 页 14 0005 序 列 表 CN 104004777 A 14 5/14 页 15 0006 序 列 表 CN 104004777 A 15 6/14 页 16 0007 序 列 表 CN 104004777 A 16 7/14 页 17 0008 序 列 表 CN 104004777 A 17。

46、 8/14 页 18 0009 序 列 表 CN 104004777 A 18 9/14 页 19 0010 序 列 表 CN 104004777 A 19 10/14 页 20 0011 序 列 表 CN 104004777 A 20 11/14 页 21 0012 序 列 表 CN 104004777 A 21 12/14 页 22 0013 序 列 表 CN 104004777 A 22 13/14 页 23 0014 序 列 表 CN 104004777 A 23 14/14 页 24 序 列 表 CN 104004777 A 24 1/3 页 25 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104004777 A 25 2/3 页 26 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104004777 A 26 3/3 页 27 图 7 说 明 书 附 图 CN 104004777 A 27 。