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1、(10)申请公布号 CN 103988779 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103988779 A (21)申请号 201410216468.4 (22)申请日 2014.05.22 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211 号 (72)发明人 潘光堂 刘敏 沈亚欧 李婉蓉 张志明 林海建 彭焕伟 葛飞 吴花拉 (54) 发明名称 一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法 (57) 摘要 一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方 法， 本发明提供了一种生根效率高、 生根质量好、 炼苗效果好、 移栽成。
2、活率高的玉米转基因组培方 法 ： 1. 将分化培养基上组培苗分成单株， 转生根 壮苗培养基。 2.组培苗长出3条主根时， 开盖炼苗 在培养基表面覆盖一层炼苗剂。3. 炼苗 7 天， 移 栽到炼苗基质中， 此基质是由园土和营养土按比 例混合而成。4. 先在育苗杯里装入 2/3 的基质， 把苗子放进育苗杯， 再用基质把苗子的根部埋上。 5. 栽入育苗杯的苗子要用带孔的塑料杯罩遮盖 7 天。6. 摘掉杯罩后， 再在温室里培养 10 天， 搬到 温室外炼苗 3 天移栽大田。7. 栽入大田后用地膜 覆盖地表， 用遮阳网遮挡 7 天。8. 有些苗子在培 养瓶里生长时， 会产生卷心现象， 在炼苗时把卷心 苗。
3、的心剥开提高成活率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103988779 A CN 103988779 A 1/1 页 2 1. 一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法， 包括生根效率高的生根壮苗培养基、 有效的炼苗方法、 良好的炼苗基质和成活率高的移栽技术 , 本发明中有效的炼苗方法主要 在于应用了自创的炼苗剂， 配方如下 ： 100 片每瓶的制霉菌素片， 用研钵将其磨成粉末状装 在瓶子里备用;用前将粉末状制霉菌素用无菌蒸馏水溶解， 配备成40mg/m。
4、l的炼苗剂原液， 放置 2 小时以上， 使其溶解 ; 炼苗时， 每升无菌蒸馏水中加入 10ml 的 40mg/ml 制霉菌素原 液， 就配成了炼苗剂， 加在培养基表面， 用来炼苗。 2. 如权利要求 1 所述的良好的炼苗基质特征在于， 由园土和营养土按照 8:2 的比例混 合而成， 炼苗基质不需要灭菌， 防止高温破坏基质中的营养成分， 栽上苗子后用步骤 2 中的 炼苗剂原液， 用自来水稀释成工作浓度为 400mg/L 的水溶液， 把基质浇透即可。 3. 如权利要求 1 所述的成活率高的移栽技术中， 为防止刚栽入育苗杯的苗子失水萎焉 死亡， 给苗子罩上带孔的塑料杯罩 , 此塑料杯罩由一次性奶茶杯。
5、做成， 在杯底打上 3 个孔， 用来通气。 4. 如权利要求 1 所述的有效的炼苗方法中， 有些试管苗在培养瓶里生长时， 由于空间 不足或缺水等问题， 会产生卷心现象 , 在炼苗或栽入育苗杯时， 把卷心苗的心剥开， 会显著 提高成活率。 权 利 要 求 书 CN 103988779 A 2 1/4 页 3 一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法 0001 本发明提供了一种玉米转基因高效组培方法， 解决了目前组培过程中， 组培苗生 根率低、 生根质量差， 炼苗长霉菌死亡， 移栽成活率低等制约玉米转基因规模化的问题。本 发明提供了一种生根效率高、 生根质量好的培养基配方 ； 提供了炼苗剂， 解决了。
6、炼苗期间培 养基疯长霉菌导致组培苗死亡的问题 ； 提供了合理的炼苗基质配方， 即解决了园土板结的 问题， 又避免了营养土烧苗现象， 还可以为苗子提供一定的营养基质， 而且这种混合基质疏 松透气、 保水保湿， 利于苗子的成活和生长 ； 提供了高效的移栽方法等。 此组培方法， 大大提 高了转基因玉米组培苗的成活率， 促进了玉米转基因的科学研究， 为玉米转基因育种奠定 基础。 技术领域 0002 本发明涉及一种生根效率高、 生根质量好、 炼苗效果好、 移栽成活率高的玉米转基 因组培方法。 背景技术 0003 转基因技术的快速发展为农业生产带来巨大利益,该技术实现了定向育种,提高 了育种效率。从 80。
7、 年代后期科学家开始进行玉米转基因研究， 至今已经取得一些重要成 果。 国外已经有部分商业化种植的玉米转基因品种， 例如高赖氨酸转基因玉米， 抗玉米螟转 基因玉米， 抗除草剂转基因玉米等。 因此， 转基因育种已经成为现代分子育种的一种重要手 段。转基因育种的一般过程可分为 ： 分子构建、 组培再生、 大田育种三个阶段。组培再生阶 段是指将含有目的基因的载体转化农杆菌， 进而侵染愈伤组织， 经抗性筛选后得到抗性愈 伤组织， 再经分化培养获得再生苗， 炼苗移栽， 最后栽入大田的过程。栽入大田的再生苗越 多， 获得的阳性苗越多， 后期的大田育种才会更有效。 因此， 在转基因育种过程中， 组培再生 是。
8、一个极其重要而且不可或缺的环节。目前， 应用最广泛的玉米转基因受体材料是以玉米 幼胚诱导培养获得的胚性愈伤组织， 以此为基础的组培技术存在一些缺陷 ： 1. 目前运用的 生根壮苗培养基生根效果不好， 很多再生苗经生根壮苗培养基培养 50 天后， 依旧没根， 导 致死亡 ； 2. 试管苗在移栽过程中， 先前由于缺乏十分有效的促控手段， 死亡损失较严重， 致 使转基因植株的获得很少， 甚至一株没有， 使得转基因育种很艰难。3. 现有的炼苗方法， 在 培养瓶里培养基表面加入一层灭过菌的蒸馏水， 即使加入很厚的一层水， 也无法避免疯长 霉菌， 导致苗子死亡， 而且， 厚厚的水层导使苗子进行无氧呼吸， 。
9、也加速了苗子的死亡。 4.栽 苗子的土也存在一些问题 ： 营养土比例过高， 容易烧苗导致苗子死亡 ； 营养土比例过低， 土 壤板结， 苗子也不易成活。 5.刚栽入花盆的苗子严重失水萎焉， 导致死亡 ； 6.在花盆里长势 很好的苗子， 栽入大田后死亡率很高等。 发明内容 0004 本发明提供了一种生根效率高、 生根质量好、 炼苗效果好、 移栽成活率高的玉米转 基因组培方法。 说 明 书 CN 103988779 A 3 2/4 页 4 0005 实现本发明目的的转基因玉米组培方法， 包括如下步骤。 0006 1. 将在培养瓶分化培养基上长至 3cm-4cm 的玉米组培苗分成单株， 并将根部的愈 。
10、伤组织剥离干净， 移至生根壮苗培养基壮苗生根， 所述生根壮苗培养基的成分为改良 MS 培 养基， 所用激素为生根粉 ABT 和矮壮素烯效唑， 浓度分别为 1mg/L 和 0.25mg/L， 所用抗生素 为噻孢霉素 （Cephalothin） ， 浓度为 200 mg/L。 0007 2.组培苗至少长出3条主根， 每条主根长15cm左右， 主根上长出毛细根时， 开盖炼 苗 , 在培养基表面覆盖一层 1-2mm 的炼苗剂 , 以免培养基长霉菌， 导致苗子死亡。炼苗共 7 天， 前 3 天带盖炼苗， 给苗子一个渐变的适应外界环境的过程， 以免苗子萎焉， 后 4 天把盖 子取掉炼苗， 使苗子彻底适应外。
11、界环境。 0008 3. 炼苗 7 天后， 苗子会变得浓绿健壮， 移栽到炼苗基质中， 此基质是由园土和营养 土按照 8:2 的比例混合而成。园土比例过高， 容易板结， 不透气， 不吸水， 不利于苗子的成活 和生长 ； 营养土比例过高， 会有烧苗现象， 导致苗子死亡 ； 按照园土与营养土 8:2 的比例混 合比较合适， 即解决了园土板结的问题， 又避免了营养土烧苗现象， 还可以为苗子提供一定 的营养基质， 而且这种混合基质疏松透气、 保水保湿， 利于苗子的成活和生长。炼苗基质不 需要灭菌， 防止高温破坏基质中的营养成分， 栽上苗子后用步骤 2 中的炼苗剂原液， 用自来 水稀释成工作浓度为 400。
12、mg/L 的水溶液， 把基质浇透即可。 0009 4. 先在育苗杯里装入 2/3 的炼苗基质， 用镊子把苗子从培养基中轻轻拔出， 切忌 不要用水洗根， 减少对根部的伤害， 如根部沾有大块培养基， 可以用镊子轻轻夹掉。然后将 苗子放进育苗杯中部， 尽量让根系散开， 再用基质把苗子的根部埋上， 轻轻按压即可。 0010 5. 栽入育苗杯的苗子要用带孔的塑料杯罩遮盖 7 天左右， 待苗子长出新叶， 便可 取掉。杯罩可以保水保湿， 防止刚栽入花盆的苗子萎焉。栽入花盆的苗子要给予充足的光 照， 有利于苗子的成活。 0011 6. 摘掉杯罩后， 再在温室里培养 10 天左右， 待苗子长到约 20cm 高时。
13、， 搬到温室外 炼苗 3 天， 便可移栽到大田。 0012 7. 栽入大田后， 用地膜覆盖地表， 用遮阳网遮挡 7 天， 防止阳光暴晒死亡。待苗子 恢复浓绿健壮， 便可撤掉遮阳网。 0013 8. 有些试管苗在培养瓶里生长时， 由于空间不足或缺水等问题， 会产生卷心现象。 在炼苗或栽入育苗杯时， 把卷心苗的心剥开， 依然会成活。如果不剥开的话， 这些苗子就会 死亡。获得的每一颗转基因苗子都很珍贵， 所以要尽量使每一颗成活。 0014 所述步骤 1 中的生根壮苗培养基， 其特征在于此培养基为改良的 MS 培养基， 改良 的 MS 培养基配方如下表所示 ： 成分成分浓度 每升培养基加入量 MS 大。
14、量10x100ml N6 有机1000x1ml MS 微1000x1ml N6 微1000x1ml 生根粉 ABT1mg/ml1ml 烯效唑0.5mg/ml 0.5ml 铁盐200x5ml 肌醇固体120g 酸水解酪蛋白固体100g 琼脂固体5g 说 明 书 CN 103988779 A 4 3/4 页 5 蔗糖固体20g 噻孢霉素200mg/ml 1ml 注 ： PH 为 6.0。 0015 所述步骤 2 中的炼苗剂配制方法如下， 100 片每瓶的制霉菌素片， 用研钵将其磨成 粉末状装在瓶子里备用。用前将粉末状制霉菌素用无菌蒸馏水溶解， 配备成 40mg/ml 的炼 苗剂原液， 放置 2 小。
15、时以上， 使其溶解。炼苗时， 每升无菌蒸馏水中加入 10ml 的 40mg/ml 制 霉菌素原液， 就配成了炼苗剂， 加在培养基表面， 用来炼苗。 0016 所述步骤3中的炼苗基质特征在于， 由园土和营养土按照8:2的比例混合而成， 炼 苗基质不需要灭菌， 防止高温破坏基质中的营养成分， 栽上苗子后用步骤 2 中的炼苗剂原 液， 用自来水稀释成工作浓度为 400mg/L 的水溶液， 把基质浇透即可。 0017 所述步骤 5 中， 为防止刚栽入育苗杯的苗子失水萎焉死亡， 给苗子罩上带孔的塑 料杯罩。此塑料杯罩由一次性奶茶杯做成， 在杯底打上 3 个孔， 用来通气。 0018 所述步骤 6 中， 。
16、摘掉杯罩后， 再在温室里培养 10 天左右， 待苗子长到约 20cm 高时， 搬到温室外炼苗 3 天， 才可移栽到大田。 0019 所述步骤7中， 栽入大田后， 用地膜覆盖地表， 用遮阳网遮挡7天， 防止阳光暴晒死 亡。 0020 所述步骤 8 中， 有些试管苗在培养瓶里生长时， 由于空间不足或缺水等问题， 会产 生卷心现象。在炼苗或栽入育苗杯时， 把卷心苗的心剥开， 依然会成活。 0021 所述步骤1中， 生根壮苗培养基厚度3cm， 足以提供组培苗50天生长需要的营养物 质， 所以生根期间不需要更换培养基， 降低对组培苗根系的伤害。 0022 所述步骤 5 中， 刚栽入育苗杯的组培苗， 要打。
17、破常规避光的操作， 应给予充足的光 照， 促进苗子的成活。 0023 本发明的转基因玉米高效组培方法的有益效果如下。 0024 1. 本发明提供的生根壮苗培养基， 生根率达到 100%， 且不定根长而粗壮、 毛细根 发达， 有效提高了移栽成活率。解决了玉米组培苗生根率低、 生根质量差的问题， 科研价值 显著。 0025 2.本发明提供的炼苗剂， 苗子炼苗7天后仍无一长菌， 与先前炼苗方法长菌率80% 以上形成鲜明对比， 而且浓绿健壮， 在此阶段炼苗成活率达到 100%。 0026 3. 本发明提供的炼苗基质， 即解决了园土板结的问题， 又避免了营养土烧苗现象， 还可以为苗子提供一定的营养基质，。
18、 而且这种混合基质疏松透气、 保水保湿， 利于苗子的成 活和生长， 显著提高了此阶段的移栽成活率。 这种炼苗基质不需要灭菌， 大大减少了工作量 和器材消耗。 0027 4. 先前栽入育苗杯的组培苗会因为培养环境的改变， 严重失水萎焉， 死亡率很 高。用带孔的塑料杯罩遮盖后， 移栽的组培苗不会因为失水萎焉死亡， 7 天后， 苗子长出新 叶， 完全适应了温室环境， 生长状况良好。 0028 5栽入大田后， 用地膜覆盖地表， 用遮阳网遮挡 7 天， 可防止阳光暴晒死亡， 显著 提高了组培苗的大田成活率。 0029 6. 在炼苗或栽入育苗杯时， 把卷心苗的心剥开， 组培苗会长出新的叶片， 依然成 活，。
19、 效果显著。 说 明 书 CN 103988779 A 5 4/4 页 6 具体实施方式 0030 本发明的具体实施方式步骤如下。 0031 1. 按照本发明提供的生根壮苗培养基配方配制生根壮苗培养基， 121高压灭菌 15 分钟， 在超净台上倒入无菌培养瓶中， 培养基厚度 3cm， 放置一天， 待表面水分蒸干即可 使用。 0032 2. 将在培养瓶分化培养基上长至 3cm-4cm 的玉米组培苗分成单株， 并将根部的愈 伤组织剥离干净， 转移至步骤 1 中配制的生根壮苗培养基壮苗生根。 0033 3. 培养 30 天左右， 注意期间不需要更换培养基。组培苗至少长出 3 条主根， 每条 主根长 。
20、15cm 左右， 主根上长出毛细根时， 开盖炼苗 , 在培养基表面覆盖一层 1-2mm 的炼苗 剂。炼苗共 7 天， 前 3 天带盖炼苗， 给苗子一个渐变的适应外界环境的过程， 以免苗子萎焉， 后 4 天把盖子取掉炼苗， 使苗子彻底适应外界环境。 0034 4. 炼苗 7 天后， 苗子会变得浓绿健壮， 移栽到炼苗基质中， 此基质是由园土和营养 土按照 8:2 的比例混合而成。炼苗基质不需要灭菌， 防止高温破坏基质中的营养成分， 栽上 苗子后用步骤2中的炼苗剂原液， 用自来水稀释成工作浓度为400mg/L的水溶液， 把基质浇 透即可。 0035 5. 先在育苗杯里装入 2/3 的炼苗基质， 用镊。
21、子把苗子从培养基中轻轻拔出， 切忌 不要用水洗根， 减少对根部的伤害， 如根部沾有大块培养基， 可以用镊子轻轻夹掉。然后将 苗子放进育苗杯中部， 尽量让根系散开， 再用基质把苗子的根部埋上， 轻轻按压即可。 0036 6. 栽入育苗杯的苗子要用带孔的塑料杯罩遮盖 7 天左右， 待苗子长出新叶， 便可 取掉。栽入花盆的苗子要给予充足的光照， 有利于苗子的成活。 0037 7. 摘掉杯罩后， 再在温室里培养 10 天左右， 待苗子长到约 20cm 高时， 搬到温室外 炼苗 3 天， 便可移栽到大田。 0038 8. 栽入大田后， 用地膜覆盖地表， 用遮阳网遮挡 7 天， 防止阳光暴晒死亡。待苗子 恢复浓绿健壮， 便可撤掉遮阳网。 0039 9. 有些试管苗在培养瓶里生长时， 由于空间不足或缺水等问题， 会产生卷心现象。 在炼苗或栽入育苗杯时， 把卷心苗的心剥开， 依然会成活。 0040 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 说 明 书 CN 103988779 A 6 。